Système gastrointestinal

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun jusqu'à treize heures, des gavages, des prélèvements sanguins à la queue avec incision, des injections et une chirurgie de prélèvement en veine porte, et pour certaines seize semaines d'alimentation grasse et sucrée induisant obésité et pré-diabète. À la fin, toutes sont mises à mort par dislocation cervicale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'animal pour cette "physiologie intégrée" entre intestin, pancréas et foie.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique, c'est-à-dire par un taux trop élevé de glucose dans le sang. Cette maladie, qui survient généralement avec l’âge, touche davantage les personnes obèses. Elle se caractérise par une insulino-résistance et une perte progressive des capacités de sécrétion d’insuline par les cellules béta pancréatiques, l’hormone qui régule la glycémie. A l’heure actuelle, les traitements utilisés ciblent soit l’action de l’insuline soit sa sécrétion, alors qu’un ciblage des 2 composantes serait plus efficace. Par conséquent, il est crucial d’identifier de nouveau mécanismes contrôlant simultanément l’action et la sécrétion d’insuline pour mieux réguler l’hyperglycémie des patients diabétiques. Le projet vise à valider un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la régulation de la glycémie qui implique un dialogue entre l’intestin, le pancréas et le foie via la sécrétion d’une hormone intestinale appelée GLP1, qui est produite par les cellules intestinales après un repas et qui va réguler l’action et la sécrétion d’insuline. Ainsi, l’objectif est de valider chez la souris ce nouveau mécanisme intracellulaire en l’étudiant de manière concomitante dans l’intestin, le pancréas et le foie afin de définir s’il pourrait constituer à l’avenir une nouvelle piste de traitement préventif et/ou curatif de l’hyperglycémie chez les patients diabétiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet de recherche est de valider une nouvelle hypothèse mécanistique impliquée dans le contrôle de la glycémie et de mettre en évidence de futurs moyens de prévention et/ou traitement du diabète de type 2. Si nos hypothèses sont validées chez la souris, nous initierons ensuite des tests chez l’homme et tenterons d’identifier des molécules capables de réguler ce mécanisme intracellulaire.

Procédures

Au cours des 4 procédures décrites dans ce projet, les souris seront soumises à : - des mises à jeun (1 à 3 selon les procédures) d’une durée de 6h30 à 13h maximum. - un gavage unique sur animal vigile (durée: 30 secondes) - des prélèvements sanguins de petits volumes (entre 2 et 6 selon les procédures) à la queue des souris pour les mesures de glycémie et d’insuline, associés à une incision unique de la queue puis un grattage du coagulum pour les prélèvements successifs. - des injections (1 à 2 selon les procédures) sur animal vigile lors des tests métaboliques (durée: 30 secondes). - une chirurgie associée à une analgésie 30 minutes avant l’anesthésie générale afin de réaliser un prélèvement sanguin en veine porte. - une alimentation riche en graisse et en sucre durant 16 semaines consécutives qui va induire une prise de poids des souris sans altérer leur mobilité.

Impact sur les animaux

- une prostration, la présence de sang dans la canule ou un gonflement de l’œsophage potentiel suite au gavage. - une sensation de faim et une hypoglycémie suite à la mise à jeun de 12-13h. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsable d’un stress chez l’animal et d’une baisse d’activité les conduisant à nicher dans leur nid. - une douleur transitoire au point d’injection lors des injections au cours des tests métaboliques. - Une hyperglycémie transitoire au cours des test métaboliques. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors des tests revient à la normale au bout de 90 minutes. - une obésité liée à l’alimentation riche en lipides et en sucrose et un pré-diabète associé à une hyperglycémie modérée. Nos études préalables démontrent que leur prise de poids ne les empêche pas de se mouvoir dans la cage et d’accéder et la mangeoire et que leur pré-diabète ne modifie pas de manière majeure leur prise hydrique ni leur besoin d’uriner.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Ce projet vient compléter des données déjà obtenues in vitro dans des lignées cellulaires de chacun des tissus d’intérêt (colon, foie et pancréas). Néanmoins il s’agit ici d’aller plus loin et de montrer qu’il y a une co-régulation de notre nouveau mécanisme intracellulaire dans ces 3 organes suite à un repas et que cela est nécessaire pour un contrôle optimal de la glycémie. Il s’agit donc d’un projet de physiologie intégrée où aucune alternative non animale n’est disponible. D’autre part, on veut également déterminer si ce nouveau mécanisme physiologique est dépendant ou pas du sexe, et ce paramètre n’est pas analysable autrement que sur animal.

