Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours de la stéatohépatite.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un régime alimentaire censé reproduire une maladie du foie liée à l'obésité leur inflige, selon le porteur, une forte inflammation, une fibrose, une perte de poids sévère et des difficultés à s'alimenter et se déplacer, en plus d'injections, de prises de sang et d'un gavage. L'objectif est de valider in vivo le rôle d'une protéine dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit les interactions entre foie, tissu adipeux et intestin, concluant que l'étude in vivo reste "indispensable".
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques. De manière complémentaire, nous utiliserons des souris pour lesquelles une population de cellule immunitaire d'intérêt a été éliminée à l'aide d'un composé biologique nous permettant d'apprécier son influence sur le développement de la maladie du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le rôle des cellules immunitaires.. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas 7 injections au total sur 7 semaines d'expérimentation maximum. Une seule mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. De plus, notre modèle alimentaire mimant la pathologie hépatique humaine conduit à une forte inflammation au niveau du foie ainsi que l'apparition d'une fibrose qui peuvent donc affecter l'état général de l'animal (perte de poids sévère, difficulté pour s'alimenter et se déplacer). Enfin, l'administration par voie orale de notre composé pour évaluer la perméabilité intestinale dans notre modèle peut aussi générer un stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires immortalisées de nos cellules immunitaires d'intérêt. Ces lignées seront incubées en présence de lipides et de dérivés bactériens car ces composés permettent de mimer les mécanismes initiateurs responsables du développement des complications hépatiques in vivo au cours de l'obésité: afflux de lipides vers le foie provenant du dysfonctionnement du tissu adipeux et afflux de dérivés bactériens provenant du dysfonctionnement de l'intestin. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe. En effet, comme retranscrit précédemment, les interactions "foie-tissu adipeux" et "foie-intestin" contribuent à la progression et au développement des complications hépatiques associées à l'obésité. De plus, comme tout organe le foie est composé d'une multitude de cellules (hépatocytes, cellules endothéliales, cholangiocytes, immunitaires...) et il est, à l'heure actuelle, impossible de reproduire toutes les interactions mutuelles entre ces différents types cellulaires in vitro.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Les souris seront mises sous le régime alimentaire favorisant l'apparition de la maladie du foie à partir de 20 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 30g.
Etude des rôles du microbiote intestinal et d’une voie de la réponse immunitaire (ALPK1) dans le traitement des dérèglements métaboliques dans des modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
4 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six mois un régime riche en gras et en sucre, des gavages et injections quotidiens pouvant atteindre 210 gestes, une coupure de la queue pour les prises de sang et un isolement en cage individuelle que le porteur décrit comme stressant. L'objet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans le diabète et la stéatose, avec des pistes thérapeutiques annoncées pour une "préoccupation majeure de santé publique". Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne simule le lien entre microbiote, intestin et organes, et juge le recours aux souris "nécessaire".
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elle sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme le diabète ou stéatose hépatique non alcoolique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de dérèglements métaboliques chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans ces dérèglements dans trois modèles murins de maladies métaboliques (prédiabète, diabète et stéatose hépatique non alcoolique).
Bénéfices attendus
Les maladies métaboliques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Les maladies métaboliques sont associées à un régime alimentaire déséquilibré et à l’obésité. De nombreux travaux étudiant l’obésité témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal et d’une augmentation des réponses inflammatoires dans les intestins ou dans les organes périphériques, associées à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients obèses, la persistance de l’inflammation et d’une perturbation du microbiote conduisent souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies métaboliques. Ce projet amènera une meilleure compréhension de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire liée à l’obésité et de ses effets sur les maladies métaboliques comme le diabète et la stéatose et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques permettant le traitement et la prévention de ces maladies.
Procédures
Pendant une durée maximale de 30 semaines, les souris recevront un régime alimentaire riche en gras, en sucre ou en cholestérol susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids. Les souris seront soumises à des injections (quelques secondes) ou des gavages (quelques secondes) quotidiens pour une période comprise entre 12 et 30 semaines soit 210 au maximum. Deux gavages et 1 injection seront aussi réalisés en fin de protocole au cours de deux tests qui seront espacés d’une semaine chacun, ainsi qu’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes). Nous effectuerons 2 collectes de fèces lors de l‘émission naturelle en début et fin de protocole. La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang de la joue sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 15 à 20 secondes.
Impact sur les animaux
Pour étudier l’impact du microbiote qui est différent entre les individus et suivre la prise alimentaire qui est une donnée essentielle à nos études, les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et pesées des animaux (une fois par semaine) seront réalisées sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. Les animaux seront soumis à des gavages et des injections quotidiens tout au long du protocole. Bien que chaque action engendre un stress léger et de très courte durée (moins de 10 secondes), cette répétition de gestes engendre un stress requalifié de léger à modéré. La procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie (OGTT, IPGTT) et l’insulinémie (ITT) présente une douleur légère car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test. . Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Ces trois tests nécessitent une mise à jeun de 6 heures. Afin d’éviter une période de jeûne trop drastique lors de ces tests, ceux-ci ne seront pas réalisés durant la phase nocturne mais en phase diurne. Un délai minimum d’une semaine séparera deux tests (OGTT/IPGTT/ITT). Les bactéries (pro-ALPK1) et molécules (ADP-H, agonistes et antagonistes) administrées n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux. Pour les souris soumises aux régimes riches en graisse, la prise de poids associée à ces régimes sur la durée d’exposition n’affecte pas leur mobilité.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, les tissus périphériques (foie, tissus adipeux) et la régulation de la glycémie. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal en lien avec les données biologiques obtenues à partir des différents tissus.
Réduction
Le choix des molécules et bactéries testées dans ce projet l’ont été préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro. Ainsi, nous avons sélectionné les bactéries et molécules les plus intéressantes et les plus activatrices pour réduire le nombre de molécules et bactéries à tester in vivo. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries ou molécules en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental. Chaque lignée de souris provient d’élevages indépendants.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément deux fois par semaine au moment de la prise alimentaire quantifiée (par pesée de l’aliment) et de la prise de poids des animaux. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.
Choix des espèces
Les animaux auront 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies métaboliques, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et metaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné sont uniquement présent dans ce modèle.
