Système gastrointestinal

400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre proposée à l'adoption. Ils sont placés en cage individuelle pendant 48 heures pour recueillir urines et fèces, subissent des prélèvements sanguins à la queue et une injection d'un traceur avant la mise à mort, pour mesurer la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à la demande de la FAO. Le porteur indique que l'isolement en cage peut provoquer un stress car les rats vivent habituellement en groupe. Sur le remplacement, il affirme que les données in vitro ne sont pas comparables et que le recours à l'animal reste "nécessaire" pour obtenir des données fiables.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à destination de l’alimentation humaine. Il répond notamment à une demande de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) de produire une base de données sur la digestibilité et la qualité de l’ensemble des sources protéiques. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Bénéfices attendus

De très nombreuses études montrent que le niveau de consommation des protéines animales des pays les plus riches ne pourra pas se généraliser à l’échelle planétaire en l’état actuel des ressources. Dans ce contexte, le maintien de la part des protéines dans l’alimentation nécessite de développer de nouveaux régimes et pratiques alimentaires qui viseront à augmenter la part relative des produits végétaux et inclure de nouvelles sources de protéines plus durables. L’évaluation de la qualité des protéines durables issues de ressources alternatives est une étape essentielle lors du développement d’ingrédients protéiques à haute valeur ajoutée. Ce projet permettra d’obtenir ces données. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Procédures

Afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés durant une durée limitée (48h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Lors de la procédure 3, Des prélèvements sanguins de 0,5mL de sang sont collectés à la veine de la queue des rats vigiles. Trois prélèvements sont réalisés par animal (avant, 1h après et 3h après l’ingestion du repas contenant la protéine à tester). Du matériel spécifique est utilisé pour limiter le temps et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. Un anesthésique local est également appliqué sur la queue avant la prise de sang afin de minimiser la douleur. Des pesées quotidiennes sont réalisées pour lesquelles les rats sont emmaillotés dans une lingette afin de les habituer à être emmailloté. Ce même emmaillotage est également réalisé lors de la prise de sang pour contenir le rat. 30 minutes avant la mise à mort des animaux, l’injection d’un marqueur permettant d’évaluer la formation des protéines dans différents organes et tissus est réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

La qualité nutritionnelle des protéines est évaluée en déterminant la consommation alimentaire individuelle des rats et en collectant les urines et fèces ponctuellement. Ceci permet de calculer plusieurs indices de qualité connus pour être transposables à l’homme. Il est donc nécessaire de les héberger en cage individuelles. Le placement en cage individuelle peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Selon les critères de qualité des protéines évalués, la mise à mort des animaux n’est pas nécessaire. Ainsi, les animaux pourront soit être placés pour l’adoption, soit être mis à mort à la fin de l’étude en fonction des critères de qualité à mesurer.

Remplacement

Un protocole de digestion des protéines in vitro a été harmonisé via un réseau international ces dernières années. Cependant les données obtenues in vitro ne sont pas complétement comparables avec les données obtenues chez l’animal. Le recours à des modèles animaux est donc aujourd’hui encore nécessaire pour obtenir des données fiables de digestibilité des acides aminés et donc des données sur la qualité des sources protéiques. Aussi, il n’y a pas de modèle n’utilisant pas d’animaux actuellement sur les effets des sources de protéines sur les concentrations d’acides aminés dans le sang ainsi que sur la formation de protéines dans les différents organes.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 8 rats/groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Afin de limiter le nombre d’animaux, les rats pourront être ré-utilisés pour évaluer un ou plusieurs critères de qualité des protéines. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même lot), deux fois par semaine durant 2 heures dans des espaces spécialement conçus, appelés parcs. Les parcs sont des espaces de 1 m² environ, avec des tunnels suspendus, des zones où se cacher et des zones à escalader. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Lors des prises de sang, un anesthésique local est appliqué sur la queue. L’animal est également habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors des injections du traceur permettant la mesure de la formation des protéines, les rats sont anesthésiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

LLe régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) recommande l’utilisation de l’être humain, ou des modèles animaux que sont le porc et le rat pour l’évaluation de la qualité des protéines. Le critère de qualité des protéines se basant sur la capacité de la protéine à soutenir la croissance se mesure chez de très jeunes rats mâles et femelles, après le sevrage (3 semaines, ~50 g) . Le critère de qualité des protéines évaluant l’utilisation et la digestibilité de la protéine en collectant les fèces et les urines se mesure chez de jeunes rats mâles et femelles encore en phase de croissance (8 semaines, ~250 g). Le critère de qualité des protéines évaluant la digestibilité des acides aminés au niveau de l’intestin se mesure chez des rats mâles et femelles encore en phase de croissance (10 semaines, ~300 g).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des gavages répétés d'antibiotiques puis de solution fécale, des mises à jeun et des prélèvements de sang et de fèces, pour étudier le rôle du microbiote et des cellules MAIT dans une stéatose du foie induite. Le porteur indique des effets possibles de perte de poids, de selles liquides, de déshydratation et de prostration, avec euthanasie si l'état ne s'améliore pas. Il affirme que ces interactions complexes seraient "impossibles à reproduire" in vitro, ce qui rendrait le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

