Système gastrointestinal

40 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale un probiotique puis une inoculation de Salmonella, avec prises de sang à la jugulaire et prélèvements de fèces répétés, pour tester une réduction du portage de la bactérie dans la filière porcine. Le porteur indique une légère hyperthermie et une modification des fèces après inoculation, sans autre effet attendu. Il affirme qu'en l'absence de modèle in vitro il est "indispensable" de comprendre le rôle de la flore intestinale du porc, et présente l'objectif comme une réponse aux "attentes de la filière porcine".

Objectifs

La salmonellose représente la deuxième cause d’infection humaine d’origine alimentaire en Europe. Cette infection est une zoonose (maladie pouvant être transmise de l’animal à l’homme et inversement) qui peut être transmise à l’Homme tout au long de la chaine alimentaire, mais plus généralement par le biais d'aliments d'origine animale contaminés. Parmi les viandes, celle de porc a été identifiée comme l’une des principales sources des cas humains de salmonellose. Le porc héberge cette bactérie dans son tractus digestif de manière asymptomatique. L’objectif principal de ce projet est de réduire le portage de Salmonella, pathogène prévalent dans la filière porcine, par l’ajout d’un probiotique, Bacteroides fragilis. Au cours d’un précédent travail, il a été démontré in vitro que Bacteroides fragilis était capable de réduire le passage de la barrière cellulaire par des Salmonella de différentes formules antigéniques. Cet essai in vivo sur porcs permettra de valider les effets bénéfiques obtenus in vitro, en vérifiant en conditions expérimentales contrôlées l’effet inhibiteur de ce Bacteroides fragilis sur le passage trans-intestinal de Salmonella. La réduction du portage de Salmonella et de sa diffusion chez l’animal sera mesurée au niveau intestinal, sanguin et immunitaire. L’impact de B. fragilis sur le microbiote digestif en présence et en absence de Salmonella sera également considéré. Développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage permettra de réduire l’usage des antibiotiques et la charge qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des consommateurs et des acteurs de la filière porcine.

Bénéfices attendus

Dans la première partie du projet, des effets bénéfiques du probiotique Bacteroides fragilis sur la colonisation de Salmonella ont été observés in vitro . L’essai in vivo nous permettra de vérifier ces effets de réduction de la colonisation par Salmonella. Ces données sont nécessaires pour l’acquisition de connaissances, et pour le développement d’une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage. Cela permettrait de limiter à terme, l’usage d’antibiotiques en cas de salmonelloses animales, de réduire la charge bactérienne qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des professionnels de la production porcine. Par ailleurs, cette étude nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo dans l'objectif de réduire le recours à l’expérimentation animale lors de futures études.

Procédures

- Administration par voie orale de Bacteroides fragilis à 8 temps donnés (J-4, J0, J1, J3, J7, J10, J14, J17) - Inoculation par voie orale de Salmonella ou d’une solution placebo à 1 temps donné (J0). - Prise de sang (10mL) au niveau de la veine jugulaire à 7 temps donnés (J-7, J-3, J1, J3, J7, J10, J14, J17, J21). - Prélèvement de fèces sur animaux vigiles lors de défécation naturelle à 8 temps donnés (J-7, J-3, J1, J2, J3, J7, J10, J14, J17).

Impact sur les animaux

Chez le porc, Salmonella est susceptible d’induire une légère hyperthermie dans les deux jours suivant l’inoculation. C’est pourquoi un suivi de la température rectale sera réalisé quotidiennement. De même, une modification de la texture des fèces peut être attendu. Pour surveiller ce paramètre, un scoring des fèces (échelle de 0 à 5) sera réalisé quotidiennement. B. fragilis, non toxigène, est considéré comme un probiotique prometteur de nouvelle génération en raison de ses capacités à atténuer l’inflammation. Il n’est donc pas attendu d’effet indésirable du au probiotique tout au long de cet essai.