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une partie des souris porte un gène de l'autophagie invalidé, et des souriceaux reçoivent dans leurs deux premières semaines de vie, sous anesthésie et séparés de leur mère, des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires. 1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 60 sans réveil et 1 080 en souffrance modérée. Le protocole comprend des tests de comportement : vocalisations ultrasoniques enregistrées pendant une séparation d'avec la mère puis en interaction sociale, actimétrie, nidification, et, avant le test social de trois mois, trois semaines d'isolement "afin de stimuler les comportements d'interactions". Une chirurgie sans réveil, suivie de la mise à mort, termine le protocole pour prélever les tissus. Le porteur annonce à court terme une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie, et renvoie à "plus long terme" des tests de molécules contre des troubles du neurodéveloppement.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Un lot de 60 animaux sera soumis uniquement à une procédure sans réveil.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1140 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Notre étude a pour but l’analyse des atteintes comportementales induites par une déficience de l’autophagie combinée à une exposition environnementale précoce (composés pro-inflammatoires). Ces explorations fonctionnelles ne peuvent être réalisées à l’échelle cellulaire et nécessitent une évaluation sur l’individu. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle animal, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1140 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent + ou – 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Régulation du développement de l’épithélium intestinal par l’interaction entre la colonisation du microbiote et la signalisation des cytokines.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
16 430 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Élevés au stade larvaire dans un milieu antibiotique pour supprimer leur microbiote, ils sont collectés à différents jours, anesthésiés et enrobés dans une matrice de cellulose pour observation au microscope, puis mis à mort pour prélèvement de l'intestin ou séquençage. Le porteur indique que la privation de microbiote entraîne un sous-développement de l'intestin et que la collecte peut être une source de stress. Il justifie le choix de l'espèce par la transparence des larves et leur développement hors de l'utérus, et affirme que la culture in vitro d'un intestin colonisé est impossible à l'heure actuelle.
Objectifs
Les cytokines sont des agents essentiels du système immunitaire et constituent une partie des molécules indispensables à la communication intercellulaire. L'activité d'une cytokine est assurée par la présence à la surface de la cellule cible, de récepteurs spécifiques : ceux-ci permettront de transmettre le message. Elles sont donc des médiateurs, et leur production a lieu en réponse, principalement, à la présence d'un agent infectieux tels qu'un virus ou une bactérie, ou de l'un de leurs constituants. La colonisation de l'intestin par les micro-organismes commensaux (hôte habituel d'un organisme sans lui causer de dommage) commence avec l'ingestion de nourriture, et augmente massivement en nombre et en complexité avec les changements alimentaires tels que l'inclusion d'aliments secs dans le repas des poissons. La génération d'animaux sans germes par l'élimination de la flore commensale en début de vie entraîne un sous-développement des cellules épithéliales et immunitaires intestinales, ce qui conduit à un dysfonctionnement durable de l'organe. Les poissons zèbres dépourvus de microbiote intestinal (ensembles des micro-organismes présents dans l’intestin) présentent une prolifération épithéliale intestinale et une différenciation cellulaire défectueuses au cours du développement. Par exemple, les maladies inflammatoires intestinales peuvent résulter d’un problème d’échange entre la lumière intestinale (espace intérieur de l’intestin) et les cellules épithéliales qui la composent. En fait, la perturbation du dialogue entre le microbiote, le système immunitaire et les cellules épithéliales via les cytokines peut avoir des effets délétères sur l’état d’équilibre de l'intestin, compromettre l'absorption des nutriments et avoir un impact au-delà de l'intestin. Plusieurs études ont révélé des mécanismes par lesquels le microbiote contrôle la maturation du système immunitaire intestinal. Cependant, la manière dont le microbiote régule le développement de l'épithélium intestinal reste largement inconnue. Nous voulons donc comprendre comment les bactéries présentes dans notre intestin et l’interaction qu’elles ont avec les cytokines d’intérêt, peuvent réguler le développement de l’épithélium intestinal.
Bénéfices attendus
Le système immunitaire est bien connu pour son rôle important lors d'infections par des bactéries, des virus et d'autres agents pathogènes. Cependant, au-delà de l'immunité et de la défense, le rôle des signaux du système immunitaire, tels que les cytokines, dans le développement et la maturation des organes n'est pas bien compris. En outre, on ne sait pas comment les cytokines interagissent avec l’ensemble des micro-organismes colonisateurs, qui favorise la maturation des organes. Ces questions peuvent être facilement étudiées dans le modèle du poisson zèbre puisqu'il se développe en pleine eau et qu'il est transparent, ce qui permet d'observer directement les organes en développement dans le contexte de l'organisme complet. En outre, la manipulation de l'environnement est également très facile avec ce modèle animal. Ces avantages expérimentaux nous permettent de comprendre en détail comment les cytokines et leur interaction avec le microbiote modulent le développement et la maturation des organes intestinaux. En outre, ce projet nous permettra de révéler comment le dysfonctionnement du système immunitaire, au-delà de l'altération de la défense et de l'immunité, peut entraîner une altération de la maturation correcte de l'intestin. Ces résultats peuvent potentiellement ouvrir la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies intestinales, y compris celles liées à l'inflammation intestinale, ainsi que pour les pathologies dans lesquelles le bon fonctionnement physiologique de l'intestin est compromis.
Procédures
Les différentes interventions sur les larves dépourvues de toute flore seront les suivantes : - Observation rapide sans ouverture de boite tous les jours ou presque - Changement du milieu antibiotique, tous les jours ou tous les 2 jours - Aux temps J5, J8, J12, J15, 25 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope. L’observation avec prise de photo de chaque larve pourrait prendre jusqu’à deux heures. Les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem. - Aux temps à J12 et J15, 30 larves seront collectées et mises à mort avant de prélever l’intestin pour analyse. - Collecte de 225 larves pour séquençage. Les larves seront mises à mort pour analyses. - 15 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope et seront mises à mort pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Nous allons étudier des larves de 5 jours post-fertilisation (dpf) jusqu’à 15dpf, avec prise alimentaire sans germe à partir de 7 dpf. La formule de cette nourriture contient tous les nutriments nécessaires à leur croissance en dehors des germes. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement. L’effet indésirable qui pourrait apparaitre serait une mortalité des larves au cours du processus. Un risque de stress lors de la collecte des larves pour analyse au microscope est possible.
Devenir
Toutes les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem
Remplacement
L'étude de cellules souches en culture extraite de l'organisme vivant n'est pas suffisante pour comprendre les processus de l'embryogénèse (processus de formation d'un organisme pluricellulaire, de la cellule initiale issue de la rencontre des cellules reproductrices parentales à un être vivant autonome). La culture in vitro d’intestin et sa colonisation avec un microbiote est impossible à l’heure actuelle. Il n’existe aucune donnée sur d’autre modèle de Vertébré. Néanmoins, il existe des données de séquençage de l’ARN (technique pour identifier et quantifier le matériel génétique à un moment donné) issues du modèle poisson sur lesquelles nous nous sommes basés.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Les tailles des lots ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet
Raffinement
Les espacements des observations ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. D’une façon générale, les expériences sont de courte durée. Les larves seront lors de la manipulation pilote surveillées quotidiennement puis la fréquence du suivi sera ajustée. Les larves mortes seront enlevées et le milieu avec antibiotique sera changé pour garder les larves dans un environnement optimal. Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l'angoisse de l'animal, ce dernier sera anesthésié durant toute la procédure expérimentale d’analyse au micrsocope par le biais de la tricaïne diluée dans l’eau.
