Système gastrointestinal

Toutes tuées pour le prélèvement des organes lymphoïdes, du tube digestif, du cerveau et de la moelle épinière, 2 676 souris vont être utilisées, dont 2 016 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les femelles gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous une lumière vive trente minutes, trois fois par jour, du treizième au dix-huitième jour de gestation. Leurs descendants adultes reçoivent une inflammation provoquée du système nerveux central ou du côlon, avec syndrome fébrile et perte de poids, la mise à mort intervenant au bout de trente jours. Le porteur écrit pourtant que "le stress en soi ne cause aucun symptôme chez les génitrices" et que les injections et pesées "ne causent pas d'effets indésirables", dans un projet dont il déclare lui-même les trois quarts des effectifs en souffrance sévère.

Objectifs

La prévalence mondiale des pathologies auto-immunes et inflammatoires est en perpétuelle augmentation dans les pays développés et en voie de développement. Elles représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ceci est basé sur l’utilisation des modèles animaux (lignées pures génétiquement homogènes, environnement "contrôlé") qui reproduisent en majeure partie les caractéristiques cliniques et histopathologiques des maladies humaines. De plus, il est tout à fait possible d’appliquer les résultats obtenus dans les modèles animaux à la pathologie humaine. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant au développement de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuse étude épidémiologique placent le stress comme l'un des facteurs majeurs impliqués dans la régulation de l'immunité. L'objectif de cette demande est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress en période néonatale et les maladies auto-immunes en utilisant un modèle animal de sclérose en plaques et les maladies inflammatoires intestinales en utilisant un modèle de colite

Bénéfices attendus

La période prénatale est une période délicate au cours de laquelle l’exposition intra-utérine à des facteurs environnementaux peut moduler le cours du développement du système immunitaire et conférer un effet durable sur la progéniture qui, plus tard dans la vie, influence le développement des réponses immunes normales et pathologiques. Cette étude sur l'impact du stress prénatal sur la réponse immunitaire de la progéniture chez la souris offre une approche expérimentale pour explorer les mécanismes sous-jacents à ces interactions complexes avec un focus sur le microbiote. Ceci pourrait identifier des souches bactériennes du microbiote ou des métabolites du microbiote qui pourraient être des cibles thérapeutiques des maladies inflammatoires. . Les résultats pourraient avoir des implications importantes pour la recherche sur la santé maternelle et infantile, ouvrant la voie à de nouvelles avenues de prévention et d'intervention.

Procédures

Les souris gestantes seront stressées du 13ème au 18ème jour de gestation à l'aide d'un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour. Nous allons induire chez les progénitures adultes ( 10 souris par groupe) une inflammatoin du système nerveux central ou une inflammation du colon. Au moment de la mise à mort (30 jours), les organes lympoides, le tractus digestif, le cerveau et la moelle epinière seront prélevés et analysés

Impact sur les animaux

Entre nos mains, le stress en soi ne cause aucun symptôme chez les génitrices et n'a aucun effet sur le nombre de petits par portée et sur les soins portés aux petits. Dans le cas du modèle de l'inflammation du système nerveux central ou de colite, les animaux présentent un syndrome fébrile entrainant une perte de poids. Puisque le stress prénatal réduit l’inflammation, on devrait s'attendre à une réduction de la sévérité de la maladie dans les deux modèles. Les expérimentations sur ces animaux (injections, pesées) ne causent pas d'effets indésirables.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire

Remplacement

Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les méthodes alternatives permettant une évaluation du statut immunitaire de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale car le stress, l'inflammation et l’auto-immunité sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité. Cependant, une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mises en place.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima à l'aide des outils statistiques en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite (perte de poids superier à 20%, grattage ou léchage anormal, posture voûté ou prostrée, amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures, anomalies de la respiration, hypo ou hyperthermie et paralysie). Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement, cachettes et objets à ronger). Une surveillance journalière de l'état générale des animaux par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Comme précisé pour chacune des procédures,les animaux seront anesthésiés + anélgésiés (xylasine) en cas d'injection ou de prélévement.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utuliserons des souris adultes mâles et femelles pour notre projet.