Devenir

Des prélèvements d’organes et de différents contenus et tissus intestinaux sont nécessaires pour évaluer la diffusion de salmonella et l’impact du probiotique. Ces prélèvements nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Le porc représente l’une des sources majeures de salmonellose pour l’homme. Afin de pouvoir identifier des moyens de lutter au mieux contre cette zoonose, il est indispensable de comprendre le rôle de la flore commensale dans le développement de Salmonella dans le système digestif du porc et sa capacité à passer dans d’autres tissus/organes. Dans ce contexte, et en en l’absence de modèle in vitro ou in silico intégré, permettant de mimer l’interaction de la flore commensale porcine avec Salmonella, seul le modèle in vivo permet aujourd’hui de travailler sur un tel niveau global. C’est pourquoi il convient de réaliser cette étude sur cette espèce cible.

Réduction

L’étude est réduite au nombre minimum de lots nécessaires, un lot témoin négatif, un lot témoin « probiotique », un lot témoin « Salmonella » et le lot ou le probiotique et Salmonella seront administrés. Pour chaque lot, un effectif de 10 animaux sera utilisé (2 parcs de 5 animaux dans une même animalerie). Cet effectif de 10 sera suffisant pour reproduire les effets et effectuer des analyses de variance les plus robustes possibles Les tests statistiques utilisés seront, pour une distribution normale, les tests ANOVA et pour une distribution ne suivant pas la loi normale, les tests de Kruskall-Wallis.

Raffinement

L’inoculation de Salmonella et du probiotique sera réalisée à la pipette par voie orale par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Dans nos précédentes expériences, suite à l’inoculation de porcs avec la souche de Salmonella, seule de légères hypertermies dans les 24h après l’inoculation ainsi qu’une modification de la texture des fèces 48h après l’inoculation ont pu être obervées chez certains animaux. Pour surveiller ces paramètres, il est donc prévu un suivi quotidien de la température rectale ainsi qu’un scoring des fèces (échelle de 0 à 5). Dans l’ensemble de notre essai, nous confirmerons l’état de santé des animaux dans nos conditions expérimentales. Pour cela un relevé de symptômes et de manifestations cliniques visuelles sera réalisé quotidiennement. Dans l’ensemble de notre essai, nous confirmerons l’état de santé et de bien-être des animaux dans nos conditions expérimentales comme indiqué au point 5.6.2. Enfin les prises de sang seront réalisées de sorte à prélever 10 mL de sang total au niveau de la veine jugulaire. Ce qui correspond à un prélèvement inférieur à 1% du volume sanguin (soit en moyenne 19mL). Ces prises de sang seront exclusivement réalisées par le personnel expérimenté de sorte à rendre le geste rapide et le plus confortable possible pour les animaux.

Choix des espèces

Le porc représente l’une des sources majeures de salmonellose pour l’homme. Afin de pouvoir identifier des moyens de lutter au mieux contre cette zoonose, il est indispensable de mieux comprendre le rôle de la flore commensale dans le développement de Salmonella dans le système digestif du porc et sa capacité à passer dans d’autres tissus/organes. Le but final étant de trouver des moyens pour réduire le portage des salmonelles par les porcs, tout en réduisant l’utilisation des antibiotiques et ainsi, de protéger la santé humaine, tout en répondant aux attentes de la filière porcine. Les porcs seront sevrés et mis en lot à partir de 4 semaines. A la fin de la 6ème semaine, les lots 2 et 3 recevront le probiotique. L’inoculation des animaux par Salmonella interviendra 4 jours après pour les lots 3 et 4, à 7 semaines d’âge. A cet âge les porcs ont atteint une maturité intestinale avec une flore stable et un système immunitaire performant. Ces conditions permettront donc d’étudier de manière optimale la modulation du microbiote et l’implantation de Salmonella en présence ou non du probiotique. Le probiotique continuera d’être administré deux fois par semaine durant 3 semaines.

