Système gastrointestinal

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris SAMP8 modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une supplémentation en butyrate, des gavages, des prélèvements de sang à la queue et des mesures du transit digestif, puis des tests comportementaux de mémoire visuelle et de motricité. Le porteur signale une perte de poids propre à cette lignée et indique que gavages, prises de sang et tests peuvent générer stress et douleur. Il affirme que l'étude du lien intestin-cerveau au cours du vieillissement ne peut aujourd'hui se faire que sur un modèle animal, faute de reproduire cette complexité in vitro.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde. Il n’existe aucun traitement efficace pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et mortelle, entraînant une perte progressive des neurones au niveau du cerveau, notamment des régions impliquées dans la mémoire. Un des signes majeurs de la maladie d'Alzheimer est l’accumulation dans le cerveau d’un bout de protéine appelé Abeta qui à la longue empêche une bonne communication entre les neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives (eg. constipation) pouvant se manifester de façon très précoce, longtemps avant qu’apparaissent les premiers signes affectant le cerveau. Ces défauts de transit gastro-intestinal suggèrent que la MA toucherait aussi bien le cerveau que l’intestin. L’intestin est composé de neurones régulant les fonctions digestives. Par ailleurs, il a également été montré que les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Il a aussi été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du tapis microbien tapissant l’intestin et d’une baisse associée de métabolites provenant de ces microbes tel que le butyrate. De plus, le butyrate a été montré comme étant bénéfique au bon fonctionnement des neurones de l’intestin et du cerveau. Dans ce contexte, améliorer le fonctionnement des neurones de l’intestin pourrait améliorer la fonction de transit intestinal et ainsi prévenir des formes graves de MA. De nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans les processus de mémoire. Au vu de tous ces éléments, améliorer le tapis microbien de l’intestin ou des métabolites qu’il produit, tel que le butyrate, peux avoir un impact positif sur les fonctions de l’intestin et la mémoire dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Favoriser la communication des neurones du cerveau par l’alimentation peut avoir des effets bénéfiques sur le vieillissement normal ou pathologique (Maladie d’Alzheimer) du cerveau. D’autre part, le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale dans le cerveau pourrait aussi impacter ceux de l’intestin et vice-versa. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans la régulation des performances cognitives (AGCCs : acides gras à courte chaine, acides aminés, vitamines). De manière intéressante, la flore intestinale et ses métabolites peuvent eux aussi impacter ces fonctions. Les AGCC sont naturellement synthétisés par le microbiote, principalement dans le colon et leur rôle central non seulement dans le métabolisme neuronal mais aussi la modulation de gènes impliqués dans la connectivité neuronale. De plus, d’autres études ont mis en évidence les effets bénéfiques du butyrate sur la communication des neurones du cerveau avec amélioration de la mémoire. Néanmoins, leur capacité à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

Après 4 mois et 6 mois de traitement, pour tous les animaux, nous effectuerons des études des fonctions digestives en évaluant le temps de transit colique (durée max 30 min) et total jusqu’à 6 heures avec addition d’eau (temps de transit total) , ainsi que la perméabilité intestinale in vivo et le nombre de fèces émises. L’objectif est de mesurer le temps de transit oro-anal et de calculer le nombre de fèces émises sur 2 heures. Ainsi les fèces émises seront collectées toutes les 15 minutes sur deux premières heures pour le temps de transit colique. Deux heures après gavage, un prélèvement d’un échantillon de sang à la queue (sur animal vigile) est réalisé (durée 30 sec). Après 6 mois, tous les animaux réaliseront des tests comportementaux (mémoire visuelle et motricité d’une durée de 10 à 30 min individuellement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant la supplémentation alimentaire en butyrate ou l’Inuline. Il est cependant important de noter une perte de poids des souris SAMP8 par rapport aux contrôles qui est indépendant de la supplémentation envisagée. Cette perte serait liée à une altération du métabolisme chez ces souris et qui est observable dès la naissance. Stress et douleur peuvent être générés par différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux).

