Système gastrointestinal

Une souris, un rat ou un hamster immobile, au poil hérissé ou au dos courbé est mis à mort sur-le-champ, et une perte de plus de 20 % du poids en trois jours, associée à d'autres signes, conduit à la mise à mort ou à une adaptation de la dose. Au total, 4 750 rongeurs vont être utilisés (2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés), tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir de quatre ou six semaines d'âge et jusqu'à 34 semaines, ils reçoivent des régimes hypercaloriques, parfois avec des boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, des traitements une à deux fois par jour et trois prises de sang, puis passent une échographie du cœur et 24 heures isolés sur grille en cage métabolique. Ces régimes doivent permettre de tester des molécules contre l'obésité, le diabète ou la stéatose hépatique. Le porteur retient le hamster pour l'alcool parce qu'il en "consomme spontanément", et invoque la hausse de la consommation pendant les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des distensions colorectales par ballonnet répétées et, dans cet établissement, des séances d'imagerie IRMf pour mesurer la réponse cérébrale à la distension, dans un modèle de stress reproduisant l'hypersensibilité viscérale du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur signale que la distension peut provoquer une diarrhée et parfois une perforation du colon. Il conclut, après des essais sur organoïdes humains, que le recours à l'animal reste "incontournable" au motif que la nociception mobiliserait l'"organisme entier".

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à six séries de distensions colorectales par ballonnet, des administrations de molécules et des lavages coliques, dans un modèle de stress destiné à provoquer une hypersensibilité viscérale imitant le syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique que la distension peut entraîner une diarrhée et, comme effet indésirable, une perforation du colon repérée au sang sur le ballonnet. Après une preuve de concept sur organoïdes intestinaux humains, il conclut que le recours à l'animal reste "incontournable" parce que la nociception exigerait une réaction de l'"organisme entier".

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse un vecteur de thérapie génique, une prise de sang et un jeûne de seize heures, avant le prélèvement de leur foie auquel elles ne peuvent pas survivre. Le projet vise à faire exprimer une protéine modifiée pour la rendre reconnaissable par un anticorps du commerce et faciliter son étude. Le porteur situe les bénéfices dans la biologie fondamentale et affirme que le foie ne peut être reproduit fidèlement en culture cellulaire.

Objectifs

L'utilisation d'anticorps pour purifier une protéine d'un fluide biologique est une stratégie bien connue et qui a fait ses preuves. Cependant, pour certaines protéines, il s'avère impossible d'obtenir un anticorps spécifique. Il est donc ici envisagé d'utiliser des souris transgéniques n'exprimant pas une protéine d'intérêt, et de réintroduire par thérapie génique la même protéine très légèrement modifiée afin qu'elle soit reconnue par un anticorps du commerce. Les souris obtenues exprimeront alors une protéine modifiée, ce qui rendra son étude possible. L'étude de protéines purifiées permet des avancées significatives dans le domaine de la biologie fondamentale, mais aussi des médecines humaine et vétérinaire. Il sera par exemple possible d'isoler la protéine d'intérêt afin de caractériser les autres molécules avec lesquelles elle entre en interaction.

Bénéfices attendus

La purification spécifique d'une protéine permettra son étude approfondie (liaison à l’ADN, interaction protéine-protéine, identification de ligands). Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront une contribution aux domaines de la médecine, de la pharmacologie et de la nutrition.

Procédures

Les animaux recevont une injection intraveineuse sous anesthésie locale (2 minutes de contention dans un dispositif prévu à cet effet), et il sera pratiqué une prise de sang (30 secondes de contention manuelle), ainsi qu'une mise à jeun de 16h, dont seulement 4h pendant la période nocturne.

Impact sur les animaux

L'injection au niveau de la veine de la queue du virus pour la thérapie génique demande une contention de l’animal stressante, et l’injection engendre éventuellement une inflammation temporaire. La mise à jeun peut entrainer une légère hypoglycémie, mais qui ne devrait pas chuter en-dessous d'un seuil mettant en péril la santé de l'animal.

Devenir

Comme les animaux ne peuvent pas survivre au prélèvement de leur foie, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L’utilisation de l’animal entier est envisagée car le foie est un environnement complexe, qui ne peut pas être mimé avec fidélité en culture cellulaire. Cet organe est constitué d’une grande diversité de cellules et est affecté par des signaux hormonaux et nutritionnels provenant de tout l’organisme. Cependant, la phase animale n’est engagée que si des tests préliminaires sur des cellules en culture des différents transgènes utilisés sont concluants (gène rapporteur, reconnaissance par un anticorps du commerce). Ces tests ont déjà été fait sur des lignées cellulaires du commerce puis sur des cellules isolées d’un animal, et sont concluants.