160 souris d'une lignée génétiquement modifiée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant huit semaines pour supprimer leur microbiote, toutes subissent des jeûnes de six heures, des prélèvements sanguins répétés à la queue et des gavages, avant mise à mort pour trier les cellules intestinales. Le porteur étudie l'effet des bactéries intestinales sur les hormones digestives, avec une application humaine dans l'obésité et les maladies inflammatoires présentée comme lointaine. Il indique que la déplétion du microbiote produit "a priori peu d'effets indésirables" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre bactéries et intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bacteries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des produits (hormones) qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines. Ces cellules jouent le rôle de senseurs, libérant les hormones en réponse à des modifications de leur environnement Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous éliminerons les bactéries intestinales par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment les cellules produisant les hormones intestinales sont impactées lors de la suppression du microbiote intestinal. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées. Compte tenu du rôle important de ces hormones, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux lorsque les fonctions de ces hormones sont altérées, dans le but à terme de prévenir et/ou guérir des maladies.

Procédures

La moitié des animaux recevra un mélange d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 8 semaines, conduisant à la déplétion de leur microbiote intestinal. Pour mesurer les niveaux des hormones et les activités des cellules produisant ces hormones, trois tests métaboliques seront réalisés, espacés de 15 jours, sur tous les animaux. Un test métabolique permet de mesurer l’effet d’un stimulus particulier sur l’animal, notamment au niveau intestinal en comparant l’animal avant et après ajout du stimulus. Chaque test comporte une phase de jeun (6h), trois prélèvements sanguins, un avant l’administration du stimulus, et deux après, à 5 et 15 minutes respectivement après l’administration pour un volume total de 150µLet un gavage par voie orale ou une injection en intrapéritonéal, permettant de mesure la libération des hormones en réponse au stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas une heure entre la première prise de sang et la dernière. Des mesures de transit intestinal par gavage (au maximum trois par animal, deux au cours de l’expérience (avec un suivi pendant 48h) et un au moment de la mise à mort (gavage une heure avant) seront également réalisées pour mesurer les fonctions intestinales, ainsi que des prélèvements de sang avant la mise à mort et la récupération des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux, les antibiotiques étant introduits séquentiellement pour éviter tout rejet par néophobie. Les animaux seront conservés en groupe et manipulés régulièrement. Le gavage oral et la prise de sang à la queue seront réalisés par des personnes compétentes, avec des temps de manipulations réduits. Les prises de sang séquentielles se faisant de manière rapprochées, une seule incision à la queue est nécessaire pour réaliser le prélèvement. Les jeûnes seront limités dans le temps, induisant une perte de poids réduite qui est en général rattrapée les jours suivants. Les souris seront suivies pendant l’heure qui suit l’administration des stimuli puis pendant le reste de l’expérimentation pour s’assurer qu’aucun n’induit d’effets indésirables, aucun n’effet étant attendu sur le type de stimuli testés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin. La lignée de souris utilisée permettra d’étudier spécifiquement les fonctions des cellules entéroendocrines, ce qui n’est pas possible dans un autre modèle. Les intestins récupérés dans ces expérimentations serviront à la production de culture de cellules intestinales (organoïdes intestinaux) qui seront utilisés dans des projets ensuite pour étudier (1) le développement de l’épithélium intestinal issu de souris déplétées en microbiote et (2) la réponse des cellules entéroendocrines à des produits spécifiques, notamment produits par les bactéries.