Les maladies métaboliques sont des affections qui touchent des sujets génétiquement prédisposés, chez lesquels le dialogue entre le microbiote intestinal et le système immunitaire est altéré. Bien que leur incidence soit en croissance et que leur impact socio-économique soit majeur, ces maladies ne connaissent pas de traitement curatif. Les malades présentent une dysbiose du microbiote intestinal, une altération de la barrière intestinale et une inflammation des tissus incluant le foie et les tissus adipeux. En plus des macrophages connus pour leur rôle dans l’inflammation, il a été récemment démontré que les cellules MAIT (mucosal-associated invariant T cells) jouent un rôle clé dans l’initiation et l’entretien de l’inflammation. Il est à noter que les cellules MAIT sont une sous-population de lymphocytes T particulièrement abondantes dans le sang, le foie, l'intestin et le tissu adipeux. Les MAIT reconnaissent des métabolites bactériens et sont aussi dotées de propriétés antibactériennes.

Bénéfices attendus

La compréhension du dialogue entre les cellules MAIT et le microbiote et le rôle des MAIT dans l’inflammation durant les maladies métaboliques et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD pour "Non Alcoholic Fatty Liver Disease") pourrait permettre d’envisager à l’avenir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’inhibition de ces cellules.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivante : - Implantation sous cutanée unique de puces pour l’identification individuelle - Gavages : 4 gavages seront réalisés. • Gavage quotidien avec un mélange d’antibiotiques pendant 1 semaine • 2 gavages avec un produit marqué à 10 semaines d’intervalle • Gavage deux fois par semaine de solution fécale pendant 2 semaines - 2 mises à jeun pendant 4 heures à 10 semaines d’intervalle - Prélèvement de sang : 2 prélèvements seront réalisés sur souris vigiles à 10 semaines d’intervalle. Un prélèvement unique de sang sera réalisé sur animal anesthésié. - 15 prélèvements de fèces provenant d’une défécation spontanée seront réalisés au minimum 1 fois par semaine - 84 pesées seront réalisées à une fréquence d’une pesée par jour.

Impact sur les animaux

Une observation quotidienne des animaux et après chaque geste expérimental sera effectuée incluant une vérification de l’état général de l’animal observé. Pour cette procédure, les nuisances prévisibles sont : une perte de poids, des selles liquides accompagnées d’un pli cutané persistant (synonyme d’une déshydratation importante), et/ou un état de prostration (souris immobile, dos voûté, peu réactive aux sollicitations des congénères ou du manipulateur, yeux fermés, absence de toilettage).

Devenir

L’étude portant sur une maladie hépatique, le prélèvement post-mortem du foie est nécessaire.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans le développement de la NAFLD mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Ainsi, utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. De ce fait, le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été déterminé en se basant sur les données acquises lors des expériences préliminaires, des études précédentes publiées dans la littérature, mais aussi grâce à un test de puissance permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour ce projet, nous utiliserons 4 groupes de souris conventionnelles (n = 20). Le nombre total d'animaux nécessaires est alors 20*4 = 80 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées par lot de 4 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée de l’expérience sera limitée à 12 semaines, temps nécessaire et suffisant pour la mise en place de la maladie, sans altérer l’état général de l’animal. Au cours de l’étude, les animaux seront examinés individuellement de façon quotidienne (à l’occasion de l’examen clinique et de la pesée) ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’anomalie.Dans le cas où un ou plusieurs points limites sont identifiés, la cause de ces signes sera recherchée afin d'apporter la solution appropriée. L'animal présentant ces points d'alerte fera l'objet d'une surveillance particulière afin d'être soigné et limiter sa douleur. Si ces signes, pour des raisons inconnues, persistent et l'état de santé de l'animal ne s'améliore pas, une décision de'euthanasie sera prise par le personnel compétant afin de mettre fin à la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour étudier les maladies métaboliques et l’effet du microbiote intestinal sur ces dernières. Ce modèle est facile à gérer (petite taille, très facile à manipuler et la maladie est facile à mettre en place) et reproduit plusieurs caractéristiques physiopathologiques de la stéatose hépatique développée par l'être humain. Ainsi, ce modèle sera utilisé pour étudier l’interaction entre les cellules MAIT et le microbiote intestinal dans le contexte de NAFLD. Au commencement de l'expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies métaboliques et de la stéatose hépatique.

