Système immunitaire
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Exposition à la silice et induction d’autoimmunité systémique : modèle de sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Des souris reçoivent à deux reprises dans la gorge de la silice cristalline, qui provoque une fibrose pulmonaire étendue à tout le poumon, ou de la poussière de pierre artificielle, et d'autres subissent jusqu'à dix semaines d'injections dans la peau d'acide hypochloreux, cinq jours par semaine, qui provoquent une fibrose de la peau et des poumons. 350 souris vont être utilisées pour mettre au point une méthode d'induction de sclérodermie systémique et mesurer les effets de cette poussière, à laquelle des travailleurs peuvent être exposés, avec 120 souris en souffrance légère et 230 en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour prélever sang, poumons, peau, rate, reins et cœur. Le porteur écrit qu'aucun signe "de difficulté ou de souffrances respiratoires" n'a été décrit dans la littérature ni observé dans ses études antérieures avec l'acide et la silice, pour une fibrose qu'il dit étendue "à l'ensemble du parenchyme pulmonaire". Les effectifs annoncés pour chaque procédure, 110, 350 et 50 souris, totalisent 510, sans que le texte dise si certaines passent par plusieurs procédures.
Objectifs
Ce projet a 2 grands objectifs qui sont les suivants: 1) optimiser le modèle de souris sclérodermique, qui à ce jour ne reflète pas entièrement la physiopathologie observée chez l’homme (inflammation, autoimmunité et fibrose cutanée et pulmonaire). Nous évaluerons ces paramètres physiopathologiques dans le nouveau modèle que nous proposons et qui sera induit dans des souris génétiquement susceptibles de développer une autoimmunité en présence de la protéine recombinante contre laquelle les auto-anticorps sont dirigés et de silice cristalline utilisée comme adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. En effet, les modèles murins actuels sont soit génétiques soit induits par injection de substances chimiques tels que l’acide hypochloreux (HOCl) ou la bléomycine (BLM).
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront : 1) de disposer d’un nouveau modèle de souris sclérodermiques dans lequel seront retrouvés les grands paramètres qui définissent cette maladie : l'inflammation, l’autoimmunité et fibrose cutanée/pulmonaire ; cela permettra d’une part d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie de cette maladie et d’autres part de disposer d’un modèle pertinent pour tester de nouvelles thérapies; 2) d’évaluer les risques sur la santé d’une exposition à la poussière de pierre reconstituée à laquelle les travailleurs peuvent être exposés dans leur cadre professionnel et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets (autoimmunité, inflammation et fibrose). Ces informations pourraient à terme permettre de mieux informer les utilisateurs des risques encourus, de contribuer à mieux protéger les personnes exposées et à limiter l’utilisation de cette pierre artificielle.
Procédures
Des souris (n=110) seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) de NaCl ou d'HOCl pendant 10 semaines maximum. Des souris (n=350) seront soumises à 2 expositions par voie respiratoire de NaCl ou de SiO2 ou de Pierre artificielle (PA). Des souris (n=50) seront soumises à 5 injections sous-cutanées de NaCl ou de rhuTOPO-1.
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique d'acide hypochloreux (HOCl) peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois une plaie cutanée (au niveau du bas du dos) qui pourront être apaisées par l'application de Douxocalm. Les souris exposées à l'acide hypochloreux (HOCl) développent une fibrose cutanée au point d'injections (bas du dos) et une fibrose pulmonaire légère à modérée qui se développe à partir de la 3ième semaine. La fibrose induite est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Les souris exposées par instillations oropharyngées de silice cristalline (SiO2) développent une fibrose pulmonaire modérée qui s'étend à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n'avons pas non plus observé dans nos études antérieures de signes de difficulté ou de souffrances respiratoires dans ces deux modèles. Même si nous ne nous attendons pas à avoir d’inconfort ou de souffrance animale avec une exposition à la poussière de pierre artificielle (PA) nécessitant le recourt à des antalgiques, nous serons attentifs sur ce point. D'après la littérature, des injections sous-cutanées répétées à 15 jours d'intervalles n'ont pas non plus montré d'effets indésirables chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de trissus et d'organes (sang, poumons, peau, rate, rein et coeur).