Gavées trois fois par semaine pendant neuf semaines, opérées trente minutes pour recevoir des électrodes, puis soumises à une distension du côlon par un ballonnet en cinq paliers de dix secondes, 540 souris vont être utilisées. 300 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 240 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées en fin de procédure pour des prélèvements de tissus. L'objet est de tester des souches probiotiques censées corriger l'hypersensibilité intestinale provoquée par un régime riche en sucres fermentescibles, avec pour horizon les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur ramène l'introduction du ballonnet et la mesure des contractions à un "inconfort", et rappelle que la même mesure se pratique chez les patients, quand 300 de ces souris sont déclarées en souffrance sévère.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est une pathologie intestinale chronique très répandue, qui altère la qualité de vie des patients de façon significative. Sur le plan thérapeutique, les traitements médicamenteux de la douleur restent à ce jour peu efficaces. L’alimentation est le domaine où ces patients sont le plus sensibles. Un groupe d’aliments promoteurs de douleurs abdominales chez ces patients a pu être mis en évidence: les sucres fermentescibles (FODMAPs). La fermentation de ces derniers par le microbiote intestinal des patients génère des composés chimiques provoquant la douleur. Aujourd'hui, pour réduire ces symptômes invalidants, un régime pauvre ou sans ces sucres fermentescibles est proposé aux patients SII. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de souches probiotiques (micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets bénéfiques sur la santé), que nous avons sélectionné pour leurs propriétés bénéfiques sur la perméabilité intestinale et la sensibilité viscérale d’individus murins ayant consommé un régime en riche en FODMAPs. Cette étude préclinique, couplée aux analyses cliniques et in vitro menées dans notre équipe , permettrait à terme de proposer une solution thérapeutique pour les patients SII hypersensibles aux FODMAPs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra 1) de valider les hypothèses sur l’implication d’une consommation riche en FODMAPs sur le disfonctionnement de la barrière intestinale ; 2) d’élaborer des outils de lutte préventive et d’apporter des pistes de stratégie thérapeutique pour une meilleure santé intestinale liée à la consommation des FODMAPs. Il apportera des données objectives permettant à terme de réaliser des études cliniques qui viseront à améliorer la qualité de vie des patients SII.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages (durée du geste : 30 secondes) trois fois par semaine sur une période de 9 semaines. Des prélèvements de fèces seront effectués au niveau de l’anus le premier jour, le 8ème jour et à la fin de la consommation du régime enrichis en FODMAPs. Des animaux subiront également un prélèvement sanguin unique non létal (20μl) effectué à la queue (durée du geste : 30 secondes). Des animaux seront équipés d’électrodes pour la mesure de sensibilité viscérale, nécessitant une chirurgie de courte durée (30 min). Après trois jours de récupération de l’acte chirurgical, les animaux seront soumis à une distension colorectale de cinq paliers d’une durée de 10 secondes chacune avec un temps de récupération de 10 minutes entre chaque palier.

Impact sur les animaux

Des nuisances ou effets indésirables attendus liés à ces procédures seront les suivants: -Une mobilité réduite liée à la contention manuelle (durée 1min) De plus l’ensemble des animaux pourraient subir une nuisance (peur) et une irritation du tube digestif lors des premiers jours d’administration orale des composés. -Un stress physique possible lié à un prélèvement de sang à la queue (durée 3min) -Des nuisances liées à la chirurgie peuvent être des douleurs post-opératoires, une perte de poids, une déshydratation ou une mauvaise cicatrisation. La nuisance liée à la contention dans le tunnel sera une mobilité réduite. L’introduction du ballonnet et la mesure des contractions peuvent être associés à un inconfort.

Devenir

Tous les animaux en fin de procédure, seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages

Remplacement

Le SII est une pathologie dont les causes sont multifactorielles et méconnues, et qui présentent une physiopathologie complexe. Par conséquent, il n’est pas possible de reproduire cette pathologie uniquement sur un modèle cellulaire. Pour évaluer si un traitement est efficace il faut nécessairement coupler des analyses sur modèle intégré in vivo à des analyses in vitro sur modèles de cultures cellulaires. Cependant, des paramètres comme la sensibilité intestinale ou la perméabilité intestinale totale ne peuvent pas être mesurées in vitro. Ainsi, seule l’utilisation de modèles animaux permettra d’évaluer l’effet des cibles thérapeutiques sur une consommation riche en FODMAPs et ainsi permettre l’obtention de résultats transposables chez l’homme. Par ailleurs, la mesure de sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale est aussi une pratique qui est réalisée en clinique chez les patients souffrant de colopathie.