142 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pancréatique leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent chaque jour pendant cinq semaines une injection d'une molécule candidate, la taille de la tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur cite parmi les signes possibles la prostration, l'ulcération de la tumeur, l'automutilation et des vocalises. Il présente le recours à la souris comme "indispensable" et justifie le choix de souris immunodéficientes par un coût réduit et des autorisations moins contraignantes que pour des espèces qu'il dit "plus évoluées".

Objectifs

Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, des inhibiteurs contre des protéines essentielles dans les tumeurs ont été développé et se sont avérés très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs obtenus, montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique. Dans ce contexte, ce projet a l'objectifs d'évaluer si ces molécules ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal en ciblant ce proteine.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.

Procédures

Une injection de cellules tumorales (par voie sous-cutanée) sera effectuée. Lorsque le volume de la tumeur est suffisant, les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 5 semaines. L’intervention dure 20-30 secondes. 2 fois par semaine, la taille des tumeurs seront mesurés avec un pied à coulisse. L’intervention dure 20-30 secondes.

Impact sur les animaux

Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, volume tumoral >1,5 cm3, ulcération de la tumeur, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que ces inhibiteurs n'ont montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.

Remplacement

Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le composé et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 142 individus (4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris control pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne les développeraient pas) conformément à la règle de réduction.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules en sous-cutanées puis encore 2 à 3 semaines d’attente pour obtenir une tumeur d’un volume satisfaisant. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 9 semaines selon la vitesse de développement de la tumeur.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries E. coli, avant des traitements à base de phages administrés par gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, le côlon étant ensuite prélevé. Le porteur précise que les souris sont génétiquement modifiées et développent spontanément un cancer colorectal, mais affirme arrêter l'expérience avant que la maladie n'affecte leur état. Sur le remplacement, il indique avoir mené des essais in vitro mais juge l'étape in vivo "nécessaire" pour vérifier l'efficacité du traitement.

Objectifs

Les Escherichia coli (E. coli) sont des bactéries colonisant naturellement le tractus digestif. Ces bactéries sont dans la plupart des cas inoffensives. Cependant, elles ont tendance à céder et à acquérir du matériel génétique pouvant dans certains cas les rendre pathogènes pour l’Homme. Ce matériel génétique peut être composé de facteurs de virulences (toxines par exemple) et/ou de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques rendant leur éradication extrêmement difficile voir dans certains cas impossible (bactéries dites multi-résistantes). A titre d’exemple, Santé publique France estime pour l’année 2015 à 125 000 le nombre d’infections par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques en France et à plus de 5 500 le nombre de décès imputables à ces bactéries. Ces chiffres étant en constante augmentation, de nouvelles méthodes d’éradication de ces bactéries sont nécessaires pour continuer à traiter efficacement les patients. Le projet aura comme objectif d’éliminer le portage digestif des E. coli possédant soit des gènes codant pour des toxines soit des gènes de multi-résistance aux antibiotiques. Dans ce projet, nous utiliserons au maximum 220 souris. Les animaux seront hébergés dans des cages standards avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture et le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale.

Bénéfices attendus

D’une façon globale, ce projet apportera la preuve de concept in vivo que notre traitement peut être une excellente approche pour éliminer le portage digestif de bactéries E. coli indésirables (producteurs de toxine et/ou multi-résistants aux antibiotiques). La production de notre traitement décolonisateur testé est peu couteuse et extrêmement facile à mettre en place (son administration est elle aussi extrêmement simple). Ainsi, si la preuve de concept de leur pourvoir décolonisant sur nos bactéries modèles s’avère être un succès, il serait alors envisageable d’imaginer de développer chez des patients porteurs de bactéries similaires cette stratégie thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront tous gavés, ce qui représente un maximum de 220 souris. Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté, habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal et ne dure que quelques secondes. En ce qui concerne la fréquence des gavages, les animaux recevront tous 1 gavage des souches bactériennes d'intérêt. Les traitements décolonisateurs seront administrés quand à eux 3 fois par semaine pendant 2 semaines (110 souris). Si les expériences sont un succès, nous les répèterons en administrant le traitement décolonisateur seulement 1 seule fois (un maximum de 110 souris).