Réduction

Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, nous allons comparer différents traitements en même temps afin de n’avoir qu’un groupe de souris contrôle. Le nombre de souris est calculé au plus juste tout en offrant la puissance statistique nécessaire pour l’interprétation des résultats scientifiques. Les paramètres mesurés étant très variables d’une souris à l’autre, un nombre minimal de 12 souris par groupe est nécessaire. Nous envisageons de potentiellement répéter une fois les procédures afin de compléter les études si nécessaires (soit 24 souris/groupe au maximum en final).

Raffinement

Les souris sont surveillées individuellement 3 fois/semaine et nous utilisons des points limites adaptés à nos procédures. Les gavages seront réalisés par une personne expérimentée à l’aide d’une sonde de gavage adaptée à la taille des souris. Pour les souris soumises à une alimentation riche en lipides et en sucrose, le nombre de souris par cage est diminué pour qu’elles aient suffisamment de place pour se mouvoir. L’alimentation hypercalorique va induire une prise de poids qui ne gêne pas la motricité des souris qui peuvent toujours accéder à la mangeoire. Néanmoins, des croquettes seront rajoutées dans la litière. Pour les prélèvements en veine porte qui nécessite une chirurgie, les animaux sont analgésiés 30 minutes avant d’être anesthésiées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car leur physiologie est « proche » de l’homme pour le contrôle de la glycémie. Selon les procédures, nous utiliserons soit des souris adultes de 10-12 semaines qui ont terminé leur croissance et ont un poids compatible pour la contention, les gavages et prélèvements sanguins, soit des souris de 5 semaines quand il s’agit de les nourrir avec une alimentation riche en graisse et sucre, dont les effets métaboliques sont plus marqués si débutée rapidement après le sevrage.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un inducteur chimique de tumeurs une fois par semaine pendant six semaines et des inoculations bactériennes par voie oro-gastrique, avec une perte de poids attendue dans les derniers mois. Le porteur étudie comment la co-infection par Helicobacter pylori et Escherichia coli favorise le cancer gastrique et colorectal, et affirme que seul un "organisme entier" permet d'étudier cette réponse. Les souris atteignant 20 % de perte de poids ou des signes de souffrance seront mises à mort avant le terme.

