Système gastrointestinal

218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Diabétiques ou non, elles reçoivent des injections de peptides puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des tests métaboliques par incision de la queue, pour évaluer la toxicité et les effets de ces molécules sur le diabète et la stéatose hépatique. Le porteur anticipe une possible perte de poids et une atteinte neurologique liées à l'action des peptides sur le cerveau. Il juge "erronée" la corrélation entre viabilité cellulaire in vitro et humain, et affirme qu'un "système animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

La prévalence de l'obésite, du diabète de type 2 (DT2) et de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a doublé au cours des 20 dernières années et représente dans la région Grand-Est, environ 1/4 de la population. La prise en charge de ces pathologies, appelées syndrome métabolique, est une priorité en santé publique et mérite un intérêt marqué pour la recherche clinique expérimentale. Il convient de noter le succès relativement limité des médicaments biologiques et chimiques disponibles pour traiter l'obésité pathologique et les maladies associées. Dans ce contexte, nous avons identifié des petites molécules appelées peptides dérivés de l'élastine (PDE) qui sont notamment impliquées dans le développement du diabète de type 2. Ces mêmes peptides activent une molécule présente à la surface des cellules que l'on appelle la neuraminidase-1, NEU-1. Le regroupement de deux NEU-1 (processus de dimérisation) permet l'élimination d'acides sialiques (appelée désialylation) présents sur certaines molécules. Par exemple, la désialylation du récepteur de l'insuline (RI) provoque le développement du diabète de type 2 mais également de la stéatose hépatique. Afin de réduire l'impact de la désialylation induite par NEU-1 sur le développement de ces pathologies, nous avons élaboré une stratégie innovante par l'utilisation de peptides interférents (PI). Ils ont été mis au point et testés sur différents types de cellules. En effet, ils diminuent la dimérisation de NEU-1 et le phénomène de désialylation associé. De ce fait, ces PI pourraient empêcher le développement du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. Il nous semble donc crucial de tester ces molécules sur un modèle animal (souris). Une première approche animale a été menée sur un modèle de souris développant des tumeurs de façon importante et spontanée. Une injection unique de ces molécules a été testée lors de cette première étude et une détection de ces dernières 7 jours après injection a été observée au sein des tumeurs. Cependant aucune donnée sur les effets indésirables de ces molécules et de leur temps d'action n'a été évoquée sur modèle animal. C'est pourquoi nous proposons une étude sur le temps d'action, la dose, la fréquence d'injection ainsi que sur la potentielle toxicité de nos molécules (procédure 1 à 3) avant toute investigation thérapeutique comme l'impact de ces molécules sur le développement du syndrome métabolique induit par l'activation de NEU-1 (procédure 4).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, à court terme et à long terme, d’obtenir des données cruciales pour la suite des expérimentations et permettra une avancée importante dans la recherche translationnelle tant en clinique humaine qu’en clinique vétérinaire. En effet, la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale et sous-optimale des peptides interférents fluorescents à injecter. Par la suite, nous connaîtrons, via la procédure 2, la fréquence d’injection optimale afin d’éviter un potentiel effet cytotoxique des peptides fluorescents injectés de façon chronique. Enfin, grâce à la procédure 3, nous pourrons vérifier si une potentielle intolérance pourrait être observée chez des animaux insulino-résistants et qui seront utiles pour la suite des expérimentations. Enfin la procédure 4 nous permettra d’évaluer les effets biologiques des peptides interférents sur l’insulino-résistance et la NASH développée par l’accumulation de PDE observées chez les sujets vieillissants ou diabétiques. Ces PDE et le CRE qui y est associé, ont été décrits comme des inducteurs de maladies cardio-vasculaires (thromboses, athérosclérose, hypertension artérielle…), métaboliques (NASH, insulino-résistance, fibrose adipeuses…), cancer (sein, mélanome, …), … Si les peptides interférents ont un réel effet sur l’insulino-résistance, alors ces peptides pourraient avoir un impact thérapeutique important sur diverses pathologies dont les traitements sont peu convaincants.

