Système gastrointestinal

416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.

Objectifs

Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.

Bénéfices attendus

L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).

Impact sur les animaux

D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.

Remplacement

Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque porc subit une chirurgie de deux heures pour la pose d'une canule dans l'intestin et d'un cathéter veineux, qu'il garde vingt-trois jours en cage individuelle, avec un risque d'infection et de plaies. Le porteur teste la valeur nutritionnelle de trois protéines issues de coproduits carnés en vue de leur usage en alimentation humaine. Il tue les animaux à l'issue au motif que la canule les rend inutilisables et impossibles à placer.

Objectifs

Etudier in vivo chez le porc en croissance la qualité nutritionnelle des protéines issus de co-produits carnés en évaluant la digestibilité standardisée et la cinétique de mise à disposition des acides aminés plasmatiques, afin de développer l’utilisation de ces ingrédients en alimentation humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer in vivo chez le porc en croissance la valeur nutritionnelle de trois ingrédients protéiques, afin de développer l’utilisation de ces ingrédients en alimentation humaine. Les trois ingrédients protéiques que nous étudions dans le cadre de ce projet sont actuellement une source non exploitée en alimentation humaine, bien qu’ils soient tout à fait conformes à la réglementation en la matière. Afin de favoriser leur utilisation en alimentation humaine, notamment pour l’enrichissement protéique, il est nécessaire au préalable d’évaluer leur qualité nutritionnelle. Cela permettra de les positionner par rapport à d’autres sources protéiques telles que les protéines de lait ou de soja, pour lesquelles des données sont disponibles dans la littérature. La valorisation de coproduits tels que ceux étudiés dans ce projet est une des voies permettant de limiter l’impact environnemental des productions agricoles et d’augmenter les ressources protéiques de bonne qualité nutritionnelle.

Procédures

Tous les animaux (n=10) subiront une opération chirurgicale d’environ 2 h sous anesthésie générale afin de leur poser une canule au niveau iléal et un cathéter veineux qu’ils garderont tout au long de l’étude (soit pendant 23 jours). Le cathéter et la canule sont nécessaires pour réaliser des prélèvements sanguins et digestifs sur une période de 9h après l’ingestion des repas, tout en limitant les interventions sur les animaux. Une attention particulière sera portée à la surveillance de l'état de santé des animaux pour limiter les effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter lors de la chirurgie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront isolés individuellement dans des cages ce qui limitera leur interaction sociale. Cependant, la distanciation sociale sera réduite, car les contacts visuels, auditifs, olfactifs seront maintenus entre les animaux. De plus, les animaux sont susceptibles de subir des effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter lors de la chirurgie, tels que des infections, des plaies, blessures, inflammation, fièvre, diarrhées, sorties de cathéter et/ou de canule. Une attention particulière sur la surveillance de l'état de santé des animaux sera réalisée via le protocole chirurgical établi.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans le cadre d’autres protocoles expérimentaux, ni placés, du fait de la pose de canules maintenues sur une longue durée (23 jours). L’euthanasie à l’issue de l’expérimentation sera donc réalisée dans l’intérêt des animaux, dans des conditions permettant de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Le projet s’intéressant à des réponses biologiques, l’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable. En effet, les modèles de digestion in vitro ne permettent pas à ce jour de reproduire à l’identique la complexité physiologique du vivant. Les mesures et indicateurs qui en sont extraits ne peuvent donc pas établir de manière certaine et indiscutable la qualité nutritionnelle des protéines alimentaires. Le porc en croissance a été choisi de par sa proximité physiologique avec l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude (n=10) a été choisi de manière à avoir suffisamment de puissance statistique pour évaluer la qualité nutritionnelle des aliments protéiques. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un plan randomisé (carré latin ajusté) sera appliqué, dans lequel chaque animal sera son propre contrôle. Ainsi, chaque animal testera les trois repas test et un repas non-protéique.

