Système gastrointestinal
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Etude de la perméabilité intestinale chez la souris et de sa modulation par le stress ou l’absorption de lipides alimentaires.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de composés, un stress chronique de trois semaines par glucocorticoïdes dans l'eau de boisson, un gavage d'un marqueur fluorescent ou des jeûnes suivis de repas gras, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever l'intestin. Le porteur étudie la perméabilité intestinale et sa modulation par le stress ou les lipides, à l'aide d'une méthode d'imagerie qu'il présente comme sensible. Sur le remplacement, il affirme que seule une approche in vivo rend compte de la complexité physiologique de l'intestin.
Objectifs
Le contrôle de la perméabilité intestinale joue un rôle crucial dans son rôle de barrière intestinale contrôlant l’entrée de nombreux nutriments ou xénobiotiques (adjuvants, médicaments, drogues), potentiellement toxiques ou de microbes, dans le tube digestif tout en permettant une digestion optimale des nutriments. De nombreux cas de stress psychologique ou de fragilités ou de pathologies intestinales ont été associés à une augmentation de la perméabilité intestinale. Elle peut être observée de façon transitoire ou permanente et consiste souvent en un passage paracellulaire, c'est à dire entre les cellules épithéliales, mais parfois aussi par passage par absorption à l’intérieur de ces cellules. Une très faible perméabilité est déjà existante à bas bruit dans le tissu sain, notamment au niveau des cellules caliciformes, productrices de mucus et des cellules M des ganglions lymphoïdes. Nous souhaitons identifier et caractériser la perméabilité paracellulaire sur tissu sain et mesurer l’impact d’un stress sur une potentielle augmentation ainsi que celle de la nutrition standard ou enrichie en graisse, en une prise unique. Cette étude sera menée en parallèle sur épithélium en culture cellulaire et sur l’intestin de souris et utilisant une nouvelle méthode d’étude de la perméabilité paracellulaire par imagerie que nous avons développée. Elle a le mérite d’être sensible et d’identifier quelles sont les cellules perméables dans l’épithélium, de permettre une analyse dans une partie ou dans l’ensemble de l’intestin grêle et colique. C’est une méthode ex vivo sur tissus prélevés après euthanasie ce qui est nécessaire pour une appréhension de la physiologie intestinale tout en limitant le stress et la souffrance des animaux.
Bénéfices attendus
La perméabilité intestinale est mesurée de longue date. Elle peut rester difficile à identifier et localiser précisément dans l’intestin, pour ensuite la relier à des pénétrations tissulaires de nutriments ou xénobiotiques et aux réponses physiopathologiques qui peuvent en découler. Nous avons développé une nouvelle technique d’imagerie cellulaire qui permet de localiser précisément les régions intestinales perméables, les cellules impliquées, certaines molécules ou organismes pénétrant dans le tissu et leurs modes d’entrée. Ceci nous permet une analyse fine du processus en visualisant les évènements de perméabilité ou la pénétration de composés qui ont eu lieu ex vivo, à l’aide de marqueurs fluorescents visibles à postériori par imagerie des tissus fixés post mortem. Nous nous en servirons pour caractériser les perméabilités intestinales chez des souris en condition physiologique normale, lors d’un stress chronique ou pendant la digestion classique d’un aliment standard ou gras. Les bénéfices attendus sont des mesures précises et reproductibles des perméabilités intestinales paracellulaires ou transcellulaires dans une barrière intacte ou potentiellement fragilisée un stress ou par l’alimentation. Ces expériences permettront une meilleure connaissance et compréhension de ces processus de perméabilité intestinale et de leur analyse expérimentale.
Procédures
Dans une expérience, 36 animaux seront maintenus une fois en contention et recevront une injection en sous cutanée ou en intrapéritonéal de composés non toxiques, d’une durée totale de 30 secondesd'une durée totale de 30 secondes. Dans une autre expérience, une mesure de la perméabilité intestinale in vivo, 24 souris vigiles seront mises à jeun de nourriture mais pas de boisson, soumises à un gavage unique avec un marqueur fluorescent non toxique et enfin, un petit volume de sang sera prélevé dans une durée totale de 30 secondes, à l’aide d’une lancette dans la veine latérale de la queue préalablement anesthésiée. Dans une dernière expérience, 64 souris seront mises à jeun de nourriture mais pas d’eau, pendant 12 heures puis alimentées pendant 1 heure avec des croquettes pauvres ou enrichies en graisse. Elles seront ensuite maintenues sans nourriture pour 3 heures (pic de digestion lipidique par l’intestin, 32 animaux) ou 8 heures pour une fin complète de la digestion lipidique (8 animaux).
Impact sur les animaux
Certains animaux recevront une injection intrapéritonéale ou sous-cutanée unique de composés à des doses pharmacologiques non toxiques qui seront aussi peu stressantes et peu douloureuses. Un stress chronique de 3 semaines sera induit chez certaines souris par addition de faibles doses de glucocorticoïdes dans l’eau de boisson, donc sans contrainte ou intervention directe sur les animaux. Il s’agit d’un stress à bas bruit donc peu contraignant pour les animaux. Certains animaux recevront une administration unique orale par gavage d’une solution fluorescente aqueuse et non toxique, effectué par des expérimentateurs formés. Les animaux auront au préalable été habitués au gavage en vue de réduire le stress que cela pourrait engendrer chez eux. Des prises de sang à la queue seront aussi effectuées par ponction dans la veine latérale de la queue, sous analgésie locale après désinfection. La ponction n'entraine pas de saignement prolongé de l’animal. Ceci permettra de mesurer le passage du marqueur fluorescent depuis l'intestin vers le sang. Ces prises de sang seront effectuées par des personnes expérimentées. A la fin de chaque expérimentation, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour une analyse post mortem de leur intestin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, l’arrêt total du cœur et de la circulation sanguine seront vérifiés et leur intestin sera prélevé.
Remplacement
Seule une approche in vivo d’activation des récepteurs cholinergiques, du stress chronique ou de l’effet d’une digestion physiologique nous permettra de prendre en compte la complexité physiologique de l’intestin des souris étudiées et de ces régulations nutritionnelles immunitaires, nerveuses et sanguines dans la mesure de la perméabilité intestinale.
Réduction
Pour les expériences 1 (traitement cholinergique) et 3 (digestion lipidique) le nombre d’animaux sera réduit à 8 par condition, pour permettre de s’assurer de la reproductibilité et de la validité scientifique du travail. Pour l’expérience 2 de stress aux glucocorticoïdes, sera effectuée qui nécessitera 12 souris témoins et 12 traitées aux glucocorticoïdes. En effets, des expériences antérieures effectuées dans le laboratoire ont montré que ces nombres de 8 ou 12 animaux sont nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement solides et fiables dans l’analyse de la perméabilité intestinale in vivo, mais aussi une validation par les expériences d’imagerie ex vivo sur les intestins prélevés.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages transparentes pour ne pas souffrir d’isolement et leur bon état de santé sera suivi journellement par le personnel de l’animalerie. Chaque cage sera agrémentée d’un tunnel en inox pour raffinement. La température et l’hygrométrie seront maintenues constantes. Pour leur confort, un change de litière hebdomadaire sera effectué et l'accès à l'eau sera illimité. L'accès à la nourriture sera aussi illimité, à part certains animaux qui seront ponctuellement mis à jeun de nourriture avant gavage avec un marqueur fluorescent ou avant alimentation par des croquettes témoins ou enrichies en huile. Lors de l’étude de la prise alimentaire de croquettes pendant une heure, les souris seront isolées pour pouvoir quantifier leur prise alimentaire. Elles seront ensuite replacées dans leur cage d’origine. Les interventions sur les animaux (contention, injections intrapéritonéales ou sous-cutanée, gavages et prises de sang à la queue) seront réalisées par des techniciens expérimentés et après une habituation des souris, afin de limiter leur stress. Les prises de sang seront effectuées à l’aide d’une lancette sur la veine latérale des queues préalablement anesthésiées et désinfectées. Tout signe de modification du comportement des animaux indiquant un point limite en terme de souffrance physique ou psychique et de perte de poids entrainera l’exclusion des animaux concernés qui seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les expériences seront effectuées sur des souris jeunes adultes de 8 à 12 semaines dont la croissance est terminée et dont le développement physiologique de l’intestin est achevé en utilisant une lignée couramment utilisée pour l’étude de la physiologie intestinale, du stress psychologique et de l’absorption et du métabolisme des lipides et qui montre une barrière intestinale intacte sous régime standard.