Réduction

Les études menées précédemment au sein de la communauté scientifique et en interne ont permis d’acquérir une meilleure performance pour le bien-être animal. L’amélioration de la prise en charge post-opératoire par l’acquisition d’armoires ventilées a permis d’améliorer le réveil des animaux, d’éviter des études en répétition et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En raison de la variabilité inter-individuelle à la sensibilité viscérale, le nombre calculé au plus juste d’animaux nécessaire est de 15 souris par groupe, et réduit à 12 souris par groupe pour les mesures de perméabilité intestinale.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal. A leur arrivée les animaux sont hébergés collectivement au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation. L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter à leurs nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux captifs, des bûchettes en peuplier seront disposées dans chaque cage afin de répondre à leur besoin naturel de ronger. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur pré-post opératoire, réhydratation, tapis chauffant, armoires ventilées).

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein de la communauté scientifique. Le modèle animal murin est un modèle largement utilisé et décrit pour la mesure de la sensibilité viscérale et reproduit les principales caractéristiques du syndrome de l’intestin irritable nécessaire pour une approche globale de cette pathologie. Les animaux utilisés sont tous à l’âge adulte (6 semaines) car il est indispensable d’avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.

Cinquante souris reçoivent, par cycles de sept jours pendant quatre semaines, un agent qui enflamme leur intestin et peut provoquer des saignements et une perte de poids, tandis que 80 des 100 souris du projet boivent pendant dix semaines une eau chargée de trois polymères de microplastiques. Les procédures sont déclarées modérées pour la moitié des animaux et sévères pour l'autre. Le RNT qualifie ce traitement de "sévère pour les animaux mais nécessaire", puis le présente comme "un modèle maîtrisé depuis longtemps" dont "nous savons rapidement repérer les symptômes". Toutes sont tuées après une endoscopie rectale finale sous anesthésie, pour que le foie, le cœur, la rate, les intestins, le sang, les selles et les urines soient prélevés.

Objectifs

Les microplastiques sont des particules de très petite taille (c'est à dire 70 fois plus petit que l’épaisseur d’un cheveu), que l’on retrouve sous différentes formes (fragments, fibres, films, billes…) et composées de différents polymères. Présentes partout dans l’environnement. On estime aujourd’hui que 10 % de l’ensemble des plastiques produits depuis leur invention auraient terminé leur vie dans les océans. Ils s’accumulent ensuite dans tous les écosystèmes, y compris les habitats les plus reculés comme les fonds marins ou les plus accessibles comme l’alimentation, ce qui conduit à leur ingestion involontaire par l’Homme. Ainsi, l'Homme consommerait en moyenne 52 000 microparticules de plastique chaque année via son alimentation. Leur omniprésence a conduit à de nombreuses études, même si les conséquences sur notre santé restent encore peu connues. Certains modèles animaux laissent à penser qu’ils pourraient impacter l’intestin. Chez l’Homme, une étude a retrouvé plus de microplastiques chez des patients atteints de Maladies Intestinales que chez les personnes saines. Certains microplastiques aggravent l’inflammation de l’intestin chez la souris. D’autres études ont montré que les microplastiques provoquent des perturbations de la flore intestinale et de la santé digestive. Cependant, ces études se sont uniquement concentrées sur les microplastiques les plus retrouvés chez les individus sains alors que des polymères différents ont été retrouvés chez des patients atteints de Maladies Intestinales. A ce jour, aucune étude ne s’est intéressée à l’effet combiné de ces microplastiques qui contaminent notre alimentation. Pour cela, notre projet propose d’étudier les effets des trois polymères les plus détectés dans les selles de patients atteints de Maladies Intestinales. Nous souhaitons, par ce projet, évaluer la capacité à provoquer une inflammation de l’intestin des microplastiques sélectionnés, indépendamment ou combinés, dans un modèle de souris. Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin. De tels résultats sont indispensables pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour freiner la progression de la maladie et d’améliorer la qualité de vie des patients atteints de Maladies Intestinales. Enfin, la santé de notre planète a un impact sur la santé des patients et le projet contribuera à développer des stratégies préventives contre la pollution par les déchets plastiques dans le Monde, tant au niveau des patients qu'au niveau de la société.

