Système gastrointestinal

2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique, des injections répétées et un suivi de la tumeur du foie par imagerie, jusqu'à un point limite au-delà duquel elles peuvent maigrir, s'isoler ou devenir agressives. Le porteur situe les retombées cliniques à long terme et au conditionnel. Il affirme que l'utilisation des souris reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement tumoral.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier des cellules du système immunitaire, les populations lymphoïdes, afin d’identifier celles qui sont impliquées dans le contrôle du développement des cancers du foie. Nous souhaitons également dans ce projet étudier le rôle de deux voies de signalisation cellulaire dans la fonction de ces populations cellulaires. Nous espérons ainsi définir clairement les différentes populations lymphoïdes impliquées dans le développement du cancer du foie et mettre en évidence un rôle déterminant des voies de signalisations dans leurs fonctions au sein de la tumeur. Nous espérons à l’aide de ces premiers résultats, qui seront complétés par des expérimentations in vitro, pouvoir améliorer l’efficacité des cellules lymphoïdes à l’encontre des cellules cancéreuses du foie afin de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Bénéfices attendus

Premièrement, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du développement du carcinome hépatocellulaire et du rôle joué par les populations lymphoïdes. Ensuite, ce projet nous permettra également de connaître le rôle de deux voies de signalisation cellulaire majeures dans la fonction des cellules lymphoïdes innées à l’encontre des cellules cancéreuses. Enfin, nous espérons démontrer qu’il est possible d’améliorer la fonctionnalité de ces cellules lymphoïdes innées grâce à la modulation de ces voies de signalisation et ainsi proposer une ou des nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie. Les résultats obtenus grâce à ce projet, pourront permettre d’explorer par la suite cette ou ces approches pour une application en clinique en vue d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Ainsi à long terme, ces expérimentations s’inscrivent dans une recherche visant à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Procédures

Les souris pourront subir une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique sur une hauteur de 2cm environ. Cette procédure chirurgicale aura lieu une seule fois et durera environ 30minutes. Les souris pourront recevoir des injections en intrapéritonéale, cette procédure dure quelques secondes et l’animal est contentionné pendant moins d’une minute. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par jour durant toute la durée de l’expérimentation. Les souris pourront recevoir des injections en intraveineuse. Pour cela la souris est contentionnée durant 2-3 minutes et l’injection dure quelques secondes. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par semaine durant 7 semaines. Un prélèvement sanguin au niveau sub-mandibulaire pourra être réalisé une seule fois. Cette procédure dure moins d’une minute. Le suivi de la pousse tumorale chez les souris sera réalisé par imagerie. Pour cette procédure, les souris devront être immobilisées durant environ 30min et la procédure sera réalisée au maximum 14 fois durant toute la durée de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les animaux ne présentent habituellement aucun signe de souffrance avant que la tumeur atteigne la taille que nous avons fixé comme point limite. Il est alors possible que les animaux commencent à montrer des signes de stress physique et comportementale. D’un point de vue comportemental, les souris peuvent acquérir un comportement asocial, voir agressif ce qui n’est pas le comportement habituel de l’espèce. Nous pouvons observer aussi un arrêt de la toilette et possiblement une dépilation volontaire signe d’une détresse. D’un point de vue physique, nous pouvons observer un amaigrissement, notamment au niveau du bassin de l’animal, signe d’une perte d’appétit de l’animal lié à une détresse causée par une taille de tumeur importante. L’injection intra-veineuse par la veine caudale d'un grand volume de solution peut entrainer une douleur transitoire. Les autres injections par voie intrapéritonéale ou intraveineuse n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront développé une tumeur.