Etude des effets d’un facteur de croissance sur le métabolisme et le muscle de la souris obèse.
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45 souris obèses et diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des probiotiques dans l'eau de boisson pendant quatre semaines, subissent deux jeûnes de six heures et une incision au bout de la queue pour mesurer la glycémie, puis une anesthésie et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. Le porteur teste une nouvelle voie d'administration d'un analogue d'un facteur de croissance contre la fonte musculaire, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible et que cette lignée génétiquement modifiée est la seule à combiner trouble du métabolisme et fonte musculaire.
Objectifs
Le facteur que nous étudions sera appelé facteur X dans cette demande de projet. Le facteur X est un facteur de croissance décrit pour son rôle dans le métabolisme et reconnu pour son abilité à lutter contre la sarcopénie. La sarcopénie est une perte progressive de la masse et de la force musculaires liée au vieillissement et/ou à la maladie. C’est un facteur de risque pour la santé des sujets puisque le degré de la sarcopénie est lié à la mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace. Dans ce contexte, le facteur X apparaît comme une solution prometteuse. Cependant, deux inconvénients sont liés à son utilisation : (i) sur le long terme, il favorise le développement de tumeurs du foie et (ii) il requiert d’être administré par injections. Ces deux inconvénients altèrent son potentiel comme outil thérapeutique. Récemment, un analogue du facteur X a été développé. Celui-ce ne favorise plus le développement de tumeurs, conserve les propriétés de régulation du métabolisme et est capable d’augmenter la taille des cellules musculaires dans des modèles en culture. Cependant, à ce jour, aucune équipe n’a encore vérifié sa capacité à lutter contre la sarcopénie ni trouvé d’alternative à l’administration par injections. Les objectifs de ce projet sont : -de valider une nouvelle méthode d’administration de l’analogue du facteur X. Pour cela, des bactéries probiotiques (bactéries non pathogènes) contenant la séquence ADN de l’analogue du facteur X ont été préparées. Elles seront données par voie orale (dans l’eau du biberon) aux souris afin que les cellules de leur intestin produisent elles-mêmes l’analogue. -de démontrer que cet analogue du facteur X produit dans l’intestin des animaux est produit en quantités suffisantes pour réguler le métabolisme et augmenter la taille des muscles et ce dans un modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques (souris ob/ob).
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices pourront être tirés de ce projet. Premièrement, aucune équipe à ce jour n’a vérifié que l’analogue possédait toujours la capacité d’augmenter la taille des muscles. Les résultats permettront donc de faire progresser la connaissance. De plus, s’il est mis en évidence que l’analogue est capable d’augmenter la taille des muscles cela permettra de faire émerger une nouvelle molécule candidate pour la prise en charge de la sarcopénie, avancée non négligeable puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique. Enfin, les résultats pourront également permettre de valider une nouvelle approche d’administration de l’analogue du facteur X via les bactéries probiotiques, méthode moins invasive et bien plus physiologique que les injections.
Procédures
Les 45 souris recevront des probiotiques dans leur biberon (durée= 4 semaines). A deux reprises (avec deux semaines d’intervalle), les 45 animaux seront mis à jeun (sans nourriture) pendant 6 heures (durée nécessaire pour obtenir des mesures fiables). Suite à ce jeûne, une petite incision sera réalisée à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang prélevée pour mesurer le glucose. Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles et sans besoin de contention (durée= moins de 30 sec). Avant la mise à mort, les 45 animaux seront à nouveau mis à jeun pendant 6 heures. Suite à ce jeûne, ils seront anesthésiés par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).
Impact sur les animaux
Cette procédure entraînera des nuisances modérées sur les animaux. En effet, le modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques est un modèle génétiquement modifié associé à un phénotype qualifié de dommageable. La mutation génétique donne lieu à une obésité massive à l’origine de la sarcopénie. Cette obésité massive peut réduire la mobilité des animaux, créant ainsi stress et inconfort. A l’âge où les animaux seront utilisés (entre 5 et 10 semaines de vie), aucune altération de la mobilité n’est attendue. Le jeûne nécessaire avant les mesures de glycémies et avant la mise à mort peut entraîner un stress et un inconfort des animaux. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer le glucose peut générer du stress et une douleur chez l’animal. L’injection d’anesthésiques nécessaire pour le prélèvement de sang final peut générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques est attendu.
Devenir
Les 45 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire l’analogue, et enfin la capacité de celui-ci à agir sur les muscles et le métabolisme. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que l’analogue a été testé en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés. Le modèle de souris génétiquement modifié ne peut pas être remplacé par un autre modèle de souris car il est le seul à combiner une altération du métabolisme et une fonte musculaire.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec le facteur X. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 2X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 2X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. De la nourriture sera disposée dans les mangeoires mais aussi directement au fond de la cage pour palier aux difficultés de mobilité des animaux obèses. Les souris seront anesthésiées par injection pour permettre un prélèvement de sang avant la mise à mort. Surveillance des animaux, pesées, incisions du bout de la queue et injections seront réalisées par une personne expérimentée, si possible toujours la même, pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier les effets des facteurs de croissance sur les muscles. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’Homme et permet d’étudier la production de l’analogue par les cellules de l’intestin ainsi que ses effets sur la taille des muscles et le métabolisme. Des souris âgées de 6 semaines seront utilisées. A ce stade, les souris obèses présentent les altérations du métabolisme et la sarcopénie qui sont les deux paramètres à améliorer grâce à l’action de l’analogue.
Rôle du GLP-1 dans la fonction barrière de l’intestin.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 96 opérées sous anesthésie sans réveil et 496 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une ischémie de l'intestin par chirurgie, avec ou sans reperfusion, et des injections répétées, pour étudier le rôle du GLP-1 dans la barrière intestinale et l'infarctus de l'intestin. Le porteur indique que les molécules testées réduisent la prise alimentaire et prévoit une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids, une partie des animaux étant tués par décapitation. Il affirme que le remplacement est "impossible" et le recours au modèle animal "indispensable" pour une approche intégrée, un biomarqueur diagnostique restant à valider.
Objectifs
L'intestin, au-delà de sa fonction d'absorption des nutriments, constitue une formidable barrière entre le milieu externe et le milieu interne. Une perturbation de cette fonction barrière entraîne une altération de la perméabilité intestinale qui a été associée à des pathologies inflammatoires chroniques et aiguës telles que l'ischémie mésentérique aiguë (IMA). L'infarctus de l'intestin est une urgence médicale qui ne peut être diagnostiquée précocement. Il s'agit de l'évolution de l'IMA, provoquée par un apport sanguin insuffisant à l'intestin, entraînant la mort intestinale. Son taux de mortalité est de 60 à 90 % en raison de la gravité de la maladie et de l'échec d'un diagnostic rapide. Au cours des dernières années, d’importants efforts cliniques et précliniques ont été déployés pour trouver des biomarqueurs capables de prédire les dommages gastro-intestinaux avant qu’ils ne deviennent irréversibles et ne se propagent au reste du corps. A ce jour il n’existe pas de biomarqueur permettant un diagnostic précoce de l’IMA. Or un diagnostic précoce permettrait des interventions plus rapides, pouvant aboutir à : 1) éviter une intervention chirurgicale ; 2) moins de morbidité postopératoire et une survie améliorée si la chirurgie était indiquée. Cela aurait également un impact direct sur l'utilisation des ressources de santé postopératoires, tant au niveau des soins aux patients que de la prestation des services de santé. Identifier un biomarqueur spécifique de l’IMA utilisable en cas d'urgence clinique, constituerait une avancée majeure. Dans notre équipe nous avons identifié un nouveau biomarqueur sérique putatif pour l'AMI.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le biomarqueur sécrété lors d’une perturbation de la fonction barrière intestinale a-t-il un rôle dans cette fonction barrière. ? Si oui est-il bénéfique ou non ? 2. La sécrétion de ce biomarqueur vient il protéger les organes à distance de par ses propriétés anti-inflammatoires ? 3. Des médicaments, actuellement utilisés en clinique humaine, pourraient-ils être utilisés ou non lors de perturbation de la fonction barrière ?