Choix des espèces
Notre compréhension de la manière dont cellules, gènes de l'hôte et microbiote contrôlent le développement des organes des vertébrés est limitée dans les modèles mammifères. Il n'est pas pratique d’y réaliser des manipulations précises dans l'environnement, dans l’animal, et en même temps, de suivre en image l'intestin en développement. Pour surmonter ces limites, notre nouvelle approche consiste à combiner les avantages du modèle du poisson zèbre avec les nouvelles technologies. Le poisson zèbre est un modèle animal idéal pour étudier le développement des vertébrés en raison de sa facilité de manipulation génétique, de sa grande descendance, de sa transparence et de son développement ex utero rapide. Il est également un système modèle puissant pour étudier le microbiome (environnement spécifique d’un microbiote) des vertébrés. Enfin, la plupart des lignées et des voies immunitaires sont conservées entre poissons et mammifères. Cette étude s’effectuera sur des larves de 5dpf jusqu’à 15 dpf. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoces sous deux conditions environnementales différentes (présence de germes conventionnels et sans germe).
Effet de la consommation de farines produites à partir de graines de protéagineux et d’oléoprotéagineux enrichies en acides gras polyinsaturés sur le métabolisme lipidique et protéique musculaire du rat jeune
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
90 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls pour contrôler leur alimentation, ce qui leur impose un stress chronique, ils sont nourris de farines d'oléoprotéagineux enrichies en oméga 3, pesés trois fois par semaine et placés quatre jours en cage métabolique, avant mise à mort pour prélever muscles et sang. L'objectif est nutritionnel et commercial, évaluer la digestibilité de protéines végétales pour développer des "ingrédients" destinés à l'alimentation humaine. Le porteur affirme que ces mesures ne peuvent être obtenues ni in vitro ni directement chez l'homme.
Objectifs
La croissance démographique mondiale pose la question de la disponibilité des ressources alimentaires et notamment des protéines. Une des solutions est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Toutefois, l'essor des protéines végétales nécessite une meilleure connaissance de leur valeur nutritionnelle, de leur cinétique de digestion et de leur biodisponibilité (capacité des protéines à fournir réellement tous les acides aminés nécessaires pour les synthèses protéiques corporelles). En effet, il est important d’étudier les qualités nutritionnelles des protéines végétales avant de pouvoir recommander leur consommation comme source protéique de substitution aux protéines animales. Et cela s’applique particulièrement aux protéines issues des oléo-protéagineux car elles sont encore peu étudiées pour l’alimentation humaine, malgré leur grand intérêt nutritionnel. En effet, ces sources alimentaires végétales, qui sont à la fois riches en acides gras indispensables (oméga 3) et en protéines (15 à 35 % de protéines dans le Colza et tournesol), pourraient être une option intéressante pour la définition de nouveaux aliments végétaux. Les farines, concentrats et isolats d’oléoprotéagineux disponibles commercialement proviennent des coproduits obtenus après extraction de l’huile (touteaux). Pour tester l’effet combiné de leurs protéines et de leurs acides gras oméga 3, il faudra rajouter des acides gras polyinsaturés aux matières protéiques végétales issues de tourteaux. Dans ce contexte, le projet vise à étudier la digestibilité de régimes riches en protéines végétales d’oléo-protéagineux enrichies avec des acides gras oméga 3, en comparaison avec un régime riche en protéines et étudier leur impact sur la digestibilité et la fonction et le métabolisme lipidiques et protéiques musculaires dans un modèle de rats jeunes.
Bénéfices attendus
L’une des solutions pour répondre au besoin accru en ressources alimentaires et notamment en protéines, est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Pourtant, il manque encore des preuves scientifiques qui permettent de considérer les protéines végétales comme source protéique de substitution aux protéines animales. Les études décrites dans la littérature portent majoritairement sur les protéines issues de graines de légumineuses (pois, lentilles), ou issues du soja mais peu s'intéressent à la valeur nutritionnelle des protéines provenant d’oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol. De plus, aucune d'entre elles n’envisage un éventuel effet synergique des lipides et des protéines issues des oléoprotéagineux tant sur leur digestibilité que sur leurs effets santé. Les plantes oléoprotéagineuses offrent un double intérêt nutritionnel car elles apportent des protéines mais également des lipides, notamment des acides gras polyinsaturés qualifiés d'acides gras indispensables car le métabolisme de l'Homme et des animaux est inapte à les synthétiser. Seule l'alimentation est capable de fournir à l'organisme, ces acides gras indispensables à un certain nombre de fonctions physiologiques. Du fait de leur forte teneur en lipides, les plantes oléoprotéagineuses sont principalement cultivées pour la production d’huiles végétales. Les procédés d'obtention de l'huile conduisent à un coproduit appelé tourteau. A partir de ces tourteaux, des produits de transformations appelés farines, concentrats et isolats, sont disponibles lorsque certains procédés de transformation sont appliqués. Ces derniers contiennent des teneurs en matières grasses résiduelles et sont concentrés en d'autres nutriments, notamment en protéines. Le présent projet fournira des données scientifiques nouvelles qui permettront d'apprécier l'intérêt de sources végétales comme les oléoprotéagineux qui combinent les protéines et les lipides tant sur la valeur nutritionnelle des protéines que sur leur éventuels bénéfices santé, résultant d'une synergie entre le métabolisme des lipides et des protéines. Ce projet pourrait donc à terme permettre de développer à partir de ces matrices protéiques végétales issues d’oléo-protéagineux, des "ingrédients" riches en protéines végétales et enrichis ou non avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, qui pourraient présenter un intérêt pour la santé et la nutrition humaine.
Procédures
L'ensemble des interventions décrites ci-après concernent l'ensemble des 90 rats. Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur mise à mort soit 4 semaines plus 10 jours d'acclimation. Les 90 rats subiront peu d’interventions durant le protocole. La première consiste à les peser, 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole. Les pesées des pesées est de quelques secondes. La deuxième consiste à récupérer la totalité des fèces et de l’urine produits par les animaux afin de mesurer la digestibilité des protéines (=azote ingéré – azote excrété/azote ingéré). Les rats seront alors hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite à son maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet.
Impact sur les animaux
A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront âgés de 4 semaines. A la fin du protocole expérimental, ils seront mis à mort à l’âge de 2 mois. Aucun effet indésirable particulier n’est attendu en lien avec les différents régimes et la mesure du poids réalisée de façon non invasive. Afin de mesurer précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole expérimental, les rats seront hébergés en cage individuelle. Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un stress chronique que nous chercherons à réduire en favorisant les contacts acoustiques, olfactifs et optiques avec leurs congénères et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage. De plus, l’ensemble des rats sera soumis à un stress supplémentaire avec leur hébergement dans une cage métabolique au cours des 4 derniers jours du protocole.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer le statut inflammatoire des rats et réaliser leur bilan sanguin.