Remplacement

Dans la mesure du possible, les études que nous menons sont réalisées dans des modèles in vitro de cultures cellulaires. Cela nous apporte de nombreux éléments qui nous permettent d’affiner nos hypothèses ou d’en émettre de nouvelles. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement tumoral afin d’étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses précises à nos problématiques de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. Une veille scientifique continue sera également effectuée, afin d’éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire leur nombre autant que possible, tout en permettant d’identifier des effets biologiques suffisamment fiable, évalués par des analyses statistiques valides. Nos calculs ont pris en compte la variabilité interindividuelle ainsi que l’effet attendu. Afin d’améliorer la relevance de ces résultats, nous avons décrit trois modèles permettant d’induire un cancer du foie. Ces modèles ne seront pas réalisés de manière concomitante. Ainsi, bien évidemment, si une hypothèse est invalidée dans le premier modèle étudié, elle ne sera pas testée dans les autres modèles afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leur stress au cours de la procédure. Une fiche de suivi sera tenue, de manière journalière la semaine suivant l’induction de la tumeur puis de manière tri-hebdomadaires jusqu’à la fin de la procédure afin de vérifier l’état général des animaux et de prévenir toute souffrance évitable. Les animaux bénéficient des conditions normales d’hébergement et de soins de notre animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit, enrichissement des cages, nourriture à volonté). Toutes les souris en expérimentation possèderont du coton dans les cages en tant qu'enrichissement. De plus, dès que les souris commenceront à présenter une perte de poids détectable, de la nourriture en gel ou des crochets humides seront ajoutées dans leur cage. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation contraignante ou invasive sera réalisée sous anesthésie générale par voie gazeuse et la douleur sera prise en charge par administration d’antalgiques. Lors des chirurgies, le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure en évaluant les réflexes et la respiration. Pour prévenir une potentielle baisse en température, les animaux seront placés sur un coussin chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours des procédures. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, une mise à mort anticipée de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Pour le moment, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement adéquat pour étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses à notre problématique de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. De plus, l’existence de lignées de souris transgéniques permet des études mécanistiques approfondies qui nous permettront de mieux décrypter les voies de signalisation impliquées dans la fonction des cellules lymphoïdes et ainsi dans le contrôle de la progression du cancer du foie. Par ailleurs, il est à noter que le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, au niveau des composants moléculaires et cellulaires, ce qui nous permet d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans le processus tumoral, et d’envisager par la suite un transfert de technologie chez l’homme. Pour ce projet, les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6 à 12 semaines afin d’être proche de la situation de la pathologie humaine. Les souris présenteront ainsi un système immunitaire pleinement fonctionnel.

378 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des injections intraveineuses ou intrapéritonéales répétées, jusqu'à seize sur soixante jours, avec prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie, pour évaluer une stratégie de ciblage des chimiothérapies vers la tumeur. Le porteur indique une nécrose tumorale possible et un stress lié aux manipulations, sans détailler de test comportemental. Il décrit des travaux préalables in vitro et sur organoïdes humains, tout en affirmant que le modèle animal reste un "prérequis obligatoire" avant tout essai clinique.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Comme pour la plupart des cancers, l’une des limitations actuelles dans la prise en charge de ce cancer est la toxicité des traitements dont les effets délétères sur la qualité de vie du patient peuvent conduire jusqu’à imposer un arrêt de la thérapie. Afin de surmonter cette limitation nous avons développé une stratégie qui devrait permettre de cibler les chimiothérapies dans la tumeur sans affecter les tissus sains. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo le potentiel thérapeutique de cette stratégie.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’établir une preuve de concept à visée clinique (au-delà de la portée du présent projet). Les enjeux sont, in fine, de mettre à la disposition des cliniciens oncologues une stratégie de délivrance sécurisée de médicaments pour la prise en charge du cancer colorectal. Les bénéfices attendus sont d’améliorer l’efficacité des traitements, de diminuer leurs effets secondaires et d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les procédures impliquent au maximum une injection sous-cutanée (en début d’expérience) et soit des injections intraveineuses ou intrapéritonéales uniques avec prélèvement sanguin, soit des injections intraveineuses ou intrapéritonéales répétées tous les 4 jours (maximum 16 sur 60 jours). Lors des études de biodistribution, les animaux subiront également des prises de sang répétées sur 24h (maximum 3) ainsi que des analyses par imagerie (maximum 4) sous anesthésie gazeuse légère.

Impact sur les animaux

Nous n’avons pour l’instant aucune donnée expérimentale permettant de prédire quels seront les effets toxiques liés à l’injection des composés. En revanche, on peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux lors des injections, de la xénogreffe et/ou de la mesure de la taille des tumeurs pour le suivi de la croissance tumorale. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables sauf nécrose éventuelle de la tumeur chez les animaux xénogreffés : il n’est pas attendu qu’une tumeur située sur le flanc de l’animal, altère la locomotion ou soit à l’origine de contraintes mécaniques chez la souris. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et ne devrait pas occasionner non plus de nuisance particulière chez l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés au terme de chaque procédure afin d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem.