Raffinement

Les compétences et expériences des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Une attention particulière sera accordée à la gestion de la douleur pendant toute la durée de l’expérimentation. Les porcs pourront avoir un contact olfactif, sonore et visuel avec leurs congénères. Des observations quotidiennes de l’état de santé général des animaux seront réalisées tout au long de l’expérimentation. Les cages seront régulièrement enrichies par des objets de nature variable (jouets en plastique, tapis).

Choix des espèces

Le modèle « porc en croissance » est actuellement celui validé pour la mesure de la digestibilité iléale standardisée des acides aminés (AA). C’est donc ce modèle que nous proposons d’utiliser pour évaluer de manière aussi réaliste que possible la qualité nutritionnelle des trois ingrédients protéiques testés. La validité de ce modèle en substitution des études chez l’Homme est confirmée d’après un corpus d’études relativement nombreuses et concordantes.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des médicaments deux fois par semaine pendant sept à neuf semaines, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur teste une trithérapie contre l'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, et prévoit de répéter voire de refaire l'ensemble de l'étude, ce qui porte l'effectif à 280. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence par chimiothérapie est inefficace dans 20 % des cas. Nos données en laboratoire montrent que l’action combinée de 2 drogues en sus de cette chimiothérapie de réfèrence permet d’éliminer très efficacement les cellules tumorales du foie en laboratoire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de cette trithérapie chez l’animal. Ces travaux de recherche nous permettrons aussi d’étudier pourquoi certaines drogues sont efficaces et pas d’autres et comment les cellules tumorales arrivent à résister à chacune de ces drogues lorsqu’elles sont utilisées seules. En effet, ces informations sont cruciales pour comprendre comment fonctionnent ces molécules et quelles propriétés les rendent efficaces. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du foie chez l’enfant permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, en particulier ceux en rechute ou en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de ces trois médicaments bloque la formation de tumeur d’hépatoblastome chez la souris plus efficacement que chaque drogue utilisée seule ou combinée deux à deux.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en sous-cutanée sur 280 animaux. Suivi des animaux pendant 7 à 9 semaines. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur au pied à coulisse 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sur les animaux sont l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée et la pousse de la tumeur pendant plusieurs semaines.

Devenir

Les 280 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). Le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence interlots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si la dose d’utilisation d’une des drogues doit être réajusté, l’étude sera refaite une fois. Nous prévoyons d’utiliser 280 souris dans ce projet du fait que nous avons 7 groupes de 10 souris (7 conditions de traitements), que l’expérience sera refaite deux fois et que l’étude globale sera refaite une fois si la dose d’une drogue doit être réajustée. Nous allons bien sûr tout faire pour que les doses choisies des trois drogues soient les bonnes dès la première série d’analyses et que l’étude ne soit pas refaite, ce qui aurait comme conséquence une réduction de moitié du nombre de souris.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux définis par un chercheur référent en 1998. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément à la directive européenne 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures.

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.

1 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les lots, elles subissent une à trois chirurgies, chirurgie stéréotaxique, injection virale et vagotomie, puis portent des fibres optiques ou un cathéter gastrique pour des tests de comportement et de métabolisme. Le porteur indique des douleurs et infections postopératoires possibles et un stress lié aux dispositifs, et précise que tous les animaux sont mis à mort pour prélever des tissus. Il affirme que les expériences ne peuvent se faire in vitro car il a "besoin" d'observer une physiologie intégrée, et que les invertébrés n'ont pas les structures équivalentes aux mammifères.