Objectifs

Environ 18% des cancers sont causés par un agent infectieux, dont la bactérie Helicobacter pylori, responsable de l’infection chronique la plus répandue dans la population mondiale. H. pylori est reconnue comme le facteur de risque majeur du cancer gastrique (CG), souvent associé à un mauvais pronostic. H. pylori pourrait aussi être impliquée dans le développement du cancer colorectal (CCR), tout comme des souches pathogènes de la bactérie Escherichia coli. Un évènement important dans la genèse de ces cancers, est la dysbiose du microbiote gastrique et intestinal, respectivement observée chez les patients atteints de CG et de CCR, et confirmée dans le modèle animal murin. Comment la co-habitation de différentes bactéries dans le même hôte peut influencer leur potentiel pathogène respectif, est la question principale à laquelle se propose de répondre ce projet. Notre hypothèse est que H. pylori et E. coli pourraient favoriser des mécanismes oncogènes communs, exacerbés par leur co-habitation dans le même hôte et impactant leur pathogenèse respective. Basé sur le développement du modèle souris de co-infection, H. pylori-E. coli, les objectifs de ce projet sont : - D’analyser si la sévérité des lésions inflammatoires gastriques induites par H. pylori peut être modulée par la présence de E. coli dans le compartiment intestinal et inversement. - De déterminer si ces mécanismes sont associés à des effets locaux ou systémiques. - De définir si les mécanismes impliqués dans les processus de tumorigenèse sont communs aux deux infections. Les évènements d’instabilités génétiques et de régulation épigénétique jouent un rôle essentiel dans la promotion des mécanismes de tumorigenèse. Ainsi, une fois établi le modèle de co-infection chez la souris et combinant différentes approches, les conséquences de la présence de ces deux bactéries seront analysées sur les mécanismes de régulation à l’origine d’un développement tumoral, dont la méthylation de l’ADN et son impact sur la réponse globale de l’hôte à ces conditions d’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine du développement des cancers gastrique et colorectaux induit par H. pylori et E.coli pathogène. D’autre part, peu de chose sont connues sur l’impact réel de la co-infection par ces deux pathogènes dans l’initiation et/ou promotion de la tumorigenèse. De plus ces données peuvent aboutir à des stratégies de dépistage et/ou prévention du développement du cancer gastrique ou colorectal ou nous permettre d’identifier certaines cibles thérapeutiques.

Procédures

- Injections intra-péritonéales (30 secondes) d’inducteur de tumeurs une fois par semaine pendant 6 semaines ou d’inhibiteur pharmacologique trois fois par semaine pendant 1 mois (fréquence sur l’ensemble de la procédure = 1 fois ou 2 fois avec intervalle de 2 mois ou fois avec intervalle de 2 mois). - Inoculations de suspensions bactériennes ou de streptomycine par voie oro-gastrique 2 fois toutes les deux semaines à 2 reprises espacées de 24 heures (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiellement attendus sont modérés. Ils sont attendus durant la période de traitement par l’inducteur de tumeurs pendant 6 semaines sous forme de baisse de mobilité dans les 48h suivant l’injection IP, comme cela a été rapporté pour la lignée murine particulièrement sensible A/J. Nous ne savons pas si ces effets seront observés pour les C57BL/6, ils ne sont pas rapportés dans la littérature. Durant la progression du protocole, il est envisageable que les groupes recevant une double-infection, et pour lesquels nous anticipons une accélération ou aggravation des lésions pré-tumorales, présentent une perte de poids modérée dans la dernière phase de l’essai (6 à 9 mois post-infection).

Devenir

La mise à mort des souris à la fin de l'expérience est indispensable pour nous permettre de prélever l'estomac et donc de quantifier les bactéries H. pylori qui ont colonisé cet organe. D’autres organes seront également prélevés pour analyses histologiques et moléculaires qui sont indispensables pour le but final de l’étude qui est d’évaluer la carcinogenèse.

Remplacement

Seul un modèle in vivo permet de répondre aux questions complexes soulevées par ce projet, i.e. étudier la réponse d’un organisme entier à une infection ou une co-infection via la mobilisation de son système immunitaire et les conséquences sur les mécanismes de tumorigenèse. Dans le cas de l’infection par H. pylori, le modèle souris permet de récapituler l’ensemble de la cascade d’évènements décrits en pathologie humaine, allant de la gastrite chronique aux lésions pré-cancéreuses que sont les dysplasies gastriques. La réponse immunitaire observée chez la souris reflète parfaitement celle observée chez l’Homme. De même, la souris est une espèce de choix pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive à l’infection par ce pathogène opportuniste sans nécessité de manipulations génétiques ou de modification du statut immunitaire des animaux. De plus la littérature concernant ces infections est abondante et les modèles expérimentaux bien établis, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en limitant le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, l’utilisation du modèle souris se justifie parfaitement car il remplit la condition essentielle de reproduire plusieurs aspects des pathologies observées chez l’Homme. D’autre part, l’utilisation d’un carcinogène est nécessaire pour diminuer les temps d’expérience. Dans ce contexte, le modèle murin de carcinogenèse AOM-induit est parfaitement adapté.