Remplacement

La mise au point de la stratégie (efficacité et sélectivité de ciblage de la cellule tumorale) a été réalisée sur des modèles in vitro (cultures de cellules tumorales et non tumorales colique). Des tests ex-vivo (organoïdes générés à partir de résections chirurgicales humaines normales et tumorales) font également partie intégrante du projet. Cette stratégie de remplacement a permis d’optimiser et d’orienter le choix des composés à tester sur les modèles pré-cliniques in vivo tout en limitant considérablement le nombre d’animaux. Cependant, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique de nouvelles stratégies de traitements dans des modèles animaux, murins notamment, est un prérequis obligatoire pour, in fine, justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’homme. Ces expériences sont en effet difficilement modélisables dans d’autres systèmes et ont une valeur prédictive bien supérieure à celles réalisées in vitro ou ex-vivo. En particulier, il n’existe pas à l’heure actuelle, de systèmes alternatifs pour caractériser de façon fiable l'efficacité anti-tumorale et évaluer les effets secondaires (toxicité) de nouvelles stratégies de traitement.

Réduction

La stratégie de réduction est basée sur un mode d’incrémentation des procédures qui, étape par étape, permettra d’optimiser le protocole thérapeutique (posologie, système de ciblage, voie d’administration). La sélection progressive d’une voie d’administration, d’une stratégie de ciblage et d’une concentration de produit à administrer permettra en particulier de limiter le nombre de conditions expérimentales (et donc le nombre d’animaux) à tester au fil des procédures. D’après notre expérience, un nombre de 6 souris par groupe expérimental permet de garantir un nombre minimum de 4 animaux pour obtenir des résultats statistiquement valides, compte tenu de possibles aléas expérimentaux (prise de greffe défaillante, perte de poids trop importante voire décès).

Raffinement

Les procédures ont été optimisées au cours d’études précédentes dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés. Une fiche de soins permettra également d’assurer la prise en charge et le suivi des animaux. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions permettant d'assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie (modèles précliniques de tumeurs intestinales induites et tests de principes actifs) sont nombreuses, bien documentées et bien validées. Les souris seront âgées de 7 semaines en début d’expérimentation (souris adultes).

220 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun jusqu'à seize heures, soumises à un gavage oral d'un colorant puis isolées jusqu'à cinq heures, pour mesurer la motricité intestinale et l'effet du fer héminique apporté par la viande rouge. Divers organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique réutiliser des souris "surnuméraires" issues de l'élevage et affirme que seule une "approche in vivo intégrée" permet de reproduire l'axe intestin-cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable est l’une des pathologies intestinales chroniques très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Son origine est multifactorielle, mais des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes, notamment en raison des ballonnements causés. Bien que non établit encore chez l'Homme, un lien a été mis en évidence chez la souris entre la consommation de fer héminique, à savoir une source de fer principalement apportée par les produits carnés, et une augmentation de la sensibilité abdominale vis-à-vis d'une pression appliquée sur la paroi du côlon. Une étude est prochainement programmée pour répondre à la question de savoir si la consommation maternelle de fer héminique engendre également cette augmentation chez sa descendance. Pour ce type d’étude s’intéressant à la période périnatale, un calcul est réalisé pour ajuster au minimum le nombre de souris mises en reproduction, mais malgré tout, cette phase d’élevage, de par le caractère aléatoire de l’obtention d’une gestation et de taille des portées, génère des variabilités d’effectif et occasionne la survenue d’individus surnuméraires qui ne sont pas requis pour l’étude. N’ayant pas subi antérieurement de procédure dommageable, l’objectif est de les dédier à la mesure de la motricité intestinale (chez la souris adulte à partir des animaux reproducteurs et de sa descendance si l'effectif est conséquent) pour savoir si elle est altérée ou non par la consommation de fer héminique. Cette mesure de motricité est fréquemment décrite dans la littérature, elle comprend l’évaluation du temps de transit et la fréquence de défécation. Nous avons cependant peu de recul au laboratoire sur sa mise en œuvre chez la souris, particulièrement pour la mesure du temps de transit. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif (i) d’ajuster les protocoles détaillés dans la littérature pour nous permettre ensuite (ii) de réaliser la mesure de la motricité intestinale chez la souris en fonction de son régime ou du régime maternel en période périnatale.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d’améliorer notre connaissance des processus physiologiques associés à notre santé digestive. Plus spécifiquement, elle permettra de savoir si la sensibilité abdominale augmentée par la consommation de fer héminique est liée ou non à des troubles de la motricité intestinale. Sur le plan de la santé publique, cette étude contribue à mieux préciser (i) les bénéfices/risques associés à la surconsommation de ces produits carnés et (ii) les recommandations nutritionnelles en fer à préconiser aussi bien pour les patients atteints du syndrome de l’intestin irritable que pour la population générale.