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des études sur des protéines, des ARN et des marquages sur des tissus.

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de vieillissement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier le butyrate comme métabolite d’intérêt et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement bénéfiques de plusieurs métabolites bactériens. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés collectivement dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. Ils seront observés quotidiennement. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine si le score reste inférieur à 1 Si, selon les tables des points limites, le score venait à augmenter, la surveillance du poids et de l’hydratation seraient quotidienne voir 2 fois par jour pour des scores de 1 à 2. Si le score devait être de 3, les souris recevraient un analgésique par voie sous-cutanée, 1 fois par jour. Pour un score de 4 les souris seraient mises à mort

Choix des espèces

Les souris SAMP8 sont un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car ne présentant aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, étant un modèle naturel/spontané sans surexpression de gènes, il se prête mieux à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec du butyrate et/Inuline envisagé dans le projet. Les travaux menés au sein du laboratoire ont également montré qu’il est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la MA. Les souris SAMP8 et leur modèles contrôles (SAMR1) seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon quotidienne avec de l’eau sans supplémentation ou de l’eau contenant du butyrate (supplémentée ou non avec de l’Inuline) jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les souris SAMP8 et SAMR1 seront utilisées à l’âge de 3 semaines et hydratées de façon journalière avec de l’eau sans supplément (contrôle) ou de l’eau contenant du butyrate jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus pour nos expériences car des études montrent que les symptômes intestinaux commencent vers 1-2 mois et les symptômes cérébraux vers l’âge de 6 mois. Etant donné que le projet vise à évaluer l’effet préventif du butyrate, les âges retenus permettent de baliser l’apparition de ces symptômes.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime gras de trois à six mois jusqu'à l'obésité, puis subissent une chirurgie abdominale de quatre-vingt-dix minutes avec pincement du pédicule du foie et des prélèvements de sang, pour mettre au point un modèle d'ischémie-reperfusion sur foie stéatosé. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité et que la chirurgie provoque une perte de poids et une défaillance du foie plus ou moins transitoire. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas un foie vascularisé et juge le recours à l'animal nécessaire.

Objectifs

La transplantation d’organe solide constitue le traitement curatif de choix des patients présentant des défaillances d’organe à un stade terminal. Malheureusement, les besoins augmentent plus vite que les organes disponibles et entraînent des pénuries de greffon, ce qui engendre des listes d’attente importantes. L’une des stratégies envisagées est l’élargissement des prélèvements chez des donneurs présentant des facteurs de comorbidité (association de plusieurs maladies) ; notamment des foies stéatosés atteints de stéato-hépatite non alcoolique (NASH), caractérisés par l’apparition de dépôts graisseux liée à un régime alimentaire trop riche en sucre et en graisse. Lors de la transplantation, des phénomènes liés à l’ischémie (défaut d’apport en nutriments et en oxygène) et aussi à la reperfusion (reprise du flux sanguin de l’organe chez le receveur) sont à l’origine de processus physiopathologiques qui vont contribuer aux lésions irréversibles du greffon. Dans le cas de la greffe de foie, la séquence d’ischémie-reperfusion peut entraîner des lésions sévères, à l’origine de dysfonctions du greffon et potentiellement du rejet de l'organe à plus ou moins long terme. L’utilisation de foies stéatosés pour augmenter le nombre d’organes transplantables doit être rigoureusement étudiée étant donné que les conséquences de la stéatose sur la qualité de la transplantation continuent à faire débat. Afin de répondre aux attentes cliniques, notre objectif est de mettre au point un modèle murin d’ischémie-reperfusion hépatique chez des souris atteintes de stéatose (obésité nutritionnelle) afin d’étudier les effets combinés de la stéatose et des lésions d’ischémie reperfusion. La première étape sera de définir les points limites de ce modèle en testant différentes durées de régime et de temps de reperfusion tout en évaluant l’impact sur les lésions d’ischémie-reperfusion hépatiques et la nuisance pour les animaux. La validation de ce modèle permettra ensuite d’établir la durée optimale de régime et de temps de reperfusion afin d’identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir les effets de l’ischémie-reperfusion en transplantation de foies stéatosés chez l’homme.

