Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours de la stéatohépatite non alcoolique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à un régime déficient en méthionine et choline qui déclenche une maladie chronique du foie, avec prises de sang et injection intra-péritonéale, la perte de poids servant de point limite. Le porteur indique surveiller le dos voûté et le poil négligé, et affirme utiliser un nombre "minimum mais nécessaire" d'animaux. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" car les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont associées au syndrome métabolique (surpoids, diabète, obésité, hypertension…). Le spectre de ces complications hépatiques va d’une stéatose simple (foie gras), à la stéatohépatite, puis à la fibrose, voire la cirrhose et au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation hépatique chronique à bas bruit joue un rôle crucial dans le développement des maladies dans cet organe. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à un stress microbien, métabolique et aux signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans le tissu adipeux et l’intestin. Ces organes participent au développement et à l'évolution des complications hépatiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine exprimée à la surface des cellules immunitaires et qui régule leur fonctions, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation. Chez les patients atteints d’une maladie chronique du foie, l’expression hépatique de CD44 est augmentée en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de ces complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle dans ces maladies. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. De plus, leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage (température, hygrométrie), d’hébergement (présence de tige en coton et d'igloo dans les cages), et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou CD8, dans un contexte de complications hépatiques. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces maladies qui actuellement de disposent pas de traitements pharmacologies.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum pouvant durer jusqu'à 1min (en fin de régime et en fin de procédure). Une injection intra-péritonéale sera également effectuée en fin de régime. Cette injection durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Au cours de ce projet, le principal effet indésirable est la perte de poids chez l’animal. Les animaux seront donc surveillés trois fois par semaine. Si des signes de souffrances (dos voûté, poil non-entretenu, indifférence du milieu extérieur…) s’ajoutent à la perte de poids, l’animal sera sacrifié pour limiter toute souffrance inutile.
Devenir
A la fin de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur organes. Ces organes sont ensuite utilisés afin de réaliser des analyses de biologie moléculaire et cellulaire indispensables pour notre étude.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel, ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites afin de confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour cette unique procédure, les souris seront mises sous régime déficient en méthionine et choline à partir de 20 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 30g. Les régimes déficients en méthionine et choline (MCDD) induisent un développement rapide des complications hépatiques. Cependant cette déficience en méthionine et choline induit une perte de poids qui nécessite l’utilisation de souris plus âgées (donc avec un poids plus élevé).
Effet du microbiote intestinal sur l’inflammation pancréatique aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins et fécaux, une inoculation orale de microbiote et des injections répétées déclenchant une pancréatite, pour vérifier qu'en l'absence de microbiote intestinal l'inflammation du pancréas est atténuée. Le porteur indique que l'induction de pancréatite ne provoque qu'une légère perte de poids transitoire et un stress de courte durée. Il affirme que ces effets systémiques ne peuvent être reproduits in vitro, faute notamment de lignées cellulaires spécifiques du pancréas.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l'une des tumeurs humaines les plus mortelles : moins de 5% des patients survivent plus de 5 ans. Il est crucial de comprendre comment les facteurs environnementaux (non génétiques) contribuent au développement de cette maladie, car cela nous permettrait d'agir sur les facteurs modifiables pour prévenir son développement. L’inflammation du pancréas appelé pancréatite est un facteur de risque pour le développement du cancer du pancréas. Une meilleure compréhension des dysfonctionnements engendrés par la pancréatite pourrait aider à diminuer le risque de la tumeur. Au cours de la dernière décennie, le microbiote intestinal est apparu comme un modulateur de la maladie pancréatique. Récemment, nous avons exploré l'effet du microbiote intestinal sur le développement de l'inflammation pancréatique basale (niveau normal de l’inflammation) ou de la pancréatite (état pathologique ; niveau important de l’inflammation). Les expériences antérieures indiquent que l'élimination du microbiote intestinal par l'utilisation d'antibiotiques à large spectre est protectrice contre la pancréatite. Ces résultats sont cliniquement importants car : i) la pancréatite est l'un des principaux facteurs de risque de développement du cancer du pancréas, ii) ils suggèrent la possibilité de moduler la maladie pancréatique en modifiant le microbiote intestinal, une stratégie qui peut être appliquée à l'homme. Malgré la pertinence de ces résultats, les observations faites avec des souris traitées aux antibiotiques doivent être validées chez des souris axéniques (exemptes de tous microorganismes). L'objectif principal de ce projet est de vérifier qu'en l'absence de microbiote intestinal, les souris présentent une atténuation de la pancréatite.
Bénéfices attendus
Ces expériences contribueront à notre compréhension de la manière dont le microbiote intestinal module l'un des principaux facteurs de risque de développement du cancer du pancréas : la pancréatite. Ces expériences sont très importantes d'un point de vue clinique, car elles nous offrent la possibilité d'agir sur un facteur potentiellement modifiable chez l'homme pour prévenir les maladies du pancréas.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue avant et après l'induction de la pancréatite, et utilisés pour réaliser des analyses biochimiques afin d'estimer la gravité de la pancréatite. Le volume de sang prélevé sera inférieur à 100 µl. Une partie des animaux auront une unique inoculation par voie orale d’un microbiote complexe. Il y aura des prélèvements fécaux avant l’induction de la pancréatite. 2-3 pellets par souris seront prélevés. Les pellets fécaux sont émis spontanément par les souris lorsqu’elles sont prises en main. Les souris subiront également des injections qui seront au nombre de 7 (une par heure) pendant une ou deux journée (non consécutives) en fonction des procédures.