Objectifs

La régulation de la prise alimentaire repose sur la balance entre besoins énergétiques et la valeur renforçatrice de la nourriture. Cette régulation résulte de l'intégration dynamique de plusieurs signaux qui façonnent collectivement les stratégies adaptatives pour le maintien de l'apport calorique et du poids corporel. Cependant, notre environnement alimentaire moderne fait évoluer les ajustements physiologiques vers des dysfonctionnements de la récompense et du métabolisme qui peuvent conduire au syndrome métabolique (obésité). Les composantes de la prise alimentaire (énergie et récompense) ont été souvent décrites et étudiées en termes de régulation par le cerveau. Cependant, dans les dernières années l’axe vagal (intestin-cerveau) a émergé comme un régulateur clé de la prise alimentaire en modulant à la fois le métabolisme énergétique et les processus de récompense. Le nerf vague représente un relai neuronal capable d’assurer le transfer de l’information intéroceptive entre les organes périphériques et le cerveau. Malgré ce rôle critique, les mécanismes sous-jacents à cette régulation en conditions physiologiques et/ou pathologiques (obésité) restent largement inconnus. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de l’axe vagal dans les processus de récompense et de métabolisme énergétique. Le projet est construit autour de 4 objectifs principaux. 1. Étudier la plasticité structurale et neuronale des neurones du système de la récompense suite à vagotomie. 2. Établir le rôle des afférences vagales intestin-cerveau dans les réponses adaptatives du circuit de récompense dans l'obésité : de l'alimentation à la détection des nutriments. 3. Interroger l'axe vagal intestin-cerveau pour restaurer les fonctions hédoniques et métaboliques 4. Explorer la signature moléculaire des neurones vagaux pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'obésité

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. En fait, à ce jour, les approches thérapeutiques les plus durables de l'obésité et des dysfonctionnements qui lui sont liés sont représentées par les chirurgies bariatriques, très efficaces mais extrêmement invasives et dangereuses, dont les mécanismes d'action restent largement inexplorés. Le développement récent de technologies de pointe et l'émergence de concepts révolutionnaires dans le domaine de la physiologie intégrative, comme le propose le projet, vont certainement élargir notre quête de connaissances et de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 5 lots à une chirurgie d'injection virale (environ 1h), puis après une période de repos de 3 semaines minimum, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles (175ul, 35ul et 35ul sur 3j à interval d'une semaine) seront fait sur deux de ces lots. -pour 4 lots à deux chirurgies (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, ou stéréotaxie 30min et après 15j de repos une vagotomie 40min), puis après une nouvelle période de repos de 15j, à des tests de comportements. -pour 1 lot à trois chirurgies qui se feront en deux fois pour le bien être de la souris (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, puis après 15j de repos une vagotomie 40min). Puis après une période de repos de 15 jours à nouveau, il seront soumis à des tests de comportements.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures il peut y avoir des douleurs ou infections post opératoires qui seront traitées par analgésie et antibiothérapie si nécessaire. Pour les procédures 1-2-3, le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement. De même pour les animaux portant un cathéter gastrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Oui selon le dessin expérimentale et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons les tests suivant: Student T Test ; One-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; Two-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; régression linéaire. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux sont bien en place.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages de tamoxifène pour inactiver un gène, subissent plusieurs tests métaboliques avec injections répétées de glucose et d'insuline, une partie étant soumise à un régime riche en graisses, avant une anesthésie sublétale suivie d'exsanguination. Une perte de poids progressive est attendue du fait de la destruction des cellules intestinales visées. Le porteur affirme que ces processus "n'existent que dans l'organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris génétiquement modifiée.

