Système immunitaire

1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés

Procédures

Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.

1 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation puis de une à neuf injections, avec induction de tumeurs, pour étudier le rôle de sous-types de cellules dendritiques dans l'immunothérapie du cancer. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent entraîner une perte d'appétit et de poids et que l'irradiation peut causer amaigrissement et diarrhée. Il qualifie d'"indispensable" le recours à la souris et renvoie les retombées thérapeutiques pour les patients à un horizon futur.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un processus de mort cellulaire qui déclenche une réponse immunitaire. Lorsqu'une cellule meurt de manière immunogène, elle libère des signaux moléculaires qui attirent les cellules du système immunitaire, comme les cellules dendritiques qui jouent un rôle central. Actuellement, différents sous-groupes de cellules dendritiques ont été identifiées mais, à ce jour, leur rôle n’est pas encore clair. Les objectifs de ce projet sont : 1) Découvrir et comprendre quels sous-types de cellules dendritiques sont les plus importants pour garantir un meilleur effet avec la thérapie immunogène anticancéreuse. 2) Etudier comment les chimiothérapies immunogènes et l’immunothérapie affectent les bons sous-types de cellules dendritiques et montrent un meilleur traitement contre le cancer que les autres. Cette recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l'efficacité des approches thérapeutiques immunogènes contre le cancer par amorçage du potentiel des cellules dendritiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Les recherches dans ce projet peuvent avoir un impact significatif sur le développement de traitements plus personnalisés et efficaces contre le cancer en exploitant le potentiel des sous-populations spécifiques de DC dans la thérapie immunogène. Voici quelques-uns des avantages attendus de ce projet : 1) En étudiant comment la déplétion sélective de certaines sous-populations de DC affecte la réponse immunitaire, nous pourrions parvenir à une compréhension plus approfondie du rôle spécifique de ces cellules dans la thérapie immunogénique du cancer. Cela permettrait de mieux cibler les interventions thérapeutiques pour maximiser leur efficacité ; 2) En comprenant comment les différentes sous-populations de DC interagissent avec la chimiothérapie et l'immunothérapie, nous pourrions optimiser la combinaison de ces approches pour une meilleure réponse immunitaire et une plus grande efficacité dans le traitement du cancer ; 3) Ces recherches pourraient révéler des sous-populations spécifiques de DC qui sont essentielles pour une réponse immunitaire efficace. Cela ouvrirait la voie à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront une irradiation (durée 14 minutes) suivie d'une injection (durée 2 minutes) sous anesthésie locale. Suivant les lots, les souris pourront avoir entre 1 et 9 injections (durée 2 minutes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (préhension, injections) peuvent induire du stress chez l'animal. La croissance tumorale et les traitements (la chimiothérapie et l'immunothérapie) peuvent entraîner une perte d'appétit et une perte de poids. L’irradiation peut induire des atteintes modérées de la santé avec amaigrissement et diarrhée transitoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.

Remplacement

L'utilisation de la souris dans la recherche sur la chimiothérapie et l'immunothérapie est indispensable car les maladies traitées par perfusion et immunothérapie, particulièrement le cancer, sont des affections complexes impliquant des interactions entre de multiples voies biologiques et des cellules. Les souris sont des modèles animaux qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec les humains, permettant ainsi de comprendre les mécanismes biologiques et les réponses aux traitements dans un système vivant complet. Les DCs sont d'une complexité biologique considérable, et leur fonctionnement et leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires sont encore en cours de découverte. Donc l'utilisation de modèles in vivo dans la recherche sur la biologie des cellules dendritiques est indispensable pour obtenir des informations approfondies sur leur fonction, leur rôle dans la réponse immunitaire, leur contribution aux maladies et leur potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés ; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail comme expliqué dans chaque procédure. De plus, toutes les expériences reposant sur la reconstitution de la moelle osseuse seront réalisées avec des moelles osseuses cryoconservées au lieu de les extraire de nouveaux animaux donneurs, ce qui réduit de moitié le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront en environnement enrichi et stimulant pour les animaux en expérimentation, avec suffisamment d'espace, de matériel et d'interactions sociales, pour améliorer leur bien-être (sizzlenests, tunnels, maisons). Les protocoles expérimentaux sont rigoureux, optimisés et validés, et minimisent la souffrance animale et les manipulations inutiles, tout en fournissant des résultats scientifiquement valides. Le personnel de recherche est formé en continu afin de réduire le stress et l'inconfort des animaux. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Un suivi quotidien est mis en place pour s'assurer de la santé des animaux et mettre en place des mesures correctrices quand c'est nécessaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions seront réalisées sous anesthésie locale ou générale et raffinées (utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...).