Impact sur les animaux
Les procédures d'induction de pancréatite aiguë légère et aiguë modérée ne provoquent pas de signes cliniques ou comportementaux indicatifs de douleur, sauf une légère perte de poids transitoire (pendant un à deux jours). Les gavages et les injections entrainent un léger stress de courte durée (moins d’une minute). Les prélèvements de sang provoquent un léger stress dû à la boite de contention et au prélèvement lui-même mais il est de courte durée (2-3 minutes).
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Il s’agit de la méthode de mise à mort la plus rapide afin d’éviter l’autodigestion du pancréas (moins de 1 minute). Nous prélèverons le pancréas, l’intestin, le foie et la rate.
Remplacement
L'effet du microbiote intestinal sur l'inflammation pancréatique est probablement médié par des effets systémiques (par exemple, par le système immunitaire) qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Par conséquent, ces expériences doivent être effectuées sur des souris vivantes. De plus, l'absence de lignées cellulaires spécifiques du pancréas rend difficile la réalisation d'expériences in vitro.
Réduction
Le nombre de souris choisi est basé sur des expériences antérieures réalisées chez des souris dans lesquelles le microbiote intestinal a été appauvri par l'utilisation d'antibiotiques à large spectre, lesquelles sont comparables aux souris axéniques. Ces expériences nous ont permis de conclure que 10 souris par groupe est un nombre suffisant pour détecter des différences statistiquement significatives entre les groupes, si elles existent. Les résultats biochimiques et histologiques seront analysés à l'aide de tests statistiques. Des mesures correctives seront appliquées si un des points limites est atteint.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identiques (3-4 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation à Les souris recevront à volonté un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Il y aura une observation quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (change de cages, etc…). Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début de procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les gavages, les injections intrapéritonéales, les prélèvements sanguins et les mises à mort seront effectués par une personne expérimentée. Les souris seront observées pendant 5 minutes après la réalisation de chaque injection, prélèvement sanguin et gavage pour vérifier que leur comportement est normal. Une observation individuelle sera effectuée deux fois par jour (matin et soir) à partir du moment de l'induction de la pancréatite. Il y aura également un suivi du poids des souris après l’induction de la pancréatite. Des points limites ont été mis en place. S’ils sont atteints alors la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
La plupart des modèles expérimentaux de pancréatite ou modèles génétiques de cancer du pancréas ont été établis chez le rongeur, la souris étant le principal modèle animal utilisé pour étudier la pathologie pancréatique. Par ailleurs, la majorité des études publiées au cours des dernières années sur la relation entre le microbiote intestinal et la pathologie pancréatique ont été réalisées chez la souris. Ces expériences font partie d'un projet plus vaste, dans lequel l'utilisation de modèles génétiques de souris prédomine. Par conséquent, l'utilisation de souris pour réaliser ces expériences est nécessaire pour garantir l'intégration des résultats. Les groupes de souris conventionnalisées seront utilisés à partir de l’âge de 3 semaines pour l’installation du microbiote. Ensuite Lles inductions des pancréatites pour tous les groupes se feront entre l’âge de 7 et 12 semaines afin de les comparer aux résultats du projet antérieur.
ROLE DE MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".
Objectifs
Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).
Bénéfices attendus
Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).
Procédures
Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.
Remplacement
Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.
Etude des altérations des cellules du foie de rat au cours de leur isolement par perfusion.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
54 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat est anesthésié pour l'incision de la paroi abdominale, puis mis à mort dans les cinq minutes pour prélever le foie et en isoler les cellules par perfusion. Le porteur présente le foie isolé de rat comme un modèle "alternatif" à l'expérimentation sur animaux vivants, tout en jugeant le recours aux rats "nécessaire" pour identifier des molécules améliorant le rendement cellulaire. Il retient le rat plutôt que la souris parce qu'un foie de rat fournit environ 700 millions de cellules contre 50 millions chez la souris.
Objectifs
Lorsque des échantillons de foie sont prélevés pour l'isolement des cellules ou pour la greffe, les cellules sont soumises à de nombreux stress dus notamment au manque d'oxygène et à la reperfusion du tissu. Les mécanismes à l'origine de ces lésions ont été mis en évidence dans des modèles de foie isolé perfusé de rat et montrent une atteinte encore plus importante des foies stéatosés. Ces lésions peuvent être réduites en utilisant des antioxydants et des anti-inflammatoires en prétraitement ou dans la solution de préservation du foie. Nous savons que d'importantes modifications du métabolisme ont lieu au cours de l'isolement des cellules du foie, cependant les différentes voies de stress présentes lors de l'ischémie-reperfusion n'ont pas été évaluées dans un contexte d'isolement des cellules. Les objectifs du projet sont d'évaluer l'effet du protocole de référence d'isolement des cellules de rat par perfusion sur le stress cellulaire et le métabolisme des cellules isolées dans un premier temps ; de cribler l'effet d'inhibiteurs de ces voies de stress sur la fonctionnalité des cellules après leur isolement ainsi que sur la résistance des cellules à la congélation ; puis d'évaluer la combinaison des molécules sélectionnées dans le liquide de perfusion. Cette étude servira de base pour proposer un milieu de préservation de foies humains avant isolement des cellules.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre les mécanismes qui jouent sur la qualité des cellules isolées de foie de rat et de sélectionner un cocktail de molécules candidates pour prétraiter des échantillons de foie humains. La validation du cocktail de préservation des cellules chez le rat permettra de répondre au problème du manque de disponibilité d'échantillons de foie humain tout en réduisant la variabilité des réponses due à la variabilité des échantillons. L'utilisation des molécules identifiées contribuera à améliorer le rendement et la qualité des cellules isolées des échantillons de foie humain et d'animaux pour répondre à la forte demande en cellules de foie humain.