Remplacement
L'utilisation d'animaux dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 ou 3 dimensions car ils ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l’homme. En effet, les cellules intestinales disponibles ne présentent pas les caractéristiques indispensables dans les phénomènes d’absorption des lipides par la muqueuse intestinale. De plus, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines (protéagineux ou oléoprotéagineux) enrichies avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, le métabolisme protéique, lipidique et musculaire et le statut inflammatoire circulant. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, les tourteaux et farines issues de tourteaux de colza ou de tournesol disponibles commercialement ne sont destinés qu’à l’alimentation animale et ne peuvent pas être utilisés pour la consommation humaine. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux rats les farines, concentrats ou isolats protéiques seront analysés d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.
Réduction
Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir d'autres végétaux (céréales) ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est 90. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons des tests statistiques.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptée à l'espèce. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 2 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études de digestion et d’absorption et de métabolisme des lipides et des protéines, en vue d’une extrapolation chez l’homme. Ce modèle a l'avantage de posséder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en regard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'international.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte: impact d’un challenge LPS sur la réponse du système immunitaire intestinal et systémique et l’homéostasie de la barrière intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées dès la vie intra-utérine à des additifs alimentaires ou à des pesticides contenant des nanoparticules, elles reçoivent ensuite une injection de toxine bactérienne qui peut perturber leur état général. Le porteur signale un stress lié aux manipulations, à la contention et à l'injection. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" pour obtenir cette exposition chronique dès l'utérus et qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les interactions entre microbiote, intestin et réponse immunitaire.
Objectifs
Ce projet fait suite à un projet précédant qui a permis de montrer une perturbation du fonctionnement du système immunitaire intestinal et extra-intestinal lors d'une exposition à des nanoparticules (TiO2 et SiO2) avec notamment une altération des réponses fonctionnelles des cellules immunitaires. Pour déterminer si cela pourrait conduire à une perturbation de la réponse immunitaire à un challenge infectieux in vivo, nous étudierons la réponse de souris soumises à une infection à une toxine bactérienne lipopolysaccharidique (appelée LPS) après qu'elles aient été exposées de façon chronique à des additifs alimentaires ou à des contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’impact d'additifs et de contaminants de type pesticide sur les défenses immunitaires dirigées contre une infection de type bactérien. Il apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques.
Procédures
Les animaux seront exposés aux additifs alimentaires ou aux contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules à des doses encandrant l'exposition humaine. Puis, ils seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera atténué par l'habituation des animaux aux manipulations hebdomadaires (suivi de poids, observations). Ensuite, la contention et l'injection de toxine peut engendrer un court stress. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre la toxine bactérienne.
Remplacement
Le projet étudie les effets des nanomatériaux alimentaires contenus dans des contaminants de type pesticide sur la réponse à une infection après une période d’exposition périnatale et jusqu'à l'âge adulte,. L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les interactions microbiote-intestin et intestin-réponse immunitaire et aucun modèle alternatif ne permet de recréer toutes ces interactions. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectifs (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris et les femelles gestantes seront isolées (1 par cage) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin d'améliorer leur bien-être. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
Réaction de sevrage et susceptibilité aux infections chez les souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium ou reçoivent du sulfate de dextran sodique qui provoque une colite, avec pertes de poids, atteintes intestinales et parfois la mort, et subissent une imagerie quotidienne sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatorze jours. Le porteur reconnaît que l'infection conduit à la mort d'une partie des animaux et fixe des points limites, dont une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme que les organoïdes in vitro ne reproduisent pas la propagation de l'infection à plusieurs organes, ce qui rendrait "essentiel" le recours à la souris.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est de comprendre l'interaction entre la formation immunitaire au début de la vie et l'infection. Il aura deux objectifs principaux : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, métabolites et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour entraîner les réponses à l'infection à l'âge adulte ; (ii) examiner comment l'infection au début de la vie affecte la réaction de sevrage. En fin de compte, nous voulons identifier de nouveaux traitements ou biomarqueurs du microbiote et du système immunitaire au début de la vie pour améliorer la réponse immunitaire à l'infection.
Bénéfices attendus
Le projet peut faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant la microbiologie, l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire et des infections.
Procédures
Gavage oral, en une seule fois, de la bactérie, qui durera quelques secondes et échantillons fécaux non invasifs seront prélevés. Anticorps administrés par injection i.p. qui durera quelques secondes, une fois par jour pendant un maximum de 6 jours. Les souris sans germes seront traitées avec des composés dérivés du microbiote (des acides gras à chaîne courte et/ou bactéries filamenteuses administrés respectivement via six injections intrapéritonéale sur 14 jours ou par un unique gavage) de la naissance à 28 jours. Les animaux seront également soumis à une anesthésie à l'isofluorane pendant l'imagerie in vivo de l'infection et durera 5 à 10 minutes. Cela se produira tous les jours jusqu'à 14 jours pendant l'infection.
Impact sur les animaux
Un traitement antibiotique chronique chez les mères entraîne une prise de poids réduite chez les souriceaux qui se rétablit à l'âge adulte après l'arrêt du traitement antibiotique. Ce retard de prise de poids dure donc jusqu'à 4 semaines (0-4 semaines d'âge) chez les souriceaux. L'infection à C. rodentium entraîne une perte de poids, une réduction de l'activité, une pathologie intestinale et la mort. L'infection par C. rodentium sera menée jusqu'à 12 jours (pic d'infection) avec une surveillance quotidienne des souris. Le traitement au sulfate de dextran sodique (DSS) entraîne une perte de poids et une pathologie intestinale chez les souris. Le DSS sera utilisé jusqu'à 7 jours consécutifs à la fois (14 jours au total par souris) avec une surveillance quotidienne.
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules immunitaires dans les tissus intestinaux et d'autres organes, ainsi que l'évaluation de la propagation de l'infection aux organes périphériques. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience. Tout sera mis en œuvre pour respecter les principes des 3R.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n'est actuellement disponible pour mener cette recherche. Bien que les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels puissent partiellement reproduire in vitro les réponses d'un seul organe à une infection en combinaison avec des cellules immunitaires particulières, ces systèmes ne sont pas en mesure de reproduire la propagation systémique des infections à différents organes, ni le recrutement de la grande variété de cellules immunitaires dans l'intestin ou d'autres sites immunitaires tout au long de la période d'infection. Par conséquent, pour répondre à ces questions concernant la formation par le microbiote de l'immunité au début de la vie et des réponses aux infections, il est essentiel d'utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature (1, 2), les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et le caractère doublement emboité du plan d'expérience (via les effets portée et cage). Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. Nous avons utilisé l'outil statistique G*power pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles d’ANOVA ajustés sur plusieurs facteurs (sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences conduisant à une infection et une maladie inflammatoire, dont la gravité peut être facilement suivie par la perte de poids, l'aspect général et le marqueur d'inflammation et donc la douleur estimée. Dans ces expériences, l'état des souris sera contrôlé quotidiennement par la pesée, l'aspect général et l'inspection des selles. Si la perte de poids dépasse 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou si les selles contiennent du sang, l'expérience sera arrêtée et les souris souffrantes seront mises à mort.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les souris que nous utiliserons seront des souris gestantes, des souris de naissance, des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), et des souris adultes (6-10 semaines). Ce projet étudie l'influence du microbiote intestinal pendant la grossesse et au début de la vie sur les résultats des infections à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 10 semaines.
