Système gastrointestinal

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter pylori puis gavées d'un composé nommé EX-01, jusqu'à deux fois par jour pendant quatorze jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur vise un médicament contre l'infection à H. pylori, associée aux cancers de l'estomac, et renvoie cette retombée à terme. Il affirme que des expériences chez la souris sont "indispensables" pour confirmer l'activité du composé, jugée impossible à modéliser in vitro.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant reponsable dans plus de 93% des carcinomes gastriques. Le composé EX-01, naturellement présent dans l’alimentation, dont l’inocuité a été montrée mais dont la composition est actuellement confidentielle car en instance de brevetage, a montré des effets antibiotiques in vitro sur Helicobacter et Campylobacter. Il a également montré des effets anti-cancéreux dans les cancers de la prostate et du pancréas mais son action n’a pas encoré été étudiée dans le cancer de l’estomac. Nous souhaitons donc à présent étudier in vivo les effets de ce composé, l’objectif à terme étant la création d’un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo chez la souris les effets du composé EX-01 sur la colonisation de l’estomac par la bactérie Helicobacter pylori.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage sur animal vigile: 20 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Gavage sur animal vigile: 40 souris, 1 fois par jour sur 3 jours puis 2 fois par jour sur 14 jours

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour, et à l’infection à H. pylori. L’infection à H.Pylori peut induire une légère inflammation au niveau de l’estomac au bout de 5 semaines

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé EX-01 sur la croissance de H. pylori a été montré in vitro (dépôt de brevet en cours). L’absence de toxicité chez la souris a été démontrée. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique (environnement acide susceptible d’affecter l’activité de la molécule), éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé par notre équipe. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des analyses biologiques de H. pylori à partir de la muqueuse gastrique des souris infectées, et l’analyse histopathologique pour quantifier l’inflammation gastrique. Des études statistiques seront réalisées : d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori, qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs. Si l'animal commence à perdre du poids, de la nourriture humidifiée sera mise dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement euthanasié. Si l'animal présente des signes de souffrance trop importants il sera euthanasié sans attendre. Les souris seront pesées deux fois par semaine, si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris C57BL6J et est maitrisé au laboratoire. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.

384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une alimentation contaminée par la mycotoxine déoxynivalénol et du fer héminique, avec pour certains une injection cancérigène d'azoxyméthane et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélèvement d'organes. Le projet étudie l'effet combiné de ces contaminants alimentaires sur le cancer colorectal. Le porteur affirme qu'une étude in vitro ne rend pas compte de la complexité de l'organisme entier.

Objectifs

Les mycotoxines sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine déoxynivalénol (DON) se retrouve dans près de 50 % des céréales et les concentrations augmentent avec le changement climatique. Aujourd’hui, environ 80 % des individus sont exposés au DON, à des niveaux proches ou supérieurs à la Dose Journalière Tolérable. Nous faisons l’hypothèse que dans des conditions réalistes de multi-exposition, le DON exacerbe le potentiel toxique du fer héminique présent en grande concentration dans la viande rouge et la charcuterie et qui est associé au développement de plusieurs maladies chroniques, dont le cancer colorectal. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser in vivo les effets “cocktails” du DON avec du fer héminique sur la génotoxicité au niveau des cellules épithéliales intestinales et sur l'initiation et la promotion de la carcinogenèse colorectale. L’hypothèse d’un effet exacerbateur de ce mélange auquel nous sommes exposés nécessite une évaluation toxicologique chez l’animal avec pour objectif de répondre à une question de santé publique.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, nous étudierons in vivo chez le rat l’effet d’une exposition à moyen (28 jours) et long terme (100 jours) au mélange DON/fer héminique. Ce projet permettra de mieux appréhender les questions de multi expositions liées à l’exposome chimique alimentaire auquel la population humaine est quotidiennement exposée. Les données expérimentales découlant des différentes procédures apporteront des réponses en terme de toxicité et génotoxicité de ce mélange dans un contexte d'exposition réaliste au DON et au fer héminique via l'alimentation. Cela permettra de répondre à une question de santé publique quant aux effets des co-expositions sur la santé digestive et le développement du cancer colorectal. Nous étudierons si l’exposition combinée aux différents cocktails impacte les marqueurs de génotoxicité dans les cellules épithéliales intestinales et coliques. D’autres marqueurs d’atteintes tissulaires (perméabilité intestinale, scores microscopiques, apoptose, prolifération cellulaire, …) d’inflammation (dosage de cytokines, activité myéloperoxydase…), et des marqueurs en lien avec la consommation de fer héminique et de DON dans les urines et les eaux fécales seront également mesurés. Les résultats attendus du projet sont importants sur le plan de la santé publique car les consommateurs sont exposés de façon chronique à ces contaminants en mélange. Si l'hypothèse d'une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu'ils sont en mélange est confirmée, les données produites dans ce projet pourront être prises en compte dans les évaluations du risque d'exposition chez l'homme.