Procédures
Tous les animaux (54) sont soumis à une anesthésie générale de courte durée pour permettre d’inciser la paroi abdominale et accéder au foie. La mort est induite pendant l’anesthésie dans les 5 minutes suivant l’incision, juste avant l’isolement des cellules par perfusion et les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Un protocole d'anesthésie générale adapté est mis en place pour supprimer la douleur associée à l’incision de la paroi abdominale pour accéder au foie.
Devenir
L'isolement des cellules implique le prélèvement du foie après mise à mort de l'animal sous anesthésie générale.
Remplacement
Le foie isolé et les cellules du foie de rat et humain sont des modèles alternatifs très utilisés en recherche fondamentale et pour l'évaluation réglementaire des médicaments en phase préclinique. Ces modèles permettent de remplacer le test des molécules sur les animaux vivants tout en permettant d’augmenter grandement le nombre de tests par échantillon. Les échantillons de foie humain disponibles pour la recherche sont rares et de qualité variable ce qui limite leur utilisation à des fins de criblage ; de plus l’isolement des cellules génère des altérations qui limitent les rendements cellulaires. Le recours à l’utilisation des rats pour étudier les mécanismes d’altération est donc nécessaire et permettra d’identifier des molécules permettant d’augmenter le rendement et la qualité des cellules isolées chez le rat pour une application future sur des échantillons de foie humain.
Réduction
La technique de perfusion de référence est maîtrisée par l'équipe et permet d'obtenir un grand nombre de cellules par animal pour réaliser des tests in vitro. Les animaux utilisés pour la formation aux gestes techniques (n=6) d'hépatectomie partielle au cours de la perfusion permettront aussi d'évaluer de façon préliminaire l'effet de l'hépatectomie sur l'isolement des cellules. 8 groupes de 6 animaux (n=48) seront utilisés pour réaliser deux cinétiques avec et sans cocktail de molécules ; ce nombre a été déterminé comme minimal pour permettre l'analyse statistique par des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des valeurs tout en prenant en compte le risque d'échec de la perfusion.
Raffinement
L'environnement des rats est enrichi (cage avec couvercle surélevé permettant aux animaux de se mettre debout ; bâtonnets de bois et carré de coton sont ajoutés dans la cage) et l'étude est organisée de manière à maintenir le contact social des rats au cours de leur hébergement. Si toutefois un animal présente des signes de maladie ou d'anxiété (absence de prise de poids au cours de l'hébergement, troubles du comportements, signes d'agressions), il est retiré de l'étude et mis à mort pour limiter sa souffrance. Le maintien d'une anesthésie générale tout au long de la procédure permet de supprimer la douleur causée par l’incision de la paroi abdominale. En cas de signes de douleur au cours de l'anesthésie (mouvement des membres ou de la peau), la procédure est suspendue et un tiers de dose d'anesthésique supplémentaire est administré. Si le rat présente toujours des signes de douleur 5 min après l'administration supplémentaire d'anesthésique, la procédure s'arrête et le rat est mis à mort pour limiter sa souffrance. Tous les prélèvements, la perfusion du foie et l'administration des molécules sont réalisés post-mortem pour n’occasionner aucune douleur.
Choix des espèces
L'optimisation des conditions d'isolement des cellules du foie est historiquement faite chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats avec la littérature. Le rat est un modèle classique d’étude du stress cellulaire au cours des lésions dues à l'arrêt de la circulation sanguine puis sa reprise (lésions d'ischémie-reperfusion). Les hépatocytes primaires (cellules principales du foie) de rat, notamment de rat Sprague Dawley, sont un modèle d’étude de référence en pharmacologie préclinique. Les perfusions de foie de rat permettent d’obtenir une quantité suffisante de cellules afin de réaliser des tests (environ 700 millions/Rat) contrairement à la souris (environ 50 millions/Souris). Les rats Sprague Dawley sont commandés à 5 semaines (180-200g) et utilisés à 6 semaines (200-230g), poids standard d'utilisation pour l'isolement des cellules du foie.
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à un régime gras ou à une alcoolisation, avec des injections intrapéritonéales pour induire une fibrose hépatique et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle de la glycoprotéine CD44 dans les complications hépatiques liées à l'obésité et à l'alcool. Le porteur indique que l'alcoolisation peut provoquer une détresse respiratoire et des signes d'ébriété, et que les injections peuvent entraîner rougeur, infection ou nécrose au point d'injection. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire" car les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Une consommation chronique d'alcool conduit au même spectre d'altérations hépatiques qui vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, qui peut progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 dans la souffrance hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8, dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise régulière d’alcool. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou dans les lymphocytes CD8 permettrait de mettre en lumière de nouveaux mécanismes moléculaires.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Le sang des animaux soumis à un régime alcoolisé sera prélevé en fin de procédure et ce prélèvement ne durera pas plus d'une minute. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. L'alcoolisation peut entraîner des signes de détresse respiratoire, des signes d’ébriété chez les animaux suivis d’un endormissement. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour les procédures 2 et 3 (souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 4 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour étudier le vieillissement hépatique (procédure 5), les animaux ne seront utilisés qu’à un stade très avancé de leur développement et seront donc maintenus jusqu’à l’âge de 22 mois maximum.