Remplacement
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune (présence d’autoanticorps dans la circulation sanguine), complexe avec des manifestations dans plusieurs organes (peau et poumons majoritairement) qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est important d’avoir un modèle de souris sclérodermique qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé chez l’homme (fibrose cutanée et pulmonaire, autoimmunité et inflammation) pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour réaliser des analyses statistiques. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre maximum de 350 souris sera utilisé.
Raffinement
Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 par cages et les cages seront enrichies. Une observation régulière (entre 3 à 5 jours/semaine selion les procédures) des souris sera réalisée (apparence physique, comportement) et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou des anti-douleurs adaptés pourront leur être administrés.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indspensable pour suivre les effets systémqiues et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps.
Impact de l’électrostimulation spinale sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
843 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 462 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 381 opérées sans réveil. Selon les groupes, chaque animal subit une chirurgie puis l'injection d'une endotoxine bactérienne ou l'induction d'une arthrite ou d'une atteinte du système nerveux proche de la sclérose en plaques, avant des séances d'électrostimulation. Le porteur reconnaît que ces inductions peuvent provoquer une douleur sévère et que les impulsions électriques peuvent créer un inconfort. L'étude vise à mettre au point un électrostimulateur contre la polyarthrite et la sclérose en plaques, qu'il présente comme un "besoin" faute de traitements curatifs.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) et la sclérose en plaque (SEP) sont des maladies inflammatoires, caractérisées par une atteinte articulaire ou nerveuse respectivement évoluant vers la déformation et la destruction des articulations ou du tissu nerveux. La PR et la SEP sont une maladie autoimmune reconnue pour présenter un nombre anormal de cellules immunitaires dans les articulations ou le cerveau respectivement qui produisent des molécules inflammatoires, activant la destruction des tissus. Des études ont montré que le système nerveux pouvait réguler le système immunitaire via la libération des molécules (tels que l’acétylcholine, l’adrénaline ou la noradrénaline) lors de la stimulation de nerfs qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire. Dès lors, l’intervention sur l’activité des nerfs dans le but de modifier l’activité du système immunitaire est envisageable. Ainsi, chez l’homme la stimulation de nerfs est déjà utilisée pour le traitement de maladies comme l’épilepsie ou la dépression. De nos jours, plus de 50000 patients dans le monde sont implantés avec des micro-stimulateurs. Les effets de ces électrostimulations sont actuellement recherchés dans des maladies inflammatoires comme la PR. Deux modèles ont été développés chez la souris qui permettent d'induire des pathologies proches de la PR et de la SEP. Le but à long terme de notre projet est de développer un électrostimulateur visant à traiter la PR et la SEP. Dans un premier temps, notre objectif sera d’évaluer l’impact de l’électrostimulation des certaines nerveuses sur un modèle simple d’inflammation afin d’optimiser les paramètre de stimulation électrique. Dans un second temps nous recherchons à évaluer l'effet de l'électrostimulation de ces nerfs sur le développement de la PR et de la SEP dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’arthrite rhumatoïde ni la sclérose en plaque. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds, non curatifs et qui génèrent de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre les maladies auto-immunes.
Procédures
La procédure 1 est une procédure chirurgicale terminale de moins de 3H sous anesthésie à l'isoflurane. Pour la procédure 2 : les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn. Une semaines après cette chirurgie les animaux recevrons une injection intrapéritonéale infra létale d'endotoxine bactérienne puis seront mis à mort 90mn après. Un prélèvement sanguin sous anesthésie est prévu 90mn après injection de LPS en fin de procédure. Pour la procédure 3 et 4 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn chacune. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront immunisés par injection d'adjuvant complet de Freund et d'une protéine (soit le collagène pour la procédure 3 soit la myéline pour la procédure 4) par voie sous-cutanée puis électrostimulés (ou non) selon différents protocoles pendant 21 jours au maximum à raison de 12, 6, 3 et 2 sessions d’électrosimulations de 2 mn par jour. Aucun prélèvement n’est prévu durant ces procédures.