Réduction

Dans nos expériences, le nombre d’animaux par groupe test est calculé au plus juste pour être statistiquement significatif en utilisant des modèles hiérarchiques (ou modèles à effets mixtes). Ce projet comprend trois procédures qui s'articulent sur un nombre de 16 animaux par groupe. Ce nombre est similaire à certaines études du même type et il est proche des estimations que réalisées par notre statisticien (pour des tailles d'effets proches de 1). Les effectifs proposés semblent donc dimensionnés par rapport aux objectifs du projet. Le succès d'infection par animal rentre également en considération. L’ensemble des organes d’intérêt sera prélevé à l’issue des différentes expériences, de fait les animaux ne pourront pas être réutilisés. Les fèces seront prélevées longitudinalement (toutes les deux semaines) et conservés congelés en vue d’étude futures visant à définir les dysbioses associées aux infections et au développement de la pathologie sans avoir à reprogrammer des expériences similaires.

Raffinement

Les faibles doses d’inducteur de tumeurs utilisées engendreront des effets néfastes modérés sur les souris. Nous serons vigilants en particulier au cours des 6 semaines de traitement par l’inducteur de tumeurs afin de prévenir au plus tôt tout signe évident de détérioration de l’état général des animaux. Des hydrogels seront mis à disposition des animaux. Nous utiliserons une feuille d'observation : tout animal présentant des signes de souffrance, tels que l'apparence du poil affectée ou un changement de leur comportement, sera noté selon une grille et mis à mort si son état le nécessite ou en cas de perte de poids >20%. En référence à notre expertise de ces modèles murins d’infection, l’observation des animaux infectés par chaque bactérie en absence d’inducteur de tumeurs ne montre aucune modification de comportement ou physique qui pourrait indiquer une quelconque souffrance. Chacune des bactéries n’induit pas de signes digestifs tels que la diarrhée après administration. Si la procédure 1 indique que la co-infection permet d’observer une synergie dans le développement pathologique sans adjonction d’inducteur de tumeurs, les procédures 2 et 3 seront menées sans inducteur de tumeurs, ce qui réduira les nuisances et améliorera le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nos deux laboratoires ont une longue expérience du modèle souris d’infection par H. pylori ou par E. coli et nous possédons des souches adaptées à la colonisation des souris. De plus, dans le cadre de notre étude, le modèle murin est adapté car il reproduit de nombreux aspects des pathologies humaines étudiées. Nous utilisons des souris C57BL/ 6, mâles, âgées au début de l’expérience de 4 à 6 semaines. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 6 semaines). Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée et leur système immunitaire est mature.

4 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la listériose, par gavage ou injection intraveineuse, puis pesées quotidiennement, certaines recevant du tamoxifène ou des anticorps, et peuvent développer diarrhées et infections d'organes dont le cerveau. Le porteur situe le projet dans la recherche fondamentale sur les interactions entre la bactérie et son hôte, et indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité d'un "organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Listeria monocytogenes (Lm) est la bactérie responsable de la listériose, maladie humaine d'origine alimentaire. Lm peut atteindre le cerveau et induire des méningites et encéphalites, en particulier chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 %. La listériose peut aussi se traduire par une infection materno-fœtale chez les femmes enceintes, provoquant fausses-couches, accouchements prématurés ou infections néonatales. Les objectifs de ce projet sont de déterminer les rôles des facteurs bactériens et de l’hôte, y compris le microbiote intestinal, dans la listériose. L’étude de la listériose est importante pour comprendre cette pathologie, mais également pour mieux appréhender la réponse de l’hôte à un pathogène intracellulaire facultatif.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses et en particulier sur la listériose. Cette maladie tue chaque année plus de 300 personnes en France. Elle constitue donc un problème de santé publique ainsi que pour l’industrie agro-alimentaire. Elle est également un modèle précieux pour la compréhension des interactions entre une bactérie intracellulaire facultative et son hôte. Une meilleure compréhension du mécanisme de dissémination des bactéries dans l'organisme et de la réponse immunitaire mise en place est en soi importante pour l’évolution des connaissances et constitue un prérequis indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques multi-cibles innovantes et efficaces. Même si nos recherches se focalisent sur Lm, une grande partie de nos approches et résultats pourrait être étendu à l’étude d’autres pathogènes..