Procédures

L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Les animaux sont hébergés par groupe de 3. Les féces seront prélevés à 2 reprises pour les procédures 1 et 2, en début et fin d'expérimentation. Pour les procédures 3 et 4, les féces seront prélevés à 3 reprises, en début, milieu et fin de procédure. Lors de l’injection d’azoxyméthane en intra-péritonéal, la solution est tamponnée pour éviter une douleur au point d’injection et dure moins d'une minute. Cette injection sera unique au cours de la procédure n°4. Dans les procédures 1 et 2, les animaux subissent un passage en cage à métabolisme pendant 24 h. Dans les procédures 3 et 4, les animaux subissent 3 passages en cage à métabolisme pendant 24 h. Préalablement une période d’adaptation de 3 h sera réalisée la veille du premier passage afin de diminuer le stress de l’animal. La mycotoxine déoxynivalénol ayant un pouvoir anorexigène, une perte de poids peut être observée à la dose de 10 mg/kg chez le rat. Les animaux seront pesés de manière bi-hebdomadaire et si une perte de poids supérieure à 15% est observée, l'animal sera alors sorti du protocole expérimental et euthanasié.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet porte sur des études nutritionnelles à moyen (28 jours) et long terme (100 jours). Un suivi du bien-être animal sera effectué chaque jour et si l’un d’entre eux présente des signes de souffrance il sera examiné par le vétérinaire référent. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit a priori pas de douleur. Cependant, un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur en charge de la procédure sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Pour les différentes procédures, les animaux sont gardés en cage à métabolisme individuelle pendant 24h. 3 heures seront nécessaires à l'habituation et adaptation des animaux avant une période de 24 heures nécessaire pour pouvoir récupérer les urines et fèces bien séparées. Pour limiter le stress d'isolement lors des passages en cages à métabolisme, chaque rat en cage à métabolisme pourra avoir un lien visuel avec au moins deux de ces congénères. Pour l'injection en intrapéritonéal de l'AOM, une douleur au point d'injection peut être engendrée, elle sera limitée par le fait que la solution est tamponnée avant l'injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation et des organes prélevés post-mortem pour analyses.

Remplacement

Une étude in vitro sur des cellules épithéliales intestinales montre des résultats quant aux effets du mélange DON-fer héminique sur plusieurs mécanismes cellulaires. Cependant les effets du mélange sur un seul type cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité d'un organisme dans sa totalité. Ainsi, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de la co-exposition mycotoxines/ fer héminique seul ou en mélange, de manière sub-chronique ou chronique sur la physiologie et santé du rat fisher 344 telles que, par exemple, l'observation d'une perte plus ou moins importante de poids ou une augmentation des atteintes dans l'intestin (inflammation et atteintes tissulaires). Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique ainsi que les interactions entre les différents composés sur la physiologie intestinale et leurs rôles dans l'inflammation et l'appration de dommages à l'ADN dans l'épithélium.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Pour ces études nutritionnelles, nos travaux montrent qu'un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour suivre les modulations de la prise de poids et de la perméabilité intestinales. Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement relevants, nous prévoyons un nombre similaire d'animaux par groupe dans ce projet.

