Système gastrointestinal

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.

Objectifs

Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.

Impact sur les animaux

D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.

Devenir

Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.

Raffinement

Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.

Choix des espèces

Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.

Ce projet utilise des souris pour confirmer des résultats déjà obtenus sur des larves de poisson zèbre, et valider ainsi un protocole que l'équipe présente comme un futur substitut à la souris. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Nourries d'un régime riche en graisses, elles reçoivent par gavage, neuf fois en neuf semaines, un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, la dioxine TCDD, le bisphénol A, le DEHP et le carbendazime, puis subissent une prise de sang derrière l'œil, en contention ferme, juste avant leur mise à mort. Le porteur écrit qu'il est "indispensable d'utiliser des souris" pour valider ce protocole censé les remplacer.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous avons mis en place une stratégie en deux temps : d’abord un criblage de l’impact sur le foie de l’exposition chronique à des mélanges de PE dans notre modèle de larve de poisson-zèbre obèse suivi de la confirmation de ces effets dans un modèle murin pertinent. L’objectif de ce projet est donc la réalisation de la 2éme phase de confirmation des effets observés chez la larve de poisson zèbre d’un mélange de PE sur le developpement de la pathologie NAFLD chez la souris

Bénéfices attendus

Le caractère novateur de ce projet repose sur le choix du modèle pour répondre aux enjeux de la recherche sur les PE notamment dans des populations dites à risque. En effet, la larve de poisson-zèbre a de nombreux avantages : faible coût financier, mise en place rapide des processus physiopathologiques sur organisme entier, sensibilité aux agents chimiques (meilleure prédiction de l’hépatotoxicité que des modèles in vitro humain), criblage moyen/haut débit. De plus, la taille et la transparence des larves seront mises à profit pour identifier des perturbations précoces mitochondriales ou membranaires. Enfin, l’emploi de ce modèle, en accord avec la règle des 3R, peut être une alternative ou un prérequis à l’emploi des modèles in vivo de mammifères classiquement utilisés. Cette étude de faisabilité a pour but de proposer un nouveau modèle in vivo visant à mieux caractériser les effets des PE en mélange sur la progression des NAFLD et ainsi de répondre aux préoccupations concernant leurs potentiels effets cocktails. Pour cela, 4 PE ont été choisis car la population y est couramment exposée et pour garantir les chances de démontrer un effet cocktail. En effet, chacune des molécules (TCDD, BPA, DEHP et carbendazime) est reconnue pour son implication dans les NAFLD. En outre, ces molécules sont issues de familles différentes (polluants organiques persistants, plastifiants et pesticides) impliquant l’activation de mécanismes variés (activation de différents récepteurs nucléaires, stress oxydant…), ce qui pourrait ainsi potentialiser leurs effets lors de mélange. Enfin, le choix du modèle s’est porté sur la larve de poisson-zèbre, dont la sensibilité aux PE a été démontrée et pour lequel nous avons déjà mis en place un modèle développant une stéatose rapidement, et qui nous a permis de mettre en évidence qu’un mélange d’agents hépatotoxiques à faibles doses favorise la transition vers la NASH. Le premier volet de ce projet sur le modèle de larve de poisson-zèbre a été réalisé et a fait l’objet d’une saisine spécifique. Les résultats ont permis de déterminer la composition d’un mélange de ces 4 PE (TCDD, CBZ, BPA et DEHP) pour lequel on a observé une avancée de la stéatose vers la stéatohépatite pour des concentrations où chaque PE en exposition unique n’avait que peu ou pas d’effet, ce qui indique un effet cocktail de ces molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage pour maitriser l'exposition aux perturbateurs endocrniens à raison d'un traitement par semaine 9 fois (entre la 3eme semaine de régime riche en graisse et la 12eme semaine). Ils seront aussi soumis à un prelevement de sanguin par voie retro-orbitale juste avant le sacrifice.

