Système gastrointestinal

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent contentions, biopsies, mises à jeun, gavages, prélèvements de sang et injections, certaines recevant une pompe osmotique implantée chirurgicalement sous la peau et un diabète induit provoquant polydipsie et glycosurie. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles comme un poil hérissé, une perte de poids et une léthargie, avant un prélèvement sanguin terminal. Il indique que les dérégulations métaboliques et inflammatoires sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme" et recourt à l'animal quand la culture in vitro ne suffit pas.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action d’un facteur qui médie les effets du glucose, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice potentiel de ce projet serait de mieux comprendre la fonction d'un facteur relayant habituellement les effets du glucose dans l'intestin. Il permettrait de notamament de comprendre si son blocage pourrait suffir à renforcer la barrière formée par l'intestin et ainsi empêcher l'augmentation de la perméabilité intestinale en cas d'hyperglycémie, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques, dans le contexte clinique des patients diabétiques et/ou obèses.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes). Un 1er lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Un 2ieme lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Ces animaux seront également placés sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). Un 3ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). Un 4ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). L’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, peut entraîner l’apparition de signes généraux de souffrance : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. L'étude comprend au total 280 animaux. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

948 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies d'induction de fibrose du foie, des injections répétées et un suivi hebdomadaire par imagerie et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour valider des vecteurs de thérapie génique ciblant les cellules du foie malade. Le porteur signale des pertes de poids, des risques d'infection et des ruptures de suture liés aux interventions. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'"organisme entier" et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Les maladies du foie, de causes très variées (excès de gras, alcool, virus, médicaments, atteinte biliaire, génétique etc), sont un enjeu majeur de santé publique. Elles mènent à la cirrhose qui est la 14ème cause de mort dans le monde et au cancer du foie, 3ème cause mondiale de décès par cancer. Quelle que soit l’origine de la maladie, un tissu cicatriciel excessif responsable de la maladie est fabriqué par des cellules appelées « myofibroblastes ». En même temps, les cellules assurant les principales fonctions du foie appelées « hépatocytes » meurent. De nombreux traitement ont été proposés mais jusqu’à présent aucun ne s’est montré satisfaisant par manque d’efficacité de ciblage sécurisé d’un type cellulaire présent dans le foie et l’apparition d’effets secondaires indésirables (ex : l’élimination de cellules saines en même temps que les cellules pathogéniques). Ce projet vise à développer et tester l’efficacité préclinique d’un vecteur de thérapie génique permettant l’élimination spécifique des myofibroblastes rendant le foie malade quelle que soit l’origine de la maladie, et d’un vecteur de thérapie génique protégeant les hépatocytes de la mort au cours des maladies chroniques du foie.

Bénéfices attendus

Il n’existe aucun traitement curatif des maladies chroniques du foie. Ce projet comprend des études précliniques de validation de vecteurs de thérapie génique ciblée pour les maladies chroniques du foie chez les animaux en vue d’application clinique thérapeutique chez l’humain.

Procédures

Des souris auront une intervention chirurgicale unique et terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris subiront une opération chirurgicale d’environ 15min sous anesthésie générale et sous analgésique. 15 jours après ces souris auront une intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris recevront une injection (5min). Une partie d’entre elles recevront une deuxième injection 1 à 3 semaines après (5 min). 1 fois par semaine, pendant 2 mois maximum, ces souris seront soumises, en même temps, à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront opérées chirurgicalement (environ 15min) sous anesthésie et sous analgésique. Ces souris recevront deux injections à 1 semaine d’intervalle en 5min. 1 fois par semaine pendant 2 semaines, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront nourries avec un régime particulier pendant 16 semaines maximum et recevront deux injections à 1 à 3 semaines d’intervalle (5min/acte). 1 fois par semaine pendant 8 semaines maximum, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie générale. Des souris seront injectées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 semaines (5min). 1 fois par semaine pendant 6 semaines, sous anesthésie, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin.