Procédures

Procédure 1 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas deux fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédures 2 et 3 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas une fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement durant toute la durée du traitement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédure 4 : Etape 1 : Aucun prélèvement n’est effectué. Etape 2 : Une incision de 1 mm au niveau de la queue est réalisée afin de recueillir une goutte de sang (

Impact sur les animaux

Nos données préliminaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) sur cellules, n’ont pas montré de modifications sur la prolifération, la viabilité ou la sénescence cellulaire. De ce fait, l’injection de doses raisonnables de peptides interférents (ne dépassant pas 1 mg/kg) ne devrait pas induire d’effets indésirables. Cependant, dans notre cas, il serait possible que ces injections induisent une perte de poids par manque d’appétit. En effet, NEU-1 a été décrit dans le système nerveux central (hippocampe) mais pourrait aussi être exprimé dans d’autres régions comme l’hypothalamus renfermant notamment le centre de la faim. La présence de NEU-1 dans le système nerveux central et l’inhibition de son activité par les peptides interférents pourraient entraîner une atteinte neurologique associée à une modification du comportement.

Devenir

Les animaux de chaque procédure (procédures 1 à 4) seront mis à mort afin de réaliser des études de biodistribution de la fluorescence et de cytotoxicité organe par organe (procédures 1 à 3), ou des études biochimiques/histologiques (procédures 1 à 4).

Remplacement

Le recours aux modèles in vitro a été réalisé en amont de la demande d’autorisation de projet. En effet, des résultats in vitro ont été obtenus concernant l’étude de la viabilité cellulaire de différentes lignées cellulaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) après incubation avec le peptide transmembranaire interférent ou le véhicule seul (micelles de Lithium Dodécyl Sulfate ou LDS qui est un détergent utilisé en biologie). Bien que nous n’ayons observé aucune cytotoxicité de ces peptides et des micelles à 1 µM et 0,1 µM après différents temps d’incubation (10), la corrélation de cette étude de viabilité sur des modèles cellulaires isolés avec l’Homme est erronée d’un point de vue scientifique. Il est donc nécessaire d’étudier la posologie et la potentielle cytotoxicité de ces peptides dans un système animal entier afin d’obtenir des informations clés pour la suite des expérimentations (procédure 1 à 3). En ce qui concerne la procédure 4, à notre connaissance, aucun modèle in silico et in vitro ne peut remplacer un modèle in vivo pour cette application et cette thématique (développement d’un syndrome métabolique, à savoir, l’insulino-résistance et la NASH).

Réduction

Les procédures 1 à 3 ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour la procédure 4. Une réflexion biostastistique (G-Power) a été intégrée à la création de ce projet afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Ainsi la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale à injecter tandis que les procédures 2 et 3 nous permettront de déterminer la fréquence d’injection afin d’atteindre les objectifs fixés dans la procédure 4, tout en garantissant le bien-être animal. L’avantage d'avoir mis au point ces procédures liées est qu'il sera possible et nécessaire d’arrêter le projet si les conditions fixées ne sont pas respectées pour l’ensemble ou l’un des deux sexes, réduisant ainsi le nombre d’animaux. De plus, pour les procédures 1 et 2, nous avons envisagé une prise de sang avant l’injection de peptides interférents afin que chaque individu soit son propre contrôle. En effet, une semaine avant le début des injections, un prélèvement de sang de 100 µL sera effectué pour chaque individu. Ceci permet de réduire le nombre d’individus nécessaire en éliminant un groupe contrôle ne subissant aucune injection. Pour les études de tomographie, un suivi dans le temps est réalisé par individu permettant d’éviter les sacrifices d’animaux aux temps intermédiaires de mesures (1h, 6h, 24h, 3 jours). Pour la procédure 4, comme les informations nécessaires à sa réalisation seront connues (posologie et biodistribution des peptides interférents), le nombre d’animaux sera le nombre minimum nécessaire. De plus, les étapes expérimentales dans cette procédure 4 impliquent de nombreuses méthodologies non invasives, permettant là encore une réduction du nombre d’animaux. Enfin des analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney (test non paramétrique) ou de test de rang de type Wilcoxon qui sont adaptés pour l’étude sur un faible nombre d’individus.