Impact sur les animaux

Le gavage induit un inconfort des animaux, reste que la NAFLD est une pathologie indolore. Le prelevement en retroorbital necessite l'inconfort d'une contention ferme, la legère douleur qui pourrait etre associée à l'introduction de la pipette est soulagée par l'anesthesis locale.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort afin de recolter les organes pour permettre l'etude scientifique.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissu adipeux et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constitue le foie. De plus, l’altération des systèmes de communications hormonaux est le mécanisme d’action définissant l’action des perturbateurs endocriniens. Seuls les modèles in vivo présentent toutes ces interactions. Le développement d’un nouveau modèle animal pour étudier la stéatohépatite qui peut être mis en œuvre sur des temps plus court et plus éthique a été proposé par l’équipe. Il utilise les larves de poisson zèbre et a montré des premiers résultats très encourageants qui doivent être confirmés sur le modèle murin de référence pour les études de toxicologie pour valider la pertinence de ce modèle de poisson zèbre et permettre la substitution de l’utilisation des souris par ces larves de poissons.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Enfin le projet vise à confirmer chez la souris la validite de résultats obtenus dans un autre modele

Raffinement

Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux, une attention journalière à l’état des animaux sera mise en œuvre, et un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les souris seront traitées dans une pièce isolée de leurs congénères sur un temps court ne permettant pas le développement de douleur. Enfin, l’utilisation de points limites adaptés et de critères d’arrêt des souffrances ont ete déterminés et seront mis en oeuvre .

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’utilisation du modèle de poisson-zèbre pour étudier l’impact de cocktail de perturbateurs endocriniens sur la transition de la stéatose en un état pathologique, la stéatohépatite et à valider le caractère prédictif du modèle de poisson-zèbre en le comparant à un modèle murin classiquement utilisé pour l’étude des NAFLD. Il est donc indispensable d’utiliser des souris pour remplir les objectifs du projet. Adulte, pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes. Animaux âgées de 8 à 12 semaines, d’environ 20g

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues dépourvues de microbiote, elles sont inoculées par voie orale avec des souches d'Escherichia coli dont une pathogène, puis tuées 72 heures après pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la souche pathogène peut provoquer faiblesse, diarrhée et déshydratation, les souris atteignant le point limite étant mises à mort par anticipation. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale capable de simuler un organisme constitué de plusieurs organes, comprendre ces mécanismes étant selon lui "indispensable" pour la santé publique.

Objectifs

Les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) sont des bactéries responsables d’infections humaines. Les symptômes vont de la diarrhée bénigne à la colite hémorragique et au syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3 à 5 % et plus d’1/3 des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Compendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La shigatoxine est une protéine formée de 2 sous-unités codées par les gène stxA et B. Ces 2 gènes font partie du génome d’un bactériophage (virus infectant les bactéries), qui infecte spécifiquement E. coli. Le génome du bactériophage peut s’intégrer au chromosome des bactéries infectées. On parle alors de prophage. Le plus étudié des prophages des STEC est le prophage 933W. Expérimentalement, chez la souris, une souche d’E. coli dont le chromosome porte le prophage 933W est pathogène. Á l’inverse, les STEC chez lesquelles le prophage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Les gènes stxA et B sont précédés d’une séquence d’ADN qui contrôle leur expression. Cette séquence est reconnue par la machinerie cellulaire de la souris ou de l’Homme, ce qui amène à faire l’hypothèse que l’infection se déroule ainsi : libération des prophages dans l’intestin sous l’action d’un facteur environnemental qui stresse les bactéries porteuses ; les particules virales libérées traversent la muqueuse intestinale et pénètrent dans les cellules cibles de l’organisme (ex : cellules rénales) ; la séquence d’ADN qui contrôle l’expression des gènes stxA et B est reconnue par la machinerie cellulaire ; ces gènes sont alors exprimés et la shigatoxine est produite. L’objectif du projet est de tester cette hypothèse en comparant des souris inoculées avec l’une des souches d’E. coli suivantes : C600:933W (prophage et sa séquence d’ADN contrôlant les gènes stxA et B, souche pathogène), C600:933W delta-pr1 (prophage sans la séquence de contrôle, souche non pathogène), C600 (pas de prophage, souche non pathogène).

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans l’expression des gènes stxA et stxB in vivo. L’utilisation de souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote intestinal, permettra de s’affranchir de facteurs confondants (transmission possible du prophage à d’autres souches d’E. coli présentes naturellement dans le microbiote intestinal), et de facteurs pouvant affaiblir le pouvoir pathogène de la bactérie modèle étudiée (effet « barrière » possible du microbiote intestinal). Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certaines de leurs manifestations cliniques. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5 %) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique de ces bactéries pathogènes, en particulier lors d’infection par les denrées alimentaires. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant.