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, et pratiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

Selon les lots, des souris reçoivent deux fois par semaine dans l'abdomen un agent qui provoque une fibrose du foie, un régime gras de 4 ou 12 semaines, une injection de bactéries, une injection de virus pour rétablir l'expression d'un gène ou une chirurgie pour injecter des cellules dans un vaisseau, et presque toutes une prise de sang de 500 microlitres sous anesthésie, "avec ouverture de la souris". 5 235 souris vont être utilisées, dont des souris de 20 à 24 mois, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la déclaration les classe toutes en souffrance modérée, y compris le lot opéré "sans réveil". Le porteur cite une prise de poids qui peut limiter la mobilité des souris soumises au régime gras et une perte de poids sous l'agent qui agresse le foie, puis affirme que la fibrose, la cirrhose et le foie gras ainsi provoqués sont "indolores" et "n'affectent pas l'état général des souris". Pour les infections bactériennes, il juge les périodes d'observation "trop courtes pour causer des souffrances".

Objectifs

Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.

Procédures

Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : * Pour les modèles d'infections bactériennes, il est important de noter que les périodes d'observation sont trop courtes pour causer des souffrances aux animaux, comme cela a été démontré dans de récentes études. Cependant, en cas d'effets indésirables, ils se manifestent généralement par une légère fièvre. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.

Réduction

Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.

1566 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules cancéreuses par voie sanguine ou sous-cutanée sous anesthésie, puis elles reçoivent divers traitements par injection ou gavage et des prélèvements de sang à la joue, pour évaluer un traitement sur cinq types de cancers. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement et un isolement, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme que seul un modèle vivant entier permet d'étudier l'évolution tumorale et les récidives.

Objectifs

Pour traiter leucémie et tumeurs solides, il est important de trouver de nouvelles façons de soigner les patients tout en minimisant les effets secondaires. Récemment, il a été développé un médicament spécifique des cellules qui prolifèrent rapidement (comme les cellules cancéreuses). Aujourd’hui, ce traitement est testé en essai clinique sur des patients atteints de leucémie, et nous souhaitons élargir l’utilisation de notre traitement à d’autres cancers agressifs, comme celui du poumon, du sein, du pancréas et le mélanome. Dans des expériences préliminaires de laboratoire, ces cellules cancéreuses sont tuées efficacement par le médicament. L’utilisation de la souris nous permet de confirmer l’efficacité du médicament dans un environnement physiologique et vivant avant de tester le produit en clinique, chez l'homme. Dans une seconde partie du projet, comme il est souvent difficile de traiter totalement le cancer avec un seul médicament, nous souhaitons combiner notre traitement avec d’autres agents couramment utilisés en cliniques aujourd’hui. Ces combinaisons de plusieurs thérapies sont de plus en plus utilisées en clinique pour augmenter l’efficacité de traitement, réduire le risque que le cancer se redéveloppe et surtout réduire les effets secondaires. Nous avons déjà testé ces combinaisons en laboratoire et avons obtenus de résultats prometteurs. Avant de pouvoir appliquer notre traitement chez les patients atteints de cancers, seul ou en combinaison, il est nécessaire de valider nos résultats sur des modèles animaux qui récapitulent fidèlement ce que l'on observe chez l’homme. Ce projet nous aidera à mieux comprendre comment le cancer peut développer une résistance, comment notre traitement interagit avec le corps humain et d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Le processus de développement d’un nouveau traitement, de sa conception initiale jusqu’à son autorisation de mise sur le marché, peut nécessiter en moyenne entre 15 et 20 années. Il est donc impératif d’optimiser au maximum l’utilisation de chaque avancée thérapeutique. Ce projet permettra d’une part d’optimiser le développement de notre traitement en l’appliquant sur différents modèles de cancer agressifs, notamment sur un modèle de cancer de pancréas pour lequel seules la chirurgie et la chimiothérapie conventionnelle existent. D’autre part, ce projet apportera une meilleure compréhension de la résistance thérapeutique, et dans la récidive du cancer. Cette compréhension favorisera la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques, qui permettront de réduire la dose administrée de chaque traitement, et par conséquent réduire le coût, les effets indésirables, et surtout la résistance au traitement. En effet, ces bithérapies permettront d’offrir une alternative thérapeutique aux patients résistants à un agent, et donc cibler une plus large partie de la population. Ainsi, ce projet ouvrira de nouvelles perspectives dans le traitement des leucémies aiguës, de cancers solides, et offrira une alternative aux patients en quête de traitements plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des greffes de différentes cellules cancéreuses pour développer la maladie, par voie sanguine ou sous cutanée. Avant et pendant chaque greffe, les souris sont endormies. Les responsables du projet suivront l’évolution de la maladie 2 fois par semaine. Pour une des procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau de la joue pour surveiller l’évolution de la maladie. Ces prélèvements seront effectués sur des animaux endormies une fois par semaine au maximum, soit un total de 3 à 12 prélèvements totaux selon la procédure. Les animaux seront divisés en plusieurs groupes pour leur administrer différents traitements par voie sanguine, sous-cutanée ou par gavage. L’administration de traitements ne nécessite pas le recours à l’anesthesie. Selon les procédures, les différents traitements seront administrés par voie orale, par injection sous-cutanée ou par injection sanguine. Toutes interventions sur la souris (injections de cellules tumorales en sous cutanée, gavages, injection du traitement et prélèvements) effectuées par des membres qualifiés dureront 1 à 5 minutes maximum par souris. Le temps de developpement de la maladie (en sous cutanée ou par voie sanguine) est estimé à deux semaines. Au moins 2 fois par semaine, les responsables du projet observeront les animaux pour détecter tout inconfort ou signe de douleur.