Impact sur les animaux
La procédure 1 de ce projet est sans réveil. Les nuisances seront donc inexistantes pour cette procédure sous réserve du respect des bonnes pratiques d'anesthésie. Les autres procédures seront réalisées sur des animaux ayant subi une chirurgie ce qui générera les nuisances suivantes : - Douleur associér à l’injection sous cutanée d’analgésique préopératoire ; - stress lié à la phase d’induction de l’anesthésie (isolement de l’animal dans une boite d’anesthésie) et à la phase post-anesthésique dans la cage de réveil ; - une inflammation au niveau des plaies chirurgicales et de la zone d’implantation ; - perte de poids dans les 2 à 3 jours suivants la chirurgie. Par ailleurs pour les procédures 2, 3 et 4 une douleur sévère pourra être observée soit suite à l'induction d'une inflammation systèmique par injection de molécule bactérienne (procédure 2), soit suite à l'induction d'une inflammation des articulations (procédure 3), soit suite à l'induction d'une inflammation du système nerveux central (procédure 4). Enfin, les impulsions électriques quant à elles pourraient également induire un inconfort transitoire ou des douleurs chez l'animal lors de la procédure.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène d’inflammation par l’arthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et ne pouvant être étudié que chez l’animal, en intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un pré-requis à la phase de développement clinique.
Réduction
Pour la procédure 1, le nombre de paramètre d’électrostimuation possible étant quasiment infini et, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu’au maximum 381 souris seront nécessaires à cette procédure. Ce nombre total de souris représente un nombre maximum sachant que nous ne pourrons mettre en expérimentation que des lots de 10 animaux étant donné les contraintes spatiales de notre animalerie et que des bilans seront réalisés tous les 20 souris à partir de la 50ième souris. Ainsi, si 10 paramètres électriques satisfaisants sont trouvés (activation des fibres splénique sans modifier la pression artérielle) avant la fin de la procédure, nous interromprons les expérimentations pour le procédure 1 et passerons à la procédure 2 pour tester ces 10 paramètres. Pour les procédures 2, 3 et 4, nous avons déterminé le nombre d’animaux par une approche statistique reconnue. En effet, notre stratégie d’expérimentation reposant sur la comparaison entre scores cliniques des animaux électrostimulé ou non, le test de puissance réalisé avec le logiciel G*power 3.1 nous donne le nombre d’animaux minimal pour obtenir des résultats significatifs en fonction des hypothèses avancées.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). Une période d’acclimatation de 7 jours minimum aura lieu pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les chirurgies seront réalisées par du personnel ayant les compétences requises et les animaux seront sous anesthésie et analgésie ce qui évitera toute souffrance. Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués pour qu'il soit mis un terme à l'électrostimulation au plus tôt si des signes douloureux apparaissent. Les effets sur la le score clinique seront évalués sur un nombre d'animaux strictement suffisant pour évaluer les effets de l'électrostimulation à long terme (procédure 3 et 4). Enfin, des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux anesthésiés ou conscients et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du responsable de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce souris sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique sur l’inflammation sur ce modèle. Il est également utilisé car il existe des modèles bien établis des pathologies auto-immunes (arthrite rhumatoïde et encéphalite) induits par immunisation. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 10 semaines)
Induction d’arthrite dans un modèle murin de production d’autoanticorps
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit treize injections et sept prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse pour déclencher une arthrite des pattes, décrite par le porteur comme la nuisance sévère du protocole. L'objectif est de mettre au point un modèle combinant production d'auto-anticorps et arthrite, en vue de tester de futurs traitements de la polyarthrite rhumatoïde humaine. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'autre alternative" et revendique le "besoin" d'un modèle réunissant les deux caractéristiques.