Raffinement

Les rats étant des animaux sociables, ils seront hébergés par 3 dans des cages transparentes afin de permettre le contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant, pour diminuer le stress provoqué par la préhension des animaux avant le prélèvement, une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'étude. Un enrichissement sous forme d’un abri en inox sera mis à disposition des animaux Y compris lors de l'hébergement en cages à métabolisme. L'utilisation de cages à métabolisme est justifiée par la nécessité de récupérer des fèces et urines séparées. Les rats y séjourneront 3 jours au total après avoir y été habitués pendant 2 demi-journées. Le suivi de leur bien-être sera renforcé pendant cette période avec plusieurs visites fois par jour. L’utilisation d’une grille de suivi individuel permettra de repérer les signes de stress ou de souffrance (poil hérissé, perte de poids supérieure à 15%, prostration, comportement alimentaire perturbé…). Si l'expérimentateur juge que l'état de l'animal se détériore au-delà d'un point limite, la procédure s'arrêtera.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l'étude de la relation entre l'alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi sur l’utilisation de modèles animaux. La lignée de rats F344 est un modèle largement utilisé pour étudier la modulation des biomarqueurs urinaires, fécaux et coliques associés à l'exposition au fer héminique. Dans cette étude, le choix d’utiliser des rats mâles a été fait pour éviter de possibles interactions avec le cycle hormonal chez la femelle notamment sur la réponse immunitaire inflammatoire. Les rats âgés de 4 à 8 semaines sont adultes et leur système digestif est pleinement fonctionnel. Les études précédentes portant sur l’exposition au fer héminique ou au DON ont été faites dans des conditions similaires.

850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de lignées de cancer colorectal humain, subissent une ou deux chirurgies sous anesthésie, des résections de tumeur et pour certaines cinq séances d'irradiation, avant d'être tuées pour prélèvement. Le projet évalue un dispositif d'imagerie par fluorescence censé guider le chirurgien, le porteur reconnaissant inflammation, perte de poids et douleur postopératoire. Il affirme que la validation du dispositif rend l'étape animale "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

Le cancer colorectal est l’un des cancers les plus fréquents et mortels chez les hommes et les femmes avec un taux de survie de 63 % à 5 ans malgré la mise en place d’un programme de dépistage. Des cancers colorectaux (CCR), 30 % sont localisées dans le rectum (CR). Le CR nécessite un diagnostic et un traitement spécifiques. La résection chirurgicale est le traitement de référence, mais elle induit une morbidité importante et une qualité de vie réduite. Les chirurgiens doivent se reposer sur leurs sens de la vision et du toucher afin de distinguer les tissus malades devant être retirés des tissus sains à préserver. Cette absence de guidage est critique ; une identification inadéquate des zones de résection peut être responsable du développement de métastases, d’une récidive locale et de la diminution de la survie. Pour répondre à cette problématique, l’imagerie est devenue un domaine de recherche majeur, notamment autour de l’imagerie de fluorescence. Cette technique non-irradiante est adaptée aux contraintes d’un bloc chirurgical. Elle nécessite l’usage d’un fluorophore sensible et spécifique au tissu malade ciblé. La stratégie « Watch and Wait » (observer et attendre) est une approche permettant de préserver les organes. Un suivi précis de ces patients est crucial pour identifier toute (re)croissance tumorale locale ou dans des organes avoisinants. C'est pourquoi de nouvelles technologies de surveillance ont été développées afin de permettre un suivi plus précis et plus objectif et de minimiser le risque de récidive et d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif l’évaluation d’un nouveau système d’imagerie avec un fluorophore cible comparé à différents systèmes d’imagerie et à d’autres fluorophores. Pour ce faire, un modèle murin de xénogreffe de cancers colorectaux permettant de reproduire les conditions du cancer colorectal humain sera utilisé. Ce nouveau dispositif d’imagerie, s’il est validé, pourrait être utilisé au cours d’une chirurgie CRC ou d’une coloscopie afin d’aider les chirurgiens dans leur prise de décision. Ce projet sera donc réalisé sur un effectif total de 850 animaux dans le respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait contribuer à optimiser les thérapies chirurgicales des cancers colorectaux en réduisant le nombre d'opérations inutiles après une réponse clinique complète et d'assurer un meilleur suivi des patients. En effet, le traitement à visée curative du cancer colorectal consiste en une chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d'une résection chirurgicale. Cette technique a permis de diminuer la récidive avec de meilleurs résultats à long terme. Toutefois, il est difficile pour les chirurgiens de distinguer les tissus cancéreux des tissus sains. Ainsi, de nouveaux outils d'imagerie diagnostique pourraient améliorer le contraste entre les tissus cancéreux et les tissus sains adjacents pendant la chirurgie. L'imagerie moléculaire ciblée sur la tumeur est une technologie émergente qui pourrait répondre au besoin d'évaluation nécessaire aux chirurgiens. Cette technique innovante peut permettre une visualisation peropératoire en temps réel de la tumeur en mettant en évidence de manière sélective les cellules cancéreuses. Ainsi, cette étude pourrait permettre la mise en place d’essais cliniques chez l’homme et fournir de meilleurs outils d'orientation aux chirurgiens traitant des patients atteints de cancers colorectaux.