Procédures

Les souris de cette étude, ayant reçu jusqu'alors uniquement un régime équilibré supplémenté en citrate de fer ou en fer héminique, subiront (i) une période mise à jeun comprise entre 0 et 16h selon les résultats de la première phase de mise au point du protocole définitif, (ii) un gavage oral par une solution semi-liquide contenant un colorant inerte non absorbable dont l'acte ne dépassera pas 10 secondes, (iii) suivi d’un hébergement en cage individuelle qui ne dépassera pas 5h avant un retour en hébergement conventionnel.

Impact sur les animaux

Pour chaque souris, les nuisances attendues sont une éventuelle baisse de la glycémie liée au jeune, associée à un stress transitoire engendré par (i) les 10 secondes de contention et d’inconfort lors de l’introduction de la sonde de gavage dans l’œsophage, suivi (ii) d'un isolement d'une durée maximale de 5 heures le temps d'attendre l'apparition de fèces contenant le colorant.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

De par la complexité des interactions de l’axe intestin-cerveau impliqué dans la motricité intestinale, aucun modèle cellulaire ou de substitution ne permet à l’heure actuelle de reproduire ce processus physiologique pour estimer un temps de transit ou une fréquence de défécation. Seule une approche in vivo intégrée est donc envisageable pour nous permettre de prendre également en compte les processus en amont liés à la digestion en fonction du régime alimentaire.

Réduction

Le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact d’un régime maternel supplémenté en fer héminique ou en citrate de fer sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept de la DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne des individus surnuméraires qui ne sont pas utilisés pour les procédures dédiées à l'étude principale (sensibilité abdominale). Nous prévoyons d’optimiser la présence de ces souris surnuméraires pour les dédier à l’évaluation de la motricité intestinale en fonction du régime déjà reçu, et ainsi éviter le recours à la réception de nouvelles souris. Pour la phase de mise au point de la méthode, aucune statistique n’est requise et nous prévoyons des très petits groupes de 2 à 3 souris. Pour appliquer le protocole finalisé au projet destiné à évaluer l’impact de la surconsommation de fer héminique (exposition chez l’adulte et en période périnatale), un nombre optimal de souris basé sur les données de la littérature (6 souris par groupe) a été retenu.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal : un hébergement collectif maximisé, un environnement contrôlé, le respect du cycle jour nuit, des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation des souris à l’occasion du nourrissage quotidien permettra de détecter toute anomalie éventuelle, et ainsi minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Plus spécifiquement au cours de la procédure, nous veillerons à minimiser le stress de l’isolement : des cages transparentes de petite taille seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les buchettes de peuplier à ronger habituellement présentes, l’eau et le régime seront également remis à disposition sur la période d’isolement. Une personne expérimentée réalisera le gavage pour limiter la durée de l’inconfort lié au stress de contention et à l'introduction de la sonde de gavage dans l’œsophage, et prendra soin de surveiller continuellement le comportement de la souris durant les 5 heures suivantes (l’observation étant également requise pour détecter l'apparition de fèces colorés).

Choix des espèces

Les travaux antérieurs de l’équipe avec la lignée de souris choisie permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa sensibilité abdominale. Ces souris se distinguent également par leur comportement maternel et le soin qu’elles apportent à leur portée. Pour l’analyse de la motricité intestinale, les animaux seront tous âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.