Impact sur les animaux

Les transplantations de cellules, les prélèvements de sang, et les administrations de traitement par voie intraveineuse se feront sous anesthésies gazeuses, ce qui peut occasionner un stress de courte durée à l’induction et au réveil. Certains traitements sont administrés par voie orale avec une technique appelée gavage qui peut entrainer une gêne physique en cas d’administration quotidienne. Comme attendu dans ce projet, les greffes de cellules vont aboutir à un développement tumoral, qui, à un certain stade, peut occasionner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement, une isolation, une perte d’activité.

Devenir

A l'issue des expérimentations, tous les animaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses sur les organes et évaluer la présence éventuelle de cellules cancéreuses résiduelles.

Remplacement

Nous avons déjà effectué plusieurs tests de laboratoire (qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux) qui ont confirmé l’efficacité antitumorale de notre anticorps seul et en combinaison avec d’autres médicaments. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier en profondeur l’évolution tumorale, les récidives, et la réponse de l’organisme au traitement. De plus, il est important d’évaluer consciencieusement les potentiels effets secondaires de notre traitement et s’assurer de la non-toxicité avant son application chez l’homme. Enfin, nous souhaitons étudier l’effet de notre traitement sur la survie des individus. Pour ces raisons, seul un modèle vivant entier pourra répondre entièrement à notre projet. La souris reste donc aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Grâce à des études déjà réalisées au sein de notre laboratoire et à des tests statistiques réalisés on sait que pour interpréter les résultats obtenus, il faut utiliser au moins 8 animaux par conditions. Ces calculs sont confirmés aussi par d’autres laboratoires, et sont également présents dans la littérature. En plus, nous utiliserons les mâles et les femelles pour généraliser la réponse au médicament chez les deux sexes.

Raffinement

Toutes les procédures seront soumises au respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupe pour privilégier leurs interactions sociales, dans des cages propres et contrôlées, contenant des jouets. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et 2 fois par semaine par les responsables du projet. Les protocoles ont déjà été optimisés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les injections et prélèvements dures 5 minutes et sont réalisés par des membres qualifiés, sur les animaux endormis permettant la réduction du stress et douleur. En cas de douleur qui peut se développer à cause de l’évolution du cancer, des anti-douleurs leur seront administrés. Un score de douleur sera établi 2 fois par semaine selon une grille très spécifique. En cas de non-réponse aux antidouleurs, les animaux seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est considérée aujourd’hui comme un modèle pertinent pour étudier et comprendre l’évolution du cancer et la réponse aux traitements observée chez l’homme, notamment du fait de la similarité biologique. Pour ce projet nous utiliserons des souris adultes (>6 semaines) pour refléter l'âge de développement de ces tumeurs chez l'homme.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie métabolique, elles reçoivent des injections d'un peptide antimicrobien et développent une faiblesse musculaire progressive, avec une biopsie de la queue pour le génotypage. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que seuls les modèles in vivo reflètent la complexité de la maladie et annonce des expériences sur cellules pour limiter le recours à l'animal.

Objectifs

Certaines myopathies héréditaires sont causées par un déficit en une enzyme conduisant à une accumulation progressive d'un sucre et à une dégénérescence des muscles (myopathie métabolique). Le seul traitement spécifique à ces maladies est la thérapie substitutive avec l'enzyme manquante qui vise à stopper l'évolution naturelle de la maladie. Cependant, les limites de la thérapie incitent la communauté scientifique à approfondir ses recherches sur la maladie. Nous souhaitons explorer si une molécule antimicrobienne joue un rôle dans la physiopathologie de la maladie. Nos études préliminaires et la littérature montrent que cette molécule est exprimée dans le muscle sans que son rôle soit connu. Notre projet a pour but de comprendre ce rôle dans un modèle préclinique de la maladie.

Bénéfices attendus

mise en évidence du rôle thérapeutique d’une molécule antimicrobienne dans une myopathie métabolique.