Procédures
L’ensemble des procédures décrites dans ce projet repose principalement sur des procédures chirurgicales dont l’objectif est d’induire une perturbation de la fonction barrière en réalisant des ischémies mésentériques suivies ou non d’une reperfusion. La durée minimale de la chirurgie est de 30 minutes lors d’une ischémie et 50 minutes si elle est suivie d’une reperfusion. Certaines procédures vont nécessités des injections intra-péritonéales (IP), ou des prélèvements de microgoutte de sang pour mesurer la glycémie. Ces manipulations se font soit sous anesthésie locale (prélèvement sanguin) soit sur animaux vigiles (injections IP) et ne prennent que quelques secondes quand réalisées par un opérateur maitrisant les gestes techniques ce qui sera le cas.
Impact sur les animaux
Les expérimentations d’ischémie et ou ischémie/reperfusion de ce projet se feront sur des animaux anesthésiés et il n’y aura aucun réveil de l’animal. Les seules manipulations sur animaux non anesthésiés seront les injections intrapéritonéales des molécules pharmacologiques ou les prélèvements de micro gouttes de sang par la queue. Nous serons plus particulièrement attentifs lors des traitements chroniques de 2 semaines car il est parfaitement décrit dans la littérature que les molécules pharmacologiques utilisées réduisent la prise alimentaire. Ainsi un suivi de la masse corporelle toutes les 48h sera réalisé. Si aucun effet négatif ne sont décrits dans la littérature concernant les effets de ces molécules pharmacologiques nous seront également vigilant à tous signes susceptibles de traduire un inconfort voir une souffrance des animaux
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu une sécrétion hormonale (GLP-1) dont les effets peuvent avoir lieu localement au niveau de l’intestin lui-même mais également au niveau d’autres organes distants. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de ces expériences à l’aide de tests statistiques adéquats. En fonction de la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques sachant qu’il y a des variations individuelles des animaux, que ce soit dans les phases d’ischémie, de reperfusion ou bien lors de l’utilisation des chambres de Ussing. . Ne sachant pas dans quel sens iront nos résultats (exemple augmentation ou diminution des paramètres étudiés) nous seront dans l’obligation de réaliser des tests bilatéraux. - L’utilisation de la décapitation par guillotine, qui nous réduit considérablement la variabilité individuelle de tous les paramètres mesurés (Sanguins : cytokines ; Perméabilité etc) et nous permet ainsi de réduire le nombre d’animaux
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement de leur milieu adapté (exemple : petit abris style tunnel, matériaux de type « Sizzle dri, pour s’isoler se cacher etc). Lors des traitements chroniques (2 semaines), ils bénéficieront d’un suivi de leur état général avec mesure de la masse corporelle toutes les 48h. Toutes les procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur (exemple : injections IP) seront réalisés soit sous anesthésie générale. En cas de perte de poids des animaux supérieure à 20% en 7 jours, ou tout autre signe suggérant une souffrance de l’animal (posture, absence de toilettage, craintif, etc) l’animal concerné sera retiré du projet (euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane). Aucun animal ayant subi une ischémie avec ou sans reperfusion ne sera réveillé et seront tous euthanasiés encore endormis. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau intestinal. Elle exprime les mêmes protéines. En particulier le GLP-1 suit le même comportement chez l’Homme et la Souris. De plus nous avons vérifié que ce GLP-1 était également sécrété lors des ischémies expérimentales réalisées chez l’Homme (ref). Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifique du gène codant pour le glucagon, Elles sont issues du fond génétique C57BL6/J. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent et se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris C57BL6/J non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus. De plus il est documenté que la fonction barrière de l’intestin évolue défavorablement avec l’âge il est donc parfaitement obligatoire de maintenir une homogénéité stricte sur ce paramètre.
Etude expérimentale d’une biothérapie innovante dans les maladies mucosales inflammatoires chez des modèles de souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
520 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit une colite ou une cholangite, avec diarrhées et saignements, avant des injections répétées d'un anticorps candidat, certaines subissant une chirurgie avec ligature du canal cholédoque, pour évaluer un futur traitement des maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que l'induction de la colite peut entraîner une mortalité et une perte de poids, et prévoit une euthanasie précoce si un score clinique se dégrade. Il affirme que la souris est un "passage obligatoire" avant l'humain et un "prérequis indispensable", les bénéfices médicaux restant renvoyés à une éventuelle entrée en clinique.
Objectifs
Mettre au point un anticorps thérapeutique spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude sont doubles : 1- valider expérimentalement l’effet thérapeutique de l’anticorps candidat sur les maladies inflammatoires intestinales et sur la cholangite. Cette étape cruciale quant à l’efficacité du traitement, sera le point de départ du second bénéfice à savoir la production à visée médicale de l’anticorps et à plus long terme son entrée en phase clinique.
Procédures
Effet curatif d'un anticorps sur la colite : Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Effet curatif des anticorps sur la colite : Instillation par voie anale avec une sonde de gavage souple 1 minute une seule fois. Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Effet pro-régénératif de l'anticorps sur la reconstruction de l'épithélium intestinal post colite : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 14 jours ou 21 jours. Effet anti-fibrosant de l’anticorps candidat dans un modèle de fibrose intestinale induite par une colite chronique : Injection intrapéritonéale de l'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 28 jours et 66 jours 3 fois par semaine. Effet de l'anticorps sur la cholangite : Cholangite induite par l’alimentation : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Cholangite induite par la ligature du canal cholédoque : Chirurgie comprenant laparotomie et ligature du canal cholédoque 20 minutes. Injection sous cutanée d’analgésie 2 secondes 1fois à deux fois par souris en fonction de la récupération des animaux post opératoire. Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection.
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations. Stress lié à la contention lors de la chirugie et lors des suivis clinique (Perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets des produits induisant la colite ou la cholangite (diarhée, saignement).
Devenir
Lorsque les points limites sont dépassés ou lorsque les temps définis sur les différentes procédures sont atteints nous nous procédons au prélevement des organes afin de réaliser des analyses immunohistologiques
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
L’effectif proposé tient compte de la mortalité possible liée à l’induction de la colite et du fait qu’un effectif plus faible ne permettrait pas de démontrer une différence statistique significative.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être). Les effets du traitement seront contrôlés par des pesées et une surveillance selon un score standardisé de colite clinique. Ce score correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'anesthésiant pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux : l’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Le modèle murin de colite inflammatoire dans les conditions de ce protocole est largement validé et décrit dans la littérature. Son utilisation est un prérequis indispensable à l'élaboration d'un anticorps à visée thérapeutique de la maladie de Crohn. L'effet thérapeutique potentiel d'anticorps spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme ne peut être évalué qu'in vivo sur des modèles validés de colite. L'efficacité des anticorps (spécificité, affinité, etc...) sera préalablement testée in vitro afin de sélectionner les plus performants dans la reconnaissance de leur cible et leur effet bloquant anti-inflammatoire. Les protocoles seront réalisés avec des souris de 6-7 semaines. Notre expérience des traitements pour une colite inflammatoire ou de la cholangite montre que l'âge des animaux influe fortement sur leur réactivité et sur la reproductibilité de la colite induite. L'inflammation colique génère des diarrhées qui participent à la perte de poids des animaux. Des souris utilisées à un âge trop jeune sont plus sensibles et sont susceptibles d'atteindre très rapidement les points limites que nous nous sommes fixés avant la fin de l'expérience. Des souris plus âgées sont moins sensibles et de facto déclenchent des colites plus contrôlables limitant, pour des résultats similaires.