1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes carencés ou enrichis en gras et sucre pendant seize semaines, des injections répétées, des gavages, et 90 d'entre elles une chirurgie d'accès aux ganglions et au tissu adipeux, avant prélèvement des organes. Le porteur répertorie une gêne à l'administration, des variations de poids et une douleur modérée liée à la chirurgie soulagée par antalgiques. Il affirme que les expériences in vivo sont "absolument essentielles" faute de système in vitro assez complexe.

Objectifs

Ce projet s'intéresse au rôle du microenvironnement immunitaire des organes périphériques comme le foie et l’intestin en conditions physiologiques et au cours de l’inflammation. L’inflammation s'accompagne de modifications des cellules immunitaires au voisinage du site d’inflammation et même jusqu’aux organes plus centraux producteurs de nouvelles cellules effectrices. Pour comprendre la régulation cellulaire et moléculaire de la réponse des cellules immunitaires dans l’intestin et le foie lors de stimuli inflammatoires, les souris sont mises dans des contextes de régimes alimentaire inflammatoires (MCD) et un régime gras et sucré (High-fat High glucose Diet, HFHG). Globalement, les désordres tissulaires engendrés par ces stimulations vont modifier le comportement des cellules immunitaires en agissant à différents niveaux (métabolisme, survie, prolifération, activation...). Ainsi, les cellules immunitaires seront étudiées pour leur propriété de prolifération, différenciation, de motilité et de circulation au niveau des organes primaires du système immunitaire (thymus et moelle osseuse), des organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate, plaques de Peyer) ainsi qu’au niveau des organes périphériques (poumons, l’intestin, le foie et le tissu adipeux). L’étude de la réponse immunitaire des différentes populations impliquées dans l’inflammation tissulaire, permettra de cibler les processus cellulaires et moléculaires mis en place par le système immunitaire en parallèle des modifications globales corporelles et systémiques (infiltration tissulaire, réponse systémique pathophysiologique avec l’analyse des caractéristiques hématologiques, biochimiques, cytologiques et histologiques). L’étape suivante consistera en l’analyse de molécules permettant de moduler la réponse inflammatoire et d’évaluer leur potentiel thérapeutique et leur mode d’action sur les cellules immunitaires et la répercussion sur l’état inflammatoire tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors d’inflammation tissulaire au cours de pathologies de type stéatose non alcoolique. A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit l’accumulation de certaines populations immunitaires dans le foie et l’intestin à la suite des inflammations causées par des régimes alimentaires spécifiques. Cela devrait renseigner sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les tissus en inflammation pour réparer ou amplifier la stéato-hépatite et l’implication des modifications métaboliques associées comme l’insulinorésistance. Le rôle des différentes populations immunitaires sur l’évolution de la pathologie du foie et la perméabilité intestinale associée est encore mal compris. Cependant, des études indiquent que ces populations immunitaires seraient cruciales pour lutter contre une mise en place de modifications irréversibles, comme la fibrose. De plus, nous étudierons si ces processus relancent une hématopoïèse et quels en sont les mécanismes moléculaires associés. A long terme, ces données moléculaires sur l’inflammation pourraient représenter une source importante de moyens thérapeutiques avec des actions supplémentaires pour lutter contre l’évolution de la pathologie de type stéato-hépatite. Le nombre de cas est en constante progression au vu de l’augmentation mondiale de l’obésité qui y est associée.