Procédures

4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) L’administration des microplastiques directement faite via l’eau de boisson durant 10 semaines sur 80 animaux (tous sauf les contrôles) (2) Le traitement pro-inflammatoire pour "imiter" les symptômes d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale sera réalisé sur la moitié des animaux (50) durant 4 semaines par cycle de 7 jours. (3) La mesure de la perméabilité intestinale : des gavages gastriques seront réalisés avec un produit fluorescent et des prélèvements de sang réalisés à la joue, sous anesthésie générale (durée maximum 2 à 3 minutes). Cette procédure sera réalisée sur animaux vigiles pour le gavage (durée quelques secondes) et ne sera réalisée qu’une seule fois. (4) L'endoscopie rectale : examen de quelques minutes (10 maximim) réalisé le dernier jour du protocole sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) L’administration des microparticules de plastique sera faite via l’eau des biberons pendant toute la durée du protocole sur 80 animaux (tous sauf les contrôles). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. (2) Induction d’une inflammation de l’intestin : réalisée sur la moitié des animaux (50 animaux) 4 semaines après le début de l’administration des microparticules de plastique, selon 3 cycles de 7 jours. Ceci reste un traitement sévère pour les animaux mais nécessaire étudier l’inflammation chez les animaux. Ces derniers pourront potentiellement perdre du poids pendant la durée du traitement mais également avoir des saignements. Cependant, la dose administrée est une dose très largement utilisée dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal mais que nous savons rapidement repérer les symptômes afin de limiter la souffrance des animaux. (3) Mesure de la perméabilité intestinale : des gavages oraux seront réalisés avec un produit fluorescent sur animaux vigiles et des prélèvements de sang réalisés à la joue sous anesthésie générale. Maîtrisée par l’expérimentateur, cette procédure n’engendre que très peu de stress à l’animal. Elle ne sera réalisée qu’une seule fois et n’a jamais provoqué de nuisance chez les animaux par le passé. (4) Endoscopie rectale : cette procédure est réalisée à la fin du protocole sous anesthésie générale sur la totalité des animaux du protocole avant mise à mort.

Devenir

Les animaux mis à mort à la fin de la dernière intervention (coloscopie) afin de récupérer les différents organes. Une anesthésie générale sera réalisée pour le prélèvement de sang de l'intervention n°3 et pour la coloscopie finale n°4. A l’issue de celle-ci, les animaux seront mis à mort et tous les organes (foie, coeur, rate, intestins) ainsi que le sang, les selles et les urines sont prélevés.

Remplacement

A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Aussi, les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant des organes extérieurs au tube digestif, il n’existe donc pas de remplacement possible du modèle animal pour explorer notre question de recherche.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par groupe, à savoir 10 souris par groupes réparties dans 5 groupes, eux mêmes subdivisés en 2 sous-groupes soit un total de 10x5x2 = 100 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux, dans des cages ventilées, avec à disposition du papier, des cabanes en carton pour se cacher et grimper, des buchettes de bois pour usure des dents et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées par des personnes formées et expérimentées. Elles auront lieu dans l’animalerie du laboratoire , dans un environnement sécurisant pour l’animal et les coloscopies se feront sous anesthésie générale. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 15%, déshydratation, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biologiques. Le modèle d'inflammation est un modèle bien maîtrisé et les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix dans l’étude des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le modèle choisi est très largement publiée, en raison de sa simplicité d'administration (dans l'eau de boisson) de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée (pour étudier le processus inflammatoire et de « récupération »). En matière d’étude préclinique, ce modèle reste le modèle de choix. Les souris utilisées auront 8 à 9 semaines. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte», ce qui correspond aux besoins du projet, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin touchant majoritairement de jeunes adultes.

Des métastases hépatiques implantées par chirurgie, un jeûne de dix à douze heures suivi d'une nuit de régime carencé en un acide aminé indispensable, l'isolement en cage individuelle pour contrôler les prises alimentaires, deux séances d'imagerie par semaine avec un trajet de quatorze kilomètres à chaque fois: 1 845 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 686 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La rubrique consacrée aux atteintes ne dit rien des métastases elles-mêmes. Elle décrit des piqûres qui "génèrent des douleurs courtes et légères", une opération de trente minutes après laquelle "les souris récupèrent rapidement", et un isolement compensé par un tube rouge et une bille métallique. Toutes sont tuées, celles qui portent des métastases ou des tumeurs pour que le foie ou la tumeur soit analysé, les autres parce qu'elles ne peuvent pas être réutilisées.