Raffinement

Une période de stabulation sera réalisée à l’arrivée des souris, leur permettant de s’acclimater à leur nouvel environnement. La température et l'hygrométrie du local sont relevés quotidiennement. La nourriture et l’eau seront vérifiées tous les jours et disponibles ad libitum. Les cycles jour/nuit de 12h seront respectés. La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de diurèse excessive des souris diabétiques. Les cages aux dimensions réglementaires (30x40cm) présenteront un enrichissement adapté et plusieurs animaux du même sexe y seront hébergées. Lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées (isoflurane 4% pour l’induction et 1,5% pour le maintien) lors de certaines méthodologies (échographie/ tomographie) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention. Cela devrait réduire le stress au minimum. Une vigilance d’autant plus accrue sera déployée à la suite des injections de peptides fluorescents ou de véhicule seul. En effet, un suivi régulier des animaux (au moins deux fois par jour) sera effectué notamment en déterminant, à l’aide d’une grille de score préalablement définie, le bien-être animal (voir document associé). Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de perte ou de gain de la masse corporelle) ou d’une hyperglycémie (supérieur à 600 mg/dl de glucose) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de mise à mort de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases de tomographies, de prélèvements de sang, des anesthésiques généraux ou locaux seront administrés. De plus, les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale à la suite de la mesure au FMT afin de réduire le temps de manipulation, le stress et la souffrance des souris. Une grille de score définie (voir en annexe) nous permettra de définir l’état dans lequel se trouvent les individus. Des tests neurocomportementaux (Labyrinthe à 8 branches, Labyrinthe en Croix Surélevé, Open Field) pourront être envisagés pour s'assurer qu'il n'y ait pas d'atteintes neurologiques suite aux traitements.

Choix des espèces

Les maladies métaboliques touchent principalement les adultes. Ainsi, afin de se placer dans les conditions les plus représentatives de ce que l'on peut retrouver chez l'Homme, les souris seront âgées de 8 semaines lors de la réception.

40 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après incision de l'abdomen, des cellules d'un cancer du foie de l'enfant, l'hépatoblastome, sont greffées dans leur foie, puis une partie reçoit une chimiothérapie au cisplatine suivie d'imagerie. Le porteur veut établir un modèle juvénile de ce cancer et affirme qu'aucune méthode alternative ne peut le remplacer. Les bénéfices annoncés se limitent à disposer d'un modèle pour tester de futurs médicaments.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à base de cisplatine. L’hépatoblastome est un cancer d’origine embryonnaire caractérisé par des mutations activatrices dans le gène bêta-caténine et une sur-activation de certaines voies oncogéniques (Wnt, MAPK/ERK…) mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal connus. La disponibilité d’un modèle juvénile de ce cancer du foie chez la souris permettrait d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition et également de tester l’efficacité de futurs médicaments dans un contexte physiopathologique plus en adéquation avec le très jeune âge des patients atteints de ce cancer.

Bénéfices attendus

Démontrer que les cellules d’hépatoblastome se développent parfaitement dans le foie de souris très jeunes et forment des tumeurs histologiquement similaires à celles décrites chez les patients. Montrer que ces cellules répondent à une chimiothérapie à base de cisplatine et donc que le modèle est pertinent pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle juvénile unique et pertinent pour étudier les mécanismes à l’origine de ce cancer d’origine embryonnaire.

Procédures

Implantation de cellules tumorales dans le foie après incision de la peau au niveau ventrale. Points de sutures au niveau ventrale. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec (1) une incision mineure de la peau ventrale pour accéder à une partie restreinte du foie, (2) la greffe de cellules tumorales dans un lobe hépatique, (3) une suture de la peau ventrale et (4) un suivi longitudinale et non-invasif de la formation de la tumeur par bioimagerie. Dans le groupe Cisplatine, une solution de Cisplatine sera administrée aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette drogue dans un contexte juvénile. Les souris seront également manipulées afin de mesurer la croissance des tumeurs par bioimagerie. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les 40 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude, l’hépatoblastome. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). D’après Berndston et al. (J ANIM SCI 1991, 69:67-76), le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si les résultats de nos analyses sont convaincants dès la première série d’expérience, celle-ci ne sera pas reconduite.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll » (Safe, France). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al. (Lab Animal 1998). Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre (cf. grille jointe en annexe). En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures (cf. paragraphe 4).