Objectifs

La digestion, la glycémie, et l’appétit sont régulés par différentes hormones (telles que l'insuline pancréatique), produites par les cellules endocrines présentes dans le pancréas et l’intestin. Des pathologies sévères telles que diabète, obésité et malabsorption intestinale sont associées à des altérations des cellules endocrines. Notre laboratoire s’intéresse aux mécanismes responsables du développement des cellules endocrines pancréatiques et intestinales, afin de comprendre comment ces cellules très hétérogènes sont produites, en particulier dans l’intestin (où elles sont appelées cellules entéroendocrines (CEE)), et comment elles sont capables d’assurer leurs fonctions tout au long de la vie. Malgré leur grande diversité, les cellules endocrines sont toutes issues de cellules dites progénitrices qui expriment un gène spécifique commun. L’absence d’expression de ce gène dans l’intestin au cours du développement entraine une perte de l’ensemble des CEE et par conséquent de toutes les hormones qu’elles produisent, provoquant une malabsorption intestinale et des diarrhées chroniques. Ces altérations engendrent des atteintes très sévères chez l’Homme et entrainent une létalité périnatale dans des modèles murins, empêchant l’étude à des stades tardifs, lorsque l’intestin est pleinement fonctionnel. Les cellules de l'épithélium intestinal, y compris les CEE, sont continuellement renouvelées (tous les 3-4 jours chez l'Homme) durant toute la vie. Afin d'étudier le rôle des CEE et des hormones intestinales dans l’intestin mature au cours de ces processus et d'éviter la létalité périnatale, nous avons développé un modèle de souris où l’on peut induire, suite à l’administration d’une drogue (le tamoxifène), l’inactivation du gène responsable de la formation des CEE dans l’intestin. Dans ce projet, nous souhaitons induire l’inactivation de ce gène chez l’adulte afin de définir l’impact de la perte des CEE sur le métabolisme énergétique (en particulier la régulation de la glycémie) et l’absorption des nutriments, et de suivre les éventuelles conséquences sur la flore intestinale. Nous souhaitons également évaluer le rôle de l’alimentation sur le développement des CEE. Dans ce but, l’ensemble des analyses (métabolisme, flore intestinale) sera réalisé à la fois en présence d’une alimentation standard et d’une alimentation riche en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des CEE chez l'adulte, notamment dans le contrôle de la digestion, de l'homéostasie intestinale, du métabolisme glucidique et du microbiote intestinal. A long terme, ces données pourraient permettre d'améliorer la prise en charge des patients souffrant d'anendocrinose entérique, qui est une pathologie caractérisée par l'absence de CEE.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à : - 3 gavages de drogue (tamoxifène) par animal sur 5 jours (1 par jour à J0, J2, J4) (1min/gavage) - 1 gavage de glucose par animal (1min/gavage) avec suivi de la glycémie (à 0, 5, 15, 30, 60, 120min) et de l'insulinémie (à 0, 15 et 30min) par prélèvement sanguin au niveau de la queue (qlq secondes) - 1 injection intrapéritonéale de glucose (1min) par animal avec suivi de la glycémie (à 0, 5, 15, 30, 60, 120min) et de l'insulinémie (à 0, 15 et 30min) par prélèvement sanguin au niveau de la queue (quelques secondes) - 1 injection intrapéritonéale d'insuline par animal (1min) avec suivi de la glycémie (à 0, 15, 30, 60, 120min) (quelques secondes) - 2 injections intrapéritonéales de molécules (1min / injection, 22h entre les deux injections) permettant l'évaluation de la division des cellules de l'épithélium intestinal - 1 injection intrapéritonéale (1min) de produits anesthésiants.

Impact sur les animaux

Une perte de poids progressive est attendue suite à la perte des cellules entéroendocrines. Des procédures sont réalisées successivement sur les animaux : 3 gavages de tamoxifène (1/jour à J0, J2, J4), 1 gavage de glucose, 1 injection intrapéritonéale de glucose, 1 injection intrapéritonéale d'insuline, 2 injections intrapéritonéales de marqueurs de prolifération cellulaire (à 22h d'intervalle) et 1 injection intrapéritonéale d'anesthésiants. En plus de ces procédures, le groupe B est soumis à un régime riche en graisses depuis le sevrage. Outre le stress causé par les procédures, nous n'attendons pas d'effets indésirables particuliers.