Colonisation et impact des archées méthanogènes sur la physiologie de l’hôte
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Six souriceaux par étude, cinq études, puis une réplication en deux groupes : 42 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements sous anesthésie, sans réveil. Gavés une à trois fois d'archées méthanogènes, seules, avec une bactérie, ou avec une bactérie et un traitement antibiotique, ces souriceaux au microbiote défini ou axéniques sont exploités pour mettre au point une méthode de colonisation intestinale, et les souris reproductrices sont tuées elles aussi, l'élevage gnotobiotique ne pouvant les reprendre. Le porteur décrit pourtant, parmi ses cinq études, une colonisation avec cinq gavages. Il écarte le poisson zèbre et les invertébrés, faute selon lui d'un microbiote anaérobie comparable à celui des humains.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle de colonisation des archées dans le tractus intestinal de souris au microbiote défini Oligo-MM12 (OMM12). Ce modèle va permettre l’étude de l’impact de la colonisation sur la physiologie intestinal et immunitaire de l’hôte. De plus, grâce à la grande stabilité intrinsèque du microbiote OMM-12, nous pourrons examiner quels sont les conséquences des archées sur la communauté microbienne tant en termes de stabilité, d’abondance ainsi que des modifications du métabolisme lié à l’hydrogène. Afin d’atteindre cet objectif, nous allons tester 5 stratégies de colonisation des souris avec les archées intestinales : 1.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 2.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux axéniques 3.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique 4.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique avec l’aide d’un traitement antibiotique 5.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 avec 5 gavages Enfin, après avoir sélectionné l’approche la plus efficace pour la colonisation des archées, nous la reproduirons deux fois indépendamment afin d’en évaluer la reproductibilité et la variance (Etude 6).
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront d’établir un modèle murin de colonisation avec des archées méthanogènes dans un microbiote définit. Ces études permettront de mieux comprendre les déterminant de la colonisation des archées intestinales chez la souris et par extension chez l’humain (dynamique temporelle, impact des bactéries, régime alimentaire). A ce jour, différentes publications montrent des corrélations entre la présence des archées et différentes pathologies chez l’humain mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les interactions archées-microbiote-hôte. Grâce à ce modèle nous pourrons étudier par la suite le rôle de ces micro-organismes, uniques en termes de structures et de métabolisme, dans le contexte de maladies inflammatoires de l’intestin et d’allergie.
Procédures
42 souriceaux seront gavés 1 à 3 fois par une solution non-irritante, chaque gavage durant moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La colonisation intestinale par les archées ne devrait pas induire d’inconfort ou de douleurs plus importantes que le stress induit par le gavage lui-même. Un premier essai de colonisation dans les souris OMM-12 adultes a montré que le gavage par des archées méthanogènes n’induit pas d’effet indésirable comme la perte de poids ou une augmentation du stress des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements terminaux, effectués en fin de procédures et sous anesthésie, ne permettant pas leur réveil. Les animaux utilisés pour la reproduction seront mis à mort car ils ne peuvent être réintroduits dans l’élevage gnotobiotique.
Remplacement
Nous avons jusqu’à présent fait des tests in vitro sur des lignées cellulaires et des organoïdes afin d’explorer le rôle des archées intestinales sur l’inflammation et la barrière intestinale. Toutefois, l’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour tester notre hypothèse car il n’existe pas de méthodologie alternative permettant d’analyser les interactions hôtes-microbiotes dans le contexte intestinal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, nous n’entreprendrons certaines études du projet uniquement si nécessaire. Le nombre d’animaux est constant dans chaque étude, avec 6 animaux pour chacune des 5 premières études. Il y aura 2 groupes de 6 animaux dans l’étude de réplication. Ce nombre est suffisant pour déterminer si la colonisation des archées est réussie et pour vérifier s’il existe un biais lié au sexe. Des tests statistiques seront menés afin de valider l’impact sur le poids des souris, la stabilité de la colonisation, de quantifier les potentielles modifications du microbiote et de déterminer la variance du modèle.
Raffinement
L’état de santé de l’animal est contrôlé lors des repas et du nettoyage des cages par les animaliers, et quotidiennement par l’expérimentateur. Avant et durant l'expérimentation, l'environnement des animaux sera enrichi par des éléments spécifiques (refuge, cellulose ou cylindre de coton). En cas de complication majeure, impossible à traiter et incompatible avec la poursuite du protocole, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin nous permet d'analyser l'interaction des trois composants : le microbiote, les archées et la réponse de l’hôte. Il n’est pas possible de mener cette étude en utilisant les poissons zèbres ou des invertébrés car ceux-ci ne possèdent pas de microbiote anaérobie similaire aux humains et ni les conditions physico-chimiques nécessaires à la vie des archées méthanogènes. Les souris auxquelles nous allons recourir seront des souriceaux à la naissance que nous suivrons entre la période postnatale et la période adulte (6-10 semaines).
Etude des effets d’un traitement par immunothérapie sur la croissance tumorale et le microbiote dans un modèle murin de cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent spontanément un cancer du foie et reçoivent des injections d'immunothérapie ainsi que plusieurs anesthésies pour un suivi par scanner, avant d'être tuées pour prélever leur tumeur et analyser leur microbiote. Le porteur décrit des injections sur animal vigile sources de stress et de douleur au point de piqûre. Il justifie le recours à ces souris par le besoin d'un organisme vivant pour relier la composition du microbiote à la réponse au traitement.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des cancers du foie. Il est le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde (nombre de nouveaux cas par an) et le deuxième plus mortel. De plus, le nombre de cas est en augmentation constante. Le CHC apparaît à la suite d’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) ou C (VHC), ou de maladies hépatiques chroniques non virales, dues à la consommation d’alcool, à l’obésité ou au diabète. Il est trois fois plus fréquent chez l’homme que chez la femme. Pendant 15 ans, un seul médicament était préconisé pour les patients dont le CHC était non opérable. Il ralentissait l’évolution de la maladie, mais permettait rarement la guérison complète. Récemment, l’utilisation de l’immunothérapie a permis d’augmenter considérablement la survie des patients, mais pour un tiers d’entre eux seulement. De nombreux articles montrent que la composition du microbiote a une influence sur la réponse des patients à l’immunothérapie. D’autre part, notre laboratoire a mis en évidence des différences dans la composition du microbiote entre mâles et femelles, chez des souris transgéniques développant un CHC. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de l’immunothérapie sur le développement du CHC chez les souris mâles et femelles. Nous suivrons la croissance tumorale au cours du traitement, par imagerie scanner et nous analyserons les modifications de la composition du microbiote au cours du traitement.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie est utilisée comme traitement dans un grand nombre de cancers, dont le CHC, mais elle n’est efficace que chez une proportion restreinte de patients. D’autre part, il a été montré que la composition du microbiote influence la réponse des patients à cette thérapie. Traiter nos souris qui développent un CHC par immunothérapie devrait nous permettre de mieux comprendre son mécanisme d’action et le rôle joué par le microbiote dans son efficacité. En outre, nous pourrons déterminer si le sexe influence la réponse au traitement. Appliqués à l’homme, nos résultats pourraient permettre d’envisager de modifier le microbiote chez des patients non-répondeurs à l’immunothérapie, pour rendre leur tumeur sensible au traitement.