Rôle de la coagulation dans les maladies du foie et dans les saignements liés à la cirrhose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
1 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose du foie par des injections deux fois par semaine pendant quatre à douze semaines ou par un régime gras, puis certaines subissent sous anesthésie une coupure de la queue ou une lésion du foie au laser après ouverture du ventre pour provoquer un saignement observé au microscope. Le porteur étudie le rôle de la coagulation dans la cirrhose et les saignements associés, sur des mécanismes qu'il décrit comme mal connus. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'organes et de grands volumes de sang.
Objectifs
La fibrose hépatique est une cicatrisation anormale du foie en réponse à des agressions répétées (infection par un virus, consommation excessive d'alcool, consommation excessive d'aliments gras ou sucrés (maladie du foie gras). La maladie du foie gras est la première cause de maladie du foie dans le monde, affectant 25% de la population mondiale, et est caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie puis l'apparition d'une inflammation et à terme d'une fibrose. La fibrose du foie peut progresser vers la cirrhose qui est une maladie grave responsable de 150000 décès par an en Europe. Les mécanismes de la fibrose du foie sont incomplètement compris et il n'existe à ce jour aucun traitement approuvé. La coagulation est une cascade de réaction aboutissant à la formation d'un caillot qui va permettre d’arrêter un saignement. Le foie joue un rôle central dans la coagulation car il synthétise les facteurs qui servent à coaguler. En cas de cirrhose, la production de ces facteurs est perturbée ce qui peut favoriser les saignements, notamment après une biopsie. Mieux comprendre les mécanismes qui perturbent la coagulation au cours de la cirrhose permettrait de mieux prévenir les saignements. De plus, la coagulation favorise également le développement de la fibrose du foie, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle. Nous étudions une protéine enzymatique qui inhibe la coagulation et favorise donc les saignements. Elle est produite par les plaquettes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, et sa concentration est augmentée dans le sang des patients qui ont une cirrhose. Cette protéine enzymatique protége du développement de la fibrose pulmonaire mais son rôle dans le développement de la fibrose du foie est inconnu. Les deux objectifs du projet sont de comprendre le rôle de cette protéine enzymatique dans le développement de la fibrose du foie (en général et dans la maladie du foie gras) et son rôle dans la coagulation et les saignements survenant au cours de la cirrhose.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont nombreux 1) En déterminant les mécanismes de développement de la cirrhose et fibrose du foie, nous allons potentiellement trouver de nouvelles pistes pour développer des traitements de ces maladies chez les personnes avec un foie gras mais aussi chez les personnes qui ont de la fibrose liée à un virus ou à une consommation excessive d'alcool. 2) En étudiant la coagulation de la cirrhose, nous comprendrons mieux les mécanismes complexes qui entrainent une coagulation anormale chez les patients atteints de cirrhose. Nous allons voir si bloquer une protéine de la coagulation permet de diminuer les saignements sur des modèles de souris. Si c'est efficace, cela pourrait devenir un traitement préventif des saignements qui surviennent chez les patients qui ont une cirrhose après une biopsie et cela éviterait d'avoir à transfuser les patients dans un contexte actuel où on manque de poches de sang.
Procédures
La demande d’autorisation de projet concerne les procédures suivantes Sur animal vigile : - Injections dans le ventre d'un produit deux fois par semaines pendant 4 à 12 semaines pour développer de la fibrose au niveau du foie - Mise sous régime riche en matières grasses pour créer une maladie du foie gras pendant 4 à 12 semaines. Sur animal anesthésié: - Injection dans une veine de la queue d’un anticorps (molécule qui bloque la coagulation) pour stopper les saignements sous anesthésie - Coupure de la queue pour induire un saignement sous anesthésie - Lésion avec un laser du foie après ouverture du ventre pour induire un saignement et observation des cellules qui aident à arrêter le saignement à l'aide d'un microscope sur la souris encore vivante sous anesthésie - Prélèvement de sang dans une veine du ventre puis euthanasie sous anesthésie et prélèvements des organes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont - Une perte de poids initiale puis une stabilisation du poids chez les souris traitées pour induire une cirrhose - Pour les souris qui ont un régime riche en graisses, une prise de poids modérée est attendue - Des douleurs temporaires au moment de l'injection de produit dans le ventre - Possible stress les premiers jours des injections dans le ventre lié à la nouveauté de la procédure qui devrait s’estomper avec le temps - Les procédures pouvant induire des douleurs ou un stress telles que le prélèvement dans la veine du ventre, l’injection de produit dans la queue, la coupure de la queue pour induire un saignement ou les lésions du foie induites par un laser - La fibrose du foie et la cirrhose sont des maladies indolores qui n'entraînent pas d'altération du bien être animal.
Devenir
Les souris seront toutes euthanasiées à l'issue des procédures sous anesthésie car elles ne pourront pas être maintenues en vie (car on aura prélevé plusieurs organes vitaux ou prélevé une trop grande quantité de sang).