Procédures

Les animaux des différentes procédures expérimentales seront soumis à : - Implantation d’une lignée cellulaire au niveau des deux flancs sous anesthésie générale gazeuse sur 72 animaux (PE1, partie 1) - Implantation de 3 lignées cellulaires sous anesthésie générale gazeuse sur 778 animaux (PE1, partie 2 et PE2-PE9) - 1 chirurgie sous anesthésie générale gazeuse pour exposer la tumeur sur 666 animaux pendant environ 1 heure (PE1, 2, 3, 4, 5, 7 et 8) - 2 chirurgies sous anesthésie générale gazeuse sur 184 animaux pendant 1 heure (PE6 et 9) - 1 résection de tumeur complète sous anesthésie générale gazeuse sur 697 animaux pendant 1 heure (PE2, 3, 4, 5, 6 résection totale, 7, 8 et 9) - 1 résection de tumeur incomplète sous anesthésie générale gazeuse sur 69 animaux pendant 1 heure (PE6 résection partielle) - imagerie (non invasive) sous anesthésie générale gazeuse sur 850 animaux pendant 5 minutes - 5 séances d’irradiation sous anesthésie générale gazeuse sur 46 animaux pendant 10 minutes une séance par jour pendant 5 jours - Euthanasie prélèvements d’organes terminaux sous anesthésie générale sur tous les animaux (850).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur notre modèle de souris de cancers colorectaux sont : - Inflammation ou nécrose de la tumeur, - Perte de poids, - Douleur suite à la chirurgie. Une grille d’évaluation de la souffrance/points limites des souris établies tous les 2-3 jours permettra de détecter et suivre la totalité des effets secondaires et de les gérer en cas de besoin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever les tissus pour des études et validations post-mortem.

Remplacement

Après un début de développement du dispositif d’imagerie grâce à des approches « in silico » (numériques) et « in vitro » (substrats de synthèse, tissus, organes isolés), le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de cette nouvelle technologie. Il s’agit de démontrer l’efficacité du dispositif d’imagerie en temps réel au cours d’une chirurgie, en validant des paramètres spécifiques dans différentes procédures expérimentales réalisées sur un modèle de cancers colorectaux. L’objectif principal est de démontrer que le nouveau dispositif d’imagerie permet de distinguer les tissus sains des tissus cancéreux pour guider le chirurgien lors de son opération. Cette étape sur l’animal est indispensable afin de pouvoir envisager, par la suite, la mise en place d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de mesures réalisées par animal a été optimisé (plusieurs systèmes d’imagerie seront utilisés sur un même animal) afin de réduire le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les études seront réalisées par étapes, avec des phases préalables de validation et d’optimisation des modèles sur de faibles effectifs avant de passer aux étapes suivantes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec du matériel pour la nidification. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement quelques jours avant de démarrer les procédures expérimentales ; la mesure de leurs tumeurs et leur poids sera réalisée 3 fois par semaine. L’implantation des tumeurs, les chirurgies et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. L’usage d’analgésie avant les opérations permettra une meilleure gestion de la douleur. Une partie des animaux sera sacrifiée sans réveil après la chirurgie. Les animaux qui seront réveillés après chirurgie seront suivi quotidiennement afin de pouvoir détecter et gérer la douleur en cas de besoin. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chirurgiens. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. Il est ainsi possible d’obtenir un modèle standardisé optimal de tumeurs colorectales, modèles plus difficiles à réaliser chez d’autres espèces. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Nous utiliserons des souris nude. Ce modèle de souris permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs. Ces souris sont connues pour être de bons modèles pour le développement de tumeurs sous-cutanées. Les animaux seront livrés à partir de l'âge de 5 semaines. A cet âge, nous pourrons réaliser les analyses prévues sur les tumeurs. L’utilisation de souris nude, sans poils, fera en sorte que la couleur de la peau et les poils n'interfèrent pas avec les différentes technologies d'imagerie utilisées.

