Système gastrointestinal

930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies avec pose de fibres optiques et de cathéter gastrique, puis des tests de comportement, de métabolisme du glucose et de calorimétrie, pour étudier le rôle d'une structure du cerveau dans la régulation de l'appétit. Le porteur indique que le port des fibres et du cathéter induit un stress initial et une mobilité réduite, et qu'une fuite gastrique entraîne la mise à mort immédiate. Il affirme que l'étude, fondée sur la physiologie intégrée, ne peut être menée in vitro ni sur des invertébrés.

Objectifs

La régulation de l’homéostasie énergétique est un processus physiologique capitale et extrêmement conservé. Le contrôle de cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer de multiples signaux indiquant les états nutritionnels/énergétiques de l'organisme, et à mettre en place des réponses appropriées. Les dysfonctionnements de ce contrôle peuvent conduire à une pléthore de troubles alimentaires (surpoids, obésité). Même si l'hypothalamus a été désigné comme le régulateur principal de l'équilibre énergétique, d'autres circuits ont été récemment identifiés. Parmi les structures extra-hypothalamiques, le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) apparaît comme un centre critique car il joue un rôle essentiel dans le relais bidirectionnel des informations du tronc cérébral vers des structures telles que l'amygdale, le striatum ventral, le cortex préfrontal et l'hypothalamus. Le PVT est principalement composé de neurones glutamatergiques. Un nombre croissant d’évidences indique un rôle clé des neurones PVT dans le contrôle des comportements liés à la nourriture. Cependant, ces études se sont principalement concentrées sur l'alimentation sans tenir compte des composantes énergétiques et métaboliques de ce comportement complexe ni de l'hétérogénéité des types cellulaires des neurones PVT. Il est intéressant de noter qu'une sous-population neuronale du PVT exprime les récepteurs D2 de la dopamine, fournissant un outil pour discriminer les sous-types cellulaires du PVT. On ignore encore si et comment les neurones exprimant les D2R peuvent moduler les adaptations homéostatiques, l'équilibre énergétique et les comportements liés à la prise alimentaire. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer la contribution des neurones PVTD2R dans la régulation de la prise alimentaire et le métabolisme énergétique. 2. Étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones PVTD2R 3. Étudier le rôle des projections des neurones PVTD2R 4. Comprendre la dynamique de l’activité des neurones PVTD2R

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. La prise alimentaire et la régulation de l’homéostasie énergétique ont souvent été étudiées sous l’angle d’une implication et dysfonctionnement de l’hypothalamus. Cependant, d’autres structures extra-hypothalamiques jouent aussi un rôle clé dans ces processus. Nos résultats préliminaires indiquent que le noyau paraventriculaire du thalamus PVT aurait un rôle central dans la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique. Le projet ThalHOME vise à établir un nouveau cadre conceptuel qui voit dans les neurones D2R du PVT une population centrale pour la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques sous-jacents au développement du syndrome métabolique. Nous sommes convaincus que la mise en lumière des aspects intégratifs de la physiopathologie du PVT dans la surconsommation alimentaire sera essentielle pour élaborer et accélérer les stratégies préventives et thérapeutiques. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ThalHOME pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 7 lots à une chirurgie (1j), puis après une période de repos, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots. -pour 2 lots à deux chirurgies qui se feront en une ou deux fois en fonction du bien être de la souris et de sa capacité à supporter une anesthésie longue. Si cela doit se faire en deux fois les souris auront une phase de repos de 10-15j minimum avant la deuxième anesthésie. Après une période de repos de deux semaines minimum, les lots seront soumis à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur un de ces deux lots.

Impact sur les animaux

Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress; de même pour le cathéter gastrique. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres/cathéters étant légèrs, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrements et de perfusions. Le cathéter peut également se déloger de l'estomac, se qui provoque une fuite gastrique en intrapéritonéale. L'animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests nonparamétriques.

