Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Développement de nouveaux modèles combinant génétique et facteur environnemental pour l’étude d’une maladie métabolique du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Deux gavages chez la femelle gestante, cinq injections chez les nouveau-nés, un bout de queue de un à deux millimètres prélevé au septième jour pour le génotypage : 884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes les interventions étant réalisées sur animal vigile. Les souriceaux qui développent la maladie visée présentent une jaunisse et un retard de croissance, la biopsie de queue entraînant selon le porteur une douleur modérée et passagère. L'objet déclaré est de combiner la délétion d'un gène du foie avec des molécules toxiques pour les canaux biliaires, afin d'obtenir une malformation des voies biliaires à un âge plus précoce que dans les travaux publiés. Tous les souriceaux seront tués à vingt et un jours et les adultes des croisements à la fin de la procédure, sans autre raison donnée que le fait qu'ils sont "nécessaires pour notre étude".
Objectifs
L’objectif de ce projet est l'étude de souris dans des modèles environnementaux de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire en utilisant des molécules potentiellement toxiques pour les canaux bilaires couplé à la délétion d'un gène impliqué dans le fonctionnement hépatique. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement d’un modèle combinant la délétion génétique avec un facteur environnemental pouvant expliquer la cause de la maladie, c'est à dire des molécules pharmacologiques dans ce contexte. Il permettra également d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes précoces de la maladie et pourront être utilisés à l'avenir pour la découverte de nouveaux traitements.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. 5 injections de 10sec chez les nouveaux nés. 2 gavage de 30sec chez la femelle gestante. Prélèvement d'un bout de queue 1 à 2 mm le 7ème jour post natal.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances seront les injections sur les nouveaux nés et les gavages chez les femelles gestantes. Elles entrainent une douleur légère et passagère. Dans le cas où les animaux développent la maladie, les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés). Pour le génotypage un prélèvement d'un à deux millimètres de queue sera prélevé entre 7 jours après la naissance ce qui entraîne une douleur modérée et passagère.
Devenir
Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Cette étude permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Les cultures cellulaires ne peuvent pas complétement remplacer les études in vivo pour l'étude de la mise en place de la fibrose et l'étude du développement de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les deux sexes seront utilisés car les études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. De multiples paramètres seront analysés pour chaque souris. Afin de vérifier que les résultats sont statistiquements significatifs des tests adaptés seront utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Afin de limiter le stress des animaux seul l’expérimentateur du projet sera amené à manipuler les animaux durant la période de croissance des nouveaux nés. Les manipulations seront effectuées le plus rapidement et calmement possible. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une table chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. Des aiguilles adaptées à la taille et au poids (volumes adaptés) de l’animal seront utilisés pour les injections. Pendant toutes les procédures une grille de score avec des points limites spécifiques ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi journalier pour les nouveaux nés.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier, le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Les souris néonatales (P1 à P21) pour étudier le développement du foie et de l’arbre biliaire ainsi que des souris adultes gestantes (de 6 semaines minimum).
Etude chez la souris de la réponse immunitaire au cours de l’infection par la microsporidie Encephalitozoon cuniculi
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des spores de microsporidie sont injectées dans la peau de l'oreille de souris transgéniques dont les cellules immunitaires sont fluorescentes, après élimination ou non de certains globules blancs par un anticorps injecté deux fois avant l'infection. 290 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 20 d'entre elles subissant en plus quatre jours d'imagerie quotidienne sous anesthésie. Le porteur écrit : "Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l'animal", et écrit ailleurs "Bien que tout stress ne puisse être totalement évité". Les 290 souris sont tuées, les unes à la fin de l'imagerie, les autres à cinq temps échelonnés de deux heures à sept jours après l'infection, pour prélever leurs tissus.
Objectifs
L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Les cellules dendritiques et les macrophages sont des cellules de l’immunité qui jouent un rôle important dans la réaction de défense contre l’infection par les microsporidies chez l’hôte infecté. En piratant ces cellules, la microsporidie contourne la réponse immunitaire de l’hôte. Cependant, peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies de piratage immunitaire in vivo. Notre projet vise tout d’abord à explorer, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre le parasite et les cellules de l’immunité innée (macrophages, cellules dendritiques). En particulier, le modèle du pavillon de l’oreille de la souris est un des plus utilisés pour analyser, par imagerie en temps réel, chez l’animal anesthésié, la dynamique de la réponse immunitaire innée. L’objectif est ici d’appliquer ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. En parallèle, les interactions entre les microsporidies et les macrophages ou les cellules dendritiques murines seront étudiées in vitro. En améliorant nos connaissances sur la réponse immunitaire dirigée contre la microsporidie E. cuniculi, de nouveaux traitements ciblant le système immunitaire pourront être mis au point pour mieux contrôler ces infections chez l’homme.
Bénéfices attendus
De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre l’espèce microsporidienne E. cuniculi, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies de traitement permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.
Procédures
1. Imagerie de la réponse immunitaire dirigée contre Encephalitozoon cuniculi -Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez des souris transgéniques possédant des cellules immunitaires fluorescentes. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. -Anesthésie générale des animaux traités ou non (avec ou sans polynucléaires neutrophiles) et infectés -Imagerie du tissu de l’oreille sur animal vivant anesthésié, par microscopie (imagerie en temps réel), chaque jour pendant 4 jours. Les animaux anesthésiés sont mis à mort à la fin de l’expérience (jour 4). Nombre total d’animaux concernés : 20 souris (10 souris traitées, 10 souris contrôle) 2. Expériences avec biopsies tissulaires chez les animaux C57BL6 infectés par E. cuniculi. - Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez les souris C57BL6. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. - Mise à mort des souris aux différents temps d’infection (2h, 24h, 48h, 72h et 7 jours). Les tissus d’intérêt sont prélevés très rapidement après vérification de la mort de l’animal. Nombre total d’animaux concernés : 135 animaux pour les études immunologiques et 135 animaux pour les mesures de charge parasitaire.
Impact sur les animaux
Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection intradermique des spores pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. Les expériences sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutanée est généralement minime. Point limite : Pendant toute la durée de l’expérience, toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière mènera à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec mise à mort des animaux.
Devenir
Procédure 1 : mise à mort à la fin de l’expérience de microscopie confocale. Le suivi des souris infectées s’effectue sur une durée de 4 jours. Au-delà, les animaux sont sacrifiés afin d’éviter les complications liées à la dissémination tissulaire des parasites. De plus, les animaux étant infectés, ils ne sont pas réutilisables pour d’autres expérimentations. Procédure 2 : mise à mort pour prélèvement de tissus
Remplacement
Notre projet inclut des expérimentations réalisées avec des cellules immunitaires en culture, mais elle reste largement insuffisante pour étudier en détail les interactions entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire à l'échelle tissulaire chez un animal. Le recours à l’approche d’imagerie en temps réel chez l’animal vivant anesthésié permet d’étudier la mise en place de cette réponse immunitaire au sein du tissu cutané.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Pour les expériences de microscopie en temps réel chez l’animal vivant, le nombre d'animaux requis sera faible (20 au total sur une année : 10 animaux avec ou sans polynucléaires neutrophiles) car cette approche permet d'étudier la réponse immunitaire chez un même animal en fonction du temps, après anesthésie. Pour les expériences étudiant la réponse immunitaire, ainsi que pour les mesures de charge parasitaire dans les tissus, le nombre total d'animaux utilisés est réduit au minimum et fixé à 135 (3 animaux par point de cinétique, 5 points de cinétique, 3 conditions expérimentales, 3 expériences). Ce chiffre a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Total des animaux utilisés sur 3 ans : 20+135+135= 290 animaux
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Ils sont hébergés par groupes de 5 individus au maximum pour permettre le maintien d’un bien-être social. Ils sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis sont établis et les expériences sont arrêtées en conséquence. Bien que tout stress ne puisse être totalement évité, les procédures et mesures de raffinement mises en œuvre visent à en limiter l’intensité et la durée. En particulier, toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection des parasites dans la peau pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’infection, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. A chaque temps de l’expérimentation de microscopie, une couverture chauffante thermorégulée est placée sur l’animal anesthésié pour éviter l’hypothermie. Après l’expérimentation et pendant la phase de réveil, l'animal est maintenu sur le tapis chauffant et gardé en observation pendant 2 heures, puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les expériences de microscopie sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutané est généralement minime. Point limite : Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de la parasitologie et de l’immunologie. Le recours à une lignée de souris transgénique qui possède des cellules immunitaires fluorescentes nous permet de visualiser en temps réel chez l’animal anesthésié la mise en place de la réponse immunitaire innée lors d’une infection microsporidienne. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines (âge adulte), ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.
