Système gastrointestinal

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues obèses et diabétiques par douze semaines de régime gras, puis soumises à un jeûne de seize heures, à un jeûne intermittent de six semaines ou à un régime cétogène, avec des tests de tolérance au glucose comprenant six heures de jeûne et sept piqûres de la queue en deux heures. Il s'agit de savoir si une protéine du foie explique les effets bénéfiques de ces régimes, déjà observés au laboratoire dans une étude non publiée. Le porteur écrit qu'il est "impossible" de reproduire par des méthodes alternatives le jeu combiné du foie, des tissus adipeux, de l'intestin, du cerveau et du muscle.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Mis à jeun douze heures, gavés une fois par voie orale, saignés à l'extrémité de la queue deux minutes plus tard : 640 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans anesthésie jusqu'à la mise à mort. Le protocole vérifie si des peptides vecteurs franchissent la paroi intestinale pour passer dans le sang, une technologie que la société veut étendre du cerveau à l'intestin. Le porteur reconnaît un risque de fausse route et de complication respiratoire si le gavage est mal exécuté, et présente le recours aux animaux non-humains comme le "principal désavantage" de sa demande. Tous reçoivent une dose létale d'anesthésique, puis leurs tissus sont prélevés.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration parentérale. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et utiliser notre technologie pour franchir de nouvelles barrières cellulaires de l’organisme, cette fois-ci au niveau intestinal, en améliorant l’adressage de médicaments administrés par voie orale. Il s’agira dans cette demande de démontrer qu’après administration orale chez le rongeur, nos protéines et peptides vecteurs seront capables de résister aux contraintes et attaques du tube digestif (Enzymes, pH), puis de valider leur passage spécifique à travers la barrière épithéliale, de l’intestin vers le sang.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur de la délivrance systémique par voir orale. Notre objectif sera donc de relever ce nouveau challenge et de transposer notre savoir-faire et technologique sur de l’application « Drug-Delivery » par voie orale. Ainsi, nous pourrions proposer de nouveaux concepts et alternatives thérapeutiques facilitant le quotidien des soignants et des patients par un meilleure accessibilité (traitements devenus trop coûteux ou trop contraignants), conservation et praticité. L’application de notre stratégie de vectorisation pourrait également servir de levier dans bon nombre de pathologies à enjeux de santé publique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous n'aurons pas d'anesthésie, ni d'étape chirurgicale. Les animaux seront uniquement manipulés éveillés et de manière délicate. L'absence de stress est ici un garant du succès et bon déroulement de la procédure. En point final, les animaux seront d'abord mis à mort avant le prélèvement tissulaire final. -Constitution des cohortes d'animaux : Manipulation douce et unique pour la pesée et l'annotation codale des animaux, pour une durée de 2 minutes. -Administration par voie orale : Gestes et manipulations ultra-précis pour réaliser correctement cette étape. Administration simple et unique sans intervention parentérale, pour une durée de 1 minutes. -Prélèvements sanguins intermédiaires : A l'extrêmité de la queue afin d'y collecter quelques gouttes de sang. Geste contentionné expert et précis qui réduit considérablement le stress. Durée Approximative 2 minutes. -Mise à mort pour prélèvements (sédatoin à dose létale + contastation du décès) : Contention manuelle rapide et précise pour réaliser l'injection intrapéritonéale du mélange d'anesthésique à dose létale.