Remplacement
La coagulation et le développement de la fibrose du foie étant des processus complexes, il n’est actuellement pas possible de remplacer totalement le modèle animal par des modèles informatiques ou des modèles de cellules en laboratoire. Néanmoins, pour limiter l'utilisation de trop de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier la coagulation sur du sang prélevé sur des malades quand cela est possible.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous incluerons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les deux groupes. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles (souris qui n'ont pas de traitement toxique pour le foie) pour plusieurs procédures. De plus, nos souris contrôles seront issues des accouplements faits pour générer les souris des différentes lignées.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien être des animaux: surveillance quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (batonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée.
Choix des espèces
Le modèle murin permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l'étude. Enfin, la fibrose du foie et la cirrhose étant des maladies multifactorielles, la proximité génétique de la souris vis à vis de l’Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 8 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l'âge auquel apparaît cette maladie chez l'homme).
Etude d’effets physiologiques de l’administration d’une solution probiotique lactofermentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Maintenues à la main, des souris reçoivent à la pipette, de façon répétée, un jus de fruit probiotique lactofermenté, après dix jours d'habituation à la même manœuvre avec de l'eau. 100 souris, jeunes adultes de huit semaines et souris âgées de 48 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec trois séries de prélèvements de sang, de selles et d'urine et 40 minutes de tests d'anxiété : boîte blanche, labyrinthe en croix dont deux bras donnent sur le vide, boîte à zone d'ombre et zone fortement éclairée. Le porteur écrit que l'administration manuelle "peut entrainer un stress chronique car répété", et promet dans le même résumé des soins "afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude". À la fin, toutes sont tuées pour recueillir leur matériel biologique, dont du tissu intestinal et cérébral, des prélèvements qu'il dit impossibles chez l'humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de l’administration d’un jus de fruit probiotique lactofermenté sur la physiologie du microbiote et de l’intestin. Le projet a recours à un modèle de souris afin de permettre l’étude de la physiologie de l'intestin et du comportement. La physiologie des animaux sera étudiée à partir d’analyse des selles, des urines, du sang, et de prélèvements intestinaux, ainsi que sur un plan comportemental avec une batterie de tests pour évaluer leur état d’anxiété. Un maximum de 100 souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’améliorer la connaissance sur l’impact de produits probiotiques alimentaires vivants sur la physiologie de la muqueuse intestinale. Les bénéfices seront à destination des humains, pour valider l’effet sur la santé d’une administration de probiotiques vivants. Les bénéfices à long terme consistent à développer des aliments probiotiques vivants à effets dirigés et connus dans un but de personnalisation.
Procédures
Des prélèvements de sang, de selles et d'urine seront réalisées au moment des manipulations des animaux (3 fois pendant la durée du protocole et espacés de 14 jours). Les tests comportementaux consistent a l'étude de l'anxiété d'exploration. L'ensemble des tests dure 40 minutes. L'animal dans une boite blanche pour étudier son déplacement, dans un labyrinthe en forme de croix, avec deux bras donnant sur le vide et deux bras protégés, et enfin dans une boite présentant une zone d'ombre et une zone fortement éclairée.
Impact sur les animaux
L’administration manuelle de la solution peut entrainer un stress chronique car répété. Cependant, la qualité sucrée de la solution peut aussi induire un conditionnement de l’animal, de plus une période d'habituation de 10 jours d'administration d'eau à la pipette sera réalisée avant le début de l'étude. Les tests comportementaux peuvent induire un stress temporaire le temps de la passation.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir recueillir le matériel biologique pour les études au laboratoire.
Remplacement
Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes pour étudier le retentissement à un niveau physiologique de l'administration de probiotiques (actuellement recours à des organoïdes permet seulement l'étude au niveau cellulaire voir tissulaire). L'étude nécessite des investigations sur des prélèvements non possible chez l’homme (tissu intestinal total, tissu cérébral). L'utilisation d'animaux permet de garantir une qualité scientifique optimale, en contrôlant a maxima les influences du milieu extérieur, ce qui est impossible chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour le protocole a été réduit au minimum mais reste élevé du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition à la solution sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter la souffrance lors de l’administration de la solution, celle-ci n’est pas faite par gavage mais par délivrance orale à la pipette lors d’une manœuvre de contention manuelle. Pour limiter le stress engendré par la contention manuelle et l'administratin à la pipette, une période d'habituation de 10 jours d'administration de 20µL d'eau à la pipette lors d'une manoeuvre de contention manuelle sera réalisée, de plus l'habituation permettra de prévenir un biasi d'administration du volume par salivation ou régurgitation. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger). Dans le cas où les souris mâles viendraient à se battre, il est prévu de les isoler en cages individuelles.
Choix des espèces
La connaissance de la physiologie intestinale et immunologique de la souris est avancée. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. 1 lot d'animaux sera acheté à l’âge de 6 semaines, et sera utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines, ce lot correspond à l'âge adulte jeune, et permet d'étudier le retentissement physiologique sur un organisme pleinement fonctionnel. 1 lot d'animaux « âgés » de 48 semaines sera utilisé pour l’étude afin d’étudier l’impact des produits sur la physiologie des sujets âgés.