Impact sur les animaux

Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (15 minutes par intervention). Une perte de poids post-opératoire, des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. Plusieurs actes seront pratiqués sous anesthésie (10 minutes environ par intervention) pouvant induire des nuisances comme le risque d’arrêt cardio-respiratoire, l’hypothermie et la perte de repère transitoire au moment du réveil. Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections comme un stress émotionnel de courte durée (5min maximum par acte) liés à la contention et la douleur de l’introduction de l’aiguille ou des saignements et irritations. Les régimes alimentaires ou le produit injectable utilisés pour induire une fibrose hépatique aux animaux entrainent une perte de poids pendant les 3 premières semaines qui se stabilise ensuite. Un des modèles de fibrose nécessite l’utilisation de souris transgéniques développant spontanément une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois. Dans ce projet ces souris seront maintenues jusqu’à l’âge de 4 mois maximum.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux de toutes les procédures est nécessaire pour pouvoir isoler les cellules du foie, évaluer la maladie du foie et pour valider le ciblage cellule spécifique des vecteurs de thérapie génique. Le prélèvement du foie entier ne permet pas la survie des animaux.

Remplacement

Les maladies du foie reposent sur de multiples interactions dans l’organisme entier entre les processus de régénération, d'inflammation, de vascularisation et de cicatrisation impliquant le support des autres organes du corps et n’est pas modélisable in vitro. Le ciblage spécifique d'un organe par rapport à un autre via l’injection d’un vecteur génique dans la circulation sanguine et l’étude de sa répartition corporelle n’est pas modélisable in vitro. De même, le ciblage spécifique d’un sous type cellulaire du foie par rapport aux autres cellules du foie nécessite d’étudier l’organe en entier. Aucun modèle 3D in vitro du foie ne reproduit actuellement la réelle complexité cellulaire du foie ni sa structure. Enfin, Il n’existe pas de lignées cellulaires proche de la physiologie réelle du foie. Pour étudier les signatures cellulaires saines ou malades dans l’organe entier, nous serons donc contraints d’utiliser des cellules primaires dont la survie est limitée en culture et qui ne peuvent être obtenues qu’à partir du foie des souris. Ainsi, pour développer cliniquement une thérapie génique ciblée, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire.

Réduction

A cause des variabilités entre animaux et des risques d’échec des procédures, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés pour le projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre notre objectif scientifique. Le nombre d’animaux a été évalué à 948 maximum. Les tests in vitro seront réalisés sur des cellules primaires mais qui ne peuvent être maintenues à long terme après isolement. Pour les types cellulaires qui le permettent, une amplification sera réalisée en culture. Afin de réduire le nombre d’animaux, un seul modèle de fibrose sera utilisé pour réaliser les expériences in vitro. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le nombre de candidats vecteurs sera réduit de 3 vecteurs à 1 au cours des procédures réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Grâce aux prélèvements sanguins et au suivi du transgène fluorescent qui nous permettent d’observer dans le temps la pathologie et l’expression de notre vecteur au cours des expérimentations, 1 seul temps d’euthanasie est nécessaire. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats scientifiques dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux seront anesthésiés pour chacune des procédures et un analgésique sera administré en per et/ou post opératoire pour éviter toute souffrance liée à l’intervention chirurgicale. Au cours des chirurgies, les souris seront placées sur une plaque chauffante pendant et après l’opération, jusqu’au réveil total, et leurs yeux seront protégés au cours de l’anesthésie par application d’ocry-gel. Au cours des expériences impliquant le produit médicamenteux induisant la fibrose, aucun analgésique ne sera administré en même temps aux souris afin d’éviter toute surdose et une insuffisance hépatique. Dans le cas des injections répétées, plusieurs sites d’injection seront alternés au cours des procédures pour éviter une irritation locale et diminuer le risque d’ascite. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal, adaptés à chaque procédure. Si l’animal atteint un point limite il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements sanguins et l’imagerie médicale réalisés au cours des procédures permettent également de surveiller précisément toutes déclarations de symptômes. Les souris seront prises en charge par du personnel qualifié et entrainé aux procédures, et examinées quotidiennement. Les animaux seront hébergés 7 jours avant le début des procédures jusqu’à l’euthanasie en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant ainsi le stress. Les animaux seront hébergés dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Au cours des 7 jours d’hébergement avant procédure, les souris s’adapteront à leur nouvel environnement et un contact sera mis en place afin de les habituer aux manipulations et ainsi réduire leur stress au cours des procédures. Les personnes non formées agiront en tant qu’observateurs et toujours accompagnés par un membre formé.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris, dans la littérature est la plus référencée pour les modèles de maladies hépatiques notamment pour leur grande reproductibilité et leur capacité à développer une pathologie très proche de l’homme. De plus la souris possède une vésicule biliaire tandis que le rat n’en possède pas. Or la vésicule biliaire possède un rôle dans la régénération du foie et son absence au cours des modèles biliaires pourrait biaiser les résultats. La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore pouvant mettre plusieurs années à se déclarer chez l’humain adulte. Chez la souris elle est également asymptomatique et peut prendre jusqu’à 3 mois pour s’installer en fonction des modèles. Dans ce projet, les souris utilisées seront donc de jeune adulte de 8 à 10 semaines afin de participer à des procédures pouvant durer plusieurs mois sans être affectées par un vieillissement avancé.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de néphrectomie des cinq sixièmes, en deux temps, leur induit une insuffisance rénale chronique, suivie de quinze semaines de régime plus ou moins riche en phosphate, de passages en cage métabolique et de prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la chirurgie, le changement de régime et les prélèvements sont sources de douleur, et prévoit une analgésie post-opératoire. Il affirme que "seul un modèle in vivo" permet d'étudier les liens entre os, rein, intestin et aorte dans le métabolisme du phosphate.