Procédures

En début de procédure, les animaux sont soumis à un jeûne hydrique de 4 heures, suivie d'une unique inoculation par voie orale. Puis deux prélèvements de fèces à 24 h d’intervalle après l’inoculation sont réalisés. La procédure s’arrêtera 72 h après l’inoculation. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique ayant une action puissante sur les douleurs viscérales. Une heure plus tard, ils seront profondément anesthésiés à l’isoflurane (dose létale). La paroi abdominale sera incisée, une ponction de la veine cave (située dans l’abdomen) sera faite pour prélever du sang, puis une perfusion intra-cardiaque sera faite pour éliminer le sang restant dans le système circulatoire afin de pouvoir prélever des tissus sans trace de sang, condition nécessaire pour des analyses histochimiques de bonne qualité. L'ensemble de cette procédure durera entre 5 et 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant la souche C600 ou la souche C600:933W delta-pr1 sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation orale avec 150 µL de culture bactérienne. D’une part, ces souches ne sont pas pathogènes. D’autre part, l’inoculation sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les nuisances attendues dans le groupe recevant la souche pathogène C600:933W sont l’expression d’un syndrome infectieux : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures et des points limites seront mis en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition du syndrome infectieux. Fréquence de surveillance accrue aux premiers signes cliniques, et mise à mort anticipée si les symptômes atteignent le point limite indiqué dans la procédure expérimentale. Les souris sont mises à mort au plus tard 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme. Pendant toute la durée de l’expérience, les souris seront maintenues en groupes sociaux de 3 individus, dans un environnement enrichi ; de l’eau stérile, des croquettes de nourriture stérile de formulation standard et de l’aliment gélifié stérile de formulation standard seront mis à leur disposition à volonté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus dans lesquels seront pratiquées des analyses destinées à étudier l’effet de la production de shigatoxine par la souche d’Escherichia coli introduite dans le tube digestif des souris.Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience de nos partenaires argentins dans le domaine étudié permet de considérer que 6 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 6 souris par groupe dans les deux groupes témoins. Dans le groupe inoculé avec la souche pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si la mise à mort est très anticipée par rapport à la date prévue pour mettre à mort toutes les souris, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 6 souris supplémentaires dans ce groupe, qui seront utilisées si nécessaire. Le protocole comportera donc 3 groupes de 6 souris, plus 6 souris supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 24 animaux.

Raffinement

Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 3 individus par cage, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement disposé les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard (gel diet) seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue induites par un syndrome infectieux (possible dans le groupe inoculé avec la souche pathogène C600:933W). De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté par voir sous-cutanée aux souris si elles montrent des signes de déshydratation (1 ml par injection, 3 fois par jour). Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite les premiers signes d’un syndrome infectieux et décider d’une mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. L’inoculation orale des souris avec les souches bactériennes sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Préalablement à la mise à mort des souris, au cours de laquelle une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque seront réalisées, un analgésique sera administré par voie parentérale (flunixine ; 2,5 mg/kg ; puissante action analgésique sur les douleurs viscérales).

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris (semaine suivant le sevrage). Chez l’Homme, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants.

323 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime de sous-nutrition provoquant une perte de masse musculaire, testé contre un probiotique, avec prises de sang sur animal vigile. Il indique que la mise à mort se fera par prélèvement d'une grande quantité de sang sous anesthésie jusqu'à l'arrêt cardiaque, une dérogation ayant été demandée pour éviter que l'anesthésique ne fausse les mesures. Sur le remplacement, il affirme que la fonte musculaire liée à l'âge est impossible à reproduire en culture cellulaire et que le rat est "la seule option possible".