Effet de l’exposition à des nanoplastiques présents dans l’alimentation sur la barrière intestinale et l’axe intestin-foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant 90 jours une eau chargée en nanoplastiques de polystyrène, la moitié recevant en plus une alimentation riche en sucre et en graisse, avec mises à jeun répétées, gavages et prises de sang à la queue. Le porteur signale le stress lié à la contention, au gavage et à l'isolement en cage individuelle pour recueillir les fèces. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la toxicité intestinale sous stress nutritionnel ni la communication entre intestin et foie, ce qui justifierait le recours à la souris.
Objectifs
Après une exposition orale, le tractus gastro-intestinal est la première barrière physique et biologique contre les contaminants environnementaux. Les nanoparticules de plastique (NPL) sont des polymères organiques synthétiques de taille inférieure à 1 micromètre. Ils peuvent être composés de polyéthylène (PE), polystyrène (PS), polypropylène (PP), polychlorure de vinyle (PVC), polyuréthane (PUR) et polyéthylène téréphtalate (PET). Les NPL auxquels nous sommes exposés via l'alimentation ou l’environnement ont été très peu étudiés dans un contexte toxicologique ciblant la sphère digestive. Les connaissances sur les interrelations entre l’ingestion de nanoplastiques et la modulation de la fonction barrière de l’intestin (épithélium/mucus/microbiote) sont peu nombreuses, l’essentiel des travaux décrits à ce jour ont été réalisé en utilisant des organismes marins comme modèle d’étude. Les seules études chez les mammifères ont très récemment été décrites chez la souris. Elles ont, par ailleurs, été réalisées avec des modèles NPL commerciaux dont le processus de synthèse et la présence d’additifs sont méconnues. Les résultats obtenus confortent toutefois l’hypothèse d’une altération des fonctions gastro-intestinales, avec une modulation de la sécrétion de mucus, des dommages sur la barrière épithéliale et l’établissement d’un déséquilibre de la flore intestinale sur ce modèle. En outre, la fonction barrière intestinale peut être fragilisée chez des sujets sains nourris avec un régime gras et sucré de type occidental qui présentent notamment une perméabilité intestinale accrue. En plus des effets connus de ce type d'alimentation, la fragilisation de la fonction barrière n’est malheureusement pas assez prise en compte dans les diverses études toxicologiques alors qu’une partie importante de la population consomme ce type d'alimentation. Ce projet a donc pour but d’étudier les effets d'une exposition orale à des NPL modèles traçables, synthétisés sans additifs et ayant une surface imitant chimiquement celle des débris ayant séjournés dans l’environnement (particules vieillies). L’objectif est de caractériser leur effet sur la sphère digestive et hépatique sur une barrière intacte ou fragilisée par l'alimentation pour détecter une potentialisation/synergie d’effets délétères.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de cette étude contribueront à l’évaluation de la toxicité intestinale des particules nanoplastiques présentes dans l’alimentation de la population. De plus, cette étude mimant l’exposition au plastique dans un contexte d’une alimentation « occidentale », permet également d’évaluer les conséquences des particules sur un système digestif fragilisé. Sur le long terme, cette étude participe à l’évaluation de la sécurité des aliments contenants de nanoparticules plastiques et aide les législateurs à faire évoluer l’utilisation du plastique dans le domaine de l’alimentation.
Procédures
Lors de l'exposition subchronique, tous les animaux de ce projet reçoivent le traitement à tester dans l’eau de boisson pendant 90 jours et la moitié des animaux reçoit une alimentation riche en sucre et en graisse. Les animaux sont mis à jeun pendant 4 à 6 h, gavés et du sang est prélevé à la queue pour effectuer les différentes mesures (glycémie et perméabilité intestinale) en début et en fin d'exposition. Chaque mise à jeun est séparée d’une semaine minimum de récupération. Le gavage sera fait d’un geste expert et très rapide (10 secondes) avec une sonde métallique à bout arrondi adaptée à la taille de la souris. Les animaux sont ensuite anesthésiés via une injection en intra-péritonéale qui est un geste maitrisé par les expérimentateurs et d'une durée de 10 secondes, et ensuite euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
Le gavage lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress dû à la contention de l’animal et un inconfort dû à l’introduction de la sonde dans l’œsophage. La prise de sang au niveau de la queue lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress chez les animaux. La mise à jeun des animaux avant les mesures de perméabilité et des tests de tolérance au glucose peut engendrer un stress chez les animaux. Lors du prélèvement de fèces, un stress dû à la mise en cage individuelle des animaux peut également être engendré.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour réaliser des prélèvements destinés à des dosages biochimiques et des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet nécessite des modèles impliquant la prise en compte de la barrière intestinale, la flore intestinale et de l’impact de l’alimentation dans toute sa diversité. Ainsi, seule une approche faisant appel à un modèle animal nous permettra d'explorer la complexité des interactions entre les nanoplastiques de polystyrène et les différents acteurs de la barrière intestinale (épithélium/mucus/microbiote) fragilisée ou non par une alimentation occidentale, et des conséquences/interrelations avec la fonction hépatique. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la toxicité sous stress nutritionnel. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la communication inter-organe (axe intestin-foie).
Réduction
La procédure 1 permet de choisir le modèle de nanoplastiques de polystyrène le plus pertinent en testant 2 modèles de nanoplastiques marqués différemment (marqueur fluorescent ou métallique). Cette étude pilote permettra de réduire le nombre d’animaux en choisissant le meilleur modèle de nanoplastique au préalable et de mettre au point les techniques de détection. Les expérimentations sont basées sur la comparaison de 4 groupes. Les effectifs seront déterminés et vos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront hébergés collectivement au calme dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger ainsi que de coton. Après une période 7 jours de repos pour qu’ils récupèrent du transport et s’habituent à leur nouvel environnement, ils seront manipulés régulièrement pour être habitués à la contention afin d’être pesés (1 fois par semaine), gavés et pour la prise de sang (4 fois sur la durée totale de l’exposition lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité). Le jour de l’expérimentation (10 à 15 jours après l’arrivée) les souris seront exposées aux particules via l’eau de boisson afin de limiter leur stress. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’acclimatation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Une période de récupération de minimum 1 semaine sera respectée entre la mesure de la perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose afin de minimiser le stress des animaux. L’état général des animaux et le comportement sera contrôlé quotidiennement et la prise de poids sera suivie afin de pouvoir déceler tous les signes anormaux de comportement, de souffrance et d’inconfort. Si une perte de poids supérieure à 10% de son poids initial, posture particulière dans la cage comme la prostration, les poils hérissés, la vocalisation sont observés alors l’animal sera retiré de l’étude et le cas échéant euthanasié si son état est jugé critique par la vétérinaire référente. Afin de suivre l'état général des animaux, des fiches d'observations seront mise en place pour uniformiser le suivi.