Bénéfices attendus

A court terme, la mise en place de ce modèle permettra d’étudier in vivo les effets combinés de la stéatose et d’une ischémie-reperfusion sur les fonctions hépatiques, ce qui n’est pas possible chez l’homme. A moyen terme, après la validation de ce modèle, nous pourrons identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion et améliorer la reprise de fonction. A long terme, ce projet vise à augmenter le pool de greffons disponibles à la transplantation chez l’homme.

Procédures

Régime riche en graisses et sucres durant 3 à 6 mois pour 144 souris. Pesée 1 fois par semaine pendant la durée du régime pour 288 souris (10s). Un jeûne de 4h avant tous les prélèvements sanguins. Prélèvements sanguins (8 maximum pour 32 animaux sinon entre 4 et 7 prélèvements pour 256 souris) sous anesthésie gazeuse d’une durée de 30s par prélèvement. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse AVEC pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse SANS pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 3, 4 ou 6 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre l’obésité. Les animaux obèses seront un peu moins mobiles mais sans conséquence sur l’accès à leur alimentation et eau de boisson et leur bien-être général. L’acte de pesée sur animal vigile pourra induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un léger inconfort au réveil. Après la chirurgie abdominale, un stress transitoire peu intense, une mobilité réduite de quelques heures (due aux sutures abdominales) peuvent être observés. En post-opératoire, une perte de poids de quelques heures jusqu’à sept jours après la chirurgie pour les animaux obèses qui reprennent un régime normal peut également nuire à l’animal. L’autre effet indésirable attendu est une défaillance plus ou moins transitoire de la fonction hépatique dont l’impact principal sera la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Un modèle in vitro de cellules hépatiques stéatosées réalisé au laboratoire nous permet d’avoir une première approche des mécanismes mis en jeu au niveau cellulaire. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un foie, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie hépatique notamment associée à une modulation du métabolisme d’un foie vascularisé. En effet, les méthodes d’études in vitro ou in silico sont très limitées pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents dans les modèles in vitro ou in silico : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’évaluer de manière intégrative et systémique la mise en jeu des éléments immunitaires et métaboliques dans les lésions d’ischémie-reperfusion en utilisant un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques de la procédure découle d’une part d’un compromis entre les questions de minimisation et d’autre part d’un calcul de puissance pour définir le nombre d’animaux par groupe suffisant pour détecter des différences statistiques biologiques intra-groupes et intergroupes. Un total de 288 animaux maximum sera nécessaire pour la réalisation de ce projet de 5 ans. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d’organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition des souris en surpoids sera prise en compte pour le bien-être animal. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire avec des grilles de score. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et locale en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène et le modèle d’ischémie-reperfusion hépatique chez la souris, sont validés et adaptés pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques (cytokines, protéines recombinantes, anticorps de détection). Les animaux seront âgés de 6 semaines au démarrage des régimes. Il est important de démarrer les régimes de façon précoce pour une meilleure installation de la pathologie. Les chirurgies pour ischémie-reperfusion seront réalisées sur animaux adultes à maturité (3 à 6 mois après démarrage des régimes).

24 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie endoscopique de deux à trois heures pour la pose d'un dispositif anti-obésité, puis six anesthésies générales échelonnées sur trois mois pour des radiographies et des prises de sang, avant d'être tué et disséqué. Le porteur reconnaît une série de complications possibles, lésions digestives, infection, obstruction, déplacement du dispositif et carences. Le projet teste, pour une entreprise, la sécurité d'une alternative endoscopique à la chirurgie bariatrique, présentée comme "nécessaire" faute d'adhésion des patients à la chirurgie actuelle.