Traitement du microbiote intestinal et des intestins pour prévenir la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes mises à mort pour prélever leur cerveau et leurs intestins. Chacune est maintenue trois minutes par jour dans un dispositif de contention pour recevoir de la lumière rouge puis infrarouge sur l'abdomen, quatre à huit semaines pour les souris exposées au pesticide, cinq jours par semaine pendant seize mois pour les souris transgéniques. Une pompe implantée sous la peau du dos délivre la roténone, les souris sont mises à jeun jusqu'à douze heures, isolées jusqu'à huit heures sans eau ni nourriture pour la collecte des selles, gavées si elles refusent de boire les solutions de test, et les transgéniques développent à partir de douze mois une réduction locomotrice pouvant aller jusqu'à la paralysie. Le porteur annonce trois tests moteurs et des tests olfactifs sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative touchant 270 000 personnes en France. Elle se caractérise par la mort progressive et irréversible de certains neurones. Cette perte entraîne l’apparition de troubles moteurs (tremblements, lenteur des mouvements, rigidité musculaire) et non-moteurs (constipation, perte d’odorat, troubles du sommeil), invalidant progressivement les personnes atteintes jusqu’à conduire à leur décès. A ce jour aucun traitement curatif n’existe. La photobiomodulation (PBM) est un traitement innovant qui repose sur l’exposition des tissus à une lumière rouge et/ou proche infra-rouge. Des études précliniques sur la MP ont montré que l’application de la PBM à l’intérieur du cerveau permet une protection des neurones et une préservation des fonctions motrices. Cependant, cette technique est invasive et limite son application en clinique pour tous les patients. Des études récentes, ont montré l’importance de l’axe intestin-cerveau dans la MP, car des dysfonctionnements intestinaux (inflammation, déséquilibres de la flore intestinale et constipation) apparaissent souvent plusieurs années avant les symptômes moteurs et pourraient contribuer au déclenchement et la propagation de la maladie. L’objectif de ce projet est de déterminer si la PBM administrée au niveau de l’abdomen, influence la flore intestinale de manière à prévenir et ralentir la MP. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 modèles de souris de la MP : 1) Un modèle induit par l’exposition à un pesticide, la roténone, qui reproduit des caractéristiques majeures de la MP, telles que l’apparition de troubles moteurs et la dégénérescence de certains neurones tout en induisant des perturbations intestinales. Il permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de la PBM abdominale administrée précocement pour prévenir ou limiter les altérations de la MP induites par des facteurs environnementaux. 2) Un modèle génétiquement modifié, exprimant une des mutations génétiques humaines présente dans une forme familiale de la MP. Ce modèle présente un avantage majeur pour l’étude des stades précoces (avant l’apparition des symptômes moteurs) de la maladie. Sa cinétique lente offre un cadre privilégié pour tester l’efficacité préventive de la PBM abdominale, visant à moduler la flore intestinale dans le but de retarder ou empêcher l’installation de la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de la flore intestinale dans le développement de la maladie de Parkinson, d’identifier d’éventuels effets secondaires de la photobiomodulation et d’optimiser la fenêtre thérapeutique avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Ces travaux permettront à la fois de renforcer nos connaissances sur la maladie de Parkinson tout en favorisant l’émergence d’un nouveau traitement pour les patients.
Procédures
Toutes les souris seront entraînées progressivement à entrer et rester pendant 3 minutes dans un système de contention en vue d’être traitées par photobiomodulation. L’abdomen des souris qui recevront le traitement, sera exposé pendant 3 minutes à une lumière rouge puis infrarouge de faible intensité tous les jours pendant 4 semaines minimum et 8 semaines maximum pour le modèle exposé à un pesticide et 5 jours par semaine pendant 16 mois pour le modèle génétique. Pour exposer les souris au pesticide, celles-ci seront opérées sous anesthésie générale avec administration d’antalgique afin de placer sous la peau de leur dos, une mini-pompe qui délivrera le produit en faible quantité sur 4 semaines. Les fonctions motrices des souris seront évaluées à l’aide de 3 tests moteurs avant et pendant l’exposition au pesticide et tous les mois à partir de l’âge d’apparition des troubles moteurs (11 mois) pour le modèle génétique. Des tests olfactifs pourront être effectués tous les 6 mois pour le modèle génétique. Afin de déterminer si les souris présentent des troubles gastrointestinaux, elles seront entraînées pendant 3 jours à boire volontairement différentes substances. Dans le cas où cette procédure échouerait, l’administration se fera par gavage. Avant chaque test gastrointestinal, les souris pourront être mises à jeun pendant 4h. Pour évaluer le temps de transit, elles boiront un mélange contenant un pigment rouge et seront ensuite isolées dans des cages jusqu’à l’apparition d’une selle rouge ou pour une durée maximum de 8h. Pour évaluer la perméabilité intestinale, les souris boiront un mélange contenant une substance fluorescente. Quelques heures plus tard, un prélèvement sanguin (maximum 5 minutes) sera effectué soit en vigile dans un système de contention soit sous anesthésie générale. Pour récolter les selles et évaluer la constipation, les souris seront placées dans des cages individuelles sans eau ni nourriture pendant 1h. Les tests gastrointestinaux seront réalisés deux fois avant la chirurgie puis toutes les semaines après la chirurgie pour le modèle utilisant le pesticide ; et tous les 3 mois pour le modèle génétique. Une IRM d’une durée d’une heure pourra être réalisée une fois sous anesthésie générale pour toutes les souris. Pour évaluer la vidange gastrique, les souris seront mises à jeun une fois pendant 12h puis placées dans des cages individuelles avant d’être replacées dans leur cage d’origine avec leurs congénères.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont les suivants : • Le placement des souris dans un système de contention pendant 3 minutes peut provoquer un stress aigu ce qui pourra affecter temporairement leur bien-être physiologique et comportemental. • L’anesthésie des animaux peut entraîner du stress et des effets physiologiques transitoires notamment lors de l’induction et du réveil. • Pour les animaux opérés, l’implantation d’une pompe en sous-cutanée peut engendrer du stress, un inconfort, une faible perte de poids, de la douleur temporaire et un risque d’infection et d’inflammation au site d’incision. • Les tests gastrointestinaux nécessiteront l’isolement des animaux (8h maximum), des restrictions alimentaires pouvant aller jusqu’à 12h, et une administration de substances par boisson volontaire qui pourront entraîner du stress, des modifications physiologiques et comportementales chez les souris. Dans le cas où les souris refuseraient de boire volontairement les substances proposées, elles seront gavées ce qui pourra provoquer du stress, de l’inconfort, et occasionner des douleurs et blessures. • Le prélèvement sanguin peut provoquer une douleur aiguë mais brève ainsi qu’un stress transitoire principalement lié à la contention et à la manipulation. • Les tests de comportement pourront induire un stress transitoire lié à la manipulation et à l’exposition à un environnement nouveau. • Concernant les souris transgéniques, les animaux développeront progressivement, à partir de l’âge de 12 mois, une réduction des fonctions locomotrices pouvant conduire à une paralysie.
Devenir
Afin de déterminer l’efficacité de la photobiomodulation au niveau cellulaire, notamment pour évaluer l’effet protecteur du traitement sur les neurones et les changements induits sur le microbiote intestinale, toutes les souris seront mises à mort en fin d’expérience afin de prélever en post mortem leur cerveau et leurs intestins.
Remplacement
Les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire sont essentielles pour étudier la photobiomodulation (l'utilisation de la lumière à des fins thérapeutiques). Elles permettent de contrôler précisément différents paramètres, comme la couleur de la lumière, son intensité, la durée d'exposition ou encore le type de cellules étudiées. Cela permet d'observer directement les effets de la lumière sur les cellules, sans les nombreuses influences qui existent dans un organisme vivant. Des études précédentes réalisées sur des cellules intestinales et des bactéries du microbiote intestinal ont permis de déterminer les réglages de lumière les plus efficaces pour réduire l'inflammation et aider le microbiote à mieux résister au stress. Ces travaux ont également amélioré notre compréhension des interactions entre les cellules de l'intestin et les bactéries qui y vivent. Dans notre étude, qui s'intéresse aux liens entre l'intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson, l'utilisation de modèles animaux est nécessaire. En effet, ils permettent d'étudier les échanges complexes entre le cerveau et le microbiote intestinal, qui ne peuvent pas être reproduits avec de simples cultures cellulaires. Grâce aux connaissances obtenues lors des études en laboratoire, les modèles animaux permettront d'évaluer si les effets de la photobiomodulation sur l'intestin et le microbiote peuvent aussi avoir un impact sur le comportement, les capacités motrices, le fonctionnement du cerveau et la santé intestinale dans le contexte de la maladie de Parkinson. À l'heure actuelle, les modèles animaux restent les seuls outils permettant d'évaluer de manière globale l'efficacité d'un traitement sur les symptômes moteurs et non moteurs d'une maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un logiciel de statistique afin qu’il soit réduit au minimum tout en permettant de pouvoir observer un effet significatif du traitement.
Raffinement
Afin de réduire le stress lié au maintien des animaux dans un système de contention pour le traitement par photobiomodulation, les animaux seront habitués progressivement sur une semaine à entrer et rester de plus en plus longtemps, jusqu’à 3 minutes maximum, dans le système de contention. Pour l’implantation de la pompe, les animaux recevront un antalgique avant l’anesthésie générale. Pour prévenir toute baisse de température, les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et ce jusqu’au réveil sous une surveillance continue. Les animaux seront surveillés étroitement pendant 3 jours suivant la chirurgie et l’état général des animaux sera évalué selon une grille de score. Le traitement antalgique pourra être prolongé si besoin. Pour les tests de comportement, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation et à la pièce d’expérimentation afin de réduire au maximum tout stress occasionné. L’administration de substances guidée par micropipette sera précédée d’une période d’entraînement sur 3 jours afin que les souris apprennent à boire volontairement les solutions proposées pour les tests gastrointestinaux. Pendant les restrictions alimentaires et l’isolement des animaux, une surveillance attentive des animaux sera effectuée. Avant la mise à mort des souris, celles-ci recevront un antalgique puis seront soumises à une anesthésie générale. Les traitements antalgique et anesthésique se feront dans une pièce différente de la salle d’hébergement et d’euthanasie pour réduire et éviter la transmission d’un stress aux autres animaux. Un mois avant l’apparition des troubles moteurs, soit à partir de l’âge de 11 mois, l’état clinique des souris transgéniques sera évalué toutes les semaines à l’aide d’une grille de score afin de prévenir toutes souffrances.