Objectifs

La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique à cause du développement de calcifications vasculaires. En effet, le défaut de fonctionnement des reins entraine des taux élevés de phosphate circulant dans l’organisme. Nous souhaitons évaluer l’impact de la réduction de l’entrée du phosphate (=absorption) dans l’organisme sur le niveau de phosphate circulant lors de la pathologie de l’insuffisance rénale chronique et sur les complications vasculaires. Nous avons récemment découvert que des souris possédant une extinction génique de la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de phosphate réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce paramètre dans le développement des complications vasculaires au cours de l’insuffisance rénale chronique. Ce projet implique des souris contrôles et d’autres modifiées pour la BSP qui subiront une chirurgie de néphro-réduction (procédure visant à induire l’insuffisance rénale chronique). Elles recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 15 semaines avant mise à mort et prélèvements des tissus pour étudier l'impact du défaut d'absorption intestinale sur le niveau de phosphate circulant des souris malades et le développement des calcifications vasculaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront d’étudier si la réduction de l’absorption intestinale du phosphate via la voie paracellulaire permet de normaliser les taux circulants de phosphate et donc d’empêcher le développement de calcifications vasculaires en condition de maladie rénale chronique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à une chirurgie de néphro reduction des 5 /6 (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux sham auront également deux chirurgies de même durée, avec des actes mimant la néphrectomie. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures. La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 15 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 23 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. En cours de protocole, une goutte de sang sera prélevée sur les animaux anesthésiés via la veine caudale. 6 et 2 jours avant la fin du protocole, les animaux recevront une injection de tétracycline (marqueur de formation osseuse). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang va être réaliser (sur des animaux anesthésiés), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique, pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, le passage en cage métabolique, la prise de sang et les injections.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort. L’enjeu du projet est d’étudier le développement des calcifications vasculaires donc l’arche aortique sera prélevée. De plus, d’autres organes comme le cœur, les os et le rein seront prélevés. Le sang sera également collecté en vue d’observer la modification du métabolisme du phosphate et les marqueurs de dysfonctionnement rénal.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la relation entre l’os (lieu d’expression de la BSP), le rein (insuffisance rénale chronique) et l’intestin (absorption du phosphate) et l’arche aortique (développement de calcifications vasculaires). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

Avant cette étude, une étude pilote a été réalisée. Cette dernière nous a permis de déterminer le sexe des animaux utilisés dans cette étude, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. L’étude pilote a indiqué que nos animaux supportaient très bien la néphrectomie (2 décès sur 47 souris). Avec un risque d’erreur de type I choisi de 5% et une puissance souhaitée d’environ 60% ; il faut inclure au moins 10 animaux par groupe. Les données de littératures sur des animaux C57Bl6 indiquent un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie. De ce fait et prenant en compte les possibles décès des animaux suite à la chirurgie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique jugée robuste. Cela est en accord avec les résultats de notre étude pilote. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de cette procédure, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections de tétracycline en fin de protocole, elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal anesthésié, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.