Impact sur les animaux

Les animaux se verront administrer un antibiotique via l'eau de boisson. Cette pratique est très fréquente pour faciliter l'implantation intestinale de souches bactériennes d'intérêts et n'entraine aucune gêne chez les animaux. L'administration des bactéries se fera par gavage. Cet acte n’induit pas de nuisance particulière hormis un stress léger lié à la contention de l’animal. Les souches bactériennes utilisées sont couramment employées au laboratoire et n’induisent aucun stress ou dégradation de l’état général de l’animal. Les effets indésirables résident plus dans le modèle murin lui-même, puisque les souris utilisées sont altérées génétiquement et développent spontanément un cancer colorectal. Cependant l’expérience sera arrêtée bien avant que la pathologie ne se traduise par un impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux auront reçu des antibiotiques, des bactéries et des phages. C'est pour cela qu'ils seront mis à mort. De plus, nous voulons nous assurer que les phages ont été capable d'éliminer les bactéries associées à la muqueuse intestinale et pour cela, les côlons doivent être récupérés et les animaux mis à mort.

Remplacement

Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro ayant démontré l’efficacité des traitements décolonisateurs utilisés in vivo. Cependant, la densité du microbiote intestinal est telle dans le tractus digestif, que l’étude de l’efficacité des traitements décolonisateurs in vivo est nécessaire pour nous assurer qu’ils sont réellement efficaces.

Réduction

Nous n’utiliserons que le nombre nécessaire d’animaux pour la bonne interprétation des données. D’expérience, nous savons que les expériences de colonisations intestinales par des E. coli nécessitent 10 animaux/lot (il y a une grande variabilité en termes de colonisation et moins de souris rend l’interprétation impossible). En effet, le laboratoire a publié des données comparant chez des souris prédisposées à développer le cancer colorectal, la colonisation d’une souche de E. coli de laboratoire à celle d’une souche de E. coli associée au cancer colorectal chez l’Homme. Les groupes comportaient entre 14 et 17 animaux. Par ailleurs, le laboratoire réalise de nombreuses infections bactériennes de souris dans le cadre de l’étude du pouvoir inflammatoire des E. coli associés à la maladie de Crohn, une maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Bien souvent les chiffres de colonisations présentent des variations et le nombre d’animaux utilisés s’en trouve impacté. Des groupes de 8-12 animaux sont fréquemment constitués. Nous prévoyons une administration répétée ou unique des traitments décolonisateurs. Les epxériences d'administration unique ne seront faites que si l'administration répétée montre un effet bénéfique. Si ce n'est pas le cas, l'expérimentation prenda fin.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans une salle climatisée avec un cycle jour/nuit de durée égale et un taux d'humidité constant. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. Le poids des souris sera également suivi avec attention car c’est un très bon marqueur de pathologies intestinales et de la sévérité d’une diarrhée. Nous utiliserons également un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites. Si un animal présente des signes de douleur, un antalgique lui sera administré par gavage pour en contrôler la prise. Les expériences seront réalisées en toute sécurité, notre animalerie permettant notamment la manipulation de pathogènes.

Choix des espèces

Pour les souris de fond génétique sauvage, nous gaverons des animaux âgés de 6-8 semaines. C'est un âge classiquement utilisé dans les expériences de gavage et d'étude de la colonisation intestinale par les bactéries. Pour les souris prédisposées à développer le cancer colorectal, nous gaverons des animaux âges de 6 semaines. C'est l'âge classique pour ce modèle.

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.

Objectifs

Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par une alimentation grasse et sucrée, elles sont gavées chaque jour pendant cinq semaines, puis soumises à des tests de tolérance au glucose et aux lipides avec incision de la queue, pour comparer des bactéries probiotiques. Le porteur mentionne comme effets un gonflement de l'œsophage, une prostration possible et une infection au point d'incision, les souris étant anesthésiées puis mises à mort pour prélever leurs organes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité éthique de prélever ces organes chez l'humain.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie reconnue comme une priorité urgente et un enjeu majeur de santé publique. La mortalité et la morbidité associées à cette maladie entraînent des coûts exorbitants de santé dans le monde. A ce jour, malgré un arsenal thérapeutique important, le traitement est loin d'être optimal. Il apparaît urgent d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour optimiser le traitement des patients. Une nouvelle voie s’est ouverte depuis que des études ont montré que l’un des effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique très largement prescrit résulte de sa capacité à modifier les populations de bactéries présentes dans l’intestin. Actuellement, des souches de bactéries probiotiques sont développées pour améliorer l’état du métabolisme des patients diabétiques de type 2. Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bienfait pour la santé de l’hôte. Récemment, dans modèle de souris, une nouvelle souche de bactérie probiotique ciblant le diabète de type 2 a été identifiée. Ce projet vise à identifier le mécanisme d’action de cette nouvelle souche en la comparant avec des bactéries probiotiques déjà connues et qui ont des effets bénéfiques sur le diabète.