Choix des espèces
La souris a une grande proximité génétique et biologique avec l’être humain, notamment au niveau des circuits nerveux impliqués dans la maladie de Parkinson. Environ 85 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, ce qui permet de reproduire certaines mutations responsables de la pathologie et d’observer leurs effets sur le cerveau. Les modèles de souris, qu’ils soient génétiques ou induits par des toxiques, reproduisent des caractéristiques essentielles de la maladie, notamment la dégénérescence de certains neurones et les troubles moteurs et non-moteurs. Par ailleurs, la souris est particulièrement adaptée à l’étude du microbiote intestinal, car sa flore intestinale peut être contrôlée, modifiée ou même remplacée, ce qui permet d’analyser précisément l’influence du microbiote sur l’inflammation et la communication entre l’intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson. Pour le modèle avec le pesticide, les souris utilisées seront adultes et auront entre 2 et 5 mois. La maladie de Parkinson touchant uniquement les adultes, l’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour reproduire les mécanismes de la maladie liés à l’âge et évaluer l’efficacité ainsi que la tolérance de la photobiomodulation dans un contexte biologique comparable à celui des patients. Les souris transgéniques seront utilisées entre l’âge de 1 et 17 mois car elles développent des troubles gastrointestinaux dès l’âge de 2 mois et le traitement par photobiomodulation doit commencer au moins un mois avant l’apparition des troubles gastrointestinaux pour pouvoir évaluer son effet préventif.
Développement d’un modèle murin de cancer colorectal métastatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Deux chirurgies sous anesthésie gazeuse, l'une pour greffer des cellules cancéreuses dans l'intestin, l'autre pour retirer le caecum, ouvrent un protocole qui se poursuit par des prélèvements sanguins hebdomadaires. 640 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement des organes, dans des procédures que le porteur classe en niveau de souffrance modéré. Le projet compare quatre techniques d'implantation de cellules tumorales afin de retenir la plus reproductible, avant tout usage thérapeutique. Entre huit et douze semaines après la greffe, le porteur annonce des douleurs au ventre, une perte de poids, des diarrhées ou des traces de sang, une grande fatigue et des difficultés respiratoires liées aux métastases, tout en maintenant le classement en souffrance modérée.
Objectifs
Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer en France, avec environ 17 000 morts chaque année. Il débute dans le côlon et peut se propager à d’autres organes, comme le foie ou les poumons, lorsque la maladie n’est pas détectée ou traitée suffisamment tôt. À ce stade métastatique, le pronostic reste défavorable malgré les progrès des traitements. Pour mieux comprendre l’évolution de ce cancer et tester de nouvelles thérapies, des modèles expérimentaux chez la souris sont indispensables. Toutefois, les modèles actuels manquent parfois de fiabilité et de reproductibilité, notamment pour la formation des métastases. L’objectif de ce projet est de développer un modèle murin robuste et reproductible de cancer colorectal métastatique capable de reproduire les principales étapes observées chez l’Homme, de la tumeur intestinale initiale jusqu’à la dissémination de cellules tumorales vers des organes distants. Quatre méthodes d’implantation de cellules tumorales dans l’intestin de la souris seront comparées afin d’identifier la plus efficace et la plus reproductible. Différents types de cellules tumorales seront utilisés, chez des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel. Une fois validé, ce modèle servira d’outil de référence pour de futurs projets, permettra de limiter l’utilisation d’animaux et facilitera le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer colorectal métastatique.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre au point un modèle de cancer du côlon métastatique chez la souris, qui se rapproche le plus possible de la maladie observée chez l’homme. Il permettra de mieux comprendre comment l’environnement qui entoure la tumeur influence son apparition, sa croissance et sa propagation vers d’autres organes. Ces recherches pourraient aussi aider à identifier des indicateurs biologiques permettant de mieux suivre l’évolution de la maladie. Ce projet est important car on ne comprend pas encore bien comment le cancer colorectal se propage dans le corps. Les possibilités de traitement sont limitées lorsque la maladie atteint un stade avancé. Ces recherches sont donc essentielles pour améliorer les soins proposés aux patients.
Procédures
Les animaux subiront une première intervention chirurgicale pour la transplantation de cellules cancéreuses et une deuxième intervention chirurgicale pour retirer le caecum. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse (moins de 25 minutes). Ils recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l’anesthésie, 8h après l’intervention et deux doses le lendemain (à 8h d’intervalle). Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure. Les différents gestes seront compris entre 20 et 90 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress temporaire lors de leur manipulation et de l’anesthésie. Après l’intervention chirurgicale, une douleur passagère peut apparaître, comme après toute opération, avec un faible risque de complications locales (irritation ou infection de la zone opérée). Les effets sur les animaux peuvent évoluer avec le temps : • 4 à 8 semaines après l’intervention : Les animaux peuvent être légèrement gênés. Ils peuvent être un peu moins actifs, avoir un pelage moins bien entretenu et montrer une discrète difficulté à se déplacer, liée au début du développement de la tumeur dans l’intestin. • 8 à 12 semaines après l’intervention : La gêne peut devenir plus importante. Les animaux peuvent ressentir des douleurs au ventre, perdre du poids, présenter des troubles digestifs (comme des diarrhées ou des traces de sang), être très fatigués, moins réactifs et se déplacer plus difficilement. La maladie peut se propager à d’autres organes, comme le foie ou les poumons, des difficultés respiratoires ou des signes de mal-être général peuvent apparaître dans les phases les plus avancées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse post mortem.
Remplacement
Ce projet vise à développer un modèle murin du cancer colorectal métastatique, afin de mieux comprendre la progression d’une tumeur vers un stade métastatique. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser des organismes vivants complets, car ils possèdent l’ensemble des interactions naturelles présentes dans un corps (circulation sanguine, système immunitaire, environnement cellulaire complexe…). Les modèles murins utilisés dans ce projet reproduisent de manière fidèle la formation de métastase. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces modèles animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.
Réduction
Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous commencerons par la méthode qui est moins invasive. Si elle fonctionne, les méthodes plus lourdes ne seront pas utilisées, ce qui réduira encore le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Après la chirurgie, les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise. En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.
Choix des espèces
Ce projet nécessite un modèle animal proche de l’humain sur le plan physiologique. Pour mener ces recherches, deux types de souris sont utilisés de façon complémentaire. Des souris au système immunitaire intact sont nécessaires pour comprendre comment les défenses naturelles de l’organisme influencent le développement des tumeurs. En parallèle, des souris dont le système immunitaire est affaibli sont indispensables pour pouvoir étudier des tumeurs humaines implantées chez l’animal. L’association de ces deux approches permet de mieux comparer les situations et d’obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe chez l’être humain. Les animaux seront utilisés à partir de 2-3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g.
Étude de l’effet de l’insufflation intra-abdominale de dioxyde de carbone (CO₂) sur l’inflammation générale et cérébrale dans un modèle d’entérocolite (inflammation sévère de l’intestin) chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Nourris par une sonde introduite par la bouche jusqu'à l'estomac, matin et soir du 3e au 7e jour de vie, avec un lait contenant une substance qui provoque une inflammation intestinale, 432 souriceaux subissent aussi trois passages quotidiens de dix minutes dans une chambre où l'oxygène est abaissé de 21 à 5 %. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, avec douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l'état général et décès parmi les effets attendus. Certains reçoivent au 6e jour une insufflation de dioxyde de carbone dans l'abdomen, que le porteur décrit comme réalisée sous anesthésie générale afin qu'ils ne ressentent aucune douleur, tout en signalant une perforation d'organe suivie du décès et une perforation possible de l'œsophage lors du passage de la sonde. Des tests comportementaux sont annoncés au 30e et au 45e jour de vie, sans que le document précise lesquels. Tous sont tués, à 8 jours pour prélever intestins, cerveaux, sang, foie et rate, à 50 jours pour prélever les cerveaux.
Objectifs
L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est une maladie grave de l’intestin du nouveau-né prématuré, correspondant à une inflammation sévère pouvant abîmer voire détruire une partie de l’intestin. Elle est responsable d’un état inflammatoire général prolongé avec un risque élevé de complications et de décès (15–30 %). Elle peut également avoir des effets sur le développement cérébral. En effet, elle est associée à une augmentation de la survenue de troubles du neurodéveloppement (TND) sans que l’on ne comprenne encore pourquoi. Les troubles du neurodéveloppement regroupent plusieurs difficultés liées au développement du cerveau pendant l’enfance et peuvent inclure par exemple des difficultés pour apprendre, se concentrer, communiquer ou interagir avec les autres. L’hypothèse principale pour expliquer ces séquelles neurologiques est que l’inflammation due à l’entérocolite perturberait le développement du cerveau chez ces nouveau-nés très fragiles. Le traitement de l’ECUN repose initialement sur les antibiotiques et la mise au repos de l’intestin (mise à jeûn). Si l’intestin se perfore ou si l’état du nouveau-né s’aggrave malgré ce traitement, une opération devient nécessaire. La chirurgie se fait classiquement par laparotomie, c’est-à-dire par une large ouverture abdominale. Une technique plus récente et moins invasive peut être utilisée. Il s’agit de la coelioscopie néonatale. Il s’agit d’une technique chirurgicale peu invasive. Elle consiste à faire de petites incisions dans le ventre pour introduire une caméra et des instruments. Le ventre est légèrement gonflé avec un gaz (le dioxyde de carbone) afin de créer de l’espace et permettre de voir et d’explorer les organes. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les études ont montré une diminution significative de l’inflammation chez les nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie. L’hypothèse est l’effet anti-inflammatoire du CO2 insufflé lors de la cœlioscopie et son interaction directe avec l'intestin. Notre projet de recherche a pour objectif d’étudier l’effet anti inflammatoire et notamment neuroprotecteur de l’insufflation intra-abdominale de CO2 sur un modèle d’entérocolite chez la souris. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des entérocolites des nouveau-nés prématurés, et sur leur pronostic.