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression (Shultz LD et al., Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174(10):6477-89 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5 .La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge de 2 jours de vie. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale des deux tiers du foie et des injections, pour étudier le contrôle de la division des hépatocytes en lien avec le cancer du foie. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer une gêne et une légère douleur, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'atteinte des points limites. Il affirme que le modèle murin est le "seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire des gènes de façon tissu-spécifique.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 280 souris et sera mené pour une durée de 2 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de RhoA, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, une injection intra-péritonéale (une fois, à 6 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (112 animaux). Par ailleurs, une hépatectomie partielle des 2/3 du foie (chirurgie) sera effectuée sur animal anesthésié (280 animaux). Enfin, une injection intra-péritonéale (une fois, à 8-10 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (280 animaux).

Impact sur les animaux

Du fait de la laparotomie nécessaire à la chirurgie du foie, les animaux pourraient resssentir soit une gêne au niveau de la zone chirurgicale (présence de sutures/agrafes) ou bien une légère douleur de par l'acte chirurgical. Par ailleurs, l’injection intrapéritonéale pourrait entrainer un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglemantaire) de l’ensemble des animaux (280).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires conduisant au CHC.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Pour cette étude, nous estimons que 280 souris seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (hépatectomie partielle) sera précédée d’une anesthésie générale et d'une prise d'antalgique pré/post opératoire. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 à 10 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux.

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par du DSS, avec gavage, test de perméabilité après huit heures de jeûne et prélèvement de sang derrière l'oeil sous anesthésie avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que le DSS peut provoquer une perte de poids, une altération des selles et la présence de sang, tout en tablant sur des effets "faibles" aux faibles doses employées. Il s'agit d'une étude pilote visant à caler le modèle avant de tester des stratégies nutritionnelles, l'espèce étant retenue faute d'accès aux biopsies humaines.

Objectifs

L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer de manière importante l'intégrité intestinale. L'inflammation aiguë responsable des maladies inflammatoires intestinales (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique) se distingue de l'inflammation chronique qui est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II, les maladies cardiovasculaires et la sarcopénie du sujet âgé. Le développement de l’inflammation intestinale est associé à des altérations majeures des fonctions digestives : augmentation de la perméabilité, anomalies de la couche de mucus protectrice, modifications histologiques significatives comme la profondeur des cryptes, altération de la motricité intestinale, perturbations de l'absorption des nutriments ainsi que des changements importants du microbiote intestinal. La consommation de lipides particuliers induisant des changements bénéfiques du profil et métabolisme lipidiques pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale et à l’altération de la barrière intestinale. Avant de commencer ces études testant de telles statégies nutritionneles de prévention, il est indispensable de réaliser une première étude pilote pour développer un modèle d’inflammation intestinale chronique induite par ajout de DSS (Dextran Sulfate Sodium) à l’eau de boisson chez la souris. Ce modèle est simple, rapide et reproductible cependant de nombreux facteurs peuvent affecter la susceptibilité au DSS et modifier les résultats. Il est donc nécessaire de caractériser le modèle d’inflammation en tenant compte de la source et du lot de DSS, de la souche de souris, de la dose et de la durée du traitement. Une dose excessive de DSS ou administrée pendant une durée trop longue induirait une réponse inflammatoire aigüe, plus typique de la rectocolite hémorragique ou de la maladie de Crohn. L’objectif est d’induire une inflammation chronique avec des doses inférieures à celles classiquement utilisées pour induire une colite chez la souris. D’après la littérature, la dose 0 ,5% - 1,0% DSS pendant sept à dix jours pourrait induire une inflammation suffisante pour mimer l’inflammation intestinale chronique induite lors d’un régime riche en gras et en sucres. Cependant, l’impact relatif de ces doses et durées sur des paramètres importants scientifiquement comme la perméabilité intestinale et la production de cytokines plasmatiques reste mal décrit.

Bénéfices attendus

L’intestin joue plusieurs fonctions essentielles à l’intégrité de l’organisme et au maintien d’une santé optimale. L’inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer de manière importante l’intégrité intestinale comme dans la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique ou les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Le taux de MICI dans le monde est passé d’environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017. Le développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induit par le DSS chez la souris permettra d’étudier ultérieurement différentes stratégies nutritionnelles pour limiter cette inflammation soit de façon préventive soit de façon corrective.