Réduction

L’utilisation de lignées de grande proximité génétique permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, les tests de puissance statistique pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé au cours du projet

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les 2 heures le premier jour puis 2 fois par jour pendant 1 semaine) après l'injection à la veine de la queue et après le prélèvement sanguin à la joue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection. Une méthode d'évaluation du stress et de la douleur est prévue. Pour être la moins pénible, la période de jeûne est planifiée ainsi : 12h pendant toute la période de jour durant laquelle les souris dorment et ne mangent que 10% de leur bol alimentaire quotidien, et 4h en période de nuit. Ce jeûne permet d’arriver au pic d’activité de la protéine d'intérêt, tout en évitant une période de privation de nourriture trop longue.

Choix des espèces

Les modèles d’invalidation de gène que nous utilisons ne sont disponible que chez la souris. Les animaux qui sont utilisés sont de jeunes adultes, dont le foie est arrivé à maturité. Comme l'étude porte sur le métabolisme et que la race de souris utilisée développe des troubles métaboliques spontanément avec l'âge, les animaux trop vieux sont à éviter.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal boit de l'eau contenant des ions perchlorates pendant quatre mois, avant l'induction d'une colite par instillation intra-colique, provoquant perte de poids et d'appétit sur deux jours. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré car il fausserait les résultats, et que les animaux souffrant trop seront isolés ou tués. Il présente cette étude comme "exploratoire", préalable à un projet "plus complet" sur le lien entre pollution et maladie de Crohn.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. La France est un pays fortement agricole et un des plus utilisateur de pesticides en Europe. Un cluster de sur-prévalence de la MC est notamment situé dans le nord de la France, région très sujette aux épandages massifs de produits phytopharmaceutiques (PP). Depuis quelques années une nouvelle préoccupation autour des effets santé des ions perchlorates est en train de naître. Ces ions sont des contaminants de l'eau de boisson et sont notamment issus de l'ionisation en milieu aqueux des perchlorates d'ammonium et de potassium issus principalement de la dégradation d'anciennes mines et munitions issus de la guerre mais peuvent provenir également de rejets industriels. Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire sur l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive. L’objectif de cette étude exploratoire est de pouvoir répondre à cette demande avant de redéposer un projet plus complet.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment que peu d'information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données essentielles et importantes concernant un potentiel effet pro-oxydant et pro-inflammatoire des ions perchlorates sur le système digestif. D'autre part, le développement d'une colite expérimentale chez des animaux traités ou non par les ions perchlorates apportera des données supplémentaires et capitales sur la capacité de ces ions à modifier le profil inflammatoire colique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des ions perchlorates de sodium dans l'eau de boisson pendant 4 mois consécutilfs. Ce mode d'administration ne génère aucune perturbation dans le bien-être des animaux. Après les 4 mois d'administration des ions perchlorates, nous induirons une colite expérimentale chez certains groupes d'animaux comme décrit dans le protocole expérimental. Ce modèle de colite est un modèle inflammatoire d'intensité modérée d'une durée de 3 jours limitant au maximum les potentiels effets délétères chez les animaux. Ce modèle est parfaitement maîtrisé par l'expérimentateur. Une perte de poids et d'appétit est observée au cours des deux premiers jours de colite. A l'issue des 3 jours de colite, les animaux sont mis à mort pour prélèvements tissulaires comme décrits précédemment.

Impact sur les animaux

Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 16 semaines. La procédure est qualifiée de légère. Le modèle de colite expérimentale est un modèle de colite très modérée. La procédure est qualifiée de modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée. L'administration du TNBS se fait par l'intermédiaire d'un capillaire en plastique inséré dans le colon à 5 cm de l'anus. Cette administration ne dure qu'environ 2 min et se fera sous anesthésie. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage respective et surveillés régulièrement pendant les heures suivant la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale pour les prélèvements de sang et d'organes ainsi que l'analyse ultérieure des marqueurs d'intérêt.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité chez de jeunes animaux soumis ou non à un polluant environnemental administré par voie orale (eau de boisson), impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=96; n=12/groupe expérimental) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles et femelles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure. De ce fait, 12 animaux mâles et femelles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique, cela aurai pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables. Les animaux seront suivi quotidiennement avec une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose induira une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat, excepté une perte d'appétit et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas où nous observerons des signes de douleur trop importants, l'animal sera isolé de ses congénères, voire mis à mort. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années pour cette espèce. Notre hypothèse de travail est que l’exposition aux ions perchlorates pendant des phases critiques du développement (enfance et adolescence) pourrait favoriser la survenue des MICI. Nous avons sélectionné un stade de développement en adéquation. Les animaux mâles et femelles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 16 semaines consécutives. A l'âge d'environ 21 semaines, les animaux subiront une anesthésie pour l'induction de la colite expérimentale. Nous souhaitons travailler pendant la phase aiguë inflammatoire et devront mettre à mort les animaux 3 jours après l'induction de la colite.