Choix des espèces
La souris C57BL/6 J (mâle et femelle) est la souche pour laquelle les outils ont été développés et adaptés au laboratoire et représente un modèle pertinent pour étudier la physiopathologie digestive. Les souris mâles et femelles utilisées seront âgées de 6 semaines à la réception, afin d'une part de faire des observations sur des souris adultes, et d'autre part de pouvoir comparer notre étude à la littérature existante.
Maintien de la lignée de souris IL10 -/- et évaluation des effets protecteurs combinés des bactéries propioniques laitières et des dérivés acides gras polyinsaturés n-6 à traiter la colite.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ce modèle déficient pour l'interleukine 10 développe une inflammation intestinale spontanée et subit des gavages quotidiens pendant sept jours pour tester un régime enrichi en oméga 6 et en bactéries propioniques contre la colite. Le porteur indique une surveillance de la consistance des selles et du comportement, avec euthanasie lorsque le score de point limite atteint 4. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever les organes, le porteur affirmant qu'il est impossible de modéliser cette complexité par des cultures in vitro ou des organoïdes.
Objectifs
L’intégrité de la barrière épithéliale intestinale est un paramètre physiologique crucial. Elle est compromise dans de nombreuses pathologies à composante inflammatoire, du diabète de type I à l’autisme en passant par les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Malgré les progrès des biothérapies, les patients atteints de MICI ont une qualité de vie très altérée, ne disposent pas de thérapies efficaces et 70% d’entre eux vont devoir avoir recours à la chirurgie au moins une fois au cours de leur vie. Il est nécessaire d’augmenter nos connaissances sur la physiopathologie des MICI et de définir de nouveaux moyens pour renforcer le tube digestif. Un intérêt croissant est donc porté aux composés alimentaires capables de renforcer la barrière épithéliale intestinale. L’objectif de ce projet est de tester si un régime riche en dérivés en acides gras polyinsaturés oméga 6 (AGPI), combiné ou pas à un enrichissement en bactéries propioniques laitières, peut réduire une colite développée chez la souris déficiente pour l’Interleukine 10. Nous souhaitons déterminer si des souches de bactéries propioniques peuvent renforcer la barrière épithéliale intestinale, diminuer l’inflammation et diminuer la colite par des dérivés AGPI oméga 6, ou s’il faut combiner les 2 agents pour optimiser une nouvelle stratégie thérapeutique pour les MICI
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de déterminer: - si un régime enrichi en Acides Gras Polyinsaturés oméga 6 peut réduire le développement d’une inflammation intestinale - si une supplémentation en bactéries laitières peut réduire le développement d’une inflammation intestinale - quelle souche peut être utilisée pour protéger de ce développement - si les 2 régimes sont complémentaires ou synergiques
Procédures
Les animaux en élevage auront une anesthésie locale avec de la lidocaïne pour l’identification au moment de la pose de la bague (geste très rapide avec une contention de 20 secondes max). Pour les animaux en expérimentation, un gavage sera réalisé quotidiennement pendant 7 jours et la contention durera moins de 20 sec par animal. Un autre gavage sera effectué 3 fois au total. Ce gavage, et donc la contention le permettant durera moins de 20 sec par animal. A l’issue de ce gavage les animaux sont à nouveaux manipulés avec anesthésie locale et le geste durera 30 secondes max. Les animaux seront positionnés en cage individuelle pendant 5h pour une exploration et ceci sera effectué au total 3 jours.
Impact sur les animaux
Il est possible d’observer des cas d'agressivité des parents sur leur petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux sont isolés avec un enrichissement adapté et peuvent être exclus de l’aspect reproduction. L’identification (pose de bague) au moment du sevrage peut entraîner une gêne et du stress. Le modèle de souris déficiente pour l’interleukine 10 est bien caractérisé néanmoins, une inflammation intestinale est présente à partir de 8 semaines avec un régime standard, et nous ne savons pas les conséquences d’un régime riche en oméga 3 ou 6 ou de la supplémentation en souches bactériennes sur ce modèle: La consistance des selles peut changer et sera surveillée ainsi que le comportement global des animaux. Leur poids sera mesuré 2 fois par semaine. Les gavages réalisés peuvent entrainer une gêne et/ou une inflammation même si ceux-ci seront réalisés par du personnel expérimenté.
Devenir
Les animaux obtenus suite à la procédure élevage seront intégrés par la suite dans la procédure expérimentation. Les géniteurs de la procédure élevage seront euthanasiés à l’issue des 6 mois en reproduction. Concernant les animaux en expérimentation, ils seront mis à mort à la fin de l’expérimentation pour permettre la collecte de différents organes afin de réaliser la suite des expérimentations mais cette fois-ci ex vivo.
Remplacement
La maladie de Crohn met en jeux différents systèmes cellulaires (bactéries, épithélium, système nerveux entérique, cellules immunitaires, muscles lisses). Il est, au jour J, impossible de modéliser cette complexité par des modèles in vitro de co-culture ou même d’organoïdes.
Réduction
Nous avons déjà travaillé sur les supplémentations en acides gras polyinsaturés n-6 ou en bactéries propioniques laitières et avec le modèle de colite induite chimiquement, ce qui nous a permis de faire des calculs de puissance, et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité.
Raffinement
Une table de points limites est bien sûr établie. Une surveillance quotidienne tout au long du protocole nous permettra de vérifier que le score de point limite reste inférieur à 1, d’augmenter notre surveillance (matin et soir) si le score est de 1 ou de 2, de réhydrater les animaux et de leurs donner des analgésiques s’il est de 3, et de les euthanasier s’il est de 4.
Choix des espèces
Au sein du laboratoire, et plus généralement, le modèle de souris IL10-/- est le plus utilisé pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et surtout mimer la maladie de Crohn. Il présente rapidement une inflammation intestinale, des défauts de barrière et un remodelage tissulaire semblables aux pathologies humaines. La supplémentation en acides gras poylinsaturés n-6 doit se faire pendant au minimum 8 semaines chez des animaux jeunes. Nous la ferons sur des souris de 4 semaines de vie et pendant 8 semaines.
Recherche de nouvelles molécules à activité antiparasitaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par un parasite intestinal par voie orale, reçoivent des injections, sont mises à jeun, puis subissent une chirurgie du ventre sous anesthésie sans réveil pour prélever le contenu de l'intestin. Le porteur affirme que la balance "bénéfice/risque" est "clairement favorable" et présente l'enjeu comme une piste de santé publique contre les parasites. Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui d'étudier ces interactions et qu'il privilégiera les modèles ex vivo quand c'est possible.