Raffinement

Le soin apporté aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fistule digestive est créée par chirurgie, puis deux injections locales de mitochondries et des imageries sont réalisées avant la mise à mort au 45e jour, pour tester une transplantation de mitochondries sur la cicatrisation. Le porteur indique des risques de douleur post-opératoire, d'infection, de déshydratation, de perte de poids et de décès. Il affirme qu'aucun modèle ex vivo ne reproduit la dynamique de cicatrisation des fistules et que le modèle rat vivant ne peut être remplacé.

Objectifs

Une fistule digestive est une communication anormale entre un organe digestif (l'estomac par exemple) et la peau. L’origine des fistules digestives est postopératoire dans plus de ¾ des cas. Dans la chirurgie de l'estomac, la fistule postopératoire, en rapport avec un défaut de cicatrisation de la suture réalisée (anastomose), est une complication fréquente (10-30%) et potentiellement grave, source d’infections, d’allongement de durée d’hospitalisation voire de décès. Le traitement actuel consiste essentiellement en des procédures invasives de drainage par voie endoscopique, radiologique ou chirurgicale, plus ou moins combinées et répétées. Il s’agit donc d’un enjeu de recherche majeur pour apporter de nouvelles alternatives moins invasives dans la gestion de cette complication. Des travaux récents ont montré l’impact des dysfonctions des mitochondries dans de nombreuses maladies comme les infarctus du myocarde ou les maladies dégénératives. Pour contrer ces effets, des méthodes de transplantation de mitochondries sont en cours de développement avec des résultats prometteurs au niveau cardiaque, neurologique, cutané… mais aucune donnée n’est disponible sur le traitement des fistules digestives. Ce transfert mitochondrial peut réduire l’inflammation locale et booster le métabolisme énergétique au sein du tissu endommagé. Ces actions sont par ailleurs nécessaires au processus de cicatrisation d’une fistule digestive. Les travaux récents dans notre unité ont évalué les effets anti-inflammatoires et pro-cicatrisants de nouvelles thérapeutiques dérivées de cellules souches (vésicules extracellulaires) sur ces modèles de fistules digestives. Cette thérapie dite sub-cellulaire utilise le même type de propriétés que la transplantation mitochondriale justifiant ainsi notre travail. Les objectifs de ce projet seront : 1/ de reproduire/développer un modèle de fistules après chirurgie oeso-gastrique chez le rat, 2/ d’évaluer l’efficacité de la transplantation mitochondriale pour améliorer la cicatrisation des fistules post-chirurgicales.

Bénéfices attendus

La thérapie par mitochondrie est une nouvelle thérapeutique dans l'arsenal de la médecine régénérative. Ses effets sont reconnus dans différentes pathologies comme les maladies dégénératives et les processus d'ischémie-reperfusion mais n'ont jamais été utilisés dans le traitement des fistules digestives jusqu'à présent. Nos précédents travaux ont montré des résultats encourageants concernant la thérapie à base de vésicules extracellulaires dans la cicatrisation des fistules digestives, qui est un traitement apparenté à la transplantation mitochondriale dans le cadre des thérapies sub cellulaires. L'application et la mise en place d'une étude pilote chez l'homme pourra se justifier et sera valorisée par une étude expérimentale animale dans cette indication.

Procédures

Une procédure unique est réalisée pour tous les animaux avec différentes phases. La première phase comprend une intervention chirurgicale, sous anesthésie générale, avec la création du modèle de type fistule digestive. Cette intervention dure 30 minutes. Deux injections locales (dans la zone de fistule) de traitement sont réalisés à J14 et J21 sur les animaux vigiles sont réalisées, sans douleur particulière pour le rat. L'évaluation de la cicatrisation est également effectuée à J14 et J21, sous une courte anesthésie gazeuse (quelques minutes). Aucun prélèvement n'est effectué pendant la durée de l'expérimentation. La dernière phase de la procédure à J45 comprend une étude morphologique par imagerie, sous anesthésie générale (environ 45 minutes), avant la mise à mort de l'animal puis le prélèvement de la zone de fistule pour l'étude histologique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels sont la douleur post-opératoire, le risque infectieux pour les risques immédiats. De manière plus retardée, peuvent apparaître, la déshydratation, la perte de poids et le décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure (J45), sous anesthésie générale, avant les prélèvements de la zone à étudier.