416 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie pour être infectés par des bactéries rendues luminescentes, puis des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, avant d'être tués pour dénombrer les bactéries dans leurs tissus. Le porteur indique une perte de poids et une possible prostration liées à l'infection, et présente ce projet pilote comme un préalable à l'étude de nouveaux antibiotiques. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire ces infections et rend l'étude "indispensable".

Objectifs

La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des rechutes sont observées, associées au développement de résistances. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des schémas thérapeutiques est donc nécessaire afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. L’évaluation de l’efficacité de ces nouveaux schémas thérapeutiques est indispensable in vivo chez l’animal infecté avant d’envisager d’éventuels essais cliniques chez l'Homme. Ce projet pilote va nous permettre la mise en place de deux modèles d’infections bactériennes, une infection intrapéritonéale (péritonite) et une infection intra-rénale (pyélonéphrite) à deux entérobactéries (E. Coli et K. pneumoniae) majeures dans l’apparition de l’antibiorésistance. Pour ce faire, l'infection est provoquée en utilisant des bactéries qui ont été modifiées en laboratoire pour être luminescentes. La quantité de luminescence mesurée par un appareil d'imagerie devrait être proportionnelle à la concentration bactérienne ; c'est ce qui sera vérifiée grâce à cette étude. Cette mise en place permet de définir les paramètres optimaux de chaque infection d’un point de vue scientifique (concentration bactérienne adéquate pour maintenir une infection sur plusieurs jours sans traitement antibiotique) et d’un point de vue éthique concernant le bien-être animal (infection provoquant des signes cliniques légers). L’objectif de ce projet pilote permettra de raffiner les procédures et de réduire le nombre d’animaux dans le projet final qui portera sur l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques d’une nouvelle combinaison d’antibiotiques chez le rat infecté par une infection à entérobactérie. Raffiner à l’aide de l'imagerie (bioluminescence) qui est un outil de suivi non invasif de l’infection.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet pilote permettra de mettre au point 2 modèles d'infection et 1 méthode d'imagerie pour le suivi des infections. A long terme, ces modèles et méthode seront utilisés dans un projet plus vaste visant à étudier de nouvelles stratégies antibiotiques, avec un bénéfice direct pour les malades souffrant d'une infection résistante aux antibiotiques.

Procédures

Tous les animaux recevront 2 fois par jour une injection d'antalgique en condition vigile par voie sous cutanée. Le nombre d'injection sera de 2 à 8 injections ( durée de 30 secondes maximum). Le jour de l'infection, chirurgie sous anesthésie générale et locale avec imagerie (bioluminescence) durée totale de l'anesthésie de 20 minutes pour tous les animaux. Les jours suivants l'infection, imagerie pour mesure de la bioluminescence pour les rats mâles : - 4 anesthésies sur 4 jours consécutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 3 anesthésies sur 3 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 2 anesthésies sur 2 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 1 anesthésie : durée 10 min pour 96 animaux. Pour les 32 animaux femelles, le nombre d'anesthésie pourra varier de 1 à 4 en fonction des résultats obtenus chez le rat mâle.

Impact sur les animaux

Anesthésie : un inconfort léger lors de la phase de réveil de l’anesthésie est attendu. Actes chirurgicaux : une légere douler est attendue post-chirurgie réduit au maximum avec une couverture antalgique adéquate. Infection : une perte légère de poids inférieure 5 pour cent est à prévoir au cours du développement de l’infection, une prostration ou une perte de mobilité transitoire jusqu'à 24 heures post-infection peut survenir.

Devenir

Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne par comptage direct et établir une corrélation avec l'imagerie.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro ou in silico permettant de reproduire ces modèles d’infections et permettant de mimer l’apparition de mutations bactériennes in vivo. Cette étude pré-clinique in vivo est donc indispensable à une éventuelle transposition chez l’homme. Le développement de ces modèles est la première étape de ce projet transversal d’amélioration de l’utilisation des antibiotiques en association dans le traitement des infections sévères.