Objectifs

Nos recherches ont pour but d’étudier les mécanismes d’adaptation à un stress nutritionnel chez les mammifères. Au cours de la dernière décade, nous avons démontré, dans des cellules en culture, le rôle clé joué par une voie de signalisation endogène dans la réponse à différents stress incluant la carence en acides aminés. En particulier, nous avons mis en évidence que cette réponse nécessite la fixation d'un facteur de transcription à un élément ADN de régulation. Ce mécanisme entraîne l’activation de la transcription de gènes cibles spécifiques. L’ensemble de ces résultats nous a permis de concevoir un système d’expression génique inductible (comprenant plusieurs copies d’éléments ADN de régulation) contrôlable par une manipulation nutritionnelle. Nous avons mis au point (i) un promoteur artificiel fortement inductible par une carence en un Acide Aminé Indispensable (AAI) encapsulé dans un vecteur de thérapie génique et (ii) une nourriture déséquilibrée en AAI qui entraîne une forte baisse de la concentration sanguine de l’AAI limitant et qui permet l’induction du transgène. En utilisant le gène rapporteur luciférase, nous avons apporté la preuve de concept de la fonctionnalité de ce système d’expression inductible. Notre technologie a permis de lever une limitation majeure à l'utilisation de la thérapie génique qui est la nécessité de moduler de manière non toxique l'expression d’un transgène en termes de durée et de niveau d'expression. ll est maintenant nécessaire de valider notre système de régulation génique dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Pour son intérêt médical, sa faisabilité, et son transfert rapide en médecine humaine, nous avons choisi le modèle des Métastases Hépatiques du Cancer Colorectal (MHCC). En effet, (1) elles concernent 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans, (2) nous avons montré que notre voie de régulation est très réactive dans le foie et (3) l’utilisation de notre technologie apportée par un vecteur viral nous a déjà permis de valider l’efficacité de l’expression d’un gène pro-apoptotique ciblant les tumeurs sur des xénogreffes de souris. Notre objectif est donc de montrer que l’induction contrôlée du gène pro-apoptotique permet de traiter les MHCC et de montrer l’effet synergique avec les molécules de chimiothérapie déjà utilisées en clinique.

Bénéfices attendus

La validation de la fonctionnalité de notre technologie dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal est une étape importante dans le transfert de cette technologie à l’Homme. In fine, les bénéfices attendus sont le traitement des patients qui ont subi des chimiothérapies inefficaces et qui ne répondent malheureusement pas aux immunothérapies actuelles.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang (sur animal vigile, 2 à 3 fois au cours de l’expérimentation, et jusqu’à 10 fois par an et demi pour les souris qui seront suivies sur le long cours). Elles auront également une injection de vecteurs de thérapie génique sur animal vigile, et elles seront soumises à un protocole nutritionnel impliquant une phase de jeûne sur la journée (période de repos chez les souris), suivi d’une période de consommation d’un régime carencé en un acide aminé indispensable sur la nuit (période active), et enfin consommation d’un régime contrôle de récupération sur 24h, ceci de façon à pouvoir induire la production de la protéine médicament. Ce traitement sera complété par des injections sur animal vigile d’un anticorps (3 à 5 injections par souris) et/ou d’un traitement de chimiothérapie (1 à 3 injections par souris) afin d’en évaluer l’effet combiné. Selon le modèle d’expérimentation, une procédure chirurgicale sera réalisée pour implanter les métastases hépatiques (sous anesthésie et analgésie, l’opération dure environ 30 min) ou une injection de cellules cancéreuses sous la peau sera réalisée sur animal vigile. Si l’état général des souris le permet, 2 analyses bioluminescentes par semaine seront effectuées grâce à un bioimageur. Ces mesures permettront de suivre le développement des métastases bioluminescentes de manière non invasive. Elles nécessitent un transport depuis leur lieu d’hébergement vers le plateau d’imagerie situé à 14 km, une double injection d’une protéine nécessaire à l’émission de bioluminescence sur animal vigile 10 minutes avant la mesure (au total 300 µL injectés), et une anesthésie afin qu'elles restent immobiles pendant la mesure.