Procédures

1128 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), avec un ou des composants du microbiote (ou PBS en contrôle) puis, 30 jours après, à un nouveau gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes, pathogène pour l’homme et l’animal. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement, et les fèces prélevés (durée d’environ 2 minutes dans une boîte individuelle). 600 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 240 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 324 souris seront soumises à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces animaux recevront 10 injections de tamoxifène ou de solvant contrôle (huile d’olive) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). 5 injections avant et 5 injections après inoculation de Listeria. L’injection de tamoxifène pourra être remplacée par l’ajout de tamoxifène dans la nourriture, si ce mode de délivrance est efficace pour notre modèle. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 480 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes. Parmi ces souris, 240 recevront 3 injections d’anticorps anti-Il-10 (ou anticorps contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 2 injections avant et une injection le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 60 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 60 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces 120 souris recevront 3 injections d’inhibiteur d’EVH1 (ou contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 1 injection avant et 2 après le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. Les animaux sont susceptibles de développer des diarrhées, des infections de différents organes y compris le cerveau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude de la physiopathologie de la listériose. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité d’un organisme vivant dans son intégralité, y compris les conditions très spécifiques pour maintenir un microbiote sous conditions physiologique. Seul les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus d’infection dans sa globalité et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. Nous utilisons en parallèle des approches in vitro ou ex vivo (organoïdes) pour répondre à des questions plus spécifiques.

Réduction

Les moyennes de CFU entre les groupes seront comparées à l'aide de tests de comparaison de moyenne (ANOVA ou test non paramétrique). Les effectifs par groupe (n=5) sont associés à des tailles d'effet de 2, pour un test de comparaison de 2 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Lorsque cela est possible, les animaux sont infectés avec un mélange de souches (index de compétition), afin de comparer leur virulence au sein du même animal, ce qui permet de diminuer le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Des points limites incluant la prostration/faciès de souffrance ou Body score 1, la perte de poids>20% du poids initial, ainsi que les signes d'infection du système nerveux central (paralysie partielle) sont appliqués pour ce projet. Les animaux seront mis à mort dès qu'un de ces points limites est atteint. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).

Choix des espèces

La souris n’est pas permissive à une infection orale par Lm du fait d’une spécificité d’espèce de l’interaction entre InlA et la E-cadhérine. La lignée murine permissive à Lm, qui exprime une E-cadhérine reconnue par InlA, sera dont principalement utilisée. L’interaction InlA-E-cadhérine n’étant pas impliquée après le passage de la barrière intestinale, des souris non permissives pour cette interaction, dont des C57BL/6J, pourront être également utilisées pour des infections intraveineuses afin de tester le rôle de facteurs bactériens ou de l’hôte indépendamment de la traversée de la barrière intestinale. Différentes lignées mutantes pourront ainsi être utilisées. Le recours à ces lignées permettra d’identifier et de caractériser les processus d’interactions hôtes / bactéries de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. Selon les procédures, les animaux suivants seront utilisés : Souris adultes (âge > 7 semaines), pour lesquelles le système immunitaire est mis en place. Souris gestantes pour étudier la listériose materno-fœtale et l’infection des fœtus. Souris âgées (plus de 18 mois) pour caractériser l’augmentation de la susceptibilité à la neuro-listériose liée à l’âge et au changement de microbiote.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin est provoquée par un produit qui altère la barrière intestinale, avec perte de poids et sang dans les selles, avant gavages, prélèvement de sang par ponction du cœur et mise à mort pour prélever plusieurs organes. Le porteur restreint l'étude aux mâles, décrits comme plus sensibles, au nom de la réduction du nombre d'animaux. Le projet teste si un produit laitier riche en certains lipides prévient cette inflammation.