Procédures
Pour pouvoir étudier le microbiote fécal, chaque souris sera mise deux fois dans sa vie dans une cage vide jusqu’à obtention d’une crotte (10 minutes au maximum). Concernant le traitement, elles recevront une injection intraveineuse dans la veine de la queue (durée maximum cinq minutes, comprenant le temps de contention et de préparation de la veine) et six injections intrapéritonéales (durée maximum une minute par injection), à raison de trois injections par semaine. Chaque injection sera précédée d’une anesthésie gazeuse d’une durée de 7 à 10 minutes pour réaliser l’imagerie de la tumeur par scanner.
Impact sur les animaux
A l’âge de 3 semaines, les animaux seront identifiés par la pose d’une bague à l’oreille. Seuls les reproducteurs auront l’extrémité de la queue coupée pour vérifier le génotype. Lorsqu’ils entreront dans le protocole (procédure 2), les animaux recevront une injection de produit de contraste dans la veine caudale (environ trois minutes, comprenant la contention et la préparation de la queue), puis 3 injections intrapéritonéales par semaine, pendant deux semaines, de l’anticorps d'intérêt ou de l’anticorps contrôle (une minute par injection). Toutes les injections se feront sur souris vigiles, ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. Néanmoins, les injections étant rapides, elles ne devraient pas entraîner plus de stress que l'anesthésie gazeuse. Enfin, les souris subiront trois anesthésies gazeuses au total pendant la durée du traitement pour réaliser l'imagerie par scanner.
Devenir
A la fin du traitement, les souris seront mises à mort, pour prélever leur tumeur et étudier l’effet du traitement.
Remplacement
Un nombre croissant de publications montrent un lien entre la composition du microbiote intestinal et la réponse des patients atteints de cancer à l’immunothérapie. Pour mieux comprendre ce lien, nous avons besoin d’un organisme vivant. C’est pourquoi, nous utilisons des souris transgéniques qui développent un cancer du foie.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique qui a permis de déterminer qu'il fallait au minimum 9 mâles et 9 femelles pour chacun des deux groupes (un groupe recevant le traitement et un groupe contrôle), soit 36 animaux, pour que les résultats soient statistiquement significatifs. Comme nous utilisons le nombre minimum, nous conserverons deux mâles et deux femelles supplémentaires, au cas où une des souris entrées dans l’expérience décède. D’autre part, grâce au suivi par imagerie, nous pourrons homogénéiser les groupes en terme de taille de tumeur au début du traitement et être sûrs de ne traiter que des souris ayant développé un CHC, ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats solides.
Raffinement
Les cages contiennent du coton pour permettre la formation d’un nid. Les femelles gestantes sont isolées avant la mise bas et jusqu’au sevrage des petits. A partir de deux semaines avant l’apparition supposée de la tumeur, l’observation minutieuse de l’état général des animaux sera effectuée 2 à 3 fois par semaine, pour détecter tout signe de souffrance lié au développement de la tumeur, en particulier un gonflement abdominal.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose pour se rapprocher au mieux du développement du cancer chez le patient. Dans le cas du CHC, il est possible d’utiliser des rats traités avec un cancérogène chimique, mais le traitement chimique est plus douloureux. De plus, il risque d’avoir des effets sur le microbiote qui masquent ceux dus au développement de la tumeur. Comme nous souhaitons suivre l’effet du traitement lorsqu’une tumeur est présente, nous utiliserons des souris à partir de 20 semaines (âge auquel une tumeur est détectable par scanner). Nous utiliserons des animaux des deux sexes, pour étudier les différences éventuelles dans la composition du microbiote et la réponse au traitement entre mâles et femelles,.
Mise au point d’un modèle murin récapitulant l’inflammation chronique intestinale observée dans une nouvelle maladie génétique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont génotypées par biopsie de la queue et, pour 240 d'entre elles, une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson pendant six jours, afin de reproduire l'inflammation intestinale associée à une maladie génétique rare. Le porteur indique que la colite peut entraîner perte de poids et sang dans les selles, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré car il interférerait avec les objectifs scientifiques. Il décrit des travaux in vitro préalables mais conclut qu'il n'y a "pas d'alternative" à l'étude chez la souris pour observer la migration des cellules immunitaires vers l'intestin.
Objectifs
Le protocole animal que nous souhaitons soumettre a pour but d’étudier une souris déficiente pour un gène responsable du une nouvelle maladie du tissu conjonctif que se transmet sur le mode homozygote en combinant principalement des anomalies vasculaires et squelettiques. Cette maladie est associée à une dérégulation de la voie de signalisation contrôleant la prolifération et la différenciation cellulaires mais aussi modulant les réponses immunitaires. En effet, nous avons observé chez l’homme que ce défaut est associé dans 50 % des cas à des anomalies immunitaires et notamment à une maladie inflammatoire intestinale. Le rôle exact de ce gène dans l’inflammation chronique intestinale reste à définir. Notre but est donc de mettre au point un modèle de colite mimant celle compliquant le défaut génétique pour comprendre les mécanismes à l’origine des dysfonctionnements de l’immunité intestinale et éventuellement disposer d’un modèle préclinique pour tester des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce modèle de souris nous permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de l'inflammation intestinale chronique qui complique une nouvelle maladie monogenique du tissu conjonctif causée par des mutations récessives du gène étudié. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale chez ces patients atteints. À terme, ce projet pourrait conduire au développement de traitements permettant de prévenir ou d'arrêter le développement de maladies digestives chez les patients présentant ce défaut génétique.
Procédures
1980 animaux seront génotypés par biopsie de la queue. La colite sera induite dans 240 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson pour 6 jours. Aucun prélèvement ou procédure chirurgicale est prévu.
Impact sur les animaux
Le génotypage invasif (par biopsie de queue) pourrait provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. L’invalidation constitutive du gène d’intérêt pourrait déclencher de l’inflammation intestinale soit spontanée chez les animaux adultes soit induit par administration de DSS (âgés de plus de 8 semaines) avec perte de poids ou sang dans les selles.
Devenir
Afin d'avoir accès au tissu intestinal pour caractériser le système immunitaire, tous les animaux seront tués à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. Par exemple, les conséquences moléculaires de la perte du gène IPO8, responsable de l'inflammation chronique intestinale observée dans une nouvelle maladie génétique, ont déjà été étudiées in vitro pour réduire le besoin d'expérimentation animale. Cependant, les maladies inflammatoires intestinales impliquent la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, suivie de l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.
Réduction
Le nombre de souris utilisé a été déterminé dans le but de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en minimisant les variations inhérentes à la recherche biologique in vivo. Le protocole d'induction de l'inflammation intestinale aiguë a été optimisé pour obtenir un développement homogène des maladies chez des souris génétiquement identiques. Ce nombre tient compte d'un minimum de cellules à collecter pour les analyses et inclut également le nombre de contrôles nécessaires pour analyser les résultats avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Des points limites et intermédiaires ont été établis pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Le bien-être des souris sera surveillé quotidiennement par le personnel de l'animalerie et trois fois par semaine par les chercheurs. Cela permet une prise en charge immédiate de l'animal et donc une réduction de la souffrance, puisque l'utilisation d'analgésiques ne peut pas être envisagée car ceux-ci interfèrent avec les objectifs scientifiques de l’étude. De l’aliment et de l’eau gélifiés seront ajoutés dans les cages des animaux présentant des signes cliniques mais n’ayant pas encore atteint les point limites finaux. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des maisonnettes en cartons, de coton de nidification, de bâtonnets à ronger et de cylindres sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement.