Objectifs

La proportion des personnes âgées (60 ans et plus) est amenée à représenter un tiers de la population française à l’horizon 2050. Cette population est très hétérogène et se caractérise, pour les extrêmes, par des individus en bonne santé, actifs, en bon état nutritionnel, peu sarcopéniques (perte de masse et de fonction musculaire liée à l’âge) et vivant en général chez eux. A l’inverse, il existe (au même âge) une population âgée fortement sarcopénique, généralement dépendante et vivant en institution et en état de sous nutrition chronique. C’est à cette dernière population spécifique que le présent projet s’adresse avec l’objectif de limiter, par une stratégie nutritionnelle (développement d’un aliment fonctionnel), la survenue de la fonte musculaire liée à l’âge généralement associée à l’état de dépendance. Il a été observé, par un des partenaires du projet que certains lactobacilles étaient sur-représentées chez des individus ayant subi une résection de l’intestin. Un transfert de ces bactéries à des rats axéniques a montré une augmentation de l’efficacité d’utilisation de l’énergie et de l’absorption des nutriments alimentaires chez ces animaux, associées à une stimulation de la synthèse des peptides digestifs, une augmentation du trophisme intestinal et une augmentation de l’insulino sensibilité et de l’état nutritionnel des animaux en général. En parallèle, il a également été montré par un des partenaires du projet qu’une amélioration de la santé intestinale pouvait favoriser la redistribution des nutriments énergético-azotés de l’aire splanchnique (intestin/foie) vers les tissus périphériques dont le muscle.

Bénéfices attendus

Nous voulons donc faire la preuve de concept qu’il est possible, par une sélection de bactéries avec des modèles in vitro efficaces et complémentaires (cellules intestinales en culture et C Elegans), de maximiser l’utilisation de l’énergie alimentaire (par une stimulation de l’appétit et de l’efficacité énergétique) afin d’améliorer le statut nutritionnel et l’anabolisme musculaire chez des individus en situation de sous nutrition, en particulier des populations de personnes âgées dépendantes présentant souvent un statut nutritionnel altéré et une fonte musculaire importante. Nous réalisons donc une étude sur une période de 60 jours pour étudier l'impact de notre probiotique sur la masse musculaire (effet long terme) et, sur rats Wistar âgés, une étude plus mécanistique à plus court terme (30 jours) pour évaluer l'impact du probiotique sur la synthèse protéique musculaire (élément explicatif de la fonte musculaire et fortement régulé dans les premières semaines d'altération du statut nutritionnel).

Procédures

- prélèvements de sang sur animaux vigiles pour les tests de tolérance orale au glucose (une fois au début et à la fin de l'expérience pour les animaux de la procédure 2)- Une demande de dérogation a été faite concerant la mise à mort des animaux (tous les animaux de l'étude) car la surdose d'anesthésique modofoe les paramètres biologiques que nous mesurons (notamment le métabolisme énergétique). Par ailleurs, une mise à part par inhalation de CO2, commotion cérébrale ou décapitation ne permettrait pas de réplever le sang nécessaire aux analyses. Nous prélevons donc une grade quantité de sang sous anesthésie gazeuse et la mort survient suite à un arrêt cardiaque lié à l'hypovolémie. La mort de l'animal est vérifiée par absence de battement cardiaque et de respiration. En cas de signes de vie, l'animal subit une dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L'effet de la sous-nutrition des animaux va induire nécessairement une perte de masse globale, de masse maigre et de masse grasse des animaux. Ces composantes, mesurables au cours de l'étude, permettront d'éviter une perte de masse des animaux trop importantes sur une durée courte. les quantités ingérées seront adaptées en cas de perte trop importante de poids des animaux (voir points limites). Les probiotiques utilisés sont des bactéries de familles que l'on retrouve dans des produits laitiers fermentés, il n'y a pas de base scientifique avarée permettant d'imqginer que ces bactéries puissent générer de réponse physiologique ou métabolique délétère chez les rongeurs.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car dans tous les cas des prélèvements de tissus ou de sang sont envisagés pour pesées et mesures ultérieures

Remplacement

Cette étude vise à déterminer comment, par une stratégie nutritionnelle, il est possible de limiter la fonte musculaire liée à l'âge. Cette sarcopénie est une condition physiologique impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples comme la culture de tissus ou de cellules. De plus, les suppléments nutritionnels (probiotiques) apportés sont connus pour avoir des effets directs sur l'intestin mais également un effet indirect sur le métabolisme musculaire. La dimension intégrant la complexité des interactions entre micobiote, tissus et organes est donc importante, ce qui ne se retrouve que chez les animaux vivants. L'utilisation d'animaux (ici rats) est la seule option possible.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupes a été optimisé pour à la fois permettre d'obtenir des données potentiellement significatives mais sans utiliser plus d'animaux que nécessaire (test de chi2 pour estimer le nombre d'individus selon le nombre de ainsi que le nombre de groupes a été limité