Bénéfices attendus

A court teme, ce projet permettra de comparer les effets d’une nouvelle bactérie probiotique avec des bactéries probiotiques déjà connues sur le métabolisme du glucose et des lipides afin identifier son mécanisme d’action. A plus long terme, les résultats de ce projet ouvriront la possibilité de valider l’effet anti-diabétique de la nouvelle bactérie vivante ou de préférence de la bactérie sous une forme inactivée pasteurisée (risque sanitaire réduit) chez des personnes diabétiques au cours d’un essai clinique. Ainsi, ce projet doit permettre de développer un nouveau traitement pour les patients avec un diabète de type 2, ce qui est particulièrement précieux face à des traitements médicaux existants qui ne sont pas optimaux.

Procédures

Toutes les souris éveillées seront gavées pendant 5 semaines (tous les jours, une fois par jour, 15 secondes au maximum par souris). A l’issue des 3 premières semaines de traitement à l’âge de 13 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test sanguin permettant de mesurer l’effet du traitement sur la capacité de leur organisme à utiliser le glucose injecté dans la cavité abdominale (une fois, 15 secondes). L’évolution du taux de sucre dans le sang après l’injection du glucose sera mesuré 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère inscision à la queue de l’animal (une seule incision, 5 secondes par prélèvement). A l’âge de 14 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test de charge en lipides donnés par gavage pour tester leur capacité à absorber les lipides (une fois, 15 seconde). L’évolution des taux de lipides dans le sang sera suivie 4 fois par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue des souris (5 secondes par prélèvement). A l’âge de 15 semaines, toutes les souris seront anesthésiées par injection (une fois 15 secondes) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

On pourrait observer après gavage du sang sur la canule, un gonflement de l’œsophage et/ou une prostration de la souris. Dans les jours qui suivent l’incision superficielle de la veine de la queue (une seule fois par test), une infection au point d’incision peut être observé. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé.

Devenir

A l’issue du protocole, à l’âge de 15 semaines, tous les animaux seront anesthésiés avant une dernière prise de sang, puis les souris seront rapidement mises à mort pour récupérer les organes nécessaires aux analyses biologiques pour permettre l’identification du mécanisme d’action de la bactérie probiotique.

Remplacement

Comme l’effet attendu d’un anti-diabétique se fait par des modifications physiologiques coordonnées entre plusieurs organes (foie, intestin et tissus adipeux, entre autres) et qu’il n’est pas possible éthiquement de réaliser ces prélèvements dans chacun de ces organes chez l’Homme, ils seront réalisés chez la souris, un animal qui fonctionne physiologiquement de manière similaire à l’Homme pour les paramètres physiologiques analysés.

Réduction

Le nombre de 16 animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance statistique et par l’expérience acquise dans des protocoles précédemment réalisés. Avec cet effectif de 16 souris par groupe, les données recueillies pourront être comparées entre le groupe contrôle et les groupes traîtés à l’aide de tests statistiques ce qui permetta de répondre aux questions initialement posées. Plusieurs bactéries seront testées en parallèle afin de ne consituter qu’une seule fois les groupes contrôles et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours avec une attention particulière en période de gavâge pour vérifier l’apparition de troubles du comportement ou de stress. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé. De plus, la personne qui va manipuler les souris lors du gavage est très expérimentée (si possible toujours la même), et réalisera un geste rapide et précis pour limiter la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Au sein de la communauté scientifique, les travaux effectués dans le domaine des bactéries probiotiques sont majoritairement réalisés chez la souris ce qui permet la comparaison des résultats obtenus par les différentes équipes. Comme la physiologie du métabolisme des sucres et des lipides chez la souris est proche de celle de l’Homme, les expériences seront réalisées chez cette espèce animale. La souris C57BL/6J est reconnue comme une souche de référence pour les études du métabolisme et tolère très bien la nourriture riche en gras et en sucres. De plus, les altérations du métabolisme glucidique et lipidique induites chez les souris par une nourriture riche en gras et en sucres sont très bien décrites et maîtrisées. L’intervention nutritionnelle débutera chez les souris âgées de 10 semaines car à cet âge, les souris sont adultes et présentent un microbiote intestinal mature. De plus, à l’âge de 10 semaines de vie, les souris sont métaboliquement prêtes à consommer une nourriture riche en gras et en sucres et à développer les altérations métaboliques voulues.