Impact sur les animaux

(1) Afin de faire un contrôle individuel de la consommation du régime carencé, il est nécessaire d’isoler les animaux (un animal par cage). Une période d’habituation et un enrichissement du milieu sont mis en place pour réduire le stress qui peut survenir en cas d’isolement des congénères. (2) L’induction de la protéine médicament nécessite une période de jeûne de 10h à 12h (qui a lieu sur la journée, période où les souris sont en phase de repos) suivi d’une période de consommation du régime carencé de 12 à 14h (sur la nuit, pendant leur période active). (3) La chirurgie nécessaire à l’implantation des métastases pouvant causer de la douleur, elle est réalisée sous anesthésie et analgésie. L’opération dure 30 min et les souris récupèrent rapidement (comportement normal dans les heures qui suivent). (4) Les piqûres (prises de sang, injections) génèrent des douleurs courtes et légères. Ces gestes techniques rapides sont réalisés par du personnel expérimenté afin de réduire stress ou douleur et sont réalisés dans le respect de la réglementation pour ce qui concerne les volumes et la fréquence de prélèvement ou d’injection.

Devenir

Chaque procédure impliquera une mise à mort des animaux, à plus ou moins long terme, selon les expérimentations. En effet, pour les procédures impliquant des métastases ou des tumeurs sous-cutanées, il est nécessaire de mettre à mort à l’animal afin d’étudier soit le foie soit les tumeurs sous-cutanées, et d’évaluer ainsi l’efficacité du traitement. Les procédures ne nécessitant pas de générer des métastases ou des tumeurs sous-cutanées nous permettent de garder les animaux en vie plus longtemps, afin d’étudier la stabilité de l’inductibilité du transgène. Néanmoins, nous ne pourrions pas les réutiliser pour d’autres projets, aussi, ils seront mis à mort à l’issue des expérimentations.

Remplacement

De nombreuses expériences préliminaires ont été réalisées in vitro sur plusieurs lignées de carcinome colique. Elles ont permis tout d'abord de tester l'efficacité de TRAIL pour induire la mort cellulaire des cellules d’intérêt, puis de tester l’effet de la combinaison de TRAIL avec l'anticorps MD5 (dirigé contre le récepteur de TRAIL), et enfin de sélectionner une série de molécules capables de faciliter l'action apoptotique de TRAIL couplé à MD5, dont celles utilisées en clinique (5-Fu + Oxaliplatine). Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons choisi de faire des études pilotes avec un petit nombre d’animaux, de manière à valider ou infirmer des paramètres clés qui seront décisifs pour les études à plus grande échelle. Les nombres d’animaux indiqués dans les procédures sont néanmoins évalués au maximum, si toutefois les premiers essais n’étaient pas concluants et que nous étions amenés à en faire de nouveaux avec d’autres doses notamment. Pour ce qui concerne les procédures impliquant des métastases, celles-ci ayant une grande diversité inter-individuelle, nous ne pouvons pas réduire le nombre d’animaux par groupe, en effet, un trop faible nombre d’animaux ne nous permettrait pas de conclure de manière fiable. En revanche, nous avons choisi de transformer les cellules afin qu’elles expriment la luciférase de manière constitutive. Une imagerie in vivo nous permet de suivre le développement des métastases sans sacrifier l’animal, grâce à une méthode non invasive, permettant ainsi d’obtenir plus d’information sans augmenter le nombre d’animaux. Pour ce qui concerne les études de clairance ou encore d’évaluation de la stabilité de l'inductibilité de du transgène, nous avons choisi de faire une étude longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de diminuer le stress dû à l’isolement des animaux, une période d’habituation et un enrichissement du milieu sont mis en place (tube rouge, bille métallique, et/ou coton pour nidification). La chirurgie pour la génération du modèle de MHCC est réalisée en prenant plusieurs dispositions pour diminuer l’inconfort et la douleur et augmenter le bien-être animal : elle est réalisée 1) sous anesthésie et analgésie afin de limiter la douleur, 2) sur une peau précédemment tondue et désinfectée afin de limiter toute infection, 3) sur un tapis chauffant de manière à pallier au manque de thermorégulation qui se produit sous anesthésie, 4) en appliquant un collyre pour éviter le dessèchement des yeux pour pallier à l’absence de clignement des yeux qui se produit également sous anesthésie. Si un animal présentait un état douloureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en œuvre du projet, et mis à mort si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Il existe en effet un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal décrit dans la littérature, qui mime relativement bien ce qui se passe chez l’Homme. Ce modèle permet d’obtenir rapidement des métastases, dont on peut suivre la croissance par mesure de bioluminescence. Stade adulte (3-4 mois) afin de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.