Objectifs

Le traitement de l’obésité est un enjeu sanitaire majeur. L’objectif du projet est de développer un dispositif médical délivré par voie endoscopique (c’est-à-dire par la bouche et l’œsophage) afin de traiter l’obésité. La solution proposée serait une alternative à la chirurgie bariatrique (chirurgie traitant l’obésité) tout en étant aussi efficace que celle-ci et en minimisant les complications associées. En effet, la chirurgie bariatrique est pratiquée sur moins de 2% des patients éligibles en France, ceci étant notamment dû aux complications associées. Une première phase de tests a été réalisée sur des modèles in vitro (en laboratoire) et ex vivo (cadavres humains et animaux). La seconde phase, sur modèles in vivo (animaux) et objet de cette demande d’autorisation, a pour objectif de développer un dispositif avec la simulation des phénomènes physiologiques attendus chez les patients humains (en particulier le phénomène de péristaltisme, c'est-à-dire le phénomène de contractions permettant aux aliments d'avancer dans le système digestif). Dans un premier temps la sécurité du dispositif doit être testée. Si cette phase est validée, nous collecterons, dans un second temps, des données sur la performance de notre approche. Ainsi, au final, la phase animale nous permettra de développer un produit permettant de répondre à la problématique, de tester son innocuité et de mesurer son efficacité. Les données sur l’efficacité seront complétées par celles disponibles dans la littérature. Actuellement, l’implantation du dispositif par voie chirurgicale chez le porc est privilégiée puisque l’anatomie de ce modèle rend l’approche endoscopique complexe.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de tissu adipeux représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1.9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie bariatrique ne soit plus à démontrer, seul 2% des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie bariatrique tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l’efficacité des dispositifs testés par l’entreprise.

Procédures

Pour chaque porc : • L’intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure 2-3 h maximum avec radiographie et prélèvement sanguin au cours de cette anesthésie • Sous anesthésie générale à J0, J7, J14, J30, J60 et J90 soit 6 au total : o Les radiographies : chaque examen radiographique prenant 45 min, il y en a 6 au total o Les prélèvements sanguins sont réalisés au même moment que les radiographies. Chaque prélèvement prenant environ 2-3 min, il y en a 6 au total

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus résident surtout dans la douleur suite au placement du dispositif. Néanmoins, la littérature décrit une série de complications éventuelles : • Lésion du système digestif ; • Infection avec ou sans fièvre ; • Obstruction gastrique ou intestinale ; • Déplacement ou rotation du dispositif implanté ; • Carence en vitamines et minéraux ; • Trouble du transit ; • Vomissement ponctuel post-implantation ; • Réaction inflammatoire locale des tissus. Notre protocole prévoit de surveiller et anticiper ces complications.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Pour comprendre l’impact du prototype et statuer sur sa sécurité, il est nécessaire d’inspecter, d’examiner et photographier les zones entourant le dispositif incluant les muqueuses et les organes. Suivant la phase du projet, des prélèvements d’organes pourront être effectués pour observations macroscopiques et analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur sujets cadavres humains et sur carcasses d’animaux ont été effectués afin de simuler la procédure et confirmer l’adéquation des dimensions des prototypes en cours de développement. Des premiers essais pour valider la sécurité ont été menés sur animaux vivants. Les tests de cette présente DAP s’inscrivent dans la continuité de ces tests en affinant les prototypes évalués précédemment. De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ces conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable, notamment pour le suivi post-implantation.