Remplacement

Après avoir validé "in vitro" les caractéristiques du produit (mitochondries), il convient de vérifier ses propritétés et effets régénérants "in vivo" avant le transfert chez l'homme. Le modèle rat vivant est le modèle permettant une transposition la plus proche et simple des fistules digestives. A ce jour, le modèle animal vivant ne peut être remplacé, car il n'existe pas de modèle ex-vivo permettant de reproduire la dynamique des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la cicatrisation des fistules.

Réduction

Après la validation in vitro et afin d'obtenir des différences significatives pour apporter de la puissance à nos résultats, un nombre minimal de 10 animaux analysables par groupe est nécessaire. En prenant l'hypothèse d'une cicatrisation de 20% dans le groupe contrôle et l'hypothèse de 65% de cicatrisation dans le groupe de traitement, nous aurons besoin de 10 animaux par groupe pour un risque alpha de 5% et une puissance de 90%. 30 animaux évaluables sont nécessaires pour l'évaluation de ce traitement. Une analyse intermédiaire de futilité (taux de cicatrisation

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées par une personne habilitée. Le zootechnicien sera en charge de l'animal avant le début des procédures puis le responsable du projet prend le relai à partir du début de la procédure expérimentale. Pour éviter toute souffrance animale, les différentes phases seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Lors du suivi, une grille d’évaluation des points limites sera utilisée afin d'anticiper toute souffrance animale excessive. Une grille de scoring de l'état général de 0 à 3 par variable sera établie prenant en compte l'apparence, le poids, le comportement spontané et provoqué. Les rats seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de la procédure. Dans le cas où le traitement serait à l'origine de douleurs visibles non soulagées par les antalgiques, de détresse ou de difficulté d'alimentation importante, le traitement sera interrompu et, si nécessaire, la mise à mort de l’animal sera anticipée. Il s’agit de la première étude qui évalue l’impact du traitement par mitochondries dans la cicatrisation des fistules digestives postopératoires. Cette étude animale justifiera l’application humaine par la suite.

Choix des espèces

Les animaux choisis sont des rats Wistar femelles. Le rat Wistar est un modèle expérimental idéal par ses caractéristiques: - l'anatomie digestive est proche de celle de l’Homme, il est donc possible de mimer la pathologie humaine - les modèles de fistules digestives sont validés par de nombreuses publications et sont considérés comme de bons modèles précliniques - L'expertise de l’équipe des zootechniciens et des chercheurs sur la prise en charge des rats - L'accessibilité, la fiabilité et la disponibilité de l'animal Des rats Wistar de 7-11 semaines sont utilisées car la taille et les mensurations sont adaptées aux manipulations expérimentales et permettent un séjour en captivité respectant la réglementation en vigueur.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage forcé unique et jusqu'à cinq prélèvements sanguins, puis sont mises à mort pour des analyses histologiques, afin de tester la toxicité et la pharmacocinétique de composés antipaludiques. Le porteur indique que le gavage cause un stress transitoire et un risque de fausse route, l'effet réel des molécules restant imprévisible. Il affirme qu'un test sur "organisme entier" est "nécessaire", les cultures cellulaires ne détectant pas la toxicité des organes.

Objectifs

Le paludisme, dû au parasite Plasmodium falciparum, est la première cause de mortalité parasitaire dans le monde. Les traitements actuels à base d'artémisinine font face à des échecs suite au développement de résistances, de sorte que de nouveaux traitements basés sur de nouvelles cibles du parasite sont nécessaires afin de contenir le risque de dispersion des résistances. Ces dernières années, la famille des quinazolines a été identifiée parmi les nouvelles entités chimiques démontrant des propriétés antiplasmodiales prometteuses. Le projet global financé par l'ANR concerne la synthèse et l'évaluation anti-paludique de composés originaux de cette famille. Le projet d'expérimentation animale décrit ici concerne une étude de la toxicité aiguë éventuelle des composés identifiés comme ayant les meilleures activités lors de tests in vitro. Cela permettra de déterminera si les composés testés peuvent poursuivre un développement pré-clinique, puis clinique plus poussé.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point de nouveaux antipaludiques. Il permettra de déterminer si les produits étudiés (dont l'activité antipaludique in vitro est démontrée) peuvent être administrés par voie orale sans toxicité particulière, et avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles avec le développement d'un principe actif. En cas de réponse positive, cela permettrait ultérieurement de pouruivre le développement de ces molécules, à commencer par un test d'efficacité chez la souris infectée par le parasite Plasmodium. Le but final étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l'efficacité des médiaments existant actuellement décroit rapidement.