Objectifs

L’intestin a plusieurs fonctions essentielles à l'intégrité de l'organisme et au maintien d'une santé optimale dont une fonction de barrière sélective limitant le passage de molécules délétères et une fonction d'absorption indispensable aux apports nutritionnels. L'inflammation intestinale modérée est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer l'intégrité de l'intestin. L’alimentation joue un rôle important dans le développement et la sévérité de l’inflammation intestinale. La consommation de certains produits laitiers contenant notamment des lipides polaires laitiers pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence, dans un modèle de souris avec inflammation intestinale modérée induite par un produit altérant la barrière intestinale pendant 8 jours, les effets préventifs d’une supplémentation en babeurre (riche en lipides polaires) sur l’inflammation, l’intégrité et la fonction de barrière intestinale, le microbiote et d’identifier les mécanismes en lien avec le métabolisme et le devenir intestinal des lipides polaires laitiers.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin est en forte augmentation sur les dernières décennies (environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017), non seulement dans les pays occidentaux mais aussi les pays émergents. Ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant la consommation de produits laitiers riches en lipides polaires et la modulation de la barrière intestinale. Les résultats pourraient contribuer à proposer des pistes de nutrition préventive associées au babeurre et aux lipides polaires laitiers dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ainsi que dans les pathologies humaines marquées par une inflammation modérée comme l’obésité ou le diabète de type 2.

Procédures

Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test lactulose-mannitol-sucralose pour tester fonctionnellement la perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection d’une dizaine de secondes en deux points sous-cutanés de 0.5 mL de solution saline afin de stimuler la miction. Après 30 minutes, les souris seront gavées en 10 secondes avec 0.2 mL de solution de lactulose/mannitol/sucralose. Pour le prélèvement de sang par ponction cardiaque, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes afin de réduire au maximun la douleur liée à ce type de prélèvement. Après 30 minutes, les animaux seront anesthésiés par un mélange analgésique/anesthésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation intestinale par le traitement des animaux avec un produit altérant la barrière intestinale peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistance des selles et la présence de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Une étude pilote a été menée en amont afin de déterminer une dose et un temps pouvant induire une inflammation modérée avec augmentation de la perméabilité intestinale. Au-delà de 8 jours de traitement à 1%, les effets du produit altérant la barrière intestinale sont plus marqués avec une diminution du poids corporel (

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, le sang des animaux doit être collecté pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Certains organes (le côlon, l'intestin grêle, rate, foie, reins) seront également prélevés pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. Il est alors impossible d’obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.

Remplacement

Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et où les données obtenues sont transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Ces stratégies nutritionnelles pour diminuer ou prévenir l’inflammation devraient permettre d’accroitre les connaissances quant au développement et à la manière de prévenir l’inflammation..

Réduction

Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale par un produit altérant la perméabilité intestinale que les souris femelles. Dans un but de réduction du nombre d’animaux, cette étude sera réalisée uniquement sur des souris mâles. Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d’animaux pour obtenir un effet significatif.

Raffinement

Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne (Week-End inclus) pour déceler un potentiel mal-être. Si des signes de souffrance des animaux sont observés, la surveillance sera accrue avec éventuellement la réhydratation des animaux, la mise de la nourriture dans la cage, le changement de la litière. Si l’état des animaux ne s’améliore pas dans des délais définis, la procédure sera stoppée.

Choix des espèces

Les travaux effectués dans ce domaine dans la communauté scientifique sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les études sur l’inflammation induite par un produit altérant la perméabilité intestinale, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J. De plus, les modèles d’inflammation intestinale induite par un produit altérant la perméabilité intestinale chez la souris sont considérés comme modèle pertinent des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin pour la transposition des résultats à l’Homme. Les souris seront commandées à 6 semaines de vie et le protocole débutera à 7 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.