Réduction

Ce projet correspond à une étude pilote pour un projet futur ainsi, seul le nombre minimum d'animaux nécessaire à l'analyse statistique des résultats sera utilisé. Ce nombre a été déterminé par un test statistique . Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux et d’étudier la variabilité inter-sexe, les études des modèles d’infection seront effectués seulement sur les mâles. Une approche progressive de l'évaluation du choix de l'inoculum sera mise en place : Le 1er inoculum testé sera l'inoculum avec la concentration la plus faible, si l'infection ne se maintient pas pendant 4 jours et/ou n'est pas quantifiable par méthode d'imagerie, un second inoculum sera testé à une concentration bactérienne supérieure. Si ce deuxième inoculum ne permet toujours pas d'avoir une infection stable pendant 4 jours, l'inoculum le plus concentré sera évalué . Le nombre d'animaux indiqué dans ce projet est donc un nombre maximal. Une fois qu’un inoculum bactérien unique et une durée unique d’infection seront définis, une étude de variabilité inter-sexe sera réalisée sur des femelles permettant ainsi de reduire le nombre d'animaux dans ce projet pilote.

Raffinement

Les rats suivent une acclimatation de 10 jours et sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et sur planche thermostatée avec analgésie opératoire et postopératoire : cette couverture antalgique sera maintenue en continue sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre 2 fois par jour les animaux tout au long du projet. Des points limites gradés, suffisamment précoces et bien identifiés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettant d'agir rapidement pour améliorer le bien être .

Choix des espèces

La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. De plus, cette lignée n'est pas une lignée génétiquement modifiée. Dans la littérature , cette souche a été utilisée pour développer des modèles d'infection similaires à ceux presentés dans ce projet. Les animaux seront agés de 8 semaines ce qui leur garantit une maturité physiologique notamment de leur système immunitaire pour résister à l’infection.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des cycles de jeûne de 24 heures alternés avec 24 heures d'alimentation pendant quatre semaines, des piqûres répétées de la queue pour mesurer la glycémie et un prélèvement de sang terminal, avant la mise à mort pour prélever le foie et d'autres organes. Le porteur étudie le rôle d'une protéine du foie chez des souris modifiées pour ne plus la produire, les bénéfices annoncés se limitant à comparer ces effets avec ceux d'un jeûne unique. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire ce processus par des méthodes sans animaux et conclut que le recours à la souris est "approprié".

Objectifs

Chez les animaux, des épisodes de jeûne sont fréquemment observés en cas de blessure ou de manque de nourriture ou encore lors de l'hibernation, dans le but d'économiser l'énergie et de s'adapter aux différents environnements. Les mammifères sont ainsi capables de tolérer de longues périodes de jeûne grâce à une réponse adaptative de l'organisme. Le foie joue un rôle majeur dans cette adaptation aux situations de jeûne car il permet la production de carburants, nécessaires au fonctionnement du cerveau et du coeur notamment. Cette production de carburants par le foie est primordiale et controlée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARα. De nombreuses études examinent les effets sur la santé de différentes stratégies nutrtionnelles qui impliquent des périodes de jeûne. Ces stratégies qui alternent des périodes de jeûne et des périodes d'alimentation ont montré des effets bénéfiques sur plusieurs pathologies, notamment chez la souris. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer le rôle de PPARa dans la réponse au jeûne lorsqu'il est alterné avec des périodes d'alimentation à volonté. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles qui n'ont pas la protéine PPARa dans le foie et leur contrôle, que nous soumettrons à des alternances de jeûne de 24h et d'alimentaion à volonté de 24h sur une période de 4 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes dont le foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir si PPARa spécifiquement dans le foie joue un rôle dans les réponses induites par des jeûnes répétées. Nous pourrons également comparer les effets avec le rôle connu de PPARa lors d'un jeûne unique.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard à volonté ou soumis à des cycles jeûne de 24h/alimentation à volonté pendant 4 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Chaque pesée prend environ 20 secondes par animal. La glycémie sera mesurée chaque semaine par prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne unique et le jeûne répété peuvent induire une perte de poids, une baisse de la glycémie et de la température corporelle. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus physiologique qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie, notamment le foie et le tissu adipeux, et plusieurs hormones qui agissent à distance. Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car elle permet d'étudier le rôle d'une protéine spécifique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie) Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure, renourri et replacé en conditions d’hébergement standard après examination par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.