Impact sur les animaux

Les possibles effets ou effets indésirables sont ici listés pour chacunes des manipulations/expérimentations. -Transport et adaptation : Le transport est une source de stress non négligeable dont il faudra tenir compte avant d'envisager les tests. -La stabulation peut engendrer un temps d'adaptation, du stress, ayant un impact sur l’alimentation et le comportement, donc la prise de poids. -Mise à jeun des animaux : Nécessaire à la bonne réalisation de l'étude, les animaux seront mis à jeun 12h avant le début des administrations. Cette phase relativement courte, induira un léger stress transitoire, mais n’aura pas de réel impact sur la santé des animaux. En effet, les données de la littérature démontrent une absence d’effets significatifs sur le poids et l’activité métabolique en cas de mise à jeun inférieure à 18h. -Administration per os (Gavage par voie orale) : Réalisée sur animal éveillé et contentionné manuellement, il est ainsi immobilisé, ce qui génère un certain stress. L'acte de gavage est une gêne évidente mais très brève. Si le geste n’est pas bien réalisé, il y a cependant un risque notable de fausse route et de complication respiratoire. -La manipulation pour la réalisation des prélèvements sanguins intermédiaires : De même que pour le gavage, cette étape sera réalisée sur animal éveillé, après immobilisation en contention spécialisée. L'animal n'aimant pas être coincé, c'est une source de stress (≤2 min). -La manipulation pour l’administration d’une dose létale d’un mélange d’anesthésique : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale, le geste rapide sera totalement maîtrisé par le manipulateur.

Devenir

L'issue de l'étude étant le prélèvement de tissus, tous les animaux seront mis à mort en point final, par administration d'un anesthésique à dose létale.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués sur des études in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires cibles (cultures cellulaires, mesure d'affinité pour le réceptuer cible), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de transposer notre modèle de pharmacologie pour de la voie orale nous devrons absolument envisager de réaliser notre administration orale sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (rat et souris). En effet, la physiologie complexe du tube digestif nous impose l’utilisation de modèle vivo. Des modèles prédictifs ex vivo existent mais nécessitent également le sacrifice d’animaux, sans pour autant intégrer l’ensemble des mécanismes physiologiques périphériques précédemment cités. Afin d’éviter une utilisation encore plus importante d’animaux, notre procédure simple, sur de courtes cinétiques, avec des prélèvements optimisés (intermédiaires et finaux), restera la plus avantageuse en termes de résultats scientifiques pour un nombre d’individus utilisé. Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 5 groupes par test et 8 études par an, ce qui représente 160 individus/an (80 mâles + 80 femelles) pour chacun des fonds et espèces utilisées. Tel que largement décrit dans la littérature pour un modèle « oral delivery », nous utiliserons dans un premier temps le modèle souris sur fond albinos, à raison de 160 individus par an. En parallèle nous voudrons vérifier nos données obtenues sur un autre modèle souris, de fond consanguin, pour un nombre équivalent d’animaux (maximum 160/an). En effet ce modèle utilisé dans nos précédentes études Pharmacologiques sera précieux pour de futurs essais sur récepteurs humanisés en vue d’une transposition à l’homme. Enfin, le modèle souris présentant certaines divergences fonctionnelles et un modèle plus développé, sera indispensable dans nos investigations. Nous travaillerons à la suite des deux précédents, sur rats de fond albinos standard, pour un gros maximum de 160 individus/an. Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Maximum 1 prélèvement caudal/individu ≤50 μl) en cours de cinétique, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe 2 : grille scores et points limites). Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 14 jours dès réception. 7 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une pièce cyclée spécifique rats ou souris (cyclée12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en plastique + cartons déchirés). Les animaux y seront visités régulièrement afin d’être sensibiliser à l’expérimentateur. A J0, les manipulations et administrations se feront sur animaux éveillés, il n’y aura pas d’anesthésie en cours d’étude jusqu’à la mise à mort en point final. En cours d’étude, les pesées, administrations et prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min). Des points limites seront malgré tout établis, afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques en intrapéritonéale permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques, sur fonds albinos ou consanguins et non génétiquement modifiés.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques périphériques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure et les trois lignées d’animaux (rat x1 et souris x2) nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 10 semaines pour les souris et 6 à 8 semaines pour les rats. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 25-27g environ chez la souris et 120-140g chez le rat, ce qui s’avère plus économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses).