Procédures

Le animaux seront soumis à un acte de gavage forcé, une fois. Ils seront également soumis à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles u sous anesthésie, une fois pour 50% des animaux, trois fois pour 17% des animaux, et 5 fois pour les 33% restants. Tous les actes ont une durée inférieure à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Le but est précisément de déterminer l'effet de composés potentiellement antipaludique sur l'organisme. Ces molécules étant nouvelles, et bien que les tests de toxicité in vitro aient été effectués, nous ne pouvons prévoir le réel effet à l'echelle de l'organisme entier. Néanmoins, l'administration par gavage en elle-même cause un stress transitoire à l'animal, et un risque de "fausse route" ne peut être totalment exclu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort : en effet, des analyses histologiques sur organe prélevés doivent être réalisées ultérieurement.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : efficacité antipaludique par tests biochimiques, tests de toxicité sur culture cellulaire (lignée et/ou primaire), premier test de métabolisation sur microsomes de souris. Cela a permis de réduire l'étude à seulement 5 composés parmi les nombreux synthétisés. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant détecter une éventuelle toxicité organique.

Réduction

Nous avons décidé de n'étudier qu'une seule dose de produit, la dose maximale tolérée, sur des groupes de 12 souris. Nos expériences précédentes ont montré que cela permet d'obtenir une réponse statistiquement exploitable. D'autre part, la détrermination de la dose de travail se fera par administration séquentielle des doses envisagées, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.

Raffinement

Le projet nécessite des prises de sang régulières. Pour limiter l'inconfort, nous utiliserons des souris swiss de 8 semaines, possédant un volume de sang de l'ordre de 2ml. Une prise de sang sera effectuée une semaine avant le début. En ce qui concerne la phamacocinétique sur 24h, nous effectuerons la moitié des prises de sang sur quatre souris, et l'autre moitié sur les quatre autres souris. Cela permettra de prélever un volume sanguin raisonnable en termes de nuisance pour chaque animal. D'autre part, afin d'éviter l'emploi de solvant organique souvent toxique, nous administrerons les composés en solution dans de l'huile alimentaire. Par ailleurs, les animaux seront très observés (toutes les deux heures pendant les 12 premières heures), et seront mis à mort s'ils montrent des signes de souffrance. Une réutilisation n'est pas prévue car l'effet sur l'organisme de ces composés n'est pas connu. Les animaux seront hébergés dans les conditions réglementaires avec eau et nourriture à volonté, et enrichissement par des abris en matière plastique et du coton.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris, ce qui correpond aux recommandations de l'OCDE pour les tests de toxicité de produits chimiques administrés par voie orale (fiche 423). L'espèce préférée est le rat, mais les autres espèces de rongeurs peuvent être utilisées. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 semaines, conformément aux recommandations de l'OCDE pour ce type d'étude.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une pancréatite, chaque souris reçoit jusqu'à dix-huit injections de céruléine, des gavages et des injections d'antibiotique ou de bactéries, la céruléine pouvant causer des douleurs modérées répétées. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem. Le porteur affirme que les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas ne peuvent être reproduites in vitro et que le modèle animal est le seul auquel il peut recourir.