Procédures

Les interventions sont: Un régime riche en gras et en sucre donné sur une période de 16 semaines à un grand nombre des souris en parallèle de leur contrôle sous régime alimentaire « normal ». Des injections intra-péritonéales (ip) (quelques secondes) tous les 5 jours pendant un maximum de 8 semaines. Des injections ip (quelques secondes) réalisées quotidiennement pendant 7 jours sur d’autres lots de souris. Une seule injection en ip (quelques secondes) sera réalisée soit 10H ou 24H avant la mise à mort. Un gavage de 2 minutes en 1 seule fois par animal sera suivi d’un dosage sanguin de quelques secondes sur une cinétique de 1, 3 et 5 heures pour certains animaux ou de 5, 15, 30, 60, 90, et 120 min pour les autres (quelques gouttes sur bandelettes). 90 animaux subiront une procédure chirurgicale (avec un maximum de 10min) permettant d’accéder aux ganglions et tissu adipeux. Des antalgiques sont administrés en pré et post opératoire et la chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons répertorié 4 points de nuisances qui sont les suivants : 1- Une gêne légère liée à l’administration et/ou les prélèvements effectués. 2- Une perte de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire déficient en Methionine et choline (MCD). 3- Une prise de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire enrichi en gras et en sucre (High-fat High glucose Diet, HFHG). 4- Une douleur modérée liée à la chirurgie et améliorée par la prise d’antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés pour prélèvement de leurs organes et l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Pour les études dans une seconde étape, toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront entreprises en culture afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, notre étude ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique car les effets du régime sont déjà décrits dans la littérature et nous avons aussi le recul nécessaire avec notre précédent projets sur les mêmes régimes alimentaires. Par exemple, nous savons que l’insulinorésistance et la résistance au glucose ne sont à tester qu’à partir de la 12ème semaine de régime pour des souris sauvages. Les mécanismes cellulaires et leurs modulations ne seront analysés qu’aux stades précis de la cinétique correspondant aux points de temps avec des différences significatives des populations immunitaires détectées lors de la première procédure du projet. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire (sur animal non manipulé), ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. De plus, nous aurons des résultats des procédures qui s’enchainent qui permettront d’éliminer des hypothèses concernant l’implications de certaines populations et/ou molécules. Ainsi, le nombre d’analyse à faire sera réduit par rapport à ce qui a été anticipé en prenant en compte toutes les lignées utilisées à la procédure précédente sans tenir compte de la significativité des résultats. Pour les tests statistiques, nous avons évalué nos nombres finaux à analyser selon les comparaisons à faire entre les variables et selon un niveau de risque fixé à 0.01 et une puissance fixée à 0.66. Quand cela était nécessaire, nous avons appliqué un possible effet cage et donc pondéré par le facteur correspondant. Seulement dans les conditions adéquates (point de cinétique précis) où l'augmentation du taux circulant des cellules immunes est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations bloquées avaient plutôt un effet pro-inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences car ils sont souvent pesés et cela limite leurs stress de suivre cette habitude d’interactions. Une fiche d’observation tout au long des régimes permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Pour la plupart des procédures, les animaux sont mis à mort très peu de temps après le geste invasif. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. Le recours à ces souris génétiquement modifiées va nous permettre d’identifier et de caractériser les processus sous-tendant la stéato-hépatite. Le détail du nombre d'animaux par procédure est mentionné dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte et les régimes débutés chez le jeune adulte âgé de 6 semaines. Cette date a été retenue comme la plus significative pour observer la mise en place et le suivi de la stéatose chez la souris. C’est le stade le plus précoce auquel les souris ont un poids assez stable et assez important pour en perdre suite au régime . De plus, comme le régime se pratique sur au moins 16 semaines, les souris doivent être prises à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après le régime et que l’on ne soit pas sur l’interprétation d’un facteur vieillissement.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime obésogène pendant douze à vingt-quatre semaines, des injections deux fois par semaine, des mises à jeun et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline nécessitant gavages et prélèvements caudaux répétés. Le porteur indique que le surpoids peut gêner les déplacements et que la contention dans le tube d'échoMRI peut être anxiogène. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes, et limite l'étude aux mâles.

Objectifs

L'obésité et le diabète de type 2 constituent des défis majeurs pour la santé publique à l'échelle mondiale, engendrant des conséquences graves sur la qualité de vie des individus et imposant un fardeau économique croissant. Ces affections sont souvent associées à un état inflammatoire , communément appelée "inflammation à bas bruit". L'inflammation à bas bruit représente un état caractérisé par des niveaux d'inflammation systémique faibles, mais persistants, qui peuvent ne pas être détectés par les symptômes cliniques traditionnels. Cette inflammation chronique de bas niveau a été étroitement associée à la pathogenèse et à la progression de l'obésité et du diabète de type 2. Cependant cette inflammation à bas bruit est-elle la cause ou la conséquence de ces pathologies est une question qui n’est pas encore tranchée dans la communauté scientifique. Comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette relation complexe est impératif pour développer des stratégies de prévention et de traitement efficaces visant à atténuer l'inflammation à bas bruit et, par conséquent, à améliorer la prise en charge des maladies métaboliques. Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension de cette interaction complexe en examinant en détail les voies biologiques et les facteurs déclencheurs qui contribuent à l'inflammation à bas bruit dans le contexte de l'obésité et du diabète de type 2. En particulier nous allons étudier l’effet d’un composé pharmacologique aux propriétés anti inflammatoire développé par une start-up dans deux situations distinctes : La prévention ou la thérapie de ces maladies métaboliques. En d’autres termes nous espérons apporter des éléments de réponse à la question : Inflammation et maladies métaboliques :cause ou conséquence ?