Pour voir si un anti-inflammatoire ajouté à l'immunothérapie retarde le cancer du foie, 104 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à des semaines différentes selon leur groupe. Deux jours après leur naissance, elles sont séparées de leur mère le temps d'une injection de streptozotocine, puis nourries au régime gras dès le sevrage jusqu'à développer une cirrhose puis un carcinome hépatocellulaire à partir de la seizième semaine. Suivent de quatre à quarante injections dans le ventre sur animal éveillé selon les groupes, trois anesthésies gazeuses, deux scanners du foie et deux allers-retours de cinq cents mètres entre l'animalerie et le service d'imagerie, le porteur qualifiant d'"indolore" cette évolution vers le cancer. La seule limite décrite pendant l'examen tient au monitoring respiratoire, l'animal en détresse étant retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu'à son réveil.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.

Remplacement

A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.

Réduction

Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.

Raffinement

Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.

Choix des espèces

Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.

Nourries pendant douze semaines avec un régime riche en graisses jusqu'à peser environ le double d'une souris témoin, mises à jeun six heures une fois par mois, gavées de boissons trois fois par semaine pendant six semaines, 64 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une goutte de sang est prélevée à leur queue tous les quinze jours pendant trois mois pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que l'obésité induite réduit leur mobilité, peut dégrader leur toilettage jusqu'à l'alopécie et provoquer une polyurie, et prévoit de changer leur litière deux fois par semaine à cause des souillures. Toutes sont tuées par ponction cardiaque pour prélever le maximum de sang et neuf tissus, dont le cœur, le foie, le cerveau et le contenu du cæcum, l'objet du projet étant de tester l'effet prébiotique de tisanes de plantes médicinales réunionnaises.

Objectifs

Le projet vise à évaluer les effets prébiotiques et anti-diabétiques de tisanes riches en polyphénols de plantes médicinales réunionnaises chez un modèle de souris obèse. Ce projet s’insère dans un programme de recherche visant à développer des thérapies innovantes contre l’obésité et l’état diabétique associé qui sont des problèmes de santé publique majeurs dans le Monde. En effet, l’accumulation de graisses causant l’obésité engendre des désordres métaboliques et inflammatoires conduisant à une résistance à l’insuline et au diabète de type 2. L’obésité s’accompagne également d’une dérégulation des communautés bactériennes du microbiote intestinal, appelée dysbiose, et d’une perméabilité de la barrière intestinale. Il en résulte une translocation dans le sang de composés bactériens comme des endotoxines de type lipopolysaccharides (LPS) et des métabolites comme la triméthylamine métabolisée en oxyde de triméthylamine (TMAO) par le foie. Ces métabolites d’origine bactérienne atteignent des organes métaboliquement actifs tel que le tissu graisseux et aggravent l'inflammation, la résistance à l'insuline et l’état diabétique au cours de l’obésité. Des études montrent que la réduction de la dérégulation du microbiote intestinal par des agents prébiotiques naturels comme les fibres et les polyphénols végétaux, diminue le risque de complications de l’obésité. En effet, les prébiotiques sont des composés utilisés comme substrats nutritifs par des communautés bactériennes spécifiques et sont en faveur de leur croissance. Notre hypothèse de recherche est que les polyphénols contenus dans des tisanes, servent de substrats aux bactéries intestinales et protègent contre la dérégulation du microbiote intestinal liée à l’obésité. Pour vérifier cette hypothèse, notre projet a pour but d’évaluer pour la première fois la capacité de tisanes riches en polyphénols issues de deux plantes médicinales réunionnaises à exercer une action prébiotique sur les bactéries intestinales chez un modèle de souris obèses. De plus, le projet vise à déterminer l’impact des tisanes riches en polyphénols sur la production de métabolites bactériens de type LPS et TMAO, pour limiter le développement de l’état inflammatoire et diabétique des souris obèses.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - d’ordre scientifique et médical : la preuve du lien entre les métabolites bactériens et les désordres métaboliques et inflammatoires au cours de l’obésité contribuera à l’apport de nouvelles connaissances sur le rôle de la dysbiose du microbiote intestinal comme facteur de risque et cible thérapeutique potentielle. De nouvelles perspectives thérapeutiques utilisant des prébiotiques pourront être développées pour la prise en charge de patients en situation d’obésité et à risque diabétique. - d’ordre biotechnologique : la preuve de l'efficacité de thérapies riches en polyphénols de plantes médicinales visant à améliorer la composition du microbiote intestinal, à moduler la production de métabolites bactériens atteignant les tissus métaboliquement actifs et à réduire les troubles métaboliques comme le diabète au cours de l'obésité permettra de valoriser le potentiel nutrition-santé de ces molécules naturelles issues de la biodiversité végétale.