Réduction

Avant d’effectuer une étude de preuve de concept, une étude pilote a été réalisée en utilisant un nombre réduit d’animaux. Cette étude nous a permis d’obtenir des estimations de l'effet et de la variation qui peuvent servir à calculer la taille de l'échantillon d'études plus importantes. Avant d’effectuer l’étude de confirmation, une première phase de preuve de concept a été initiée en janvier 2023 en utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10). Pour arriver à une confirmation de cette preuve de concept, un nombre de 9 animaux est nécessaire sur une base de 3 sessions de 3 animaux. Dans le cas où un nombre inférieur à 9 animaux permettrait de prouver la preuve de concept, la phase 2 sera initiée et la phase 1 terminée sans utiliser les 9 animaux initialement prévus. La preuve de concept sera démontrée si le dispositif répond aux attentes c’est-à-dire s’il est bien toléré et les données obtenues sont concluantes, notamment : paramètres cliniques acceptables, tolérances locales macroscopique et microscopique acceptables (évaluées par un pathologiste indépendant), troubles digestifs acceptables, absence d’obstruction gastrique. Dans le cas où la preuve de concept est démontrée (avec un nombre d’animaux ≤ 9), il sera décidé de passer à la phase 2 du projet (vérification). Pour cette phase, un nombre de 15 animaux sera nécessaire : 3 groupes de 5 animaux (un groupe avec suivi jusqu’à 1 mois, un groupe suivi jusqu’à 3 mois et un groupe contrôle). Dans le cas où la preuve de concept n’est pas démontrée, il sera décidé de relancer une étude afin d’améliorer les caractéristiques du dispositif, si celui-ci ne répond pas aux attentes. Cette étape permettra de réduire le nombre d’animaux (ne pas utiliser les 15 animaux prévus en phase 2).

Raffinement

Les porcs seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. Des enrichissements du milieu, tels que jouets en caoutchouc, sont mis à disposition. Les animaux auront un patch de fentanyl 3 jours après la chirurgie protégé par un bandage. Un isolement individuel pendant 24h après la chirurgie sera nécessaire afin de suivre individuellement l’état clinique des animaux (vomis, selles et urines). Pour compenser cet isolement de 24h, les animaux seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel. De plus, la température de la salle d’hébergement sera maintenue à 21± 2°C. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec ces animaux. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). La douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20%, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique. Au cours de l’étude, une série d’examens sera effectuée afin de détecter les signes de douleur incluant : - Examens du comportement des animaux avec pesée au minimum hebdomadaire ; - Rayons-X avec ou sans agent de contraste (si indisponible échographie) ; - Examens sanguins afin de confirmer l’absence de carence et de signe d’infection.

Choix des espèces

Le Porc est l’espèce animale la plus étudiée dans la littérature pour la chirurgie bariatrique. En effet, elle possède de grandes similarités avec les humains au niveau du système gastro-intestinal en termes de dimensions et de physiologie. Pour les porcs, le critère de sélection principal sera le poids (environ 60-80 kg) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents.

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques, elles reçoivent des injections répétées d'une protéine, la pose d'une pompe osmotique et d'un cathéter sous chirurgie, et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la maladie du foie induite peut provoquer douleur, inconfort, inflammation et troubles du comportement. Le composé testé est présenté comme "prometteur" pour traiter le diabète et les maladies du foie, sur la base de données "préliminaires".

Objectifs

Ce projet vise à mettre en évidence que l'administration de K1K1 ralentit la progression de la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) en réduisant la stéatose et la fibrose hépatique dans deux modèles nutritionnels de souris atteintes. De plus, nous postulons que l'effet antifibrotique de K1K1 dans le foie sera associé à la prévention de certains types de cancers du foie. In vivo, des données préliminaires montrent que l'administration intrapéritonéale de K1K1 pendant 3 semaines améliore fortement la production, la sécrétion et la sensibilité à l'insuline, conduisant à une réduction significative de l'hyperglycémie dans un modèle de souris obèses et diabétiques. Sur la base de données préliminaires fortes et uniques fournissant la preuve du développement d'un mimétique fonctionnel du facteur de croissance hépatique pour une administration in vivo, nous postulons que le mimétique K1K1 est un composé prometteur pour améliorer la transplantation de cellules des îlots, traiter le diabète et les maladies du foie. Nous proposons donc dans cette étude collaborative de valider l'efficacité et la sécurité de K1K1 d'une part dans le traitement de la stéatose et de la fibrose hépatiques, et d'autre part vis à vis de l'Elafibranor, tout cela à l'aide de modèles in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait donc permettre de valider le rôle régénérateur de K1K1 dans la fibrose hépatique

Procédures

Pour la procédure 1 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. Pendant la semaine 3 : tests de tolérance à l'nsuline, injection d'insuline et prélèvements de gouttes de sang à la queue pour mesurer la glycémie (durée 120 minutes). 3 jours plus tard : tests de tolérance au glucose, gavage de glucose puis prélèvements de sang pour dosage d'insuline à t0, t15 et t90 (durée 120 min). Procédure 2 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp. Procédure 3 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Procédure 4 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp.