Réduction

160 animaux au total répartis en 20 lots seront utilisés dans ce projet, répartis en 10 procédures. Chaque procédure incluera un lot de 8 souris traitées par antibiotiques et un lot contrôle de 8 souris non traitées et sera effectuée sur des animaux de même sexe pour tester l’effet de trois stimuli et récupérer les tissus pour un usage spécifique. 5 procédures différentes permettront de tester au total 15 stimuli de cellules entéroendocrines (par exemple, glucose, mélange d’acides aminés et protéines, acides gras, produits microbiens..), ainsi que pour récupérer les tissus intestinaux des souris pour différents usages, un seul tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage lors du tri cellulaire (transcriptomique, peptidomique, génération d’organoides, histologie…). Les procédures seront reproduites sur les femelles et les mâles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage. L’hydratation, notamment lors de l’introduction des antibiotiques, sera surveillée et si nécessaire, l’ajout d’antibiotiques sera modifié pour permettre une meilleure tolérance. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés (ainsi que leur ingéré alimentaire) 2 fois par semaine. Une grille de décision (points limites) est établie et permet d’agir de façon appropriée en cas d’apparition de signes de souffrance chez un animal, Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux, avec un maximum de 10µL/g et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements. Les souris seront au moins 2 par cage pour éviter l'isolement. Une grille de score de bien être permettra de suivre régulièrement chaque animal individuellement en prenant en compte son aspect général, son poids et son comportement. En cas de hausse modérée du score, un suivi plus attentionné sera réalisé avec l’ajout de nourriture plus facilement accessible. Dans le cas d’une forte dégradation du score les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. Les procédures seront appliquées sur les femelles et les mâles avec un lot de souris traitées aux antibiotiques et un lot contrôle. Les procédures seront reproduites 5 fois pour tester différents stimuli et pour différents usages des tissus, chaque tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées.

700 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie orale par le parasite Eimeria pour étudier le rôle d'un type de lymphocytes dans l'inflammation intestinale, puis tués pour prélèvement de tissus. Le porteur situe l'enjeu dans les pertes de production de l'aviculture et annonce un bénéfice uniquement scientifique. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier cette infection, et la perte de poids attendue resterait en deçà du point limite.

Objectifs

L’amélioration des performances de croissance en production avicole s’est effectuée grâce à la sélection génétique et à une optimisation de l’alimentation, mais elle a été réalisée au détriment de la santé des animaux associée à une augmentation de l’incidence des maladies infectieuses. La coccidiose, causée par des parasites du genre Eimeria, représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture induisant des pertes de production ayant de graves conséquences économiques dues à de la mortalité mais surtout de la morbidité. L’infection par Eimeria conduit à une inflammation intestinale importante. Cependant, la nature des différents acteurs cellulaires et moléculaires ainsi que les mécanismes précis conduisant à cette inflammation nécessitent d’être mieux connus. Des travaux montrent l’importance de l’interleukine 17 (IL-17) sur l’inflammation et l’apparition de lésions. Dans ce contexte, et comme les lymphocytes T gamma delta sont des cellules majeures impliquées dans la production d’IL-17, nous avons pour objectif d’étudier le rôle fonctionnel de ces cellules dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria. Nous testerons plusieurs espèces d’Eimeria indépendamment. Pour ce faire nous utiliserons au maximum 700 poulets au total.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est scientifique et nous permettra de mettre évidence le rôle plus ou moins important des lymphocytes T gamma delta sur la physiopathologie de l’infection par Eimeria lors d’une infection primaire.

Procédures

L’objectif de créer une infection expérimentale per os pour étudier le rôle des lymphocytes T gamma delta sur la physiopathologie de l'infection par E. tenella. L’inoculation est de courte durée (20s maximum) et est effectué par du personnel expérimenté. les animaux sont calmes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. Dans le cas peu probable que l’état des animaux exempts de lymphocytes T gamma delta infectés soit pire que les animaux contrôles wild type, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, refus d’alimentation …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales pour l’étude de la physiopathologie de l’infection, la physiopathologie étant est la résultante, lors de l’infection par E tenella, de l’activation et de l’interaction de différents types cellulaires entre eux et directement ou indirectement avec le parasite ou ses antigènes au sein de la muqueuse intestinale conduisant à l’apparition de signes cliniques (exemple des lésions caecales). Par conséquent, l’étude du rôle des lymphocytes Tγδ dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria ne peut être étudié in vitro et nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot est adapté aux buts de cette expérimentation. Les effectifs sont basés sur le nombre d’oocystes qui est le paramètre le plus variable de cette étude. Ainsi, pour avoir un log de différence d’excrétion d’oocystes entre 2 groupes avec une puissance de 90%, il faut 20 animaux ce qui correspond à 2 réplicats de 10 animaux par groupe. Les effectifs utilisés devraient aboutir à suffisamment d’animaux pour permettre de conclure sur le rôle des lymphocytes Tγδ dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria.