Bénéfices attendus
Un enfant né prématuré sur trois aura des TND. La survenue de ces troubles est plus fréquente en cas d’ECUN associée. En effet, plus de 50% des nouveau-nés prématurés avec ECUN auront un trouble du neurodéveloppement. Les effets de l’entérocolite sur le cerveau des nouveau-nés n’ont pas encore été élucidés. Avec ce projet, nous cherchons à comprendre d’une part l’association entre TND et entérocolite en étudiant l’impact de l’inflammation sur le développement du cerveau des nouveau-nés. Nous cherchons à comprendre d’autre part la baisse de l’inflammation et la meilleure évolution des nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie, qui ont été constaté chez les patients. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les résultats de nos expériences précliniques, s’ils s’avèrent positifs, constitueraient un pré requis indispensable à la généralisation de l’exploration coelioscopique chez les nouveau-nés atteints d’ECUN. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des ECUN, et sur leur pronostic à court et long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’intervention : - Une alimentation par une fine sonde orogastrique (fin tube introduit par la bouche, jusqu'à l'estomac) avec une solution lactée matin et soir du 3ème au 7ème jour de vie. La composition de la solution lactée diffère entre les groupes. Certains souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire. D’autres souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire contenant une substance qui provoque de l’inflammation intestinale (Dextran Sodium Sulfate). Cela permet de reproduire, chez la souris, une entérocolite similaire à celle observée chez les nouveau-nés prématurés. - Un maintien pendant 10 minutes trois fois par jour du 3ème au 7ème jour de vie dans une chambre avec une concentration en oxygène abaissée de 21 à 5%. - Au 6ème jour de vie, certains souriceaux auront une insufflation de CO2 dans l’abdomen, c’est à dire qu’ils recevront une faible quantité de gaz dans la cavité abdominale à l’aide d’un très fin tube. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le gaz sera administré pendant 10 minutes avec une pression très faible et contrôlée. Chaque souris concernée recevra cette intervention une seule fois. - Une IRM cérébrale sera réalisée sur chaque souris autour du 40ème jour de vie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale pour obtenir une immobilité parfaite.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent tout d’abord subir un stress temporaire lors : des manipulations, de la séparation ponctuelle avec la mère chez les souriceaux, des tests comportementaux, et du transport des animaux vers les salles d’expérimentation. Ils peuvent ensuite être sujets aux symptômes d’entérocolite : douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l’état général, décès. L’administration du lait par voie orogastrique (sonde introduite par la bouche jusqu’à l’estomac) présente également des risques : l’introduction de cette sonde peut entrainer un stress et un inconfort liés au passage de la sonde et à la contention. Dans de rares cas des complications peuvent survenir, comme une fausse route ou une perforation de l’œsophage. De plus, bien que cela reste exceptionnel, une perforation d’organe suivi du décès peut survenir lors de l’introduction du petit tube d’insufflation de CO2. Pour finir, ils présentent un risque de décès provoqué par les produits anesthésiants lors des procédures réalisées sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires post-mortem : - A l’âge de 8 jours : prélèvement des intestins pour caractériser l’entérocolite, des cerveaux pour analyse de l’architecture cérébrale et des conséquences cérébrales de l’inflammation, du sang, du foie et de la rate pour caractériser l’inflammation. - A l'âge de 50 jours : prélèvement des cerveaux pour caractériser l’architecture cérébrale.
Remplacement
Les effets de cette maladie sur le cerveau et sur le système de défense du corps ne peuvent pas être étudiés correctement sans utiliser un animal entier. Il n’est pas possible de tester cette approche uniquement sur des cellules en laboratoire ou à l’aide d’un logiciel, car ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie. La souris est un animal souvent utilisé en recherche médicale pour les modèles d'entérocolite. Elle permet d’étudier cette maladie de manière fiable, car son organisme réagit d’une façon comparable et adaptée à ce type d’étude.
Réduction
Le modèle de maladie utilisé a été mis au point pour provoquer des lésions de l’intestin tout en limitant la gravité de l’état des jeunes souris, permettant de limiter la souffrance et de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Une surveillance au minimum quotidienne est mise en place afin d’apprécier l’état des souriceaux. Plusieurs examens sont réalisés sur les mêmes animaux au cours de l’étude, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations tout en limitant le nombre total de souris nécessaires. Le nombre de souris est réduit au strict nécessaire à l’obtention de résultats fiables.
Raffinement
Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et autorisé. Cela concerne notamment l’alimentation des jeunes souris à l’aide de la sonde, l’anesthésie, les insufflations dans l’abdomen. Les animaux sont hébergées dans des conditions adaptées à leur bien-être : alternance jour/nuit régulière, température stable, eau et nourriture à volonté. Les cages contiennent du papier doux pour leur permettre de construire un nid. Les mères et leurs petits ne sont pas dérangés avant le troisième jour de vie. Lors des manipulations, la séparation est la plus courte possible et les petits sont maintenus au chaud avant d’être replacés auprès de leur mère. Pendant la période où la maladie est provoquée, les animaux sont observés deux fois par jour (poids, comportement, état général). Des règles précises sont suivies pour décider si un animal doit être euthanasié plus tôt afin d’éviter toute souffrance inutile. L’administration du gaz dans l'abdomen est réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Le matériel utilisé permet de délivrer une pression très faible, adaptée à la taille des jeunes souris. Les animaux sont surveillés en permanence pendant et après l’anesthésie. Les tests de comportement sont réalisés dans une salle calme. Les animaux sont d’abord habitués à l’environnement et sont manipulés avec douceur.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux d’ECUN, le rongeur est largement utilisé dans la littérature. Plusieurs études sur les conséquences de l’insufflation du CO2 chez la souris ont été publiées précédemment. L’insufflation de CO2 intra-abdominale chez la souris est facilement réalisable, reproductible et ne nécessite qu’un seul point de ponction. Notre modèle d’entérocolite est induit chez des souriceaux du 3ème au 7ème jour de vie car ils ont à cet âge, un développement cérébral comparable à celui d’un nouveau-né prématuré. Les tests comportementaux sont réalisés pendant la période de l’acquisition motrice puis plus tard au 30ème et 45ème jours de vie correspondant aux périodes d’adolescence et de jeune adulte, à la recherche de troubles du neurodéveloppement.
Evaluation préclinique de l’efficacité d’inhibiteurs de protéases dans des modèles d’hypersensibilité viscérale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un cathéter est implanté dans le côlon de 800 rats sous anesthésie, puis des substances leur sont administrées une à deux fois par jour pendant dix à quatorze jours, avant des mesures de distension colorectale menées sur animal vigile. Les procédures impliquent un niveau de souffrance qui va de léger à sévère, et le porteur y attend des réponses douloureuses aiguës, une diarrhée possible et des signes d'inconfort abdominal. Le texte annonce pourtant que l'approche sera testée chez la souris, alors qu'aucune souris ne figure au projet et que les 800 rats en constituent l'effectif entier. Tous sont tués à la fin de chaque procédure pour prélever des tissus et des organes.
Objectifs
Nos recherches suggèrent qu’une des causes possibles de ces douleurs est une enzyme produite en quantité anormalement élevée dans l’intestin chez certains patients. Cette enzyme, fabriquée par les cellules qui tapissent la paroi intestinale, peut stimuler les nerfs sensoriels et rendre l’intestin plus sensible à la douleur. Pour agir sur ce mécanisme, nous avons développé une molécule capable de bloquer spécifiquement cette enzyme. Afin qu’elle agisse directement à l’endroit souhaité, nous souhaitons l’intégrer dans une microcapsule conçue pour résister au passage dans l’estomac puis se fixer sur la muqueuse intestinale afin de libérer le traitement au plus près de la paroi de l’intestin. Nous testerons ensuite cette approche chez la souris dans des modèles reproduisant une hypersensibilité intestinale, c’est-à-dire une sensibilité exagérée à la douleur digestive. Si le traitement permet de diminuer cette douleur, cela constituerait une première étape importante vers le développement d’une nouvelle solution pour soulager les douleurs persistantes chez les patients atteints de MICI
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré le contrôle de l’inflammation et l’entrée en rémission, 30 à 50 % des patients continuent de souffrir de douleurs abdominales persistantes liées à une hypersensibilité viscérale, pour lesquelles les options thérapeutiques restent limitées. Les bénéfices scientifiques attendus à court terme concernent une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette douleur persistante, notamment le rôle d’une protéase surexprimée chez les patients atteints de maladie de Crohn en rémission. Le projet permettra également de caractériser son implication dans l’activation des voies sensorielles intestinales et dans l’installation de l’hypersensibilité viscérale. Cette étude permettra par ailleurs d’évaluer une stratégie thérapeutique innovante basée sur l’administration locale d’un inhibiteur sélectif de cette protéase, formulé sous une forme permettant une délivrance ciblée au niveau de l’épithélium intestinal. Les travaux fourniront des données précliniques essentielles sur l’efficacité de cette approche dans des modèles d’hypersensibilité viscérale. À moyen et long terme, les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées à améliorer la prise en charge des douleurs persistantes chez les patients atteints de MICI en rémission, répondant ainsi à un besoin médical actuellement insuffisamment couvert. Le recours au modèle animal est nécessaire dans ce projet afin d’évaluer l’effet du traitement dans un organisme entier intégrant les interactions complexes entre l’épithélium intestinal, les systèmes nerveux et les mécanismes physiologiques impliqués dans la perception de la douleur, qui ne peuvent actuellement pas être reproduits intégralement par des méthodes alternatives in vitro.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique consistant en l’implantation d’un cathéter au niveau du côlon proximal sous anesthésie générale, avec analgésie péri- et post-opératoire. La durée de l’intervention est d’environ 30 à 60 minutes, suivie d’une période de récupération de 3 jours avant début des administrations. Les animaux recevront des administrations répétées via le cathéter pendant 10 à 14 jours (1 à 2 fois/jour), ainsi que des traitements expérimentaux principalement par voie orale, et selon les besoins par voies intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intracolique. Les traitements sont administrés pendant 7 à 14 jours (1 à 2 fois par jour). Les mesures de sensibilité viscérale sont réalisées chez l’animal vigile : au minimum 2 mesures ou des mesures répétées chaques jours selon le protocole. Les animaux sont suivis cliniquement (état général, comportement, poids) pendant toute la durée des procédures. L’euthanasie est réalisée à la fin de chaque protocole avec prélèvements de tissus pour analyses.