Raffinement

Les méthodologies employées lors des mesures réalisées ont été employées afin de pouvoir utiliser les mêmes animaux pour des mesures répétées (analyses de la composition corporelles par Echo-MRI par exemple). Cette mesure, non invasive, permet de voir un effet de traitement sur une composante que l'on peut mesurer plusieurs fois sur le même animal. Par ce biais, on gagne fortement en puissance statistique en limitant la mise à mort des animaux pour des mesures intermédiaires. Elle permet également de préciser le moment le plus pertinent pour réaliser la mise à mort relativement à l'objectif visé (ici un effet sur la masse maigre). Par ailleurs, sur ces analyses en Echo-MRI, nous avons limité le temps de séjour des animaux dans l'appareil afin de limiter le stress des animaux au cours de la mesure. Par ailleurs, les animaux bénéficient d'un environnement enrichi (jouets en Inox). Enfin, les points limites ont été clairement définis : En cas d’apparition d’un point limite (absence toilettage, pilo-érection, posture anormale, porphyrine, hypo-activité, agressivité, trychophaghie, maigreur, vocalises, hypo-réactivité, comportement de fuite, automutilation, tumeur ou perte de poids>20%) l’animalier alertera les responsables de l’étude. Nous effectuerons une observation plus poussée de l’animal. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, il pourra être apporté à l'animal des soins (nettoyage de plaie, prise d’antalgique, d’anti-inflammatoires) ou, si les soins sont inefficaces ou que les soins ne peuvent pas être apportés, les animaux sont euthanasiés par inhalation de CO2. Ci dessous la liste des points limites notables : apparence sans manipulation (manque de toilettage, piloérection, posture anormale, porphyrine), comportement sans manipulation (hypoactivité, agressivité, trychophagie, maigreur, baisse d'ingestion), apprence lors de la manipulation (diarrhées, sang dans les urines ou féces, deshydratation), comportement lors de la manipulation (agressivité, vocalisation, hypo-réactivité, fuite anormale). La liste des points limites graves : mutilation, absence d'ingestion (supérieure à 2j), tumeur, perte de poids supérieure à 20%.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des rats Wistar âgés de 6-8 ou 18-20 mois. Afin d'étudier le métabolisme musculaire et l'effet potentiellement bénéfique de probiotiques chez le sujet adulte ou âgé, nous avons besoin d'un modèle animal dont le métabolisme soit proche de l'homme, dont la durée de vie est limitée afin d'avoir rapidement des animaux âgés et de taille raisonnable. Le rat est l'animal le plus approprié. De plus nous avons déjà fait des études du métabolisme musculaire en situations cataboliques chez le rat Wistar au laboratoire (Mercier et al, 2002; Magne et al, 2012). L'utilisation du rat Wistar adulte et âgé dans cette étude nous permettra de comparer les données par rapport à des études précédentes. Animaux adultes ayant fini leur croissance : adultes jeunes (6-8 mois) et animaux âgés (18-20 mois) couramment utilisés dans l'ensemble des études sur le vieillissement dans le laboratoire (Dardevet et al, 2012).

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une injection d'azoxyméthane déclenchant une cancérogenèse du côlon, suivie cent jours plus tard d'un jeûne de seize heures, d'un gavage et d'une prise de sang sous anesthésie, avant la mise à mort et le prélèvement du côlon. Il indique que les interventions peuvent provoquer du stress mais "pas de douleur" et que les lésions précancéreuses restent indolores. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune étude in vitro ne reproduit l'ensemble du développement d'un cancer colique.