Procédures

-Injections intrapéritonéales de cathélicidine (douleur de quelques secondes) -Développement de la maladie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive sans paralysie invalidante. -Risque d'aggravtion du phénotype dans la lignée nouvellement générée. -Biopsie de queue pour génotypage.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéales d'un peptide antimicrobien (douleur de quelques secondes) -Développement d'une myopathie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive. Douleur légère pour la biopsie de queue.

Devenir

-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie de la maladie de Pompe, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre le systéme immunitaire et le muscle. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Des expériences in vitro sur des cellules primaires seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences in vivo.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses biologiques et extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris présentant les symptômes de la myopathie (faiblesse musculaire) : nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 mutantes seront utilisées à 4, 12 et 24 semaines pour étudier les différents stades de développement de la myopathie.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, la trachée est disséquée puis suturée pour y injecter une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, avant des prélèvements sanguins et des injections de cellules et de molécules thérapeutiques, le porteur reconnaissant des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort. Des cultures de cellules humaines sont utilisées en parallèle, mais le porteur conclut qu'aucune alternative ne modélise l'"organe entier" et qualifie la souris d'animal "incontournable".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, évolutive et mortelle caractérisée par le remplacement du tissu pulmonaire normal par un tissu cicatriciel (fibrose) ne permettant plus les échanges gazeux au niveau des alvéoles pulmonaires. Les patients atteints souffrent d’une dyspnée (difficulté à respirer) qui peut s’aggraver dramatiquement au décours d’une maladie infectieuse respiratoire (exacerbation). Il n’existe actuellement aucun traitement pour stopper la progression de la maladie. Les mécanismes aboutissant à la FPI ne sont que partiellement connus. La FPI résulte d’un processus de cicatrisation excessive des alvéoles pulmonaires en réponse à des agressions répétées (tabac, infections virales, pollution…), et sa progression est probablement favorisée par un dérèglement des cellules immunitaires présentes dans les poumons (inflammation). Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules X qui participent en temps normal à la lutte contre les infections bactériennes et virales. Cependant, ces cellules X constituent une arme à double tranchant car elles sont également capables d’amplifier l’inflammation et la fibrose. Nos résultats préliminaires chez l’homme et chez la souris montrent qu’il existe un lien entre ces cellules X et la progression ou la sévérité de la fibrose pulmonaire. En outre, des publications récentes ont montré leur rôle délétère dans la fibrose du foie. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser le comportement des cellules X dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence des cellules X sur la progression de la fibrose, et 3) d’étudier le potentiel thérapeutique de trois molécules capables de bloquer ou activer les fonctions des cellules X. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider les cellules X comme nouvelle piste thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions fonctionnelles multi-directionnelles entre tissu pulmonaire et cellules immunitaires. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle d’un type de cellules immunitaires dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes) sur animaux vigiles. Entre J9 et J20, les souris recevront deux doses d’une molécule thérapeutique dont on veut évaluer l'action sur la fibrose pulmonaire. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’oesophage au lieu de la trachée. Avant l’administration de la molécule thérapeutique, les souris recevront à l’état vigile une injection de cellules X par voie intraveineuse (veine caudale, durée 30 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids (entre le 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection). Une mise à mort est prévue en cas d'atteinte des points limites inférieur à 10% des effectifs selon notre expérience).

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des cultures ex-vivo de cellules pulmonaires humaines et une lignée de cellules X humaines. Cependant, ces méthodes alternatives ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ces modèles n’intègrent pas 1- la complexité de la physiopathologie de la fibrose pulmonaire, 2- le système immunitaire dans sa globalité et 3- ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement cellulaire vers d’autres tissus/organes via la circulation sanguine. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires issues.

Réduction

D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal tout en respectant l’hypothèse scientifique. Le nombre d’animaux, calculé par un test statistique, est de 24 en moyenne par groupe. Ce chiffre tient également compte du risque d'atteindre les points limites définis selon notre grille de score amenant à la sortie précoce des animaux du protocole (habituellement entre 0% et 10% des effectifs entre les jours 7 et 14 après traitement). D’autre part, dans le but de réduire le nombre d’animaux élevés, nous prévoyons d’utiliser non seulement les souris transgéniques portant le gène d’intérêt (enrichies en cellules X), mais également les souris issues des mêmes portées mais ne portant pas le gène d’intérêt (ces dernières seront incluses dans des groupes contrôles). De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules d’intérêt ex vivo

Raffinement

Les contraintes induites par les conditions expérimentales seront réduites par plusieurs approches. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment du sacrifice. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur afin de détecter précocément et réduire toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux . Cette surveillanve clinique évalue l’apparence de l’animal, son comportement, la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Afin de prévenir une douleur légère, détectée par l’un de ces critères (moindre déplacement ou mauvaise posture ou toilettage excessif ou état défensif ou plissement des yeux) un analgésique sera administré aux animaux. Les souris seront mises à mort dès la détection de points limites.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules X sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.