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : Le composé pharmacologique aux propriétés anti-inflammatoires démontrées, est-il en capacité de prévenir l’installation des maladies métaboliques et/ou de traiter ces maladies une fois qu’elles sont installées. Les résultats obtenus devraient nous permettre d’apporter des éléments de réponses quant à l’association des maladies métaboliques à l’inflammation à bas bruit. De plus si ce composé à des effets bénéfiques, alors on peut imaginer que cela puisse un jour être un traitement pour ces maladies.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire obésogène de type HFHS et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire (12 24 pesées sur 12 ou 24 semaines de régime pour la procédure 1 ou 2 respectivement ). Une mesure de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 12 et 24 sera réalisée. Des prélèvements sanguins au niveau caudal après légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (crème EMLA 30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront également réalisés en semaines -S11 (pocédure 1 et 2) et S23 (procédure 2) pour la réalisation des tests métaboliques (OGTT et ITT). Dans chaque procédure il y a aura deux injections par semaines pendant 12 semaines soit 24 injections. Une injection IP (volume 100µl), réalisée par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne prends pas plus de 10 secondes, préhension de l’animal incluse. Concernant OGTT et ITT, respectivement 6 et 5 prélèvements caudal seront nécessaire. Un prélèvement réalisé par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne dépasse pas 15 secondes, préhension de l’animal incluse

Impact sur les animaux

Les animaux en régime High Fat /High Sucrose peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais observé après 12 semaines de régime. Une attention particulière sera portée aux animaux de la procédure 2 qui eux seront sous régime HF/HS pendant 24 semaines Les préhensions des animaux lors des pesées, des injections intra péritonéales peuvent causer au moins au début du protocole un peu de stress sur les animaux. Pour diminuer au maximum ce stress (et éviter également que ce dernier puisse perturber le protocole), les animaux seront manipulés lors de la deuxième semaine d’acclimatation par le même expérimentateur qui procédera au différentes mesures hebdomadaires. De la même manière, les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maitrisant parfaitement ce geste technique Les test de tolérance oral au glucose (OGTT), les test de tolérance à l’insuline (ITT) nécessitent des mises à jeun de 4h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact mais permet de s’affranchir des variations interindividuelles du métabolisme glucidique. L’OGTT, nécessite une préhension des animaux afin de les gaver avec la solution de glucose ce qui est invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’ITT nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale d’insuline qui peut également être invasive (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). OGTT et ITT nécessitent des mesures de glycémie pendant 2h. Ces mesures sont réalisées à l’aide d’un glucomètre par prélèvement d’une micro goutte de sang L’EchoMRI nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétrique sachant qu’il y a des variations individuelles dans la mise en place de l’obésité. - Cette série d’expérience se fait uniquement sur les mâles. Si des effets sont observés, la necessité impérative de reproduire les données avant publication se fera alors sur les deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale, soit sous anesthésie générale. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. . Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique dans les études de maladies métaboliques Les animaux seront réceptionnés au centre de zootechnie à l’âge de 8 semaines, stade adulte des souris. Le début du régime HF/HS commencera à partir de 10 semaines et se terminera soit a 22 semaines (S12) (procédure 1) soit à 34 (S24) semaines (procédure 2)

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent différentes molécules par injection quotidienne pendant trois à cinq jours ou par voie orale, pour étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal. Le porteur ne décrit que des désagréments brefs, stress de contention et sensibilité locale de quelques minutes, un contraste avec la gravité modérée déclarée pour le projet. Il indique utiliser en priorité des organoïdes in vitro mais affirme qu'une analyse in vivo reste nécessaire pour tenir compte du microenvironnement de l'organe.