Objectifs

Le microbiote intestinal influence le développement des maladies digestives. En effet, les patients avec une pancréatite alcoolique présentent des modifications de leur microbiote intestinal en comparaison des patients avec une consommation alcoolique similaire mais sans pancréatite ou développant une atteinte hépatique. On trouve notamment une augmentation des entérocoques, en particulier d’Enterococcus faecalis. Il a été́ démontré que, chez les patients ayant une hépatite alcoolique aigue, les souches d’E. faecalis produisant la toxine cytolysine sont augmentées, cela est corrélé à la sévérité de la maladie. Il est montré que les patients avec une consommation alcoolique excessive développant une pancréatite alcoolique hébergent plus souvent des souches exprimant la cytolysine que les patients ayant une hépatite alcoolique. De plus, l’abondance relative d’E. faecalis productrice de cytolysine est de 10 à 100 plus importante chez les patients développant une pancréatite par rapport à ceux développant une hépatite. Cependant, le rôle de cette souche dans l’apparition et la gravité de la pancréatite n’est pas connu. Notre objectif est de démontrer que cette bactérie est un facteur prédisposant à la pancréatite en particulier lorsque la souche est productrice de la toxine cytolysine. Nous avons isolé des souches de E. faecalis de patients ayant une pancréatite. Notre projet vise à évaluer sur des modèles murins de pancréatite chronique ou aigue induites par la céruléine, l’implication de E. faecalis (avec ou sans production de cytolysine) sur le développement des lésions de pancréatite.

Bénéfices attendus

La pancréatite et ses complications, notamment le risque de cancer du pancréas, sont associées à une mortalité élevée et il existe peu de traitements actuellement. Notre approche vise à évaluer le rôle du microbiote intestinal chez les patients alcooliques, et en particulier d’Enterococcus faecalis, dans la survenue des dommages du pancréas. Si notre hypothèse se confirme, des stratégies de modification du microbiote intestinal, avec éradication de E. faecalis, pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de pancréatite chronique, soit environ 15 000 patients en France, et potentiellement prévenir les complications de la pancréatite sur le long terme, comme le cancer du pancréas.

Procédures

- Induction d’une pancréatite chronique : de 3 à 6 injections maximum intrapéritonéales de céruléine espacées d’une heure, une fois par semaine, pendant 3 semaines soit 18 injections /souris, ce qui concerne 180 souris au total. - Induction d’une pancréatite aiguë : 6 injections intrapéritonéale de céruléine espacées d’une heure,suivi du sacrifice la même journée soit 6 injections intrapéritonéale /souris/ ce qui concerne 120 souris au total. - Gavage PBS ou E. Faecalis : 1 gavage par semaine pendant 2 semaines soit 2 gavages/souris ce qui concerne 168 souris au total. - antibiothérapie préalable au gavage : 1 injection sous cutanée de clindamycine pendant 3 jours, pendant 2 semaines soit 4 injections /souris ce qui concerne 168 souris au total. - injection intraveineuse d’E. Faecalis : 1 injection intraveineuse de souches d’enterococcus faecalis par semaine pendant 2 semaines soit 2 injections intraveineuse/souris ce qui concerne 36 souris au total.

Impact sur les animaux

Le traitement à la céruléine par injections intra péritonéales peut engendrer des douleurs modérées, mais répétées lors des injections et dans les heures qui suivent. Les injections sous cutanées d’antibiotiques peuvent entrainer des douleurs légères au moment de l’injection. Le gavage peut entrainer un stress de la souris, et des douleurs modérées lors du gavage.

Devenir

Mise à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les complications qui vont être observées au cours de la pancréatite mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet correspond à un travail qui permettra de comprendre le lien entre microbiote intestinal, la barrière intestinale et le développement d’une pancréatite. Le modèle animal est le seul auquel nous pouvons avoir recours et qui permet d’intégrer les interactions entre bactéries, tube digestif et pancréas.

Réduction

Nous nous sommes basés pour calculer la taille des groupes sur le dosage d’un marqueur sérique de pancréatite qui est augmentée dans le modèle avec céruléine. Nous avons ainsi déterminé la taille des groupes de souris afin à la fois d’obtenir des résultats robustes d’un point de vue statistique et permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, 12 souris par groupe de comparaison seront utilisées dans les procédures.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 4. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique. Le jour de la mise à mort, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. C’est une des raisons pour laquelle nous demandons à ne pas avoir à pré-traiter les souris par une pommade à la lidocaïne. Nous utilisons pour les injections intra-péritonéales des petites aiguilles et un volume réduit afin de minimiser la douleur de la piqure. Pour les injections en intra-veineuse au niveau du sinus retro-orbital, les souris seront anesthésiées et les 2 injections à une semaine d’intervalle seront réalisées sur le sinus gauche puis à droite la semaine suivante. Les gavages réalisés sur souris vigile pour éviter les fausses routes seront également réalisées 2 fois à 1 semaine d’intervalle avec un volume réduit à l’aide de canules de gavage fine et courte bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les injections sous cutanées permettant l’administration des antibiotiques au niveau interscapulaire seront réalisées. Dans tous les cas les souris hébergées par 4 seront remises dans la cage avec leurs congénères avec une quantité de sciure augmentée favorisant leur enfouissement, en particulier après les manipulations.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la physiopathologie de la pancréatite sont proches de ceux observés chez l’Homme.