Objectifs
L’objectif de ce projet est simple, et consiste à démontrer que certaines cellules épithéliales du tractus digestif, nommées cellules tuft, sont capables de produire des composés antiparasitaires. Cette démonstration est d’une importance majeure en termes de santé, puisqu’ouvrant la voie à de nouvelles pistes en matière de lutte contre les parasites, qui touchent des millions de personnes dans le monde. Nos données obtenues montrent clairement que les souris dont les cellules tuft sont dans l’incapacité de produire de l’acétylcholine sont très sensible aux infections parasitaires. L’idée de ce projet consiste à montrer le lien direct entre cellules tuft, acétylcholine et ciblage des parasites, en démontrant spécifiquement la présence d’acétylcholine produite au sein de l'intestin. Notre stratégie expérimentale consistera à infecter des souris avec un parasite classiquement utilisé comme modèle expérimental, utilisé avec succès dans notre équipe par le passé. Nous doserons, en fin de procédure, le taux d’acétylcholine produite, via une procédure contrôlée sous anesthésie générale, pour récupérer le contenu intestinal. Ce travail devrait nous permettre de revisiter les modalités de la réponse de l’hôte contre des parasites entériques, dans une étude originale et potentiellement impactante en termes de santé publique.
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires pour démontrer le rôle des cellules tuft comme cellules productrices de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, les infections entériques avec des parasites touchant des millions de personnes dans le monde.
Procédures
Contention lors de l'étape d'infection parasitaire, administration de substances par voie intra-péritonéale, procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les étapes susceptibles d’être une source de stress pour les souris sont principalement celles de l’inoculation des parasites par voie orale, les injections de substances par voie intra-péritonéale, la mise à jeun de 4 heures, la réaction immunitaire liée à l'infection parasitaire, ainsi que la procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les tissus digestifs et la ponction luminale.
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains parasites. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse lors d’une précédente étude, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. De manière claire, toute possibilité d’utilisation des modèles ex vivo sera priorisée pour compléter les données acquises avec cette étude.
Réduction
A ce jour, nous avons le recul nécessaire d’un projet précédent, ce dernier nous ayant permis d’obtenir des données encourageantes. Les résultats seront obtenus via des analyses statistiques comparant la réponse antiparasitaire de nos groupes d'animaux. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction du nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité, selon des points limtes ayant été précdemment validés et déterminés. Afin de réduire le stress pendant les infections, les animaux seront anesthésiés. La phase expérimentale de prélevement durera 60 minutes, sous anesthésie générale contrôlée dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée avec des substances anesthésiques, un analgésique local, ainsi qu'un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l'homme et nos modèles génétiquement modifiés nous permettent de répondre à nos questions et finaliser notre étude. Ces dernières seront utilisées à l'âge de 8 semaines, lorsque le système digestif est mature.
Validation des effets de deux analogues d’un facteur de croissance sur les muscles de la souris saine.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent chaque jour, pendant dix à trente jours, des bactéries dans le creux de la joue ou des injections sous la peau, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour vérifier si des analogues d'un facteur de croissance augmentent la taille des muscles. Le porteur rappelle que le facteur d'origine favorise le développement de tumeurs du foie et affirme que ses analogues en seraient dépourvus. Il conclut qu'aucune alternative non animale ne peut répondre à cette question et prévoit d'arrêter le projet si les analogues n'agissent pas sur des cellules en culture.
Objectifs
Le facteur X est un facteur de croissance décrit pour son rôle dans le métabolisme et reconnu pour son abilité à lutter contre la sarcopénie. La sarcopénie est une perte progressive de la masse et de la force musculaire liée au vieillissement et/ou à la maladie. C’est un facteur de risque pour la santé des sujets atteints puisque le degré de la sarcopénie est lié à la mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace contre la sarcopénie. Dans ce contexte, le facteur X apparaît comme une solution prometteuse. Cependant, deux inconvénients sont liés à son utilisation. Premièrement, sur le long terme, il favorise le développement de tumeurs du foie. Deuxièment, il requiert d’être administré par injections. Ces deux inconvénients altèrent son potentiel comme outil thérapeutique. Récemment, des équipes ont développé des analogues de ce facteur X. Ces analogues ne sont plus capables de favoriser le développement des tumeurs mais conservent les propriétés de régulation du métabolisme. Un des objectifs de ce projet est donc de montrer que ces analogues ont également conservé la capacité à lutter contre la sarcopénie en augmentant la taille des muscles chez la souris. L’autre objectif du projet est de développer une méthode innovante d’administration des analogues du facteur X afin d’éviter les injections. Pour cela, des bactéries probiotiques (bactéries non pathogènes) contenant la séquence d’ADN du facteur X ou de ses analogues seront préparées puis données par voie orale aux souris afin que les cellules de leur intestin produisent elles-mêmes le facteur X et ses analogues. En résumé, les objectifs de ce projet sont (1) de montrer que l’ingestion de bactéries probiotiques contenant les séquences ADN est bien suivie de la production du facteur X et de ses analogues par l’intestin de la souris et (2) que les analogues une fois produits sont ensuite bien capables d’augmenter la taille des muscles comme cela est le cas lorsque le facteur X est injecté.
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices pourront être tirés de ce projet. Premièrement, aucune équipe à ce jour n’a vérifié que les analogues possédaient toujours la capacité d’augmenter la taille des muscles. Les résultats permettront donc de faire progresser la connaissance. De plus, s’il est mis en évidence que les analogues sont capables d’augmenter la taille des muscles cela permettra de faire émerger deux nouvelles molécules candidates pour la prise en charge de la sarcopénie, avancée non négligeable puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique. Enfin, les résultats pourront également permettre de valider une nouvelle approche d’administration des analogues du facteur X via les bactéries probiotiques, méthode moins invasive et bien plus physiologique que les injections.
Procédures
54 souris recevront des bactéries dans le creux de la joue : souris vigiles, une seule administration dans le creux de la joue par jour pendant 10, 20 ou 30 jours selon les groupes. La durée de l’administration (contention comprise) est de 30 secondes maximum par animal. 15 souris recevront des injections sous la peau du facteur X : souris vigiles, une seule injection par jour, pendant 10, 20 ou 30 jours. La durée de l’injection (contention comprise) est de 20 secondes maximum par animal. 60 souris recevront des bactéries par administration dans le creux de la joue : souris vigiles, une seule administration par jour pendant 10, 20 ou 30 jours. La durée de l’administration (contention comprise) est de 30 secondes maximum par animal. A l’issue des procédures, toutes les souris (maximum 129 au total) seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise par animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).
Impact sur les animaux
Ce projet devrait entraîner des nuisances légères à modérées sur les animaux. Une contention quotidienne des animaux sera nécessaire pour réaliser l’administration des bactéries dans le creux de la joue. Cela peut générer un léger stress chez l’animal le temps de la manipulation. Pour les animaux recevant le facteur par injection, une contention quotidienne sera nécessaire pour réaliser l’injection au niveau du flanc sous la peau. La contention peut générer un léger stress chez l’animal le temps de la manipulation. Les injections répétées quotidiennement sur plusieurs jours peuvent conduire à une légère douleur au niveau des sites d’injection. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires réalisés avec le facteur X, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux. Aucun effet néfaste des formes analogues du facteur X n’est attendu. De plus, les effets pro-tumoraux du facteur se déploient à l’issue de traitements bien plus longs que 30 jours. Aucun phénotype dommageable n’est donc attendu.