Etude de la fonction de Kat2b et autres mécanismes moléculaires dans le développement de la Fibrose Hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Cinq jours en cage métabolique, des tests métaboliques de quatre heures toutes les deux semaines, des injections d'insuline et de pyruvate dans l'abdomen et une prise de sang derrière l'œil sous anesthésie en fin de protocole : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale sous anesthésie. Les régimes et traitements imposés altèrent le fonctionnement du foie, avec un risque de fibrose et de troubles digestifs, afin d'évaluer le rôle du gène KAT2B dans l'identité des cellules hépatiques. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour ne plus exprimer ce gène dans le foie. Le porteur affirme qu'il est "impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro", et annonce adosser au projet le développement d'organoïdes de foie humain censés fournir "un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle".
Objectifs
Notre projet vise à définir le gène de la lysine acetyl transferase 2B (KAT2B) comme un gardien de l'identité des hépatocytes et une cible pharmacologique pour contrecarrer la perte d'identité et de fonction hépatocytaire caractérisant les foies gravement lésés.
Bénéfices attendus
Le contrôle et le rétablissement de l’identité hépatocytaire émergent comme des voies thérapeutiques potentielles dans les formes graves d’atteinte à la fonction du foie. En identifiant un acteur pouvant être ciblé pharmacologiquement dans ce but, notre projet fera passer un cap permettant d’envisager plus sérieusement cette approche thérapeutique. D’autre part, en y adossant le développement d’organoïdes de foie humain, ce projet contribuera à fournir un modèle pertinent vis-à-vis de la recherche translationnelle.
Procédures
La totalité des souris sera soumise à différentes régimes ou traitements (6 protocoles de traitements ou régime) associés à des tests métaboliques et cages métaboliques (5 jours) afin de mesurer l'éfficacité des traitements provoquant la dysfonction hépatique et le rôle de nos gènes d'inéterets ou molécules pharmacologiques dans la physiopathologie hépatique. Ces tests métaboliques seront réalisés tous les 2 semaines sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pendant une durée de 4 heures. La totalité des souris sera soumise à un prélèvement sanguin à la veine caudale lors des tests de tolérance au glucose afin de determiner l'insulinémie et la glycémie. La totalité des souris sera soumise à une injection intra péritonéale d'insuline et de pyruvate. Un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire d'une durée de 3 minutes sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane à l'issu des protocoles expérimentaux. Nous utiliserons 60 souris de chaque génotype (wt/ko) pour les 5 procédures, traitées ou non avec l'activateur pharmacologique.
Impact sur les animaux
L'effet indésirable qui pourrait être attendu sur les animaux est l'apparition d'un stress en lien avec la manipulation des animaux. Le développement d'une fibrose du foie pourra également générer des effets indésirables, notamment des troubles digestifs.
Devenir
A l'issu des protocoles, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie générale de l'animal. Des dissections des échantillons biologiques seront réalisées pour mener les études histologiques, moléculaires et épigénétiques.
Remplacement
Nos objectifs sont de mieux comprendre la physiopathologie de stéatose hépatique. Pour cela, la validation chez l'animal est une obligation pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et physiopathologiques à l'origine de CETTE maladie. Nous devons donc utiliser des souris génétiquement modifiées pour identifier certains gènes intervenant dans le dévelopement de cette maladie. Il est nécessaire de travailler sur un organisme entier vivant pour reproduire la physiopathologie complexe de la stéatose hépatique, car cette maladie fait intervenir plusieurs types cellulaires dans le foie mais également d'autres organes comme l'intestin. Il est donc impossible de modéliser ces interactions complexes in vitro.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux, une étude statiistique (utilisation du logiciel gpower pour definir le nombre d'animaux necessaires) est utilisée pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de générer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés (glycémie, poids, ...).
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée reste le meilleur modèle pour étudier l'effet d'un gène sur le développement d'une maladie. Nous utiliserons donc des souris invalidées pour notre gène d’intéret spécifiquement au niveau hépatique. Ces souris seront soumises à différents traitements régimes afin de mimer le développement d’une maladie du foie. Les animaux utilisés sont des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines (pesant entre 20 et 30g) possédant un système digestif et immunologique mature, permettant l'étude d'un système physiologique digestif optimal.
Étude de l’induction d’une immunité entrainée chez le souriceau en comparasion de l’adulte.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Injectés par voie intrapéritonéale à une puis deux semaines de vie, éveillés et sous contention, des souriceaux reçoivent des immunostimulants censés installer une mémoire immunitaire innée, comparée à celle de souris adultes traitées de la même manière. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus, et le porteur prévoit 20 à 30 % de mises en reproduction en plus parce que le stress de certaines lignées "favorise le cannibalisme", les surnuméraires pouvant être "introduits dans un autre protocole". Des femelles, gestantes ou non, boivent une eau additionnée d'antibiotiques, et toute médication est proscrite pour ne pas fausser les mesures immunitaires. Sur l'injection, le porteur écrit qu'"aucune nuisances n'est observée", puis que "des douleurs légères peuvent être liées à l'injection intra-péritonéale", et juge "impossible d'anticiper" les effets indésirables des immunostimulants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité de divers immunostimulants à induire une réponse immunitaire innée mémoire lorsqu’ils sont administrés en début de vie de l’animal. L’implication du microbiote intestinal sera également étudiée dans la modulation et la mise en place de l’immunité innée mémoire. La stimulation et la modulation des cellules de l’immunité innée en période néonatale pourraient permettre d’induire une réponse durable, avec une mise en place de la mémoire immunitaire innée pour favoriser le contrôle d’infections futures à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Les stratégies de contrôle pour lutter contre les infections sont parfois limitées et trop spécifiques d’un agent (ex : vaccin). L’idée ici est de proposer une nouvelle stratégie prophylactique qui cible l'hôte lui-même et plus spécifiquement son système immunitaire inné. Il repose sur l'utilisation d’immunostimulant favorisant la stimulation des récepteurs de l’immunité, et ainsi booster la réponse immunitaire innée pour mieux contrôler une infection zoonotique présente ou ultérieure (d’où les essais d’induction de mémoire innée).