Objectifs

L'épithélium intestinal est un tissu qui se régénère rapidement et qui résiste aux agressions tout en maintenant sa fonction de barrière tout au long de la vie adulte. Bien que nous connaissions certains types de cellules qui le composent, nous ne savons pas comment ces cellules sont capables de se renouveler sans perturber l'intégrité du tissu. Le but de ce projet est d'étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal chez les souris. Nos principaux objectifs sont de caractériser le comportement de types de cellules intestinales rares (cellules de « goblet » et « tuft ») et de comprendre les mécanismes de renouvellement et d'intégrité de l'épithélium dans l'homéostasie intestinale.

Bénéfices attendus

Étant donné le rôle essentiel de l'homéostasie épithéliale dans la (patho)physiologie, la recherche proposée aura de vastes implications et applications dans un certain nombre de domaines. L'extrapolation des données à différents contextes physiologiques ou pathologiques, notamment les troubles inflammatoires de l'intestin, le vieillissement et le cancer, sera déterminante pour la recherche fondamentale et appliquée. • En ce qui concerne la recherche fondamentale, l'identification des mécanismes impliqués dans l'établissement et le maintien du renouvellement épithélial aidera à comprendre le développement et la fonction normale des organes, ainsi que la façon dont la dérégulation de ce processus contribue aux troubles du développement, au vieillissement et, en particulier, au cancer. • Comprendre comment le nombre homéostatique de cellules est préservé dans l'intestin des mammifères est essentiel pour comprendre comment la pathologie peut se produire - le dérèglement du renouvellement épithélial, que ce soit par une prolifération excessive, une migration aberrante ou une extrusion, pourrait conduire au développement de tumeurs. Ainsi, l'élucidation de la manière dont ces processus sont régulés et couplés pour atteindre l'équilibre sera d'un intérêt particulier pour la communauté médicale, qui pourra également bénéficier de nos systèmes modèles et de nos technologies. • L'intégrité de l'épithélium est essentielle pour sa fonction de barrière, qui consiste à isoler le microbiome gastro-intestinal de l'environnement interne ; si cette fonction est compromise, elle peut conduire ou contribuer à une maladie inflammatoire. La découverte des voies de signalisation qui sont activées en réponse à des niveaux physiologiques ou pathologiques de stress mécanique sera utile pour le développement et la thérapie des maladies. • Les études sur l'intégrité épithéliale et la perméabilité de l'intestin sont bénéfiques pour l'industrie pharmaceutique ; de nouveaux médicaments pourraient être testés sur nos modèles ex vivet in vitro, afin d'évaluer leur sécurité avant de les tester sur des modèles animaux et des humains.

Procédures

Les animaux recevront différentes molécules par deux voies d'administration différentes, soit par injection, une fois par jour pendant 5 secondes pendant 3 à 5 jours selon la molécule, soit par administration orale d'une molécule une fois pendant 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 30 secondes. Certaines injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour recueillir les tissus.

Remplacement

Pour compléter et réduire les études in vivo, nous avons développé des modèles d'organoïdes intestinaux en 2D ou 3D. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo. Toutefois, ces études in vitro devront être complétées par une analyse in vivo pour étudier l'influence du microenvironnement de l'organe et du tissu sur la biologie de l'épithélium intestinal.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, sur la base de notre expérience antérieure et de tests statistiques, les analyses seront réalisées sur 3 expériences indépendantes, avec toutes les souris en double, ce qui donne une fourchette de 12 à 24 souris nécessaires au total pour 3 expériences indépendantes. Ceci constitue un minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

La surveillance renforcée permettra une vigilance accrue pendant l'expérimentation et la détection des atteintes des points limites. Les souris seront quotidiennement observées et pesées par du personnel compétent. Des grilles de scoring seront utilisées pour suivre les animaux en expérimentation afin de mettre en place, lorsque nécessaire, des mesures pour atténuer la douleur, l'angoisse ou le stress.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. Les modèles transgéniques proposés ont déjà été utilisés avec succès pour étudier le rôle du cytosquelette et des forces mécaniques dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Ces modèles nous permettront d'évaluer la contribution des forces mécaniques dans la régulation de l'homéostasie intestinal chez l'adulte, ce qui devient un sujet d'intérêt majeur dans le domaine de la recherche, ainsi que pour la communauté biomédicale. Nous utiliserons des souris adultes (2-4 mois) pour étudier l'homéostasie épithéliale dans l'intestin des mammifères adultes.