Impact sur les animaux
Procédure 1: Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’intervention chirurgicale et aux manipulations intestinales. Ils peuvent inclure : douleur et inconfort post-opératoires transitoires, inflammation locale au site d’implantation du cathéter, risque d’infection ou de désunion des sutures, ainsi qu’une diminution temporaire de l’activité et de l’appétit. Des troubles digestifs (diarrhée, modification de la consistance des selles) peuvent également être observés en lien avec les administrations intracoliques de la molécule. Procédure 2: Les effets indésirables attendus sont liés à l’induction pharmacologique et aux mesures de distension colorectale chez l’animal vigile. Ils incluent une hypersensibilité viscérale transitoire, des signes d’inconfort abdominal (contractions, agitation), une possible diarrhée aiguë, ainsi qu’un stress lié aux manipulations et à la contention. Lors des distensions colorectales, des réponses douloureuses aiguës peuvent être observées
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés.
Remplacement
La douleur abdominale étudiée dans ce projet résulte de mécanismes complexes impliquant à la fois le système nerveux de l’intestin, le système nerveux central et certains médiateurs biologiques. Elle se traduit par une sensibilité accrue à des stimulations mécaniques de l’intestin et par des comportements de douleur qui nécessitent une intégration de l’ensemble de l’organisme. L’évaluation de cette douleur repose sur des réponses globales de l’animal (réactions comportementales et sensibilité à la distension de l’intestin), qui ne peuvent pas être reproduites dans des systèmes cellulaires ou des modèles simplifiés. En effet, ces approches ne permettent pas de prendre en compte les interactions entre l’intestin, le système nerveux et les comportements de douleur. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier ces mécanismes dans un organisme complet et évaluer l’effet de nouvelles stratégies visant à réduire la douleur abdominale dans un contexte physiologique réaliste.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été déterminé afin de concilier la robustesse statistique des résultats et la limitation du recours aux animaux. Il repose sur l’expérience acquise avec ces modèles expérimentaux ainsi que sur les données disponibles dans la littérature. Les protocoles sont conçus pour optimiser l’utilisation de chaque animal. Dans chaque modèle, la comparaison avant/après traitement chez un même individu permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre total d’animaux nécessaires. Le suivi longitudinal des réponses chez un même animal contribue également à limiter le recours à des groupes supplémentaires. Les plans expérimentaux incluent des analyses statistiques adaptées permettant d’exploiter au maximum les données générées et d’éviter les répétitions inutiles. Lorsque cela est possible, les groupes témoins sont mutualisés entre expériences réalisées dans des conditions comparables. Une analyse rétrospective des résultats sera réalisée afin d’évaluer la variabilité observée et d’ajuster, si nécessaire, les effectifs utilisés dans les études futures dans une démarche d’amélioration continue.
Raffinement
Toutes les procédures ont été conçues afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les animaux sont habitués aux manipulations et aux dispositifs expérimentaux avant le début des procédures afin de réduire le stress lié à la contention et aux interventions. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, de manière à minimiser la durée et l’inconfort associés. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale est utilisée, complétée par une analgésie péri- et post-opératoire systématique ainsi qu’une anesthésie locale au site d’incision. Une surveillance rapprochée est mise en place en période post-opératoire et des soins de support sont administrés si nécessaire. Les administrations de substances sont réalisées en limitant les volumes et la fréquence des injections ou gavages, conformément aux recommandations en vigueur. Les techniques utilisées sont choisies afin de réduire l’inconfort lié aux voies d’administration. Les procédures sont interrompues immédiatement en cas de signes de détresse ou d’inconfort important. L’hébergement et l’environnement des animaux sont adaptés avec enrichissement, maintien des interactions sociales lorsque possible, et mesures de soutien (alimentation adaptée, hydratation, réchauffement) mises en place en cas de besoin. Les animaux font l’objet d’une surveillance clinique régulière permettant d’adapter rapidement la prise en charge en cas de signes d’inconfort ou de dégradation de l’état général.
Choix des espèces
Le rat est communément utilisé dans les modèles de douleur viscérale. Nous utiliserons des rats âgés d’au moins 6 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures.
Impact d’une supplémentation en levures vivantes en pré-sevrage chez le veau en système allaitant sur le développement et la maturation du rumen, les performances et la santé (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour tester un bolus de levures vivantes destiné aux élevages allaitants, 34 jeunes veaux mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué à l'issue. Ils subissent des prélèvements de jus de rumen par sonde gastro-œsophagienne, deux endoscopies avec biopsie de la paroi du rumen, des fouilles rectales, une tonte du flanc et des prises de sang à la veine caudale, réparties sur huit sessions autour du sevrage. Le porteur situe la retombée dans des "recommandations pratiques aux éleveurs" et des valorisations scientifiques et techniques, si le bolus prépare mieux le jeune au stress du sevrage. Ce résumé est le second de deux volets portant le même intitulé et déclarant chacun 34 veaux pour le même protocole, sans que le lien entre les deux soit explicité.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d'étudier l'intérêt d'une supplémentation en levures vivantes probiotiques autour du sevrage pour favoriser le développement du microbiote commensal et fonctionnel dans le tube digestif et ainsi de stimuler le développement des papilles ruminales et leur fonctionnalité. Au-delà des effets au niveau de la sphère digestive, un impact bénéfique sera recherché sur la limitation du stress au sevrage et sur la croissance et l'efficacité alimentaire en post-sevrage. Ce projet est multisite et se déroulera sur 2 sites différents distants de 32 km. Le changement de site se fera le jour du sevrage.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces investigations permettra d’approfondir notre connaissance, encore très limitée, sur l’impact des stress de sevrage (séparation maternelle, changement d’alimentation) et de changement de lieux d’hébergement chez des veaux sous la mère. Le suivi longitudinal des animaux permettra de caractériser les effets du sevrage sur la stabilité du microbiote digestif (ruminal et fécal), l’impact de celui-ci sur le développement du rumen et sur sa fonctionnalité, et de mesurer les conséquences potentielles sur le comportement, la santé et la performance des jeunes taurillons. L’étude permettra d’apporter également des informations uniques sur le développement des papilles ruminales grâce à l’utilisation de l’endoscope. Si la stratégie de supplémentation en levures vivantes probiotiques via un bolus nutritionnel permettait de mieux « préparer » le jeune au stress du sevrage grâce à un écosystème ruminal plus stable et performant et une meilleure maturation du rumen, l’étude pourrait conduire à des valorisations scientifiques et techniques ainsi qu’à des recommandations pratiques aux éleveurs.
Procédures
Dans ce projet, les veaux seront soumis à six types de prélèvements : prélèvement gastro-oesophagien, prélèvement de fèces, prise de sang, endoscopie avec prélèvements de papilles ruminales, écouvillonnage buccal et tonte de poils. Lorsque cela est possible, ces prélèvements seront réalisés le même jour afin de limiter le nombre de contentions et de réduire le stress associé aux manipulations répétées. Par ailleurs, un intervalle minimal de 10 jours sera respecté entre deux sessions de prélèvements, afin de permettre un rétablissement complet de l’animal. À l’exception de l’endoscopie, qui sera réalisée deux fois par animal. Les autres prélèvements seront effectués 3 fois au cours de la période pré-sevrage et cinq fois au cours de la période de post-sevrage du veau. La durée cumulée des interventions lors d’une même session n’excédera pas 10 minutes. En cas de dépassement ou de signes de mauvaise tolérance, les interventions seront immédiatement interrompues. Enfin, les volumes et quantités d’échantillons prélevés ont été définis en amont de manière à ne pas compromettre la santé, le bien-être ou la survie des animaux, conformément aux recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
L’étude prévoit plusieurs prélèvements à différents niveaux de sévérité notamment des prélèvements de jus de rumen (PGO) et des biopsies en classe modérée. Différents prélèvements relevant de procédures légères (fèces et sang) afin de caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des jeunes bovins (JB) à l’engraissement. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les prélèvements de fèces par défécation naturelle ou fouille rectale si besoin et le prélèvement de poils par tonte au niveau du flanc de l'animal. La prise de sang peut induire une douleur succinte. La prise de sang, la PGO et la fouille (si nécessaire) dureront maximum 3 minutes chacune. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagiens (PGO) et pourrait engendrer une irritation de l'oesophage. Les biopsies (J-5 et J+45) seront réalisées par un vétérinaire et pourraient engendrer une irritation de l’oesophage et de la paroi du rumen. Au total, les prélèvements n'excéderont pas 10 minutes. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation.
Devenir
Les 34 veaux seront maintenus en vie à l'issue de l'étude, sous réserve de l'autorisation du vétérinaire. Quatre d'entre eux réintégreront le circuit classique du premier élevage, tandis que les 30 autres poursuivront leur parcours au sein du deuxième élevage, où ils seront suivis durant leur phase d'engraissement.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant d’obtenir des données scientifiques sur la maturation du rumen du veau allaitant donc sur un processus dynamique qui est propre à chaque individu, et qui comprend l’analyse de différents compartiments digestifs, aucune solution de remplacement in vitro n’est adaptée pour ce projet.