1404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec pour une partie des animaux une induction de cancer intestinal par injection, puis une injection de cellules B régulatrices et des prélèvements sanguins. Le projet teste une thérapie cellulaire contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées pour caractériser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme que les migrations et interactions cellulaires en jeu ne peuvent pas être modélisées in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser l’effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices (Bresg) dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Les MII incluent la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC) qui sont des troubles chroniques et récidivants, dont le cancer est une complication à long terme potentiellement mortelle. Plus de 2 millions d'Européens et 1,5 million de Nord-Américains sont atteints de MII. Bien que les traitements actuels permettent de ralentir la progression de ces maladies chez certains patients, une rémission durable et la prévention du cancer associé ne sont pas toujours possibles, et il n'existe actuellement aucun traitement curatif pour les MII. Les MII impliquent des cellules du système immunitaire responsables de la pathologie intestinale. L’activation de ces cellules pathogènes est normalement empêchée par un autre type de cellules du système immunitaire appelées Bregs. Les Bregs sont déficitaires chez les patients atteints de MII si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices chez ces patients. Des Bregs peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. Les MII peuvent être modélisées chez la souris. En utilisant ces modèles les objectifs de ce projet sont de caractériser l’effet des Bregs produites in vitro sur la progression de la maladie, leur localisation dans les souris traitées, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur effet bénéfique, et leur capacité à compenser pour des défauts dans d’autres mécanismes régulateurs importants dans l’inflammation intestinale. Le projet évaluera également la capacité de ces Bregs à empêcher le développement de cancer intestinal provoqué par l’inflammation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les Bregs pour traiter les MII et empêcher le développement de cancers associés, ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté, l'intestin. Les MII, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, sont des troubles chroniques et récidivants du tractus gastro-intestinal. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif des MII. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale aberrante chez ces patients. L'activation de la réponse immunitaire est normalement contrebalancée par des lymphocytes régulateurs, tels que les lymphocytes B régulateurs (Bregs). Les Bregs sont déficients dans les MII et donc incapables de bloquer la réponse inflammatoire conduisant à la maladie. Il existe un grand espoir qu'il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices à ces patients. Les Bregs peuvent être produits en grand nombre par différenciation des cellules B naïves à l'aide d'un protocole récemment établi.

Procédures

La colite sera induite dans 1404 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson. Ces souris suivront 8 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chacun de ces traitements. 1) injection de Bregs, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 90 souris. 2) injection de PBS, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 15 souris. 3) injection de Bregs, analyse J10 : 345 souris. 4) injection de PBS, analyse J10 : 210 souris. 5) Injection de Bregs, analyse J28 : 384 souris. 6) Injection de PBS, analyse J28 : 96 souris. 7) pré-traitement AOM, injection de Bregs, analyse semaine 12 : 216 souris. 8) pré-traitement AOM, injection de PBS, analyse semaine 12 : 48 souris.