Raffinement

Les poulets seront dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté dans un milieu enrichi social et comportemental (petites plaques en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans). Une visite quotidienne est réalisée dans la salle expérimentale afin de surveiller l’état général des animaux et l’apparition d’éventuelle symptômes liés à la maladie. Même si les doses administrées sont déterminées de manière à éviter toute pathogénicité qui entraverait le développement cette étude, le point limite défini est l’observation d’un état de prostration tel que l’animal ne s’alimente plus. La décision est prise de le mettre à mort. Sur l’ensemble des protocoles de multiplication au cours des 3 dernières années, aucun animal inoculé n’a atteint le point limite nécessitant sa mise à mort.

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria tenella, acervulina et maxima. Les œufs étant éclos et le génotypage ayant lieu à J1-J3 d’âge, les expérimentations commencent dès la sortie de l’éclosoir. Les infections seront réalisées à 2 semaines d’âge et les prélèvements seront réalisés à 7 jours et 9 jours post infection (19-23 jours d'âge).

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur transfère des lymphocytes T qui déclenchent un diabète auto-immun, avec injections répétées et jusqu'à dix prélèvements de sang à la queue, l'hyperglycémie entraînant soif, perte de poids et baisse d'activité avant l'euthanasie. Le projet vise de nouvelles immunothérapies ciblant les lymphocytes responsables de la destruction des cellules du pancréas. Le porteur affirme que la validation de ces stratégies passe forcément par des "organismes entiers", les composés étant d'abord testés in vitro.

Objectifs

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune caractérisée par une perte totale ou quasi-totale de la capacité du pancréas à produire de l’insuline, hormone essentielle pour réguler le taux de glucose dans le sang. La perte de la fonction insulinique est due à la destruction des cellules béta du pancréas par son propre système immunitaire. Parmi l’ensemble des cellules immunitaires se sont les lymphocytes T qui sont majoritairement retrouvés au niveau des lésions pancréatiques et qui sont responsables de la destruction des cellules bêta. Les modèles murins ont permis de mettre en évidence que l’apparition de la maladie se fait en deux étapes consécutives dans des tissus anatomiquement distincts. Premièrement, les lymphocytes T sont activés dans les ganglions lymphatiques drainant le pancréas. Puis ils infiltrent le pancréas où ils vont pouvoir aller détruire spécifiquement les cellules bêta. L’Europe et l’Amérique du Nord ont les taux d’incidence les plus élevés, supérieurs à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en des injections régulières d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie ciblant les lymphocytes T impliqués dans la maladie.

Bénéfices attendus

Le diàbète de type 1 est une maladie auto-immune dont l’incidence en Europe et Amérique du Nord est supérieure à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en un apport quotidien d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Nous espérons que nos études contribueront à jeter les bases de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces sur le diabète de type I. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus pour ce projet devraient contribuer au développement de nouvelles stratégies immmunothérapeutiques pour d’autres pathologies auto-immunes.