Réduction
Des tests statistiques prenant en compte, la puissance statistique nécessaire de 75%, la variabilité individuelle entre les animaux (races pures et mixtes et âges de naissance étalés sur plusieurs semaines) de 10% et le seuil de significativité fixé à 0.1, ont permis de déterminer à 15 le nombre minimal d'individus par lot pour générer des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les fouilles rectales pour les prélèvements de fèces ne seront réalisées que si les animaux ne défèquent pas naturellement au moment de la collecte. Les animaux seront habitués à chaque acte en mimant les différents prélèvements lors de contention. Cet entrainement sera réalisé 2 fois avant les prélèvements réels. Les prélèvements se feront de façon groupée dans la mesure du possible afin de ne pas multiplier les séquences de manipulation et de contention. L'utilisation de lubrifiant durant la PGO ou de la fouille rectale altère la qualité de l'échantillon. Cependant, lorsque la fouille rectale sera effectuée, les gants utilisés seront humidifiés pour faciliter le prélèvement. L'utilisation d'un lève-tête pour les PGO est systématique afin de limiter les risques de blessures pour l'animal et l'opérateur. Après chaque journée de prélèvements, les animaux seront suivis durant 5 jours pour détecter tout comportement anormal potentiellement induit par les prélèvements. Après le sevrage, lors du changement de site des animaux, ceux-ci auront une phase d'habituation à leur nouvel environnement et auront individuellement une inspection générale de leur état corporel. Le jour du sevrage, les veaux seront transportés dans une bétaillère adaptée, offrant une ventilation suffisante, un sol antidérapant et un espace adapté au nombre d'animaux. De plus, les veaux seront transportés en groupe, avec leurs congénères, afin de limiter le stress lié à l'isolement. Enfin, le transport sera effectué sur une courte distance (moins d'une heure) et nous réaliseront le transport tôt le matin afin de limiter le plus possible les périodes de fortes chaleurs.
Choix des espèces
Parmi les ruminants, l’espèce bovine est une espèce de choix pour étudier la dynamique de mise en place des fonctions ruminales dans les conditions de l’étude. Par ailleurs, un des objectifs de ce projet est d’étudier l’intérêt d’un probiotique distribué sous forme d’un bolus à libération lente permettant une efficacité potentielle prolongée pendant la période d’alimentation à l’herbe jusqu’au post sevrage. Les bovins ont été choisis car ils sont à la fois modèle et sujet de la recherche. Les animaux mobilisés seront des jeunes veaux mâles entre 50 jours avant sevrage et 120 jours après sevrage. La période autour du sevrage étant la cible de notre étude.
Rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
9 156 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune recevant par gavage une suspension bactérienne en trois minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur précisant que les animaux ne peuvent être "ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés" puisque l'objectif est de prélever l'estomac ou l'intestin. Il attend de l'infection gastrique aucune souffrance et de l'infection intestinale un inconfort léger épisodique, sur la foi de son expérience et de celle de ses collègues. Le même résumé annonce 9 156 souris au titre du "cas pessimiste" où chaque souche mutante et chaque temps d'observation feraient l'objet d'expériences indépendantes.
Objectifs
Le répertoire des récepteurs de l’immunité innée inclus des protéines capables de reconnaître virtuellement tous les différents composants de la paroi bactérienne. Cette détection de ces composants de paroi permet à l’hôte et aux bactéries d’établir une symbiose bénéfique aux deux partenaires. Cet équilibre est rompu dans le contexte d’une bactérie pathogène. De nombreux pathogènes ont développé des stratégies d’échappement à l’hôte en modifiant ou masquant leur surface au système immunitaire inné. Nous avons fait dans le passé la preuve de principe en étudiant certains mécanismes de modification de certains composants de la paroi bactérienne qui permettent au pathogène d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire inné de l’hôte. Néanmoins, il reste encore à découvrir beaucoup de nouveaux mécanismes de régulation de la paroi bactérienne permettant à des pathogènes d’échapper à la surveillance de l’hôte. Nous étudions ces mécanismes dans deux pathogènes du tractus gastrointestinal : responsable de pathologies gastriques sévères comme le cancer de l’estomac, et responsable de gastroentérites et souvent associé à des maladies chroniques inflammatoires de l’intestin. Ainsi, nous étudierons la capacité de souches mutantes pour des gènes impliqués dans la modification et/ou régulation de la paroi bactérienne à coloniser leur niche naturelle (estomac et intestin). Grâce à ces nouvelles connaissances, nous espérons pourvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces fonctions importantes pour la survie de ces deux pathogènes dans leur niche.
Bénéfices attendus
La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de l’homme. De plus, il existe un grand nombre de lignées murines mutantes, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité, permettant par la suite, en fonction des résultats obtenus sous ce projet, des études mécanistiques approfondies de la réponse immunitaire de la souris face à l’infection de l’estomac par l’une des bactéries étudiéesi. Ces nouvelles connaissances permettraient d’améliorer les stratégies vaccinales contre cette bactérie qui pour l’instant ne sont pas efficaces. De plus, le fait de se focaliser sur des mutants du métabolisme de la paroi chez cette bactérie nous pourrons identifier des cibles prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre cette bactérie. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme.
Procédures
L’administration des suspensions bactériennes par gavage sur animal vigile est très rapide (3 min par individu).
Impact sur les animaux
Le gavage entraine un inconfort et une douleur légère de courte durée. Suivant la littérature, l’infection de l’intestin par les souches pathogènes de l’une des 2 bactéries étudiées peut entrainer épisodiquement un inconfort léger de la souris avec de la diarrhée. Néanmoins, nous n’avons jamais observé avec nos souches de d’inconfort ou de diarrhée. Par contre, l’infection de l’estomac par l’autre bactérie étudiée n’entraine aucune souffrance pour la souris suivant notre expérience et celle de nos collègues nationaux et internationaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour toutes les procédures, l’objectif final est de prélever certains organes pour l’observation de la colonisation bactérienne de l’estomac ou de l’intestin. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts.
Remplacement
Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre à la question scientifique du rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence. Des systèmes cellulaires ou d’organoïdes ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire. De plus, avec ces systèmes in vitro, il y a absence complète de l’environnement complexe de : 1) l’estomac notamment l’acidité produite par les cellules pariétales qui ont un impact très fort sur la survie de l’une des 2 bactéries étudiée ; 2) de l’intestin, notamment, la production d’acides biliaires ou la compétition avec la flore commensale qui impactent fortement la capacité de l’autre bactérie étudiée à coloniser cette niche. Ainsi, le comportement de mutants dans des systèmes cellulaires ne reproduit pas le stress rencontrer dans le tractus gastrointestinal.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utiles à ce projet a été débattue avec les biostatisticiens. Nous utiliserons ici 9156 souris sur une période de 5 ans dans le cas pessimiste où chaque souche mutante et chaque temps d’observation ferait l’objet d’expériences indépendantes. Lorsqu’une expérience permettra l’observation de plusieurs mutants en même temps, ou de plusieurs temps avec une même souche mutante, un seul groupe contrôle sera produit.
Raffinement
Durant les deux semaines précédant toute expérimentation, les expérimentateurs rendront visite aux souris pour les habituer aux manipulations avant toute procédure expérimentale. Pendant le protocole, les expérimentateurs rendront visite tous les jours aux souris lors des deux premières semaines d’infection. Après les 15 premiers jours, si aucun signe visible de détresse est observé, les visites se feront deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. En cas de diarrhée, nous mettrons du gel hydrique dans les cages à dispositions des souris. En cas
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité des précédents projets menés au laboratoire. C’est le modèle pour lequel nous avons le plus d’outils moléculaires pour étudier la réponse de l’hôte à l’infection. De plus, nous avons à notre disposition des modèles murins génétiquement modifiés, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité qui permettrons une suite en cas de résultats intéressants avec certains des mutants à tester. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront âgées de 5 ou 6 semaines. Cet âge défini est basé sur nos précédents projets internes et externes qui ont fait appel au modèle murin.
Impact d’une supplémentation en levures vivantes en pré-sevrage chez le veau en système allaitant sur le développement et la maturation du rumen, les performances et la santé (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Encore sous la mère, 34 jeunes veaux mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent six types de prélèvements en cage de contention, dont un prélèvement de jus de rumen par sonde gastro-œsophagienne, deux endoscopies avec biopsie des papilles ruminales, et une fouille rectale si la défécation naturelle ne suffit pas. Le jour du sevrage, ils sont séparés de leur mère et transportés vers un second site distant de trente-deux kilomètres, le stress de ce double changement étant l'un des objets de l'étude. Aucun n'est tué à l'issue, quatre réintègrent le premier élevage et les trente autres poursuivent leur engraissement sur le second, le porteur les décrivant comme "à la fois modèle et sujet de la recherche".
Objectifs
L'objectif du présent projet est d'étudier l'intérêt d'une supplémentation en levures vivantes probiotiques autour du sevrage pour favoriser le développement du microbiote commensal et fonctionnel dans le tube digestif et ainsi de stimuler le développement des papilles ruminales et leur fonctionnalité. Au-delà des effets au niveau de la sphère digestive, un impact bénéfique sera recherché sur la limitation du stress au sevrage et sur la croissance et l'efficacité alimentaire en post-sevrage. Ce projet est multisite et se déroulera sur 2 sites différents distants de 32 km. Le changement de site se fera le jour du sevrage.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces investigations permettra d’approfondir notre connaissance, encore très limitée, sur l’impact des stress de sevrage (séparation maternelle, changement d’alimentation) et de changement de lieux d’hébergement chez des veaux sous la mère. Le suivi longitudinal des animaux permettra de caractériser les effets du sevrage sur la stabilité du microbiote digestif (ruminal et fécal), l’impact de celui-ci sur le développement du rumen et sur sa fonctionnalité, et de mesurer les conséquences potentielles sur le comportement, la santé et la performance des jeunes taurillons. L’étude permettra d’apporter également des informations uniques sur le développement des papilles ruminales grâce à l’utilisation de l’endoscope. Si la stratégie de supplémentation en levures vivantes probiotiques via un bolus nutritionnel permettait de mieux « préparer » le jeune au stress du sevrage grâce à un écosystème ruminal plus stable et performant et une meilleure maturation du rumen, l’étude pourrait conduire à des valorisations scientifiques et techniques ainsi qu’à des recommandations pratiques aux éleveurs.