Objectifs

Le contrôle de la perméabilité intestinale joue un rôle crucial dans le maintien d’une intégrité fonctionnelle et protectrice de l’intestin, face à de nombreux intrants alimentaires ou toxiques et face au contact permanent entre le microbiome et le tube digestif. De nombreux cas de fragilité ou de pathologies intestinales ont été associés à une augmentation de la perméabilité intestinale qui peut être observée de façon transitoire ou permanente. Cette perméabilité augmentée a été largement observée suite à des situations de stress, d’inflammations ou de cancers colorectaux (CRC) mais sa contribution dans la genèse ou l’entretien de pathologies intestinales reste à préciser. Ce projet étudiera la perméabilité intestinale de façon globale, in vivo mais aussi ex vivo sur des côlons prélevés post mortem, en comparant des rats mâles témoins à des rats dont la cancérogénèse colorectale a été chimio-induite 100 jours plus tôt par une injection d’azoxyméthane. Chez ces animaux traités, des lésions prénéoplasiques indolores se seront développées dans les côlons sans aller jusqu’au stade tumoral et sont de bons marqueurs de cancérogenèse qui sont largement acceptés par la communauté scientifique. Ces lésions seront dénombrées après mise à mort des animaux et la perméabilité intestinale sera détectée in vitro. Nous chercherons notamment à préciser en précisant l’abondance des zones perméables et leur proximité avec des lésions précancéreuses.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de préciser, notamment sur les côlons prélevés post mortem, où se situent les zones perméables du côlon et leur proximité des zones prénéoplasiques afin de mieux comprendre en quoi la perméabilité intestinale peut participer au processus de cancérisation du colon. La comparaison de la structure des côlons sains par rapport à celle des rats chimio-induits nous permettra d’identifier les lésions prénéoplasiques et de potentielles différences de perméabilité intestinale dans les zones saines ou précancéreuses.

Procédures

Sur une durée d’expérience de 100 jours, les rats vigiles seront soumis à J0 à une injection intrapéritonéale d’AOM, à J90 à une mise à jeun, avec accès libre à l'eau de boisson, puis gavage au FD4 et prélèvement de sang à la queue sous anesthésie à l'isoflurane, à J100 mise à mort sous anesthésie, par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Seules quelques interventions sur les animaux seront effectuées pouvant provoquer un peu de stress mais pas de douleur. A J0, 12 rats recevront une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane (AOM) dilué dans du sérum physiologique sera effectué par une personne qualifiée, afin de réduire la douleur et le stress de l’animal. A J90, le gavage de FD4 sera effectué par un utilisateur expérimenté ainsi que la prise de sang qui sera effectuée sur animaux anesthésiés à l'isoflurane. Le jeûne de 16h, avant l’administration orale est long mais nécessaire pour vider le côlon de ses fèces et le rendre ainsi accessible au FD4. Avant cette expérience les animaux auront été habitués à la contention et au gavage pendant quelques jours pour diminuer leur ressenti de stress.

Devenir

Tous les animaux seront anesthésiés et mis à mort à la fin de l’expérimentation (J100 après injection d’azoxyméthane) et leur côlon sera prélevé.

Remplacement

Aucune étude in vitro ne permet d’évaluer l’ensemble des étapes de développement des cancers, au niveau de l’écosystème colique. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité physiologique du côlon, dans les différentes étapes de son fonctionnement et du développement de foyers cancéreux qui sont influencés par la consommation alimentaire, la formation de composés toxiques, le microbiote et qui sont en permanence régulés par les systèmes immunitaires, sanguins et nerveux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum (12 rats témoins et 12 rats traités à l’AOM) pour obtenir des résultats statistiquement solides et fiables dans l’appréciation de la relation entre l’installation de foyer prénéoplasiques dans le côlon et des modifications potentielles de la perméabilité intestinale.

Raffinement

Les rats seront maintenus à 2 par cage qui sera transparente pour ne pas souffrir d’isolement et dans laquelle un tunnel pour s'abriter sera ajouté pour raffinement. La température et l’hygrométrie seront maintenues constantes avec un cycle constant de lumière et obscurité de 12h chacune, un accès illimité à la nourriture et à l’eau et un change de litière hebdomadaire, pour leur confort. Les interventions sur les animaux (contention, injection d’AOM et gavage au FD4) seront réalisées par des techniciens expérimentés et après une habituation des rats, afin de limiter leur stress. La prise de sang sera effectuée sous anesthésie brève à l’isoflurane.

Choix des espèces

Le traitement de rats de la souche F344 à l’AOM induit dans leur côlon des carcinomes qui sont similaires aux carcinomes coliques humains sur de nombreux aspects comme la formation de foyers de cryptes aberrantes (ACF pour aberrant crypt foci) qui sont des lésions prénéoplasiques. Ces lésions sont précurseurs des adénomes ou carcinomes coliques chez l’homme et, chez le rat, permettent d’étudier la raison de la genèse des cancers colorectaux et de développer des thérapies préventives ou curatives. Rats adultes L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes. Ce projet vise à compléter les études précédentes des stratégies préventives sur le rôle du fer héminique dans l’effet promoteur de la cancérogenèse colorectale, il est important de rester au même stade de développement.