Procédures

Les nuisances prévues sont associées à 4 types d'interventions chez les animaux : 1- Prélèvement d’une goutte de sang au niveau de l’une des veines latérales de la queue pour la mesure de la glycémie (durée 1 min, 1 fois tous les 15 jours pendant 3 mois, 8-10 µL). 2- Gavage de boissons (durée 2 min, 3 fois par semaine pendant 1,5 mois). 3- Gavage d’une solution de glucose pour le test de tolérance au glucose (durée 2 min, 1 fois par mois pendant 3 mois). 4- Ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale (euthanasie, durée 2 min).

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisses provoque une augmentation du poids/état d’obésité des souris générant des contraintes physiques (mobilité réduite/inactivité, diminution possible de toilettage/alopécie, modification des fécès, polyurie) voire psychologiques (stress/angoisse), engendrant une augmentation de la souillure des litières. Pour détecter ces possibles effets indésirables et garantir au mieux le bien-être des animaux, un suivi quotidien du comportement des animaux, et de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines sera effectué. Le test oral de tolérance au glucose réalisé une fois par mois va induire un stress vu que les souris seront mises à jeun pendant 6 h pour évaluer l’hyperglycémie provoquée. Les mesures de glycémie seront réalisées grâce à un glucomètre à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction au niveau d’une des veines latérales de la queue, après application sur la queue d’une crème analgésique. Pour limiter le stress et la douleur, les manipulations seront réalisées par un personnel habilité et dûment expérimenté. L’étape de gavage des boissons prévue 3 jours par semaine pendant 6 semaines peut aussi induire un état de stress chez les animaux. Pour limiter ce stress, les manipulations seront réalisées par le même personnel habilité et expérimenté. Un suivi quotidien du comportement des animaux et une mesure de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines permettront de détecter des possibles effets indésirables afin de garantir au mieux le bien-être des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer chez les animaux un volume de sang maximal ainsi que différents tissus (tissu adipeux sous-cutané et épididymal, foie, coeur, crosse aortique, cerveau, caecum et contenu cécal) qui sont requis pour réaliser des dosages de marqueurs métaboliques et inflammatoires circulants permettant de caractériser l’état diabétique des souris.

Remplacement

Au laboratoire, nous développons des études mécanistiques sur modèles in vitro de cellules graisseuses, sur lesquelles des composés bactériens et polyphénols végétaux sont testés. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité de l’organisme vivant, avec les échanges inter-organes impliqués dans le métabolisme énergétique comme entre l’intestin, le tissu graisseux et le foie, ni de mesurer la bioaccessibilité tissulaire des métabolites bactériens et des polyphénols en condition d’obésité. Il est aussi question d’évaluer l’impact du régime obésogène associé aux boissons à potentiel prébiotique sur la composition du microbiote intestinal et l’état inflammatoire des souris en situation d’obésité. Seul un modèle animal permet de reproduire ces conditions physiopathologiques liant dysbiose du microbiote intestinal, obésité et complications métaboliques et inflammatoires. L’utilisation d’animaux vivants permet d’évaluer l’efficacité de la stratégie nutritionnelle envisagée à base de molécules prébiotiques et anti-diabétiques, car celles-ci nécessitent un métabolisme dans le tractus digestif par les bactéries puis une absorption intestinale pour un impact sur les échanges métaboliques inter-organes intestin-foie-tissu graisseux impliqués dans la pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour tester notre hypothèse de recherche selon laquelle les polyphénols de tisanes issues de plantes médicinales pourraient exercer des effets prébiotiques et anti-diabétiques dans le contexte de l’obésité.