Procédures
Les souriceaux seront soumis à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants : une fois à l’âge d’une semaine, puis à l’âge de deux semaines. Les souris adultes seront soumises à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants sur la période de 6-8 semaine à une semaine d’intervalle. Cette administration est réalisée sur animaux vigiles sous contention. Pour évaluer l’implication du microbiote intestinal, les souris adultes gestantes ou non recevront des antibiotiques dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Il est impossible d’anticiper, mais il est possible que des effets indésirables altérant l’état général de l‘animal puissent être remarqués avec certains immunostimulants. Concernant l’injection intra-péritonéale aucune nuisances n’est observée, en effet, nous utilisons des seringues adaptées (seringue insuline, 30G pour les souriceaux, et aiguille 29G pour les adultes), neamoins des douleurs légères peuvent être liées à l’injection intra-péritonéale.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …).
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par l’établissement). Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. L’étude de l’immunité innée mémoire s’effectuera dans différents organes. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation, les différents organes prélevés sur un même animal seront utilisés autant que possible pour réaliser différents types d’analyse. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes adaptés qui tiennent compte à la fois des traitements immunostimulants et de la répétition des expériences.
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis 2 fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas
Choix des espèces
Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra d’étudier et décrire très précisément les mécanismes d’induction des réponses immunitaires innées mémoires après l’administration d’immunostimulants. 1. Des souriceaux entre 0 jours et 3 semaines seront utilisés car c’est la fenêtre que nous souhaitons étudier pour l’induction de l’immunité innée mémoire. Des souris gestantes fourniront les souriceaux 2. Des adultes seront utilisés dans le cadre de l’étude de l’immunité innée mémoire, afin de comparer ces évènements entre la période néonatale (premières semaines de vie) et la période adulte (6-8 semaines).
Comprendre le rôle du CD36 intestinal dans l’apparition des maladies métaboliques et de l’inflammation associée : utilisation de « faux lipides » bio-sourcés et dérivés d’acides gras naturels.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du sans réveil au modéré, 128 individus étant menés sans réveil. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 intestinal, elles reçoivent par gavage des agonistes et de l'huile après une mise à jeun de douze heures, avant prélèvement sanguin sous anesthésie et mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur cherche à établir le rôle du CD36 intestinal dans l'obésité et présente ce récepteur comme une éventuelle cible thérapeutique. Il affirme le remplacement "impossible" au motif que l'étude met en jeu plusieurs organes.
Objectifs
L’obésité est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires et au diabète. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité et de l’inflammation associée. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36. La contribution physiologique spécifique de CD36 intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation de CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques associées au développement de l'obésité. 2) Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement modifiées, n’exprimant pas le récepteur CD36 spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le récepteur CD36 au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant CD36. Ce sont des molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Nous disposons de deux agonistes différents pour réaliser ces expériences (nommé A et B pour des raisons de confidentialité). Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être très utilisés comme éventuelle molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire l’hypertriglycéridémie postprandiale, réduire l’endotoxémie postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.
Procédures
L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une ou deux fois. C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin( 30 secondes maximum), puis euthanasiées par dislocation cervicale, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Celui-ci est diminué par le fait que pendant cette période les souris sont laissées dans leur cage avec un enrichissement supplémentaire de leur mileu de vie (frisons en carton, petits abris en carton ou en plastique).
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.
Etude pilote pour la mise en place chez le rat d’une insuffisance rénale chronique suivie ou non d’une transplantation rénale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
310 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du sans réveil au sévère, 120 individus étant classés en sévère et 120 sans réveil. On leur induit une insuffisance rénale chronique par injection dans la queue, suivie huit semaines par IRM sous anesthésie et prélèvements sanguins répétés, une partie étant d'abord rendue obèse par trois mois de régime gras et sucré, puis certains subissant une transplantation rénale sous anesthésie générale. Le porteur indique que l'insuffisance terminale peut provoquer tremblements et perte de 20 % du poids, seuil qui déclenche la mise à mort, et présente la greffe comme "bénéfique" pour l'animal. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'est "pas possible" de recréer sans animaux la maladie ni la complexité de la transplantation, et qualifie l'ensemble d'étude pilote destinée à préparer un projet ultérieur.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie des reins d’évolution silencieuse : progressivement, la fonction des reins se détériore et peut évoluer vers un stade terminal (IRCT) nécessitant la mise en place d’un traitement par dialyse ou une transplantation rénale. La transplantation rénale offre une meilleure survie et qualité de vie. Ce projet est une étude pilote pour mettre au point le protocole d'insuffisante rénale chronique et de transplantation rénale sur des rats, mâles et femelles, minces ou obèses, et de suivre l'état des reins par de l'imagerie IRM.