1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.

Objectifs

Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.

Bénéfices attendus

En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime riche en lipides, elles subissent des gavages et des prélèvements sanguins répétés à la queue, à la mandibule et en rétro-orbital, avant d'être mises à mort pour prélèvement des tissus. L'objectif est de mesurer l'absorption des vitamines liposolubles chez la souris obèse. Le porteur affirme que le modèle animal demeure la "meilleure approche", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui la complexité du tube digestif.

Objectifs

Les personnes obèses présentent souvent des taux circulants en vitamines liposolubles et en caroténoïdes effondrés par rapports aux personnes minces. Les taux de vitamines liposolubles circulants pourraient être partiellement diminués à cause d’un stockage accru de vitamines liposolubles dans le tissu adipeux. Cependant, des études chez le rongeur ont montré que les régimes à forte teneur en lipides induisaient des modifications de l’expression de transporteurs intestinaux de lipides, qui sont également impliqués dans l’absorption des vitamines liposolubles. Il est donc possible que l’absorption des vitamines liposolubles soit altérée chez les sujets obèses. Il est également possible la clairance ou l’excrétion des micronutriments soit modifiées. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de l’obésité sur l’absorption des vitamines liposolubles et des caroténoïdes chez la souris. Le nombre d’animaux par groupe sera de 10 et le nombre total d’animaux dans l’étude sera de 160.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le métabolisme des micronutriments lipidiques chez le sujet obèse, afin de proposer des supplémentations adéquates aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins à la mandibule, à la queue ou rétro-orbitaux 4 fois pendant la procédure, un prélèvement retro-orbitaux à jeun une semaine avant la procédure. La durée de chaque prélèvement sanguin est calculée autour de 5 minutes. Le gavage sera réalisé avec les animaux en état de vigile car on veut observer la clairance á 5 temps avant l’euthanasie des animaux pour prélever les organes. La procédure de gavage est estimé à 2 minutes hors la préparation de la seringue.

Impact sur les animaux

Afin de limiter le stress lié à la manipulation pendant les prélèvements, les animaux seront habitués à être manipulés lors des pesées hebdomadaires et lors des changements de litière. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement avant incision et prélèvement de sang à la queue. Les prélèvements sanguins au niveau de la queue, mandibulaire ou retro-orbitaux peuvent stresser l’animal. A noter qu’il est nécessaire d’alterner les sites de prélèvement. Le premier sera fait à la queue, puis au niveau mandibulaire et enfin en retro-orbital sous anesthésie au sévoflurane (6% sévoflurane et débit d'oxygène = 1L/min, 5 min).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis a mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques et en micronutriments) pour évaluer les effets de l’obésité sur l’absorption des micronutriments lipidiques.

Remplacement

Les modèles in vitro (culture cellulaire, chambre d’Ussing) ne reproduisent pas la complexité biologique du tube digestif (mucus, mouvement, échange entre organes, présence d’un microbiote). Le recours au modèle animal demeure la meilleure approche pour étudier l’absorption intestinale des micronutriments liposolubles puisque seul un modèle animal permet d’avoir une approche intégrée du phénomène d’absorption-efflux.