Réduction

Au laboratoire, nous disposons uniquement de souris transgéniques ne permettant pas la réutilisation d’animaux. Les expériences seront conçues en utilisant le moins d’animaux possible, tout en permettant de réaliser des études statistiques exploitables. Une approche statistique a permis de déterminer qu’il faut au moins 8 souris par groupe pour atteindre des résultats significatifs. Pour comparer les effets du régime alimentaire standard et du régime riche en graisses, supplémenté ou pas par une des deux tisanes ou par des fibres alimentaires, le projet impliquera 8 groupes de 8 souris, soit un total de 64 souris. Cet effectif prend aussi en compte les études précédentes du laboratoire ayant mesuré la variabilité des expérimentations visées et établi le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre une puissance statistique permettant de valider l’hypothèse de recherche testée.

Raffinement

Les souris seront placées dans des conditions optimales, au nombre de 4 par cage maximum, et l’atmosphère contrôlée en température, humidité, lumière, ambiance sonore. Les animaux bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau, et d’un enrichissement de leur environnement pour favoriser leur comportement naturel et limiter leur stress et anxiété. Les animaux seront séparés en cas de bagarre ou de barbering important. Le change des litières sera effectué une fois par semaine et adapté à 2 fois par semaine pour les souris en situation d’obésité en cas de souillures plus fréquentes. Dans un objectif de respect du bien-être animal et de réduction de la douleur, les mesures seront prises telles qu’une habituation des souris par un personnel habilité et expérimenté ainsi que l’utilisation d’anesthésie générale par inhalation d’isoflurane 2% et d’administration de buprénorphine (0,05 mg/kg) lors des expérimentations. En cas d’atteinte d’un point limite strict, une mise à mort par dislocation cervicale sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour les expérimentations in vivo. Les procédures, les manipulations, l’évaluation de la douleur ou de la souffrance sont par conséquent bien établies. Les souris C57BL/6 sont choisies car c’est un modèle sensible au développement de l’obésité et du diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses. De plus, la littérature évoque chez ces souris la présence d’un microbiote intestinal et la production de métabolites bactériens comparables à ceux détectés chez l’homme, de par l’existence de principaux phyla bactériens (Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes, Proteobacteria) qui permettent d’évaluer la dysbiose du microbiote intestinal causé par le régime obésogène. Ce modèle animal est donc idéal pour la réalisation de notre projet et l’ensemble des procédures est maîtrisé sur ce modèle, notamment au laboratoire. Les 64 souris C57BL/6 utilisées seront des souris mâles (32) et femelles (32) âgés de 10 semaines au démarrage de l’étude qui durera ensuite 12 semaines. La pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre touchent principalement les adultes, il est donc indispensable d’avoir des animaux de cet âge afin de donner une perspective thérapeutique à ce projet de recherche. Nos résultats antérieurs issus de projets similaires ont été obtenus à ces stades de développement des animaux, ce qui permet de réaliser des analyses comparatives dans le but de limiter le nombre d’animaux. Poids d’une souris nourrie avec un régime équilibré standard (ND) : environ 20-25 g. Poids d’une souris nourrie avec un régime riche en graisses (HFD) : environ 45-50 g.

1 415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie et de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de virus dans une veine, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique qui fait apparaître des tumeurs du foie, ce dernier chez des souriceaux de 14 jours, puis en moyenne huit échographies sous anesthésie, des injections d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois au plus, une toxine qui provoque une hépatite ou une chirurgie abdominale terminale. Ces tumeurs peuvent conduire, selon le porteur, à une encéphalopathie mortelle sans perte de poids. L'équipe veut comprendre pourquoi une même mutation donne deux types de tumeurs du foie, résistantes à l'immunothérapie, et en tirer des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'il est "crucial de travailler sur des modèles murins pertinents", tout en prévoyant de mettre au point des cultures de tumeurs en trois dimensions pour tester de futurs médicaments.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s b) une injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30s c) une injection intrapéritonéale unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30s 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection intrapéritonéale d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30s (pendant 2 mois maximum) d) une injection intrapéritonéale unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30s 3) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection intrapéritonéale unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30s.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections intraveineuses de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.