Impact sur les animaux

La colite aiguë est induite par ajout de DSS dans l'eau de boisson pendant une semaine à une concentration de 4,0 % (modèle aigu). Pour le modèle chronique, les souris ont une eau de boisson avec du DSS à 2,5 % pendant une semaine, puis une semaine pendant laquelle l’eau de boisson ne contient pas de DSS, suivie par une semaine avec de l’eau de boisson à 2,5% en DSS (modèle chronique). Dans le modèle aigu, les souris développent la colite quelques jours après l'administration de DSS. Pour le modèle chronique, la concentration de DSS a été optimisée afin que les souris développent une maladie plus légère. Dans le modèle chronique, les souris développent progressivement la colite après le premier cycle d'administration de DSS et sont en rémission pendant la semaine suivante, puis la maladie rechute avec le deuxième cycle d'administration de DSS et se rétablit progressivement après le retrait du DSS. L'induction d'un cancer associé à une colite se fait par injection intrapéritonéale d'AOM suivie de trois cycles d'administration de DSS via l’eau de boisson (modèle AOM/DSS). Dans ce modèle de cancer, les symptômes sont provoqués par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par DSS. Les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur sont généralement peu nombreux et le nombre d’animaux devant être mis à mort pour atteinte de point limite est généralement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole de production des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures contenant uniquement des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le besoin d'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l'effet Bregs dans des modèles de MII et de cancer du côlon associé. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires et impliquent des processus d'interaction entre différents types de cellules et des migrations cellulaires qui ne peuvent actuellement pas être modélisés in vitro. Les maladies inflammatoires intestinales impliquent également la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, puis l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction des MII a été optimisé de manière à ce que les maladies se développent de façon homogène chez des souris génétiquement identiques, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valides. Des mesures de remplacement et d'affinement ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires à ce projet. Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et sur les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power. Nous comparerons le jour d'apparition des signes cliniques, le score clinique maximum et l'incidence de la maladie avec le test de Mann-Whitney, et le niveau global de la maladie avec des ANOVA à mesures répétées. En outre, nous utiliserons une stratégie d'imagerie par luciférase pour suivre le devenir des Bregs au fil du temps sur le même animal, ce qui réduit le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Le protocole d'induction des MII a été affiné de manière à ce que l'évolution de la maladie ne dure que 10 jours dans le modèle aigu, si bien que les souris ne sont malades que pour quelques jours, et soit plus douce dans le modèle chronique afin de réduire la souffrance des animaux. Dans le modèle de cancer associé à la colite, les symptômes sont causés par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par le DSS. Le protocole a été raffiné au niveau des doses utilisées afin que les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur soient généralement rares. Nous avons établi des points finaux pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux, et par les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement pour les expériences avec le modèle de colite aiguë et deux fois par semaine pour les modèles de colite chronique et de cancer de l'intestin.

Choix des espèces

Les modèles de MII et de cancer colorectal proposés ici sont bien standardisés. Les connaissances disponibles sur ces modèles permettent de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de MII. Même si ces modèles ne sont pas une copie parfaite des MII ou des cancers associés, ils constituent des modèles utiles pour le développement de pistes thérapeutiques pour la pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est approprié pour ces études car cela correspond à l’âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est appropriée pour étudier cette maladie.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec un régime gras à l'huile de palme, elles subissent des prélèvements sanguins répétés, des gavages et des périodes de jeûne, pour étudier le rôle d'une protéine intestinale dans l'obésité. Le porteur indique que le régime vise à induire l'obésité et que l'isolement, le gavage et les injections peuvent provoquer stress et gêne. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un excès d’apport énergétique et une élévation de l’endotoxémie. Le récepteur membrannaire CD36 (cluster of differentiation) semble impliqué dans le transport de ces toxines du microbiote intestinal. Dans un précédent projet, nous avons étudié l’impact d’un régime riche en acides gras insaturés. L’objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité induite par un régime riche en acides gras saturés. En effet le CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies associés à un excès de lipides. Pour ce faire nous utiliserons des souris n’ayant plus de CD36 dans l’intestin, comparées à des souris contrôles. 96 souris contrôles et 96 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime classique soit avec un régime hyperlipidique enrichi en huile de palme durant 12 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Afin d’étudier les variations liées au sexe l’intégralité de ce projet sera réalisée avec des animaux mâles et des animaux femelles. 192 animaux au total seront donc utilisés.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle la dépense énergétique en régime normo- et hyper-lipidique riche en acides gras saturés ? 2. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et l’adaptation intestinale à un régime hyperlipidique riche en acides gras saturés ? 3. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’endotoxémie et l’écologie du microbiote intestinal en régimes normo- et hyperlipidique riche en acides gras saturés? 4. La proteine CD36 intestinale modifie-t-elle l’effet obésogène de l’exces de lipides alimentaires saturés ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaire.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire, ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 2 à 3 minutes) en semaine 0, 2, 4 et 12. La procédure 1 est appliquée à la moitié de l’effectif pour laquelle des mesures de prise alimentaire et de récolte des feces dans la cage seront réalisées, en semaine 0 et 11. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine -2, -1, 6, 7 et 9. La procédure 2 est appliquée à l’autre moitié de l’effectif où une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 7. Cette mesure est indolore et non invasive et s’effectue dans des cages spécifiques de mesure. Des prélèvements sanguins seront également réalisés en semaine 0 et 5. A l’issue du régime en semaine 12, l’ensemble de l’effectif subira un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie générale, puis sera euthanasié pour réaliser des prélèvements d’organes.