Choix des espèces
La souris est un modèle d'étude pertinent pour comprendre les réponses immunitaires chez les mammifères, car elle possède tous les composants clés du système immunitaire inné et acquis. Le fonctionnement et les molécules du système immunitaire des souris sont bien caractérisés et présentent de nombreuses similitudes avec le système immunitaire humain. Par conséquent, les résultats expérimentaux obtenus avec des souris sont souvent transposables aux humains. De plus, la souris offre un modèle de référence pour les études immunologiques, notamment grâce à la disponibilité de nombreux modèles transgéniques et knock-out, ce qui permet d'approfondir les mécanismes impliqués. En plus, le modèle de colite aiguë proposé ici est bien standardisé, permettant de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de plasmides dans la veine de la queue pour déclencher des tumeurs du foie, certaines recevant aussi des molécules anticancéreuses, avec un suivi par imagerie tous les quinze jours. Le porteur affirme que la nuisance de la manipulation reste temporaire et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît au stade précoce, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut provoquer des souffrances. Il décrit des tests in vitro sur cellules et organoïdes de foie mais conclut que la validation chez la souris est "indispensable" pour confirmer l'implication des gènes candidats.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une pathologie complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance au traitement. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de cancérisation est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Pour cela, nous envisageons d'injecter par voie intraveineuse des plasmides, qui s'intégreront dans les hépatocytes (cellules du foie). Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs dans un foie sain.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance globale de l'ensemble de la manipulation n'est que temporaire (
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (p
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’hébergement). La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par imagerie non invasive ("photon counting micro computed tomography" et/ou bioluminescence/fluorescence). En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Effets de bactéries anti-inflammatoires dans un modèle murin d’inflammation de la muqueuse intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant onze jours, elles reçoivent des gavages quotidiens et une injection d'un agent anticancéreux qui enflamme la muqueuse intestinale, avec pesées et prélèvements répétés, pour tester des bactéries probiotiques contre cette mucosite. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, un pelage hérissé et une apathie comme dommages attendus, et tue les souris en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que l'animal reste "le seul moyen" de reconstituer les interactions entre le microbiote et le système immunitaire.
Objectifs
La mucosite est une inflammation et/ou une ulcération de la muqueuse du tractus digestif, en particulier buccale et intestinale. Elle est un problème majeur rapporté chez 50 à 80 % des patients subissant une chimiothérapie, affectant significativement leur qualité de vie. Cette inflammation peut être provoquée par l´agent anti-cancéreux utilisé. Plusieurs études ont montré qu’elle était associée à une modification du microbiote sain et induisant une aggravation des effets de la chimiothérapie (diarrhée, saignement dans les selles, douleurs abdominales, perte de poids). Dans ce contexte, il est nécessaire de trouver des traitements qui restaurent un microbiote intestinal sain. De nombreuses bactéries probiotiques ont été décrites comme des outils prometteurs pour le traitement et la prévention des inflammations intestinales. Ceci a été démontré dans de nombreux modèles précliniques. Le but de ce travail est d'étudier les effets anti-inflammatoires d’une famille de bactéries probiotiques, sur la mucosite murine expérimentale induite par un agent anticancéreux particulier. L’emploi de ces bactéries comme agent préventif et thérapeutique contre la mucosite constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de l’inflammation intestinale chez les patients sous traitement par l´agent anti-cancéreux. Dans ce modèle, l’agent anticancéreux induit une inflammation des tissus semblable à celle retrouvée chez des patients présentant des effets secondaires. La réponse immunitaire développée suite au traitement peut être étudiée en détail. Le projet sera réalisé en 2 étapes : • Validation du modèle de mucosite dans nos conditions expérimentales • Evaluation des effets préventifs et thérapeuthiques des bactéries ou de composés qui en dérivent sur l’inflammation intestinale ; Analyser l'effet de ces administrations sur la composition du microbiote intestinal avant, pendant et après mucosite ; Evaluer l'action des bactéries ou composés dans l'amélioration des signes cliniques en cas de mucosite due à l´agent anti-cancéreux. Ces bactéries ainsi que leurs composés ont été testées précédemment lors d’essais in vitro et in vivo sur un modèle d’inflammation aigüe reproduisant les symptômes des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Suite à des résultats positifs concernant leur effet anti-inflammatoire sur une inflammation aigüe, nous souhaiterions évaluer leur efficacité sur une inflammation due à l’agent anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
Actuellement, une grande majorité des patients cancéreux traités par cet agent anti-cancéreux développe des effets secondaires au niveau intestinal tels qu’une inflammation de la muqueuse appelée mucosite, due principalement à la réponse inflammatoire. Ceci induit des modifications tissulaires et favorise l’altération du microbiote et de l’équilibre intestinal. L’ensemble de ces modifications participe au développement de diarrhée et d’hémorragies intestinales. Ces effets, en plus des contraintes liées au traitement et à la maladie, contribuent très souvent à une baisse de moral des patients combinée à une importante perte de poids. De plus, à l'exception des traitements palliatifs (anesthésiques ou antibiotiques dans les cas graves), il n'existe aucune option thérapeutique connue pour prévenir la mucosite intestinale induite par la chimiothérapie. Il est donc important de développer d’autres approches complémentaires qui préservent les effets thérapeutiques de cette chimiothérapie mais qui protègent contre ses effets secondaires au niveau intestinal. Parmi ces nouveaux traitements se trouvent les probiotiques, qui sont des micro-organismes (bactéries ou levures) vivants ayant des effets bénéfiques sur l’organisme. Beaucoup de bactéries déjà utilisées comme probiotiques, sont des candidates potentielles car leurs effets anti-inflammatoires au niveau intestinal ont déjà été prouvés sur d’autres pathologies, sans effet secondaire. Des bénéfices en termes de connaissances sur l’interaction hôte - microorganisme, plus particulièrement microbiote intestinal - santé intestinale pourront être obtenus au cours de ce projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Nous aimerions savoir si les bactéries testées sont capables d'améliorer les signes cliniques de la mucosite et quels changements induisent-elles au niveau de la réponse immunitaire et histologiques pour y parvenir. Pour les nouveaux microorganismes n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera plus longue mais constitue un objectif d’amélioration du bien-être (réduction des effets secondaires au niveau intestinal du traitement et amélioration de la qualité de vie des patients sous traitement).
Procédures
- Pesée quotidienne pendant 11 jours, une pesée dure environ 5-10 secondes, animal vigile, 448 animaux. - Gavage intra gastrique quotidien de 10 secondes maximum pendant 11 jours, animal vigile, 448 animaux. - Isolement des souris pendant 10 minutes maximum dans des pots transparents pour prélever des crottes fraiches. 3 fois pendant les 11 jours , animal vigile, 448 animaux. - Injection intrapéritonéale unique de 10 secondes d’un agent anti-cancéreux (ou de son solvant pour contrôle), animal vigile, 448 animaux. - Isolement quotidien des souris pendant 10 minutes maximum pour réaliser le score clinique. 4 fois pendant les 11 jours (2 de ces isolements seront communs à ceux réalisés pour la collecte de feces). Animal vigile, 448 animaux - injection unique pour l’anesthésie de 10 secondes pendant le 11 jours (avant le prélèvement de sang). Animal vigile, 448 animaux - Prélèvement de sang de 30 secondes après l´administration d’un traceur fluorescent (par gavage) une fois pendant le 11 jours. Animal anesthésié, 448 animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole viennent du traitement par l´agent anti-cancéreux qui provoque une inflammation des muqueuses. Les dommages principaux liés au traitement peuvent se manifester par une perte de poids, une diarrhée légère (crotte molle) ou une déshydratation due à la diarrhée. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voutée, yeux clos ou mi-clos, apathie. Lors du prélèvement de crottes et lors de la réalisation du score clinique, les animaux seront isolés pendant 10 minutes maximum, cela peut induire un stress le temps de l’isolement. Les animaux conservent cependant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres animaux. Aussi, les gavages des bactéries et des composés bactériens ainsi que l’injection intrapéritonéale et le prélèvement de sang peuvent entrainer un stress et/ou une douleur le temps de la manipulation.
Devenir
A l’issue de chaque prodédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes pour de futures analyses.