Impact sur les animaux

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une maladie du foie caractérisée par l'accumulation excessive de graisse dans les cellules du foie. Il peut donc survenir plusieurs effets indésirables au cours de l’étude : L'induction de la NAFLD peut perturber le métabolisme des souris, entraînant une augmentation de la glycémie et une résistance à l'insuline. Elle peut également entraîner une inflammation dans le foie et d'autres tissus, ce qui peut causer de la douleur, de l'inconfort et des troubles du comportement chez les souris. De plus, si celle-ci n'est pas traitée, elle peut évoluer en fibrose hépatique, ce qui peut entraîner une dégénérescence du foie et une insuffisance hépatique. L'accumulation de graisse dans le foie peut également entraîner une production accrue de radicaux libres, qui peuvent endommager les cellules hépatiques et provoquer une réponse de stress oxydatif.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes et/ou étude de la radioactivité

Remplacement

Le remplacement par des études in vitro (avec l'études de cellules d'hépatocytes en culture par exemple) ne semble pas possible au vue de cette étude: nous souhaitons étudier principalement l'effet du peptide K1K1 sur la stéatose hépatique mais avant tout les bénéfices de celui-ci sur un organisme complexe, avec des effets sur des voies métaboliques intégrées telle que la sensibilité à l'insuline. De plus, l'utilisation de souris est nécessaire, avant les tests chez l'Homme, pour suivre des effets actuellement inconnus (nous souhaitons par exemple vérifier en parallèle si ce traitement permet d'éviter un développement tumoral induit par la NASH, phénomène que l'on peut observer exclusivement dans un organisme vivant complexe, regit par bons nombres de cascades de signalisation inter organes, hormonales, neurales,etc...). Des approches in silico et in vitro ont déjà été mises en oeuvre afin de s'assurer que le peptide K1K1 lie bien le récepteur Met et active la voie de signalisation, ainsi l'utilisation d'animaux est l'étape suivante pour s'assurer d'un effet biologique in vivo. Selon les résultats de l'étude, d'autres approches in vitro pourraient être utilisées afin de disséquer sur des modèles de cellules les mécanismes d'action (on pourrait envisager l'utilisation d'organ-on-chip afin de faire cohabiter les différents types de cellules hépatiques).

Réduction

Plusieurs études au sein de notre laboratoire ont précédemment montré que des groupes de 10 souris étaient necessaire au minimum pour obtenir des résultats optimaux. Afin de réduire le nombre d'animaux contrôles, nous utiliserons des souris contrôles sous régime normal pour comparer aux souris génétiquement diabétiques ou ayant une résistance à l'insuline induite par un régime hyper-lipidique.

Raffinement

Enrichissement environnemental, consistant à fournir un environnement plus stimulant pour les souris, en ajoutant des objets tels que des tunnels, des matériaux de nidification, etc. Cela permet de réduire le stress et l'ennui chez les souris en captivité, tout en favorisant leur comportement naturel. Anesthésie et analgésie : il est important d'utiliser des protocoles d'anesthésie et d'analgésie efficaces pour minimiser la douleur et la détresse chez les souris lors de procédures chirurgicales ou invasives. Suivi régulier de l'état de santé des souris : il est important de surveiller régulièrement l'état de santé des souris pour détecter rapidement tout signe de maladie ou de détresse et agir en conséquence.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle d'étude de l'homéostasie glucidique (physiologie et pathophysiologie très similaires à l'Homme).

30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous-cutanée, un gavage de microbiote humain et une injection d'azoxyméthane, un composé cancérigène destiné à déclencher des lésions précoces du côlon, puis subissent trois prélèvements de fèces avant d'être tués pour analyse. Le porteur décrit ces gestes comme générant un stress et une douleur "minimes" et affirme que l'injection du cancérigène n'engendrera pas de douleur. Les retombées annoncées, une piste nutritionnelle contre le cancer colorectal moins coûteuse que le médicament, restent formulées comme une possibilité.