Devenir

- Groupes A et B : A l'issue de la PE1 : les animaux seront réutilisés pour les PE 2 à 6 succesivement. La PE6 (anesthésie sublétale) est suivie d'un prélèvement sanguin intracardiaque (exsanguination) et d'un prélèvement d'organes (intestins, pancréas, foie). Les tissus prélevés seront utilisés pour des analyses histologiques et de biologie moléculaire. Le sang prélevé en intracardiaques sera utilisés pour réalisés des analyses biochimiques (glucose, cholestérol, ...). - Groupe B : A l'issue de la PE7 (groupes B) : les animaux seront réutilisés pour les PE 1 à 6 successivement et mis à mort lors de la PE6. Pour plus de détails voir point mentionnée ci-dessus. - Groupe C : Tous les animaux sont mis à mort (inhalation de CO2 ou dislocation cervicale) après la PE1 pour dissection.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer comment les cellules endocrines intestinales, sécrétrices d'hormones, sont générées dans l'intestin adulte et comment ces cellules sont capables de contrôler le métabolisme énergétique, l'absorption intestinale et la flore intetsinale. L'ensemble de ces processus nécessite non seulement des régulations au sein du tissu mais également des communications inter-organes et avec l'environnement, qui n'existent que dans l'organisme entier. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt uniquement dans les cellules étudiées. Par ailleurs, des études antérieures ont révélé que les mutations du gène d'intérêt (Ngn3) chez la souris entrainent des pathologies très proches de celles observées chez l'Homme.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans cette étude a été calculé en tenant compte notamment de la variabilité inter- individus (élevée dans le cas de tests métaboliques) mais également pour l’application de tests statistiques adéquats (tels que le t-test ou le test non paramétrique de Mann Whitney). La répétition des études sera jugée nécessaire uniquement si les résultats d'une expérience ne peuvent être correctement interprétés (nombre de points mesurés trop faible).

Raffinement

Les procédures expérimentales seront réalisées par un personnel compétent effectuant couramment les différentes procédures et respectant l’ensemble des règles relatives au bien-être animal, limitant ainsi au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, les animaux seront maintenus dans des cages incluant litière et enrichissement. En outre, des phases de repos de 15 jours seront respectées entre les différents tests métaboliques. Les procédures mises en oeuvre impliquent un suivi régulier, notamment une pesée hebdomadaire; en cas de souffrance d'un animal, l'avis du vétérinaire sera demandé.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement manipulées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt uniquement dans les cellules étudiées. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 8 et 30 semaines), l'invalidation du gène d'intérêt, Ngn3, dans l'intestin au cours du développement étant létale dans la période périnatale. Le modèle murin utilisé permet de contrôler l'invalidation du gène d'intérêt, qui ne se produit qu'après traitement au tamoxifène.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent dès le quatorzième jour de vie l'injection d'un carcinogène chimique, puis subissent un régime induisant une forte prise de poids, des prélèvements sanguins réguliers et un développement tumoral du foie pouvant provoquer amaigrissement et altération de l'état général. Les retombées annoncées pour les patients, de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" car il constitue selon lui le "seul modèle préclinique" permettant de modifier l'expression des gènes de façon ciblée.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour élucider la pathogénie sous-jacente de la maladie. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations génétiques, métaboliques et inflammatoires favorisant un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte, cellule majoritaire du foie. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique.

Bénéfices attendus

Les résultats de notre projet permettront de déterminer les mécanismes par lesquels l’hépatocyte assure le maintien de l'intégrité du génome, et en particulier lors des maladies métaboliques et inflammatoires du foie conduisant au développement d’un cancer du foie. Les retombées de nos travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié. Une injection intra-péritonéale de tamoxifène sera réalisée (une fois, à 6 ou 7 semaines de vie suivant le lot expérimental, durée 30 secondes) sur animal vigile. Un prélèvement sanguin au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière bi-mensuelle (16 répétitions, entre le 4ème et 12ème mois de régime, durée 30 secondes-1 minute). Une injection intra-péritonéale de Diethyl-nitrosamine (carcinogène chimique) sera réalisée (une fois, à 14 jours de vie, durée 30 secondes) sur animal vigile. Une injection intra-veineuse (veine de la queue) sera réalisée (une fois, à 6 semaines de vie, durée 5-7 secondes) sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Du par le régime alimentaire auquel seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Du fait de l’injection IV par la veine caudale, une douleur transitoire dans cette région pourra être ressentie. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général (asthénie, perte de poids...).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux (2240).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les processus de carcinogenèse du foie.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet, 2240 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection intra-orbitaire) sera précédée d’une courte anesthésie générale (mélange gazeux d'O2-Isofluorane [0.5-2.5%]). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées dans ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.