Procédures
Dans ce projet, les veaux seront soumis à six types de prélèvements : prélèvement gastro-œsophagien, prélèvement de fèces, prise de sang, endoscopie avec prélèvements de papilles ruminales, écouvillonnage buccal et tonte de poils. Lorsque cela est possible, ces prélèvements seront réalisés le même jour afin de limiter le nombre de contentions et de réduire le stress associé aux manipulations répétées. Par ailleurs, un intervalle minimal de 10 jours sera respecté entre deux sessions de prélèvements, afin de permettre un rétablissement complet de l’animal. À l’exception de l’endoscopie, qui sera réalisée deux fois par animal. Les autres prélèvements seront effectués 3 fois au cours de la période pré-sevrage et cinq fois au cours de la période de post-sevrage du veau. La durée cumulée des interventions lors d’une même session n’excédera pas 10 minutes. En cas de dépassement ou de signes de mauvaise tolérance, les interventions seront immédiatement interrompues. Enfin, les volumes et quantités d’échantillons prélevés ont été définis en amont de manière à ne pas compromettre la santé, le bien-être ou la survie des animaux, conformément aux recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
L’étude prévoit des prélèvements à différents niveaux de sévérité notamment des prélèvements gastro-oesophagiens (PGO) et des biopsies en classe modérée. Différents prélèvements relevant de procédures légères (fèces et sang) sont prévus tout au long de l'essai pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des jeunes bovins (JB) à l’engraissement. Le prélèvement de jus de rumen, considéré comme une procédure modérée sera réalisé par prélèvement gastro-œsophagiens (PGO) et pourrait engendrer une irritation de l'œsophage. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les prélèvements de fèces par défécation naturelle ou fouille rectale si besoin et le prélèvement de poils par tonte au niveau du flanc de l'animal. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation. Les biopsies (J-5 et J+45 par rapport au sevrage) seront réalisées par un vétérinaire et pourraient engendrer une irritation de l’œsophage et de la paroi du rumen. La prise de sang, la PGO et la fouille (si nécessaire) dureront maximum 3 minutes chacune. Au total, les prélèvements n'excéderont pas 10 minutes. Les biopsies font l'objet d'une procédure de mise au point de méthode pour réduire le temps au minimum nécessaire. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation.
Devenir
Les 34 veaux seront maintenus en vie à l'issue de l'étude, sous réserve de l'autorisation du vétérinaire. Quatre d'entre eux réintégreront le circuit classique du premier élevage, tandis que les 30 autres poursuivront leur parcours au sein du deuxième élevage, où ils seront suivis durant leur phase d'engraissement.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant d’obtenir des données scientifiques sur la maturation du rumen du veau allaitant donc sur un processus dynamique qui est propre à chaque individu, et qui comprend l’analyse de différents compartiments digestifs, aucune solution de remplacement in vitro n’est adaptée pour ce projet.
Réduction
Des tests statistiques prenant en compte, la puissance statistique nécessaire de 75%, la variabilité individuelle entre les animaux (races pures et mixtes et âges de naissance étalés sur plusieurs semaines) de 10% et le seuil de significativité fixé à 0.1, ont permis de déterminer à 15 le nombre minimal d'individus par lot pour générer des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les fouilles rectales pour les prélèvements de fèces seront réalisées que si les animaux ne défèquent pas naturellement au moment de la collecte. Les animaux seront habitués à chaque acte en mimant les différents prélèvements lors de contention. Cet entrainement sera réalisé 2 fois avant les prélèvements réels. Les prélèvements se feront de façon groupée dans la mesure du possible afin de ne pas multiplier les séquences de manipulation et de contention. L'utilisation de lubrifiant durant la PGO ou de la fouille rectale altère la qualité de l'échantillon. Cependant, lorsque la fouille rectale sera effectuée, les gants utilisés seront humidifiés pour faciliter le prélèvement. L'utilisation d'un lève-tête pour les PGO est systématique afin de limiter les risques de blessures pour l'animal et l'opérateur. Après chaque journée de prélèvements, les animaux seront suivis durant 5 jours pour détecter tout comportement anormal potentiellement induit par les prélèvements. Après le sevrage, lors du changement de site des animaux, ceux-ci auront une phase d'habituation à leur nouvel environnement et auront individuellement une inspection générale de leur état corporel. Le jour du sevrage, les veaux seront transportés dans une bétaillère adaptée, offrant une ventilation suffisante, un sol antidérapant et un espace adapté au nombre d'animaux. De plus, les veaux seront transportés en groupe, avec leurs congénères, afin de limiter le stress lié à l'isolement. Enfin, le transport sera effectué sur une courte distance (moins d'une heure) et nous réaliseront le transport tôt le matin afin de limiter le plus possible les périodes de fortes chaleurs.
Choix des espèces
Parmi les ruminants, l’espèce bovine est une espèce de choix pour étudier la dynamique de mise en place des fonctions ruminales dans les conditions de l’étude. Par ailleurs, un des objectifs de ce projet est d’étudier l’intérêt d’un probiotique distribué sous forme d’un bolus à libération lente permettant une efficacité potentielle prolongée pendant la période d’alimentation à l’herbe jusqu’au post sevrage. La taille des animaux choisis est adéquate pour répondre à cet objectif. Les bovins ont été choisis car ils sont à la fois modèle et sujet de la recherche. Les animaux mobilisés seront des jeunes veaux mâles entre 50 jours avant sevrage et 120 jours après sevrage. La période autour du sevrage étant la cible de notre étude.
Etude de la capacité régénérative de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées chaque jour pendant deux semaines, puis recevant une injection destinée à provoquer une lésion de l'intestin, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées en fin de protocole pour analyse des tissus. Les dommages intestinaux entraînent diarrhées, inflammation, douleurs, déshydratation et perte de poids pendant cinq jours au plus, et le porteur signale qu'un mauvais positionnement de la sonde de gavage peut provoquer une détresse respiratoire imposant une mise à mort immédiate. L'objectif est d'observer la capacité de régénération de l'intestin chez des souris porteuses d'une hypercalcémie d'origine génétique, et de voir si une molécule en développement l'améliore. Ni la substance qui provoque la lésion ni celle administrée par voie orale ne sont nommées, et aucun seuil de mise à mort n'est chiffré pour un projet classé sévère.
Objectifs
Le maintien de l’équilibre du calcium dans l’organisme repose sur une régulation hormonale finement contrôlée principalement par le calcitriol, la forme active de la vitamine D. Une augmentation anormale des niveaux de calcitriol dans le sang peut conduire à des pathologies rares, chez l’enfant comme chez l’adulte, caractérisées par une accumulation excessive de calcium et de calcitriol dans l’organisme, communément nommée hypercalcémie liée à des excès de vitamine D. L’une des causes génétiques identifiées dans ces hypercalcémies est la perte de fonction du gène qui code une enzyme indispensable à la dégradation du calcitriol. En l’absence de cette dégradation, le calcitriol s’accumule, induisant une absorption excessive du calcium. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que les souris génétiquement modifiées permettant l’inactivation sélective de cette enzyme, reproduisent fidèlement le phénotype des patients comportant une hypercalcémie marquée. Nous avons identifié que ces souris présentent également des anomalies au niveau des cellules souches intestinales, essentielles au renouvellement régulier du tissu. En cas de lésion intestinale sévère, ces cellules entrent dans un programme de régénération qui va permettre de réparer le tissu. Pour étudier les mécanismes de réparation tissulaire dans un contexte pathologique lié à des excès de calcitriol et de calcium, nous utiliserons une substance permettant d’induire une lésion transitoire dans l’intestin, afin d’observer la capacité de régénération du tissu chez ces souris. En parallèle, une partie des souris seront injectée préalablement avec une molécule thérapeutique qui améliore grandement la pathologie, actuellement en cours de développement, pour déterminer si le processus de régénération de l’intestin est amélioré grâce à cette molécule.
Bénéfices attendus
Ces études permettront d’étudier le potentiel des cellules souches intestinales dans un contexte d’hypercalcémie liée à des excès de vitamine D, et de comprendre des activités encore peu connues de la vitamine D. De plus, à terme, ce projet pourrait contribuer à l'identification d'un potentiel traitement pour les maladies liées à des excès de calcitriol.
Procédures
Pendant deux semaines, les animaux recevront chaque jour une petite quantité d’une substance, administrée par la bouche. Cette substance a pour but d’améliorer l’hypercalcémie liée à des excès de vitamine D. Ces administrations sont courtes et généralement bien supportées par les animaux. À l’issue de ces 2 semaines, une injection sera réalisée afin d’induire une liaison intestinale. Sur l’ensemble du projet, 480 souris seront nécessaires. Toutes les manipulations seront effectuées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect du bien-être animal. Si, malgré ces précautions, un animal présentait des complications ou des signes de souffrance (ce qui reste exceptionnel), il serait immédiatement retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée afin d’éviter toute souffrance inutile.
Impact sur les animaux
L’induction des dommages intestinaux peuvent conduire à des diarrhées, de l’inflammation des douleurs, une déshydratation et une perte de poids de l’animal. Ce traitement durera un maximum de 5 jours. Les injections peuvent exceptionnellement causer des infections au niveau du site d’injection. L’administration par la bouche peut rarement conduire à une irritation. Le gavage peut amener à des erreurs de manipulation due à un mauvais positionnement de la sonde qui peut mener à une détresse respiratoire nécessitant une euthanasie immédiate. Les différentes administrations de traitement pourront éventuellement générer un stress chez l'animal ainsi qu'une douleur au niveau du site d'administration. Ces gestes sont effectués par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses de l'expression des gènes et des protéines).