Choix des espèces

L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). Nous disposons au laboratoire des souris déficientes en BSP. L’étude est menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier des syndromes d'hypercroissance liés au gène PIK3CA. Une partie est gavée pendant deux mois avec un inhibiteur, d'autres reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules mutées, plusieurs lignées génétiquement modifiées étant entretenues en parallèle. Le porteur indique que les souris de maintien de lignée restent en vie, celles des procédures étant tuées pour exploration anatomique et histologique. Il affirme que ces syndromes ne peuvent pas s'étudier in vitro, hors de leur environnement, et que la souris est le seul animal chez qui la protéine PIK3CA a été mutée.

Objectifs

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Nous souhaitons maintenant : 1-Étudier l’effet de la mutation PIK3CA dans chaque tissu de l’organisme (graisse, muscle, os, vaisseaux lymphatiques, vaisseaux artériels, vaisseaux veineux et les nerfs) en utilisant des modèles génétiques appropriés. 2- Tester l’efficacité d'un inhibiteur dans chacune des conditions. 3- Comprendre la physiopathologie de ces syndromes.

Bénéfices attendus

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Identification des tissus sensibles à une inhibition pharmacologique.

Procédures

Au cours de la procédure 2, un gavage sera effectué par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souples et non traumatisante pour l’animal. Au cours de la procédure 3, des cellules de différents types de tissus portant une mutation PI3KCA seront injectées en sous cutanée chez des souris immunodéficientes. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté, chez des souris anesthesiées et un injectant le plus petit volume possible.

Impact sur les animaux

1-Le gavage quotidien qui débutera à la semaine 6 de vie et sera effectué pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. 2- Injection sous cutanée de cellules mutées PIK3CA chez des souris immunodéficientes (une injection unique).Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage ou à l'injection sous cutanée.

Devenir

Procédure 1: maintien de lignée, donc souris maintenues en vie Prodédures 2 et 3: animaux sacrifiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur lces syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus avec des modèles murins peuvent tout au mieux être complétés par des expériences in vitro.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n-25), minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque le gavage sera réalisé sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par du BYL719. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori l'inhibiteur de PIK3CA devrait améliorer le phénotype des souris. Nous injecterons également 1 million de cellules en sous cutanée chez des souris. Ces injections seront réalisées chez des souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de Kétamine (128 mg/kg)/Xylazine (6,4 mg/kg)), par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul).

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul animal pour lequel la protéine PIK3CA a été mutée Jeunes souris de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle pendant plus de quatre semaines, elles reçoivent un régime riche en fructose et trois injections intrapéritonéales, puis subissent un test du labyrinthe en croix surélevé et un test de nage forcée pour mesurer anxiété et dépression. Le porteur reconnaît un stress modéré lié à l'isolement, aux injections et à la nature même des tests. Il présente ce projet comme "essentiel" et affirme l'impossibilité de modéliser hors de l'animal le lien entre microbiote, cerveau et comportement.