Procédures

Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test de perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection sous-cutanée de solution saline pour favoriser la production d’urine et seront gavées oralement avec une solution de lactulose, mannitol, sucralose puis placées individuellement dans une cage vide. L'urine sera collectée directement dans la cage à l’aide d’une pipette tout au long des 4h suivant le gavage. A la fin du test, les souris seront regroupées dans les cages comme précédemment. La durée totale de l’intervention (jeûne compris) sera de 8h. Le dernier jour de l’étude, toutes les souris auront une anesthésie locale au niveau de l’œil par une goutte de tétracaïne 1min avant anesthésie générale par inhalation isoflurane 3% suivie d’un prélèvement de sang en rétroorbital (500µl) avant leur mise à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation par le traitement au DSS peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistence des selles et la présence de trace de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Au regard des faibles doses de DSS utilisées, inférieures ou égales à 1%, les effets devraient être faibles et limités aux derniers jours du protocole.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, nous devons collecter du sang pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Nous devons aussi prélever les organes inflammés comme le côlon, l'intestin grêle pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. On ne peut donc pas obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.

Remplacement

Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et les données obtenues de ces études transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Le développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induit au DSS chez la souris devrait permettre d’accroitre nos connaissances sur l’inflammation et de mettre en place par la suite des stratégies nutritionnelles pour la diminuer ou la prévenir.

Réduction

Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale et des altérations dues au DSS que les souris femelles. L’étude pilote se fera uniquement sur des souris mâles afin de maximiser les chances d’observer une inflammation modérée. Des calculs de puissance avec Rstudio ont été réalisé avec l’objectif de réduire la quantité d’animaux. La puissance a été défini à 0,8, le niveau de significativité à 0,05 et la taille de l’effet à 0,6 (un effet important au niveau du traitement au DSS est attendu). La Après avoir défini le nombre de groupes étudiés, Rstudio détermine le nombre nécessaire de souris par groupe pour avoir des résultats significativement élevés. Pour cette étude pilote avec le traitement au DSS, 7 souris par groupe sont requises selon les calculs d’analyse de puissance (5 groupes, 7 souris par groupe = un total de 35 souris).

Raffinement

Les souris seront mises en cage par groupes de 3 ou 4 afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Pendant toute la durée des traitements, les animaux auront un accès à volonté à l’eau et à la nourriture sauf lors du test de perméabilité intestinale. Pour le prélèvement de sang en rétroorbital, les souris auront une anesthésie locale au niveau de l’oeil suivie d’une anesthésie générale. Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne pour déceler un potentiel mal-être. L’aspect du pelage, le comportement, la perte de poids comparé au poids initial, la consistence des selles et la présence de trace de sang dans les selles seront évalués et récoltés sur une feuille d’observation. Les différents gestes expérimentaux réalisés dans ce projet n’ont jamais démontré de souffrance, d’angoisse ou de douleur chez la souris nécessitant une prise en charge spécifique. Au cours du test de perméabilité intestinale, les gavages peuvent irriter l’oesophage des animaux. Pour minimiser cet effet potentiel, une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté qui vérifiera l’état de la canule et le comportement de l’animal.

Choix des espèces

Les travaux effectués dans ce domaine (dans la communauté scientifique en générale mais également au sein du laboratoire) sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les etudes sur l’inflammation induite au DSS, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J et BALB /c. Cependant, les souris BALB /c sont plus résistantes au DSS que les souris C57BL/6J, donc l’utilisation de souris BALB /c nécessiterait d’utiliser des doses plus fortes de DSS et/ou sur des temps plus longs. Ainsi, la souris C57BL/6J est le modèle le plus pertinent pour ce projet. De plus, elle est reconnue comme souche de référence pour les études métaboliques. Les souris seront commandées à 10 semaines de vie et le protocole débutera à 11 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux. Suite à cette étude pilote, les effets préventifs d’un traitement de 4 semaines avec des lipides polaires sur l’inflammation intestinale seront étudiés sur des souris agées de 6 semaines. C’est pourquoi, nous réalisons l’étude pilote avec des souris agées de 10 semaines.