Remplacement
Pour étudier comment l’intestin se répare dans certaines maladies liées à un excès de vitamine D et de calcium, il est nécessaire d’observer l’ensemble de l’organisme. En effet, plusieurs organes (comme les reins, le système immunitaire ou les os) interagissent entre eux et influencent ce processus. Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de manière fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’utilisation d’un animal vivant est donc indispensable pour comprendre ces mécanismes dans des conditions proches de la réalité. La souris est un modèle de référence en recherche, car son fonctionnement biologique et la structure de son intestin sont très proches de ceux de l’être humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les méthodes employées sont bien maîtrisées par l’équipe, ce qui permet de mener des expériences de qualité sans multiplier les animaux. Chaque souris sera utilisée pour plusieurs analyses, afin d’éviter toute utilisation inutile. Les résultats étant comparables chez les mâles et les femelles, les données pourront être regroupées. Les groupes seront toutefois composés à parts égales de mâles et de femelles afin de garantir un bon équilibre. Ainsi, seuls les animaux indispensables à la validité scientifique de l’étude seront inclus.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, dans des cages adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Elles seront surveillées régulièrement, notamment par l’observation de leur comportement et le suivi de leur poids. Si un animal présente des signes de déshydratation ou de malaise, des soins adaptés seront immédiatement mis en place. Les manipulations (administration des traitements) seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec des techniques conçues pour réduire au maximum l’inconfort et le stress. Si un animal montre des signes clairs de souffrance, il sera retiré de l’étude et pris en charge sans délai afin d’éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
La régulation du calcium et de la vitamine D fait intervenir plusieurs organes et différents types de cellules. De même, la réparation de l’intestin est un mécanisme complexe qui ne peut pas être étudié correctement avec des cellules isolées. La souris est particulièrement adaptée à ce type de recherche, car elle réagit aux traitements de manière comparable à l’être humain. Elle permet également l’utilisation de techniques génétiques avancées, indispensables pour comprendre le rôle de certains gènes. L’étude porte sur des animaux adultes. Les souris recevront un traitement à partir de l’âge de 8 semaines, puis une injection unique à 10 semaines afin de déclencher un phénomène contrôlé de régénération intestinale, qui sera ensuite analysé.
Effet de préparations pro-pré-post-biotiques sur la physiologie de l’hôte dans un modèle rongeur
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1440
Gavées chaque jour pendant vingt-huit jours, isolées dans une cage vide jusqu'à quinze minutes pour le recueil des fèces deux fois par semaine, et saignées une fois par semaine, 1 440 souris et 1 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués en fin de protocole pour analyse des tissus. Le porteur affirme qu'aucune nuisance liée aux substances n'est attendue parce qu'elles sont "connues pour leur sécurité d'emploi chez l'homme et l'animal", alors que le projet existe précisément parce que leurs mécanismes d'action "restent largement peu décrits". Il indique par ailleurs qu'un calcul de puissance formel ne peut pas être établi de façon robuste pour ces analyses, et retient un effectif de 2 880 rongeurs jugé adéquat.
Objectifs
L’utilisation de micro-organismes ou leurs dérivés (les « probiotiques » ou assimilés), ou d’autres interventions thérapeutiques visant le microbiote intestinal (certaines fibres, les « prébiotiques ») ont déjà démontré leur intérêt dans diverses aires thérapeutiques, en prévention ou en complément des traitements de référence. Pourtant, les mécanismes biologiques actionnés par ces substances (pré, post et probiotiques) restent largement peu décrits, notamment en raison de leur complexité en termes de composition, mais aussi d’interactions avec l’hôte et son microbiote. La recherche d’une meilleure compréhension de ces modes d’action se justifie car elle permet de mieux communiquer sur la pertinence scientifique de ces solutions de santé, mais également de renforcer leur sécurité. Dans cet objectif, si le recours à des modèles in vitro est possible dans certains cas, il n’existe pas à ce jour de modèle non animal capable de récapituler la complexité du système digestif, qui comprend l’hôte, son microbiote, les substances issues de l’alimentation, et met en jeu des interactions entre ces acteurs et le reste de l’organisme – système digestif, système gastro-intestinal, système nerveux, système immunitaire… L’utilisation de modèles animaux pour aborder l’aspect mécanistique est alors un complément indispensable à l’obtention des données cliniques. Outre la description des mécanismes, les modèles animaux sont idéaux pour développer, améliorer, comprendre les solutions existantes ou en développer de nouvelles. L’objectif du projet est donc de caractériser l’effet de préparations pré/post/probiotiques existantes ou en cours de développement sur la physiologie de l’hôte, notamment sa physiologie digestive, chez l’animal sain, et en en mesurant les conséquences sur des paramètres cliniques (courbe de poids, dosages sanguins) ou microscopiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer et de comparer l’efficacité de préparations pré/post/probiotiques dans un contexte physiologique, à travers des mesures de marqueurs biochimiques, d'inflammation, ... et de décrire leurs mécanismes d’action notamment sur la physiologie intestinale. Finalement, les données obtenues permettront de développer les solutions thérapeutiques les plus efficaces et les plus sûres, sur la base de critères scientifiques objectifs.
Procédures
Sur animaux vigiles : -administration des substance évaluées par gavage, quotidiennement, pendant 28 jours maximum. -prélèvements de fèces, deux fois par semaine maximum, pendant 6 semaines maximum. Les animaux seront isolés dans une cage vide jusqu’à l’émission, avec une durée maximale de 15 minutes. -prélèvements sanguins, une fois par semaine maximum, pendant 6 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, aucune nuisance liée aux substances administrées n’est attendue, car ces substances sont connues pour leur sécurité d’emploi chez l’homme et l’animal. Les administrations, l’isolement transitoire pour les prélèvements fécaux ainsi que les prélèvements sanguins et les contentions associées à ces gestes peuvent être une source de stress pour l’animal.
Devenir
Une partie du projet se base sur des mesures effectuées sur les tissus prélevés post-mortem. L'mise à mort en fin de protocole est donc nécessaire.
Remplacement
La physiologie du tube digestif, lieu d’action primaire des pré/post/probiotiques, est complexe. Elle implique le tube digestif, lui-même composé de plusieurs types cellulaires, le système immunitaire, le microbiote, et le dialogue biochimique complexe qui s’établit entre ces différentes composantes. Il n’est actuellement pas possible de reconstituer une telle complexité par des modèles non animaux, y compris les plus complexes.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux impliqués est basée sur : -une bonne connaissance du modèle permettant d’ajuster les effectifs au minimum tout en maximisant la qualité et la pertinence des résultats obtenus -une exploitation maximale du matériel biologique et des données cliniques, permettant de limiter le nombre de réitérations -une bonne connaissance des produits testés, de la dose efficace et de leur absence d'effet indésirable, permettant de ne pas requérir de mise au point ou d’ajustement de doses et de durées de traitement. -le regroupement des essais permettant de limiter le nombre de groupes témoins La taille des groupes est justifiée par une approche combinant données de la littérature, expérience acquise avec ce modèle et variabilité attendue des données collectées. Un calcul de puissance formel nécessitant de définir a priori un critère principal, une variance et une taille d’effet attendues, il ne peut être établi de façon pleinement robuste pour ces analyses exploratoires et multidimensionnelles. Le nombre d’animaux retenu vise donc à garantir des résultats interprétables et statistiquement exploitables, tout en limitant les effectifs au nombre adéquat.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes, avec enrichissement (ouate, abri, roue, tube…). Une surveillance individuelle renforcée quotidienne (weekend et jours fériés inclus) sera appliquée pendant la procédure afin d’écarter au plus vite tout animal dont l'état général se dégraderait. Les prélèvements fécaux seront réalisés au maximum deux fois par semaine. Les prélèvements sanguins seront réalisés au maximum une fois par semaine et limités au volume minimal nécessaire aux analyses.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces de référence pour les raisons suivantes : -existence d’outils moléculaires pour l’exploration mécanistique -existence de données préliminaires sur ces modèles concernant les produits évalués Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre 8 et 15 semaines, car le projet concerne des produits visant une utilisation chez l’adulte
Fibrose hépatique au cours du diabète de type 2 : impact des récepteurs CB1 et CB2 chez la souris obèse et diabétique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour tester si deux cibles pharmacologiques combinées freinent la fibrose du foie liée à l'obésité, 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras pendant vingt semaines, puis un gavage oro-pharyngé quotidien pendant vingt-huit jours et quatorze incisions de la veine de la queue pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que ce régime peut les rendre incapables d'accéder à la nourriture et à la boisson, provoquer un état dépressif et de l'anxiété, et que l'isolement en cage individuelle des vingt-huit derniers jours sera une source d'angoisse prolongée. L'effet chez les patients reste au conditionnel, les deux molécules ayant chacune été testées séparément sans que leur combinaison ait été évaluée.
Objectifs
La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutiques sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.
Bénéfices attendus
La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses, bien que multiples, voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont chacune déjà démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.
Procédures
Pendant les 20 premières semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 10 minutes par souris cette période. Pendant les 28 jours de traitements pharmacologique, la masse corporelle sera évaluée quotidiennement. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 14 minutes par souris cette période. De plus, l’administration quotidienne des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes supplémentaires, soit 19 minutes au total par animal sur cette période et 29 minutes sur l’ensemble du projet. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle).
Impact sur les animaux
En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Enfin, l’hébergement en cages individuelles pendant les 28 derniers jours de la procédure sera une source d’angoisse prolongée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’action mis en jeux.
Remplacement
L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier, justifiant ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu, au cours des projets, réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécules, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi, des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe (10 animaux par cages) pendant les 20 premières semaines avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle afin de pouvoir monitorer la prise alimentaire quotidienne pouvant être influencée par les différents traitements. Par conséquent, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel et olfactif entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes sans couvercle filtrant.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont les plus proches possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 12 semaines. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 32 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 36 semaines lors de la fin de l’expérimentation.