Un score de 3 sur la grille de surveillance suffit à retirer une souris de l'étude, mais les 288 souris de ce projet finissent toutes tuées par dislocation cervicale pour analyser leur foie. Elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une injection dans la veine de la queue d'un virus qui éteint le gène FGF21 dans le foie, deux prises de sang et une mise à jeun de 20 heures dont 8 heures de nuit. Le porteur indique que le jeûne peut entraîner une légère hypoglycémie et l'injection du transgène une inflammation temporaire. L'enjeu déclaré reste la connaissance, comprendre le rôle d'une hormone produite par le foie dont des analogues sont déjà en essai clinique chez l'être humain.

Objectifs

Le jeûne est pratiqué depuis longtemps et ses effets bénéfiques sur la santé générale et la longévité ont plus récemment été mis en avant. En effet, le jeûne représente un bon stress physiologique qui force l’organisme à s’adapter et à survivre. Ainsi, le jeûne permet d’optimiser l’utilisation de l’énergie et de réduire l’inflammation et le stress oxydant. Chez les mammifères, le foie joue un rôle majeur lors du jeûne. Il permet notamment de produire du sucre qui est utilisé par les différents tissus de l’organisme en période de carence en nutriments. Lors de période de jeûne, le foie produit également une hormone, appelée FGF21. Elle est libérée dans le sang lors du jeûne mais aussi lors d’une surcharge en sucre. Elle a des actions bénéfiques sur le poids corporel et sur le niveau de sucre dans le sang. Ainsi, de nombreuses molécules similaires à FGF21 font actuellement l’objet d’essais cliniques pour le traitement de maladies métaboliques comme le diabète. Bien que FGF21 soit produite en grande quantité lors de période de jeûne, son rôle dans ce contexte est peu compris. Dans ce projet, pour approfondir les connaissances sur le rôle de FGF21 lors du jeûne, nous générerons des souris dont le gène FGF21 n’est plus fonctionnel dans le foie et nous les soumettrons à une période de jeûne.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle hépatique de FGF21 lors du jeûne. En effet, FGF21 est produite en grande quantité lors du jeûne mais son rôle dans ce contexte est encore mal compris. Des analogues de FGF21 faisant l'objet d'essais cliniques dans le cadre de plusieurs maladies métaboliques, mieux comprendre son rôle en physiologie est d'une importance majeure.

Procédures

Les animaux recevront une injection intraveineuse prenant environ 20 secondes (1 fois), et il sera pratiqué 1 fois par semaine une prise de sang prenant environ 15 secondes (2 fois), ainsi qu'une mise à jeun de 20h, dont 8h pendant la période nocturne et un prélèvement de sang juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

L'injection au niveau de la veine de la queue demande une contention de l’animal qui peut entraîner un stress. L'injection du transgène peut engendrer éventuellement une inflammation temporaire. La mise à jeun peut entrainer une légère hypoglycémie. Les prélèvements de sang peuvent entraîner un stress lié à la contention ainsi qu'une légère douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale afin de réaliser des analyses sur les échantillons de foie.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus biologique complexe qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un test statistique adapté et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures de jeûne du laboratoire.. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, ces tests pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé au cours du projet.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif (4 ou 5 animaux/cage) et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris après l'injection à la veine de la queue du transgène et après le prélèvement sanguin à la joue. Plus généralement, nous surveillerons attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée) après examination par la vétérinaire référente. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection. Pour être la moins pénible, la période de jeûne est planifiée ainsi : 12h pendant toute la période de jour durant laquelle les souris dorment et ne mangent que 10% de leur bol alimentaire quotidien, et 8h en période de nuit. Ce jeûne permet d’arriver au pic d’activité de FGF21, tout en évitant une période de privation de nourriture trop longue.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques (ici FGF21) en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles ne sont disponible que chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Sur les 207 souris utilisées, 192 seront tuées pour prélever leur intestin et leur cerveau, les 15 souris dites naïves employées dans les tests d'interaction sociale étant mises à disposition d'autres utilisateurs. Ces souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une hypothyroïdie provoquée chez les mères par un antithyroïdien dans l'eau de boisson, puis chez la descendance un gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, des prélèvements de sang à la queue et une bille introduite par voie anale pour mesurer le transit colique. Les tests comportementaux sont détaillés, exploration, interaction sociale de 35 minutes, mesure des stéréotypies et test d'anxiété de 15 minutes chacun. Le porteur affirme qu'évaluer un traitement des symptômes digestifs et comportementaux de l'autisme ne peut, à ce jour, être réalisé que sur des animaux non-humains.