Devenir
Les 129 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la capacité des probiotiques données par voie orale à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire le facteur X et ses analogues, et enfin la capacité de ces molécules à agir sur les muscles. Il s’agit d’une problématique scientifique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, il est important de mentionner que les analogues sont testés en amont sur des cellules en culture afin de valider leurs propriétés. En toute cohérence avec les règles d’éthique animale, si l’un des analogues ne montrait aucune efficacité sur les cellules, il ne serait pas testé dans le modèle animal. Si aucun des deux analogues ne montrent des effets positifs sur les cellules en culture alors aucune étude animale ne sera réalisée, le projet sera stoppé.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec le facteur X. Un effectif de 5 animaux/groupe (sauf dans les groupes contrôles où 3 animaux suffisent) est suffisant pour mesurer la production du facteur X et des analogues. Si tous les analogues sont testés (fonction des données recueillies sur les cellules) cette procédure utilisera au maximum 54 animaux. Ensuite, pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles prélevés, il faut compter 15 souris/groupe. Si tous les analogues sont testés (fonction des données recueillies sur les cellules) cette procédure utilisera au maximum 75 animaux. Ainsi, le nombre d’animaux s’élèvera à 129 au maximum. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite l’analyse des muslces ou pourront être partager avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances, les animaux seront surveillés tous les jours par la personne qui réalisera les injections et les administrations de bactéries. Les animaux seront pesés tous les 5 jours pour surveiller leur croissance. Les bactéries seront administrées dans le creux de la joue et non par gavage pour limiter tout stress ou blessures qui pourraient être liés aux gavages. Les injections seront réalisées en alternant les sites afin d’éviter tout inconfort ou douleur au niveau du point d’injection. Les volumes d’injection et de solution de bactéries ont été réduits au maximum. Les animaux seront profondément anesthésiés avant le prélèvement sanguin terminal. Les gestes techniques seront réalisés par une personne expérimentée (toujours la même) afin de limiter la durée des gestes et le stress de l’animal. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de précédents protocoles utilisant ce facteur X ou l’administration dans le creux de la joue de bactéries, aucun mal-être n’a été observé.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier les effets des facteurs de croissance sur les muscles. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’Homme et permet d’étudier la production du facteur X (et de ses analogues) par les cellules de l’intestin ainsi que leurs effets sur la taille des muscles. Des souris âgées de 4 semaines seront utilisées. A cet âge là, les muscles sont en pleine croissance et les effets du facteur X sur leur taille sont importants, plus robustes et plus faciles à mettre en évidence que chez la souris adulte.
Étude pilote sur la cinétique de la toxine diphtérique dans des modèles de souris déficientes en SUMO.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage puis une injection de toxine diphtérique destinée à détruire les cellules de leur épithélium intestinal, pour étudier la régénération de la paroi de l'intestin. Le porteur décrit une simple étude pilote visant à établir la dose de toxine, en amont d'un projet ultérieur. Il affirme que l'infection provoque une colite modérée et transitoire et qu'aucune alternative non animale n'est possible pour ce processus.
Objectifs
Il s'agit d'une étude pilote visant à évaluer les effets de la toxine diphtérique chez les animaux sauvages par rapport aux animaux déficients en molécule SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), vise à déterminer l'importance de la sumoylation dans le processus de régénération de l'épithélium intestinal après une lésion induite. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Grâce à cette étude pilote, nous allons déterminer la cinétique de la toxine diphtérique dans le modèle de souris déficient en SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier). Cela nous permettra de réaliser un projet ultérieur, dans lequel nous administrerons de la toxine diphtérique à ce modèle pour générer une lésion intestinale, ce qui nous permettra de déterminer le rôle de SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que ces maladies sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Ce modèle murin offre ainsi une bonne opportunité pour explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la maladie puisqu’il permet d’induire une lésion ponctuelle et ciblée dans l’intestin, qui entraînera la mort des cellules épithéliales associée à une inflammation marquée et d’ainsi reproduire chez la souris un phénotype proche de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration orale de tamoxifène par gavage (20s), trois frois ; une tous les 5 jours puis il y aura une seule injection intrapéritonéale de toxine diphtérique à J17 (5s).
Impact sur les animaux
Le projet soumis est basé sur l'étude de la régénération intestinale à la suite d’une lésion induite par injection de toxine diphtérique, qui entraîne l'élimination de tous les types de cellules épithéliales de l’intestin. Les effets attendus seront ceux provoqués par la perte de l'épithélium intestinal. Comme aucun autre type cellulaire n'est affecté par la toxine, nous n’attendons ainsi que des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent néanmoins souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, comme aucun effet secondaire n’est induit par le tamoxifène ou son véhicule et que les animaux seront maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration de toxine diphtérique, nous n’attendons pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période. Le stress lié au gavage/contention, douleur au point de piqure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure afin de récupérer les organes pour étudier les effets de la toxine diphtérique en fonction des doses sur l’animal. Dans le but de déterminer pour l’avenir, la dose idéale à utiliser afin d’étudier les processus de régénération musculaire sans induire de souffrance aux souris.
Remplacement
Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de l'intestin lumen, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.
Réduction
Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois, à des jours différents, pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétition principalement) en utilisant es modèles à effets mixtes. Les animaux témoins seront comparés aux animaux de laboratoire expérimentaux par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus avec suffisamment de puissance. - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.
Raffinement
En ce qui concerne le futur projet, cette procédure nous permettra d'effectuer un affinage important puisque, grâce à cette étude pilote, nous connaîtrons la cinétique de la toxine diphtérique dans notre modèle, et nous établirons les temps d'étude et le dosage, de sorte que dans le projet sur l'étude du rôle de SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), dans la régénération intestinale, les animaux auront les conditions optimales impliquant moins de souffrance, sans effets secondaires attendus. En ce qui concerne cette procédure : - Les animaux seront gardés dans un nombre maximum de 5 par cage. - Les injections et gavages seront administrés par une personne formée et compétente dans ce type de techniques. - Un criblage de différentes doses de toxine diphtérique sera effectué afin d'établir une dose minimale de toxine qui ne cause ni douleur ni stress aux animaux. - L'état de santé des animaux sera contrôlé 2 fois par jour tous les jours pendant toute la durée de l'expérience. Des points limites seront mis en place, basés sur une observation clinique de l’animal, des seuils d’intervention et des interventions adaptées (utilisation d’analgésique, mise à mort).
Choix des espèces
La souris de laboratoire Mus musculus est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'il n'interfère en aucune façon dans l'obtention de résultats, ainsi qu'ils soient pas trop âgé, de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement ne le fasse pas.