Impact sur les animaux

Le régime hyperlipidique est utilisé pour induire l'obésité chez les animaux. Des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids pourraient être attendues. Toutefois, elles ne sont jamais observées après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris sur de courtes durées, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Un enrichissement supplémentaire sera proposé dans leurs cages d'hébergement afin de compenser cet effet indésirable. Le gavage gastrique peut entraîner un certain stress, des irritations ou une gène de courte durée. L'echoMRI est une technique non invasive, qui recquiert une contention courte inférieure à 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique est indolore et non invasive. Cependant, elle nécessite une individualisation en cage spécifique, qui peut induire un stress sur 5 jours. Le sprelèvements sanguins à la queue des souris nécessite une contention légère et ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement sanguin en intracardiaque final est réalisé sous anésthésie, et ne dure pas plus de 30 secondes. Les souris subiront une mise à jeun de 12 heures. Pour les injections en IP (intrapéritonéale, au niveau de la cavité abdominale) et en IV (intraveineuse), il peut y avoir une douleur au point d'injection. Les produits injectés sont indolores (insuline) et à de faibles volumes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques (ANOVA), sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids supérieure à 20% en 7 jours). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras et sucré pendant 28 semaines induisant obésité et maladie du foie, une injection d'un virus AAV dans la veine de la queue, des prélèvements sanguins à la joue et à la veine porte, avant mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle d'une protéine hépatique dans la stéato-hépatite non alcoolique, avec des stratégies thérapeutiques annoncées pour l'humain. Le porteur affirme que l'étude de l'axe intestin-foie nécessite un "organisme entier" et des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la maladie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été supprimé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une maladie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme une grande différence entre les hommes et les femmes. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle hépatique de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Après les 2 semaines d'acclimatation, les animaux seront placés sous régime (WD). Dans la même semaine, nous injecterons un volume 100 microlitres de solution contenant les AAV à chaque animal au niveau de la veine de la queue. L'AAV est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. Après 14 semaines de régime, nous exposerons aussi les animaux à 1 prélèvement de sang à la joue (représentant moins de 5% de leur volume de sang total), le geste durera moins de 1 minute par animal. Après les 28 semaines de régime nous procèderons à 1 prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale. Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 28 semaines.

Impact sur les animaux

Le régime WD, qui est un régime enrichi en graisse, en sucre et en cholestérol, mime le régime consommé par les populations occidentales dans lesquelles l'incidence de l'obésité atteint 30% de la population, ce régime induit donc une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. L'AAV quant à lui est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. L'injection de l'AAV au niveau de la veine de la queue demandera une contention de l’animal qui peut entraîner un stress. Enfin, le prélèvement sanguin à la joue demandera une contention et peut entrainer un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après le prélèvement de sang à la joue et après l'injection au niveau de la queue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local la queue avant l'injection au niveau de la veine de la queue. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, l'anesthésie débute dans une cage à induction volatile. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal; apparence physique externe; signes cliniques mesurables; changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique supérieur ou égal à 3, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin et foie notamment) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, afin d’étudier spécifiquement le rôle de la protéine CAR dans cette pathologie systémique, la souris est actuellement le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels cette protéine a été supprimée au niveau de tout l’organisme (modèle knock-out KO). Enfin, nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (souris âgées de 7 semaines minimum)