Procédures

1. Injection dans la cavité abdominale : Pour reduire le nombre de cellules dans le sang, qui est nécessaire pour déclencher la maladie. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 2. Injection intra-veineuse : Pour injecter les lymphocytes tueurs autoréactifs. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 3. Injection intra-veineuse : 1 seule fois pour chaque animal. Pour injecter un traitement à base de cellules. L'injection prend moins de 10 secondes. 4. Injection dans la cavité abdominale : Pour injecter un traitement à base d'anticorps. 6 injections maximum par souris. L'injection prend moins de 10 secondes. 5. Prélèvements sanguins : Les souris seront suivies pour l’apparition du diabète en mesurant le taux de glucose dans le sang. Une goutte de sang obtenue par ponction dans la veine de la queue est suffisante pour relever une mesure. Un maximum de 10 prélèvements par souris. Cela prend moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris seront surveillées pour détecter l'apparition de la maladie en mesurant les niveaux de glucose dans le sang tous les 3 jours. Une goutte de sang sera prélevée dans la veine de la queue à cette fin. Les prélèvements répétés peuvent causer du stress aux animaux. Au cours de nos expériences, certaines souris vont développer un diabète auto-immun constaté par une hyperglycémie, ce qui marquera la fin de nos expériences. Cette condition peut entraîner une douleur légère ou modérée pendant les 1 ou 2 derniers jours de l'expérience avant l’euthanasie des animaux. L'hyperglycémie apparaît vers le 10ème jour après le transfert de cellules T. Après ce point, les souris commencent à uriner plus fréquemment. 3-4 jours après l'apparition de l'hyperglycémie, les souris présenteront des poils dressés, une perte de poids et une mobilité réduite. Les animaux seront euthanasiés après deux mesures consécutives supérieures à 300 mg/dL. Les injections provoquent une gêne de très courte durée chez les souris. Les cellules ou les anticorps injectées ne doivent avoir aucun effet indésirable notable sur les souris.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée à J11 pour prélèvement des organes. L’autre partie sera suivie notamment pour l’apparition du diabète. Les animaux seront euthanasiés au fur et à mesure de l’expérience quand ils présentent des signes de souffrance ou deux valeurs consécutives de glycémie supérieure à 300 mg/dL. Les expériences seront arrêtées au bout de 30 jours et toutes les souris encore en vie à ce moment là seront euthanasiées pour pélèvement d’organes.

Remplacement

Le diabète est une maladie auto-immune qui implique différents acteurs du sytème immunitaire ainsi que différents organes (ganglions lymphatiques, pancréas...). La validation de nouvelles stratégies d’immunothérapie implique donc forcément l’utilisation d’organismes entiers. Cependant, les composés nouvellement développés seront systématiquement testés et validés in vitro et seules les approches ayant données des résultats probants in vitro seront évaluées in vivo chez la souris.

Réduction

La réalisation des expériences in vivo est conditionnée par l’obtention au préalable de résultats probants in vitro. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles, ce qui évite de réaliser un tri lors des naissances des souris. Pour les expériences d'apparition du diabète, 12 souris par groupe seront nécessaires pour avoir des résultats significatifs. D’après notre expérience avec ce modèle, pour des expériences de caractérisation des cellules T ex vivo, 9 souris par groupe devraient être suffisantes pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre d'animaux représente le minimum requis.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des portoirs ventilés dans un milieu enrichi. Nous nous basons sur une grille de score pour évaluer le comportement et l’état des animaux tous les 2 à 3 jours. Si nous constatons un problème (perte de poids excessive, poil hérissé…) les souris seront euthanasiées. L’apparition d’un diabète se traduit par le fait que les souris commencent à uriner plus fréquemment, une perte de poids et une baisse de l’activité. Afin d’améliorer la condition des souris, dès le début de l'hyperglycémie, une observation quotidienne des cages et du niveau des biberons sera effectuée. De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, elle sera directement deposée dans la cage.

Choix des espèces

Le projet proposé ici est basé sur nos résultats précédents obtenus en utilisant notre modèle de souris transgénique de diabète auto-immun. Outre les modèles de diabète auto-immun spontané, plusieurs modèles de maladie induite chez des souris transgéniques ont été générés, qui permettent de suivre facilement et rapidement le devenir des cellules T responsables de la destruction des cellules bêta du pancréas. Les animaux utilisés seront des animaux âgés de 8 à 16 semaines. A cet âge les souris ont un système immunitaire suffisamment développé pour les besoins du projet. Par ailleurs, ceci nous permettra d’être dans la continuité des précédents travaux menés par l’équipe.