Réduction

Ce projet est constitué de 16 conditions maximums. Ce nombre est choisi en se basant sur les résultats préliminaires physicochimiques qui ont permis d’éliminer les conditions non pertinentes et donc de réduire drastiquement le nombre d’individus. Pour chacune de ces conditions, et compte tenu de la variabilité interindividuelle existant chez la souris et de la difficulté de la mise en place du protocole, des groupes de 10 individus sont nécessaires pour assurer la validité statistique du phénomène observé. En effet, notre expérience sur l’induction de l’obésité chez la souris montre, par exemple, qu’un minimum de 10 souris par lot est nécessaire pour mettre en évidence une prise de poids significative. Lors d’un protocole de ce type, les souris contrôles (alimentation standard) pesaient à la fin de l’expérimentation en moyenne 33,9 ± 0,7 g contre 40 ± 1,2 g pour les animaux nourris avec un régime riche en lipides ce qui représente une différence significative avec une p-value associée de 0.005. Il s’agit d’une obésité modeste. Un nombre plus restreint d’animaux ne permettrait pas une finesse suffisante des résultats pour répondre à nos objectifs de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Le début des régimes aura lieu après 7 jours d’adaptation dans l’animalerie. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Toutes les procédures invasives (prélèvement sanguins retro-orbitaux, dislocation cervicale) seront réalisées sous anesthésie générale (6% sévoflurane et débit d'oxygène = 1L/min, 5 min). Les animaux auront accès à l’eau et nourriture jusqu’à 12h avant le début de l’expérimentation postprandiale et l’eau jusqu’à la fin de l’expérimentation.

Choix des espèces

Dans la littérature, les expériences de biodisponibilité des micronutriments sont le plus souvent réalisées chez la souris, dont le système de digestion et d’absorption est anatomiquement proche de celui de l’homme. De plus, le modèle de souris offre des avantages comme la facilité de la mise en œuvre et le faible coût. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie leur est provoquée par un régime alimentaire spécifique, et 255 subissent six prélèvements sanguins répétés au sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour tester des vecteurs censés bloquer les gènes de la maladie. Le porteur renvoie au conditionnel la mise au point de traitements contre la fibrose et la cirrhose. Il affirme qu'on ne peut reproduire l'architecture d'un "organe entier" autrement que chez l'animal.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première de fibrose hépatique est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de notre projet est de développer des médicaments pour traiter la fibrose hépatique métabolique. Le principe de ces médicaments est d’empêcher les gènes responsables de la maladie de s’exprimer. Nous allons élaborer des vecteurs synthétiques capables de délivrer ces médicaments spécifiquement dans le foie pour réduire au silence les gènes impliqués dans le développement de la fibrose.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude sera un premier pas vers la mise au point de nouveaux médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.

Procédures

Un prélèvement sanguin de 100 à 150 μL par voie retro-orbitale après anesthésie totale par un mélange kétamine (100mg)/kg/xylazine (10mg/kg) sera effectué toutes les 2 semaines sur une partie des animaux prévus dans le projet. Soit 6 prélèvements répétés sur 255 animaux. La durée du prélèvement est d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chacune des procédures. En effet, il est indispensable de récupérer le foie et le sang des souris pour pouvoir étudier les effets des vecteurs thérapeutique sur la fibrose hépatique.

Remplacement

Les procédures expérimentales nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Le modèle de fibrose que nous avons choisi consiste uniquement en l’apport d’une alimentation spécifique, il a l’avantage de refléter fidèlement la pathologie humaine. Avant d’être administré aux souris, les systèmes thérapeutiques développés seront préalablement testés sur des cellules en cultures. Seuls les systèmes présentant une efficacité suffisante seront testés chez la souris.

Réduction

D’après la littérature et d’après notre expérience sur le modèle CDAHFD, la variabilité des réponses à l’induction de la fibrose est très faible (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Cependant, suivant les durées de régime, la variabilité de l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins marquée. Ainsi, d’après nos résultats précédents, l’étude d’une réponse aux agents thérapeutiques nécessite des lots minimum de 15 animaux pour pouvoir réaliser une étude statistique. Pour les études d’effet thérapeutique nous réaliserons dans un premier temps, l’expérience sur un lot de 10 animaux, testerons la validité statistique des résultats, et nous recommencerons l’expérience sur 5 animaux supplémentaires si nécessaire. Pour les études de biodistribution, des lots de 5 animaux sont suffisants. Ainsi, le nombre d’animaux indiqués est un nombre maximum. Le test statistique utilisé sera un test non paramétrique Mann–Whitney permettant l'analyse d'échantillons de petites tailles.