Remplacement
Le présent projet vise à étudier l’effet du microbiote intestinal, plus particulièrement d´une espèce bactérienne en particulier, sur la réponse immunitaire des animaux, principalement son effet anti-inflammatoire lors d’une inflammation due à un agent anti-cancéreux précis (et déjà employé en médecine humaine). A l’heure actuelle, l’utilisation des animaux reste le seul moyen qui permet de reconstituer l’environnement et les interactions complexes que l’on retrouve entre le microbiote et le système immunitaire d’un être vivant.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données issues de la littérature et acquises les années précédentes sur des modèles similaires comparables ont permis de calculer les tailles de groupes. Le nombre obtenu correspond au maximum d’animaux qui peuvent être utilisés par groupe. Au total, nous utiliserons 448 animaux.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où nous injectons l’agent anti-cancéreux aux animaux, un score clinique individuel est établi chaque jour. Les critères observés seront l’aspect des fécès (diarrhée), l’aspect du pelage, la posture, la réponse face au stimulus, la locomotion et la déshydratation de chaque animal. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Des traitements seront mis en place si les animaux présentent des signes de douleur ou stress. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux seront hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton ou en polycarbonate. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. La surveillance, les injections, prélèvements et manipulations seront réalisés par des expérimentateurs formés et maitrisant ces gestes afin de réduire au maximum le temps de manipulation et donc le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est le modèle d’étude dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, car leur développement intestinal est relativement similaire à celui de l'intestin humain et elles possèdent un grand nombre de réponses immunitaires, de microbiomes et de gènes identiques aux l´homme. Il est possible d’induire une mucosite chez la souris avec différents produits chimiques. Les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 semaines. Les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits bactériens sur une mucosite induite. De plus, cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données.
Etude de l’inactivation d’un gène pour un modèle de neurocristopathie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour un modèle génétique de malformations de la face et de l'intestin. Le porteur indique que les souriceaux les plus atteints meurent après la naissance de malformations qui les empêchent de se nourrir, et qu'une analgésie n'est pas possible pour ces animaux trop fragiles pour survivre au sevrage. La survie d'une partie est suivie pendant trois semaines au maximum avant mise à mort, tandis que des femelles et des mâles reproducteurs sont gardés et réutilisés pour d'autres portées. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour ces maladies rares et qu'il est "nécessaire" de faire naître des animaux.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motricité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée,nous inactivons un second gène. Il est décrit dans le littérature scientifique que cela avait des effets bénéfiques dans d'autres pathologies de la même famille.
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Bien que le phénotype attendu soit sévère nous utilisons 42 % des animaux produit à la naissance ou avant. Pour ces animaux il n'y aura aucune souffrance. Pour 7% nous étudierons leur survie après inactivation d'un gène, pour une période de 3 semaines maximum. Les animaux seront observés et monitorés selon les points limites décrits dans le projet. Enfin 59% sont des animaux d'élevage pour lesquel il n'y aura aucune souffrance. Pour suivre les animaux reproducteur nous effectuerons avant leur 15jours un tatouage aux phalanges en conformité avec les recommandations de la CNEEA et sous la supervision de notre SBEA. En outre pour le génotypage de nos animaux, nous effectuerons 1 biopsie de moins d'un millimètre de large à l'oreille.
Impact sur les animaux
Les animaux les plus sévèrement atteint meurent après la naissance à cause de multiples malformations qui les empêches de se nourrir et de digérer normalement. La gravité de ces malformations est variable d'un individu à l'autre et les points limites nous permettrons de minimiser la souffrance de ces animaux. Une analgésie n'est pas possible pour ces animaux fragiles qui ne survivront pas jusqu'au sevrage. La biopsie pour le génotypage des individus pourra produire douleur légère de courte durée au moment du prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure car leur maladie est sévère et incurable. L'euthanasie sera suivi de prélèvement post mortem pour des études de biologie moléculaire et d'histologie.
Remplacement
Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux à faire naitre, nous obtimisons nos croisements pour maximiser les chances d'obtenir. Pour la réalisation d'une coube de survie, la dispersion le long de l'axe temporel nécéssite que nous utilisions 10 individus pour nos statistiques. hormis cette expérimentation, toutes nos analyses sont réalisés sur des tissus post-mortem. La pénétrance du phénotype étant variable d'un individu à l'autres 10 individus permet de nous assurer que nos conclusions sont robustes.
Raffinement
Les femelles seront regroupées et réutilisées après l'expérimentation pour générer d'autres portées. Les points limites prédictifs et précoces sont en place pour éviter toute souffrance aux animaux. (mise à mort si perte de poids, euthanasie des animaux avant l'apparition des tumeurs chez nos animaux reproducteurs. Les mâles reproducteurs devront être isolés après les accouplements car il n'est plus possible de les mettre entre mâles et les laisser avec des femelles engendrerrait trop de portées inutiles. Les cages font déjà l'objet d'un enrichissement important dans toutes les cages. Les cages ouvertes dans notre animalerie permet des échanges olfactifs et visuels. Les mâles pouvant reservir pour de nombreux accouplement nous les gardons pour les réutiliser.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Nous travaillons à la compréhension du famille de maladie du developpement induisant des malformations graves chez les enfants. Nous travaillons donc à un stade embryonnaire E15,5 et avec des animaux nouveaux-nés. Nous travaillons aussi avec quelques animaux en période de lactation pour évaluer l'évolution de la pathologie les jours suivants la naissance après des traitements correcteurs.
Etude du rôle des cellules stellaires hypertrophiées dans la fibrose hépatique sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises jusqu'à vingt semaines à un régime gras destiné à provoquer une fibrose du foie, elles reçoivent jusqu'à onze injections intraveineuses sous anesthésie, avec un risque de lésion ou de douleur de l'œil. Le porteur indique que le régime entraîne une perte de poids les premières semaines puis une reprise, et que toutes les souris développent la fibrose. Leur foie est prélevé après la mise à mort pour récolter les cellules étudiées.
Objectifs
La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Or il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de ce projet est d’étudier un type de cellules du foie, connu pour être impliqué dans la fibrose hépatique, les cellules stellaires hépatiques. Il a été récemment découvert que certaines de ces cellules prenaient une forme particulière lors de la maladie hépatique, qualifié de cellules stellaires "hypertrophiées". Ces cellules ont été découvertes à la fois sur des modèles animaux et sur des biopsies de patients atteints de fibrose hépatique. Nous évaluerons dans un modèle murin qui mime la fibrose hépatique chez l’homme, l’efficacité d’un traitement sur la disparition de la fibrose et la forme des cellules stellaires. L’étude approfondie de ces cellules au cours de ce projet permettra de mieux comprendre leur rôle dans la fibrose hépatique et de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la fibrose du foie.
Bénéfices attendus
La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude pourra permettre d’identifier des cibles potentielles pour le développement de médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.
Procédures
Les administrations de molécules thérapeutiques seront réalisées par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie 10 min, durée de l’injection 30 secondes) toutes les 2 semaines pendant 5 mois maximum, soit 11 injections au maximum. A la fin de l’expérience, une anesthésie profonce de l’animal est réalisée (injection de l’anesthésique = 20s) et un prélèvement sanguin est réalisé (30 secondes). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique (riche en gras et à quantité contrôlée en acides aminés) pendant 20 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. Les injections répétées peuvent induire un stress, une lésion ou des douleurs potentielles de l’œil.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin des expériences car il est indispensable de récupérer le foie pour récolter les cellules d’intérêt ou de récolter leur foie et leur sang pour étudier les effets du traitement testé sur la fibrose hépatique.
Remplacement
Les expérimentations nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations de notre molécule in vitro pour ne tester chez l’animal que celles optimales.
Réduction
Ce modèle de fibrose hépatique présente une très faible variabilité d’apparition de la maladie entre les souris (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Mais la qualité des cellules d’intérêt obtenues à partir du foie des souris ayant développée une fibrose peut être variable. Ainsi le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pour obtenir un nombre suffisant de résultats exploitables. De plus suivant les durées de régime, l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins variable. Ainsi, le nombre d’animaux nécessaire pour étudier l’efficacité d’agents thérapeutiques a été calculé pour pouvoir exploiter les résultats statistiquement. Toutes les expériences seront réalisées d’abord sur un premier petit groupe d’animaux, la validité statistique des résultats sera testée, et l’expérience sera poursuivie sur des animaux supplémentaires si nécéssaire. Ainsi, le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Dans un souci de réduction, certains animaux âgés de 6 à 18 mois seront des anciens reproducteurs issus de fournisseurs agrées.