Objectifs

6. Les troubles du spectre de l’autisme sont caractérisés par des déficits dans les interactions sociales, des stéréotypies et des centres d’intérêts restreints. En plus des symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes avec TSA souffrent de symptômes gastro-intestinaux. Aucun médicament spécifique des troubles du spectre de l’autisme n’existe à ce jour. Il s’avère que le microbiote intestinal présente une composition altérée chez les patients avec autismes par rapport à des sujets témoins. Appuyant le microbiote intestinal comme possible cible thérapeutique dans l’autisme, des études cliniques pilotes de thérapie par transfert de microbiote fécal ou de probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures exerçant un effet bénéfique sur l'organisme) chez des enfants avec autisme ont permis d’améliorer certains symptômes comportementaux et digestifs, suggérant que des éléments produits par le microbiote intestinal possèdent un potentiel thérapeutique. Nous proposons de tester l’un de ces éléments : les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal qui sont présentes dans les selles. Parmi les facteurs de risques de l’autisme, la santé de la mère pendant la grossesse semble jouer un rôle crucial. En particulier, l'hypothyroxinémie maternelle est associée à un risque quatre fois plus élevé de développer des troubles du spectre de l’autisme chez la descendance. L’hypothyroxinémie est une forme d’hypothyroïdie dans laquelle la concentration sanguine de T3 (l’hormone thyroïdienne active) est normale alors que celle de T4 (précurseur de T3) est diminuée. Un modèle animal chez la souris permettant de modéliser l’hypothyroxinémie maternelle montre en effet l’apparition de troubles comportementaux et digestifs pertinents des TSA chez la descendance. L’objectif de ce projet est d’étudier une nouvelle approche thérapeutique dans un modèle animal d’hypothyroxinémie maternelle. Cette approche est basée sur l’utilisation vésicules extracellulaires fécales (contenant les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal) ou des vésicules extracellulaires issues de probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures). L’objectif est d’étudier si un traitement d’un modèle animal avec des vésicules extracellulaires provenant d'un microbiote fécal sain ou de probiotiques réduira les symptômes comportementaux et gastro-intestinaux de type autistique chez la descendance de mères avec hypothyroxinémie.

Bénéfices attendus

Les troubles du spectre de l’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et restent en constante augmentation sans médication proposée à ce jour. Plusieurs études indiquent que des éléments produits par le microbiote intestinal ou par des probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures) possèdent un potentiel thérapeutique pour les troubles du spectre de l’autisme. En ciblant les vésicules extracellulaires, notre projet pourrait apporter un nouvel outil thérapeutique dans l’autisme. Dans des modèles animaux de colites, l’emploi des vésicules extracellulaires fécale ou dérivées de probiotiques, a montré leur efficacité dans la diminution des symptômes gastro-intestinaux. Ce projet pourrait donc apporter de nouvelles perspectives pour un traitement thérapeutique de l’autisme basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques (composés produits par les probiotiques).