Objectifs

Le risque de cancer colorectal (CCR) est fortement affecté par l’alimentation, avec un risque augmenté par la consommation de viande rouge et un risque réduit par un régime pesco-végétarien (sans viande mais avec des oeufs et des produits laitiers en plus des végétaux, auquel on ajoute des produits de la mer comme les poissons, les crustacés et les mollusques). Le projet porte sur l’étude de la contribution du microbiote intestinal dans ces effets de l’alimentation sur le risque de CCR.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle du microbiote intestinal en lien avec le régime alimentaire dans le développement du cancer colorectal, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour favoriser un microbiote limitant le risque de cancer colorectal. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.

Procédures

- 1 implantation sous-cutanée d’une puce électronique destinée à identifier les rats de manière unique et pérenne (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes. - 1 gavage unique de microbiote humain dilué (1 ml) (rats vigiles, tous les rats), durée : 10 secondes - 1 injection intra péritonéale unique d’un composé cancérigène (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes - 3 prélèvements de fèces (2 semaines après l’inoculation, à 7 semaines, et à 14 semaines après l’inoculation). Pour cela, chaque rat est placé quelques minutes dans un grand pot en plastique transparent ; les rats émettent spontanément et rapidement les 1-2 crottes nécessaires (rats vigiles, tous les rats)

Impact sur les animaux

Le projet porte sur les liens entre alimentation, microbiote intestinal et cancer colorectal. Il est donc attendu que les rats présentent, suite à l’injection d’azoxyméthane, une augmentation des marqueurs de cancérogenèse au niveau du côlon. Toutefois, il s’agit d’une procédure établie pour étudier les stades précoces de la cancérogenèse (foyer de cryptes aberrantes, lésions prénéoplasiques…) qui n’engendreront pas de douleur. Les interventions sur les animaux seront d’une part l’inoculation des microbiotes par gavage et d’autre part l’injection intra-péritonéale d’une solution tamponnée d’azoxyméthane. Ces gestes sont assurés par des personnels expérimentés et généreront un stress et une douleur minimes. LLes prélèvements fécaux n’occasionneront que peu de stress ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques associés au développement du cancer colorectal.

Remplacement

A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote et de l’alimentation sur le cancer colorectal nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique suffisamment sophistiquée pour le remplacer.

Réduction

Nous utiliserons 10 rats par groupe. Notre expérience, et celle d’autres groupes de recherche, dans l’étude de l’effet du régime alimentaire et/ou du microbiote intestinal sur la cancérogenèse colique, indique qu’un effectif de 10 rats par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En particulier, les résultats obtenus lors d’un protocole similaire (mais avec transfert de microbiotes de rats) ont montré que ce nombre d’animaux permettait de mettre en évidence des effets du microbiote sur certains marqueurs de la cancérogenèse.

Raffinement

La solution du composé cancérigène est préparée de façon à ce qu’elle évite une douleur au point d’injection. Il n’y aura pas d’autres manipulations provoquant de la douleur pendant cette procédure, et l’étude est arrêtée au stade de lésions précancéreuses qui ne provoquent pas de douleur. Tous les rats auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l'ajout de feuilles de cellulose (pour faire le nid), d'un bâton de bois à ronger et des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper. Les rats seront 2 par cage pour éviter l'isolement et auront libre accès à la nourriture et à l'eau. Tous les rats recevront de l'eau stérilisée à l'autoclave et un régime alimentaire standard irradié.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est l’injection unique d’un composé cancérigène qui a l’avantage de provoquer des stades précoces du cancer colorectal comparable à la situation humaine. Nous utiliserons des rats adultes, âgés de 5 semaines au début de l’expérimentation, l’objectif étant d’étudier la relation alimentation-microbiote-cancer colorectal chez l’adulte.