Raffinement
Ce régime entraine une perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines. Les souris reprennent ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des expériences. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.
Choix des espèces
Pour ce projet, l’espèce animale choisie est la souris. Les modèles de maladie hépatique chez la souris, en particulier de fibrose hépatique, ont été très largement décrits dans la littérature et sont bien connus. La souris présente en effet les mêmes étapes de développement de la maladie que la fibrose humaine, ce qui en fait une espèce de choix pour l’étude de nos cellules d’intérêt et l’élaboration de nouveaux agents thérapeutiques. Comme cela est largement décrit dans la littérature, les animaux malades utilisés devront être des souris âgées de 6 semaines (1,5 mois) afin de s’assurer que leur système gastro-intestinal soit bien développé. Et les souris contrôles devront être âgées de 6 mois à 18 mois pour obtenir un nombre suffisant de cellules d’intérêt (car plus les souris sont âgées plus le nombre de ces cellules augmente).
Etude des mécanismes de réparation tissulaire de la jonction anorectale et de leurs conséquences sur le développement des cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
109 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines, génétiquement modifiées, développent spontanément un cancer anorectal accompagné d'une inflammation intestinale, avec perte de poids, prostration et diarrhée à partir de six ou sept mois. D'autres subissent des microlésions de la jonction anorectale qui provoquent des saignements de l'anus, ainsi que des injections rétro-orbitaires et une phalangectomie. Le porteur évoque les organoïdes comme alternative mais affirme qu'aucun ne reproduit aujourd'hui cette région, et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Avec plus de 40 000 cas par an en France, le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Les services de santé publique s’accordent tous sur le fait que ce nombre de cas sera plus que doublé d’ici 2035. Faute de connaissance des mécanismes précoces conduisant à ce cancer, son diagnostic est très souvent tardif expliquant une prise en charge à un stade trop avancé de la maladie et donc le fort taux de mortalité. Il y a donc urgence de comprendre les étapes précoces de la maladie pour la soigner à son début. Ce cancer se localise préférentiellement dans la partie basse du rectum dans la région entre le rectum et l’anus, appelé la jonction anorectale. Chez l’Homme plusieurs arguments suggèrent que des micro-cassures spontanées de la région anorectale notamment lors du passage de selles, provoqueraient une entrée des bactéries qui vivent dans le rectum et donc créeraient une inflammation à l‘origine du cancer. Ce projet de recherche vise à comprendre comment la région anorectale se répare pour prévenir l‘entrée des bactéries et de l’inflammation. L’hypothèse basée sur des études antérieures suggère que le système immunitaire et plus particulièrement certains globules blancs contribuent à la réparation de la jonction anorectale.
Bénéfices attendus
Ainsi, en validant que certains globules blancs sont capables réparer les micro-cassures de la jonction anorectale, ce projet devrait permettre de considérer les patients présentant un défaut de ces globules blancs comme des sujets à risque de développer un cancer colorectal et ainsi de mettre en place une prise charge à un stade très précoce la maladie afin d’augmenter leur survie.
Procédures
Certains animaux servent à l’élevage et ne subissent pas de gestes techniques autres qu'une phalangectomie, d’autres subissent au maximum une unique procédure avant la mise à mort, consistant à réaliser des microlésions de la jonction anorectale, cette intervention sera réalisée une unique fois par animal.
Impact sur les animaux
Les souris ayant une réponse incomplète à la molécule d'intérêt développe un cancer anorectal, associé à une inflammation intestinale qui se manifeste par la perte de poids de la souris, sa prostration et la présence de diarrhée, à partir de 6-7 mois de vie. La procédure de microlésions de la jonction anorectale peut provoquer des micro saignements de l’anus, observables par tapotement avec un mouchoir en papier blanc (petites traces rouges). Ces micro saignements ne durent pas plus de 30 minutes. L’injection intra- veineuse par voie retro-orbitaire est une procédure courante, mais qui peut toutefois causer une douleur courte. Dans l’ensemble des procédures, les contentions des souris sont également une source de stress à ne pas négliger.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort soit suite à la fin des procédures, soit lorsqu’un point limite est atteint.
Remplacement
Une alternative à l’utilisation d’animaux pour des pathologies intestinales serait la génération d’organes in vitro, appelé organoïdes qui, en théorie, impliquerait un seul animal. Si ces organoïdes de côlon sont facilement mis en place dans les laboratoires, il n’existe pas aujourd’hui de méthode permettant la génération d’organoïdes comprenant l’anus, le rectum et la jonction anorectale. La génération de tels organoïdes reste encore un challenge technologique qui impliquerait plusieurs dizaines d’animaux du fait que cette région est unique. Par ailleurs, des bactéries commensales devraient être placées dans la lumière. Une telle approche alternative demanderait dans ses mises au point plus de 30 souris. Par ailleurs, les facteurs physiologiques tels que les tensions physiques dues au passage des selles ne seraient pas prises en compte, excluant toutes conclusions physiologiques des observations qui pourraient être faites in vitro.
Réduction
Le développement de la pathologie dans les souris développant un cancer anorectal est standardisé. 100% des animaux développent spontanément un cancer. Par ailleurs, le site de transformation est très précis et spécifiquement localisé à la jonction entre l’anus et le rectum. Ces conditions font que nous obtenons une puissance statistique forte avec 6 animaux par groupe par rapport aux modèles d’injection de cellules tumorales ou d’agents oncogéniques communément utilisés en cancérologie (le nombre de souris a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistique). Le genre n’ayant pas d’effet sur la pathologie observée, les animaux des deux sexes seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux générés Par ailleurs, les moelles osseuses des animaux mis à mort seront systématiquement congelées. Elles permettront de recréer un système immunitaire génétiquement modifié dans des souris receveuses. Une moelle pouvant générer un système immunitaire dans plus de 20 souris, ces moelles seront partagées avec des chercheurs du monde entier, évitant la génération d’animaux.
Raffinement
Les procédures de microlésions impliqueront en plus d’une anesthésie gazeuse, une injection d’analgésique et une pommade anesthésiante, appliquée en région anale 5 min avant les microlésions. Ces 2 produits sont efficaces dès les premières minutes et durent entre 1h30 et 4h, délai au-delà duquel la fonction de défécation doit être revenue. Par ailleurs, le geste de microlésion est maitrisé par les expérimentateurs qui ont été formés par l’équipe ayant décrit la méthode des microlésions. Les animaux ne seront jamais isolés directement afin d’éviter tout stress et si un isolement est obligatoire il se fera via un système de plexiglass assurant un maintien olfactif et visuel. En plus des observations faites par les responsables de protocoles et le personnel technique, une observation quotidienne des animaux par les responsables bien être sera réalisée. Les expérimentateurs surveilleront le moindre signe de souffrance de l'animal selon un système de score, ce qui permettra une réponse adaptée à la douleur en question.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire impose que cette étude ne se fasse que dans un système proche de celui de l’Homme. La souris, apparaît comme un modèle d’expérimentation animale de choix. De plus la physiologie de la jonction anorectale est identique à celle de l’Homme et correspond à une région à fort potentiel de transformation. Enfin, les outils d’analyse indispensables à ce projet de recherche, sont développés chez cette espèce animale. Pour les souris dont le phénotype est potentiellement dommageable, les premiers signes cliniques sont observés après l’âge de 6-7 mois de vie. Dans ce contexte, y compris pour les accouplements, aucun animal au-delà de 6-7 mois de vie ne sera utilisé. La maturité du système immunitaire au niveau de l’intestin est établie après 2 mois. Tous les animaux utilisés en procédure auront entre 2 et 6 mois de vie.