Raffinement

Ce régime entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Des mesures visant à réduire la douleur des animaux seront prises, les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des procédures. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.

Choix des espèces

Les objectifs du projet sont de tester différents agents thérapeutiques pour traiter la fibrose hépatique et d’étudier l’évolution des marqueurs de cette pathologie. Le recours à des animaux est indispensable pour atteindre de tels objectifs, puisque la fibrose hépatique prend place au niveau d’un organe entier, le foie. Il n’est actuellement pas possible de reproduire l’architecture et la complexité d’un organe entier autrement que chez l’animal. De nombreux modèles de fibrose hépatiques existent et sont bien connus chez la souris. En soumettant les animaux à un régime alimentaire spécifique, bien caractérisé par l’équipe, cela permettra de récapituler, les différentes étapes du développement et les potentielles variabilités de la maladie à l’échelle de l’organisme entier. Un tel niveau d’information ne peut pas être obtenu à l’aide d’un modèle in vitro.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal, sous la peau ou par injection dans la rate pour induire des métastases, puis des injections de microbulles et des ultrasons deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte des points limites. Le porteur cite parmi les atteintes la douleur de la chirurgie du ventre et la dégradation de l'état général liée à la croissance de la tumeur. Il affirme qu'à cette étape le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle in vitro ou in silico.

Objectifs

Evaluer différents types de microbulles pour la délivrance d’un protocole de chimiothérapie, l’irinotécan (libre et encapsulé) par action combinée de microbulles et d’ultrasons (appelé également sonoporation).

Bénéfices attendus

Optimiser le modèle murin de métastases hépatiques de cancer colorectal Optimiser la procédure d’imagerie CT des métastases hépatiques de cancer colorectal Améliorer l’efficacité thérapeutique de l’irinotécan libre et encapsulé pour le traitement du cancer colorectal

Procédures

Procédure 1 Evaluation de microbulles de gaz pour la délivrance d'une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané chez la souris 1- identification par puce – insertion sous cutanée du trocart –anesthésie gazeuse– 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 2- injection sous cutanée de cellules tumorales – anesthésie gazeuse - 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 3- i.v. microbulles gaz et/ou chimiothérapeutiques et/ou ultrasons (

Impact sur les animaux

- Le stress lié à la manipulation des animaux - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale - La douleur induite par la chirurgie abdominale - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale

Devenir

Procédure 1 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude. Procédure 2 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences sur des cellules cellulaires dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés avec un modèle préclinique. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.

Réduction

Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si ces différentes thérapies permettent une diminution significative de la croissance, du métabolisme et de la perfusion tumorale (Puissance de test: 80%, Seuil de risque: 0.05).

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. Les animaux seront observés une fois par jour afin d’évaluer leur stress/leur douleur après les différentes procédures réalisées sous anesthésie gazeuse (Vetflurane). - Le stress lié à la manipulation des animaux : Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale : L’animal est réchauffé par une couverture chauffante. - La douleur induite par la chirurgie abdominale : La douleur sera prise en charge par une analgésie adaptée (Buprénorphine 0.05 mg/kg et lidocaïne) en pré- et post-opératoire. - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale : Le poids sera mesuré tous les deux jours et les animaux seront observés tous les jours selon les critères ci-dessous : (1) Détérioration générale de l'état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, dos vouté et yeux enfoncés). (2) Cachexie associée à une perte de poids de 17% du poids total de l'animal. (3) Symptomologie évocatrice : Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances… La manifestation d'un seul de ces signes cliniques conduira à une euthanasie par dislocation cervical après anesthésie au vetflurane (5%) par une des personnes en charge de l'étude. Une analgésie ne pourra pas être administrée aux animaux pendant la croissance tumorale car cette première influence cette dernière.

Choix des espèces

Dans la littérature et pour la lignée cellulaire CCR choisie pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes. Dans la littérature et pour les lignées cellulaires CCR choisies pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.