Bénéfices attendus
L'obésité affecte plus de 30% des patients en insuffisance rénale chronique terminale et est un frein à la transplantation rénale . Ces travaux permettront dans un second temps de déposer un nouveau projet afin de déterminer l'impact de la chirurgie de l'obésité sur la fonction rénale d’une part et sur le succès de la transplantation rénale sur des animaux obèses en insuffisance rénale. Notre second projet apportera des connaissances sur le comportement du rein greffé à moyen terme en fonction du type de chirurgie de l'obésité et pourra permettre d’orienter le choix de la chirurgie de l’obésité optimale chez les patients.
Procédures
Il sera induit une insuffisance rénale chronique par injection unique d’une substance au niveau de la queue qui sera suivie sur 8 semaines par IRM avec un agent de contraste et un prélèvement sanguin. L’animal est anesthésié pendant l’injection (10min) puis à chaque IRM (pendant 2h maximum) au cours desquelles se fait également le prélèvement sanguin. Une IRM avec prélèvement est réalisée avant l’induction puis toutes les 2 semaines après l’induction pendant 8 semaines (5 IRM et 5 prélèvements au maximum). Le protocole dure 10 semaines au maximum. Certains animaux subissent exactement le même protocole après avoir été rendus obèses par un régime riche en sucres et en graisses de 3 mois. Le protocole dure 22 semaines au maximum. Certains animaux avec ou sans insuffisance rénale chronique induite par injection unique d’une substance au niveau de la queue subiront une transplantation rénale sous anesthésie générale (1h30 maximum) toujours suivie par IRM. Une IRM avec prélèvement (sous anesthésie 2h maximum) est réalisée avant l’induction puis 4 semaines après l’induction juste avant la transplantation et enfin 4 semaines après la transplantation (3 IRM et 3 prélèvements au maximum). Le protocole dure 10 semaines au maximum. Certains animaux subissent exactement le même protocole après avoir été rendus obèses par un régime riche en sucres et en graisses de 3 mois. Le protocole dure 22 semaines au maximum.
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisses et en sucres est extrêmement agréable pour les animaux mais il entraine une prise de poids. Cependant, et contrairement à l'homme, il n'y a pas de maladies associées dans ce modèle (ni diabète ni foie gras ni insuffisance rénale). Des lésions rénales apparaitront au cours du traitement, l’animal ne présente souvent aucun symptôme. En revanche l’insuffisance chronique terminale peut induire des troubles du comportement comme des tremblements et une perte de poids de 20%. Le risque de mortalité est inférieur à 5%. La transplantation rénale est réalisée sous anesthésie et analgésie et est bénéfique pour les animaux puisqu'elle restore une partie de la fonction rénale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer sans l'usage d'animaux la maladie de l'insuffisance rénale chronique ou la complexité de la transplantation rénale.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe pour valider la faisabilité de nos modèle d'insuffisance rénale chronique et de transplantation rénale. Un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables pour les futurs projets. La fonction rénale sera suivie au cours du temps en imagerie IRM, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par groupe. La transplantation rénale est réalisée sur un seul rein, ce qui permet aussi de limiter le nombre d’animaux, puisque le rein non transplanté sera le contrôle interne de chaque animal. Les rats donneurs de rein pour la transplantation sont utilisés dans d’autres expérience nécessitant des prélèvements post-mortem de tissus.
Raffinement
1 semaine d’acclimatation est laissée aux animaux entre leur transport sur le site et l’expérimentation. Les animaux sont maintenus à au moins 2 individus par cage pour éviter le stress de l’isolement. Un suivi quotidien visuel est assuré et un suivi clinique quotidien est mis en place avec une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés lors des traitement ou des transplantations. Les IRM, prélèvements et injections sont réalisés sous anesthésie. Les transplantations sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur, est prévue avant, pendant et après l’opération pour le rat receveur comme pour le rat donneur d’organe. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi de poids et de la prise alimentaire des animaux avec des pesées journalières les 7 jours après l'opération puis hebdomadaires, ainsi qu’une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés. Si un point limite est atteint pour un animal, un antidouleur est administré et si il n'y a pas d'amélioration de l'animal dans les 12h, l'animal est euthanasié. Les animaux ont donc ce suivi clinique qutidien mais également un suivi quotidien visuel au cours duquel un inconfort ou une éventuelle douleur peut être reconnu par un changement de comportement de l'animal qui sera alors pris en charge de façon appropriée. Après les opérations chirurgicales, les animaux sont isolés pendant 7 jours pour suivre leur prise alimentaire individuelle, la reprise du transit intestinal et leur capacité à uriner puis ils sont remis ensemble. Dans tous les cas, les cages sont enrichies avec un tube en polycarbonate.
Choix des espèces
Nous développerons notre projet en utilisant le modèle de rongeur rat. Le modèle de rat est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité et de l’insuffisance rénale induite. Il est suffisamment gros pour pouvoir reproduire le plus fidèlement possible les transplantations rénales réalisées chez l'homme. Nous utilisons des animaux adultes (de plus de 5 semaines) obèses, mâles et femelles, puisque c'est à l'âge adulte seulement que les êtres humains souffrent d’insuffisance rénale chronique et peuvent subir une transplantation rénale.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.
Procédures
Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.
Devenir
En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.