Objectifs

Pendant des milliers d'années, les humains ont consommé moins de 5 g de fructose par jour. Au 19ieme et 20ieme siècles la baisse du prix du sucre et la conversion industrielle du glucose en sirops de maïs à haute teneur en fructose à l'échelle mondiale a entraîné une augmentation drastique de la consommation de sucre ce qui a multiplié par un facteur 40 la consommation de fructose. Cependant plus de 50% de la population adulte et 80% des enfants de moins de 5 ans ne peuvent pas absorber complètement une charge de 25 g de fructose, alors que l'apport quotidien moyen est de 50-80 g. Ainsi, les changements dans les habitudes alimentaires ont créé des conditions de malabsorption du fructose. Or le fructose apparait de plus en plus comme un facteur de risque pour le développement de troubles fonctionnels cérébraux (apparition de troubles cognitifs, émotionnels et troubles du comportement alimentaire). Cependant les mécanismes liant fructose et troubles de l’humeur demeurent inconnus. Nous avons montré que la consommation excessive de fructose de par la malabsorption à laquelle elle est associée entraîne de profondes modifications du microbiote intestinal et de la production d’une molécule par l’intestin, la cholécystokinine, qui participe à la régulation de l’ingéré alimentaire. Or le microbiote intestinal est de plus en plus reconnu comme étant impliqué dans les troubles de l’humeur et du comportement alimentaire. Nous émettons l’hypothèse que des modifications du métabolisme du microbiote induites par l'ingestion de fructose pourraient donc participer indirectement au développement de troubles de l'humeur et à la modification du comportement alimentaire. Nous émettons également l'hypothèse que ces changements de comportement sont en lien avec l'habilité de ce microbiote à activer la production de cholécystokinine. Ces 2 hypothèses seront testées dans ce projet. Pour cela deux modèles de souris génétiquement modifiées présentant une malabsorption du fructose ainsi que des souris ne présentant pas cette altération seront utilisées. Le projet comprend une procédure permettant d’évaluer l’ingéré alimentaire ainsi que l’état état d’anxiété et de dépression en réponse à une malabsorption du fructose et en présence ou pas d’inhibiteur pharmacologique de la cholécystokinine. Les souris recevront un régime contenant 20% ou pas du tout de fructose pendant 3 semaines et 5 jours.

Bénéfices attendus

L'impact d'une alimentation déséquilibrée sur les fonctions cérébrales est une préoccupation de santé publique. La surconsommation de fructose a été pointée par l'Anses comme potentiellement nocive. Jusqu'à présent, la plupart des études se sont concentrées sur l'impact négatif de la surconsommation de fructose sur le syndrome métabolique. Des études épidémiologiques suggèrent que les régimes enrichis en fructose favorisent le dévelopement de comportements de type anxieux ou dépressif. Récemment le rôle du microbiote dans ce type de comportement a été décrit. Compte tenu de nos données préliminaires il apparait plus que probable que dans le contexte de l'ingestion excessive de fructose (et donc de sa malabsorption), le microbiote participe à ses effets déléteres notamment sur les troubles de l'humeur. Ce projet est essentiel à la compréhension des mécanismes de régulation du stress et de l'anxiété par le fructose.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche en fructose susceptible de diminuer leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux vigiles recevront 3 injections intra péritonéales durant l'ensemble de la procédures (quelques secondes par injection). L'ensemble des animaux seront soumis à 2 tests comportementaux (un test du labyrinthe en croix surélevé de 5 minutes et un test de nage forcée de 6 minutes) afin de mesurer leur niveau d'anxiété et de dépression.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 semaines et 5 jours ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux malabsorbant le fructose réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime contenant 20% de fructose. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les animaux soumis aux tests d'anxiété et dépression subiront un stress modéré lié à la nature même des tests. Ce stress durera le temps du test (5 minutes pour le labyrinthe en croix et 6 minutes pour la nage forcée). L'injection IP pratiquée par un expérimentateur expérimenté constitue un stress modéré notamment dû à la contention. Ce stress est cependant très limité dans le temps (quelques secondes seulement). Aucune douleur n'est attendue durant le protocole.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthansié à la fin de la procédure

Remplacement

le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre composition du microbiote, cerveau et comportement alimentaire/comportement d'anxiété-depression.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire et le comportement d'anxiété et de dépression sur les memes animaux. Un nombre de 20 animaux par groupe a été calculé afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres.

Raffinement

L’ensemble des animaux bénéficiera d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abris en propylène rouge.Les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de l'ingéré alimentaire et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau excel quotidiennement. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considéré comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont d'une lignée C57Bl6 car on dispose dans cette lignée de souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes de régulation du comportement lié à la malabsorption du fructose (un sucre majeur de notre alimentation). Ce modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation et nous avons une expertise propre sur ces modèles animaux. Des animaux adultes sont utilisés, comme dans nos études préliminaires, car le microbiote est stable à ce stade.