Procédures

Pour la procédure n°1 visant à induire une hypothyroxinémie chez les souris gestantes, nous réaliserons un seul prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue (environ 200μl) de 5min. Pour la procédure n°2 visant à étudier le comportement et les fonctions digestives, nous réaliserons : - un gavage 3 fois par semaine (un jour sur deux) durant 2 semaines à l’aide d’une canule de gavage pour rongeurs avec 100 µl d’une solution de VE (2min). - des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : 1) test d’exploration, 2) test d’interaction sociale de 35min 3) mesure des stéréotypies de 15min et 4) test d’anxiété de 15min. - un seul prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue (environ 30μl) de 5min. - un prélèvement de selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l’étude.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux, à l’exception des souris naïves dites inconnues utilisées pour les tests comportementaux d’interaction sociale, seront mis à mort. Les souris naïves seront mises à disposition pour d’autres utilisateurs. L’intestin et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires d’expression de protéines clés des fonctions digestives et cérébrales.

Remplacement

Une étude visant à évaluer le bénéfice thérapeutique d’un traitement sur les symptômes digestifs et comportement dans le cadre des troubles du spectre de l’autisme ne peut, à ce jour, être réalisée que sur des animaux.

Réduction

Des études antérieures publiées sur des modèles in vivo de colites et des approches in vitro conduites dans notre laboratoire sur des modèles de cultures de neurones entériques ont montré la bioactivité des VE fécales ou dérivées de probiotiques à induire des modifications fonctionnelles des neurones entériques et ainsi à déterminer la dose efficace de VE à administrer chez l’animal. Ces données et expériences préliminaires in vitro ont permis de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour révéler ces effets in vivo. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souris gestantes au stade gestationnel embryonnaire de 6 jours, soit 5 jours avant le début du traitement avec le 2-mercapto-1-methylimidazole dans l’eau de boisson pour induire une hypothyroxinémie gestationnelle. Les souris gestantes seront hébergées collectivement dans un environnement enrichi avec frisottis et tunnels, puis seront transférées 3 jours avant la mise-bas dans des cages individuelles enrichies avec igloo pour leur permettent de construire leur nid. Pour la descendance, les souris seront hébergées collectivement dans des cages enrichies avec frosottis et tunnel. Concernant les tests comportementaux, une habituation d’1h est réalisée dans la pièce dédiée au comportement avant le début des tests. Pour le test du temps de transit colique distal par l’introduction d’une bille par voie anale dans le rectum, de la vaseline sera utilisée pour l’introduction de la bille. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis de poids, d’apparence physique (pelage, posture), d’activité, de comportement et de fréquence respiratoire. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés régulièrement pour les femelles gestantes et au stade P10, P30 et P55 pour la descendance. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place. Si l’animal présente 2 ou 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, il sera retiré de l’étude et sacrifié. En cas de doute, nous ferons appel aux responsables de la SBEA de l’établissement. Si un seul signe clinique est notable, il sera alors demandé une consultation par le vétérinaire référent ou un responsable SBEA. Si un protocole d’analgésie s’avère nécessaire, les souris ayant eu une analgésie seront retirées de l’étude en raison du biais expérimental apporté par l’analgésie.

Choix des espèces

Des études antérieures conduites par nos collaborateurs ont montré la pertinence chez la souris du modèle d’hypothyroxinémie maternelle comme modèle d’autisme intégrant un facteur de risque maternel. De plus, nos études conduites dans le laboratoire montrant l’impact du microbiote fécal dans les troubles gastro-intestinaux et comportementaux ont été réalisées chez la souris. Les souris gestantes au stade gestationnel E4 seront réceptionnées à l’animalerie. Pour induire l’hypothyroxinémie, les souris au stade gestationnel E10 recevront 0,02% de 2-mercapto-1-methylimidazole (MMI) dissout dans l’eau de boisson jusqu’au stade E14 selon le protocole bien établi. Sur la descendance, les souris recevront le traitement avec les VE au stade 40 jours après la naissance, correspondant à un stade adolescent, encore en phase développementale de maturation cérébrale et intestinale. A cet âge, les symptômes gastro-intestinaux et comportementaux sont apparents. De plus cet âge est pertinent avec l’autisme, s’inscrivant dans une trajectoire développementale. Après 2 semaines de traitement, les souris seront étudiées au stade 54 jours après la naissance jusqu’à 58 jours.