Objectifs
Ce projet permettra de développer un modèle d'arthrite « auto-immune ». Ce modèle murin permettra d'analyser la production d'auto-anticorps, la genèse de l'arthrite et potentiellement d'évaluation des solutions thérapeutiques destinées à la polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Avoir un modèle murin qui combine la production d’autoanticorps et l’arthrite nous permettra de tester de nouvelles thérapies chez l’homme qui visent à éliminer les cellules B productrices des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
Les souris vigiles seront injectées : 3 fois en sous cutané dans le dos avec une protéine ou la solution saline. 1 fois en sous cutané dans le dos ou en intrapéritonéal avec un composant bactérien. 9 fois en sous cutané dans le dos ou en intrapéritonéal avec des anticorps Les souris seront prélevées 7 fois dans la veine mandibulaire d’un volume de 0.1 ml de sang après une anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Des nuisances modérées comme des difficultés à se déplacer pendant quelques minutes, des démangeaisons sur le dos et la joue pendant quelques secondes peuvent se produire suite aux interventions (13 injections de composés pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 7 prélèvements de sang de 10 secondes). La nuisance sévère est l’arthrite des pattes. L’ensemble des interventions listées ci-dessus est susceptible d’induire une arthrite chez les souris pendant quelques jours.
Devenir
A la fin du protocole, les 360 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.
Remplacement
Il n’existe pas d’autre alternative à l’expérimentation animale qui permettrait d’analyser globalement la production des autoanticorps et le développement de l’arthrite. Chez l’homme, il est difficile d’analyser l’apparition des autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Nous développons des traitements susceptibles de bloquer la production des autoanticorps et le développement de l’arthrite mais pour les tester nous avons besoin d’un modèle où les souris font à la fois des autoanticorps et une arthrite.
Réduction
Nous allons suivre pendant 60 jours ou 70 jours l’effet de l’injection de molécules susceptibles d’induire une arthrite sur des souris de 2 fonds génétiques. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Nous allons tester 6 groupes de 30 souris pour chacun des 2 fonds génétiques. Le nombre total de souris sera de 360.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une plateforme de gestion et d'acquisition du matériel d'animalerie pour les équipes de recherche. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens quotidiennement pour suivre l’apparition d’arthrite. Une mesure systématique du gonflement des pattes sera faite à l’aide d’un pied à coulisse sur la souris. Un score de gravité sera attribué en fonction de l’inflammation et/ou de la déformation de chaque doigt et paume de l’animal. Les signes de souffrance seront aussi chiffrés de manière hebdomadaire dans une grille de score. De la nourriture et de l’eau gélifiée seront mis à disposition dans la cage si les souris montrent des difficultés à atteindre la nourriture et le biberon d’eau positionnés en haut de la cage. En cas d’atteinte des points critiques, la souris sera immédiatement retirée de l’étude et euthanasiée. Une anesthésie gazeuse sera réalisée pour les prélèvements de sang dans la veine mandibulaire. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole.
Choix des espèces
Nous allons choisir des souris qui ont des fonds génétiques à risque de développer une arthrite. Chez l’homme, les deux allèles HLA-DR qu’il exprime déterminent le risque pour un individu de développer une polyarthrite. C’est la raison pour laquelle nous souhaitons développer un modèle chez des souris BL6 qui expriment HLA-DRB1*04:01, allèle de susceptibilité à la polyarthrite ou des souris C3H dont les molécules H-2 ressemblent à HLA-DRB1*04:01. Des souris adultes âgées de 7 semaines d’un poids moyen de 25g seront testées dans un modèle murin de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle tente de reproduire la polyarthrite et cette maladie touche plus fréquemment les adultes.
Utilisation de modèles d’infections et d’élimination microbiennes chez les souris associées à une évaluation thérapeutique d’un candidat médicament
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par des bactéries après mise en narcose, puis tuées 72 heures plus tard pour un prélèvement sanguin et tissulaire terminal. L'objet est d'étudier la réponse immunitaire à des bactéries responsables de sepsis et de tester une molécule candidate. Le porteur qualifie la souris de modèle "incontournable" et affirme que le recours à l'animal est "inéluctable".
Objectifs
Les infections chez les patients atteints de mucoviscidose ou de la maladie granulomatose chronique (CGD :Chronic Granulomatous Disease) et âgés sont en recrudescence en raison de l'acquisition par les bacteries de mecanismes de resistance aux antibiotiques. C’est particulièrement vrai pour les bactéries P. aeruginosa, B. cenocepacia, C. violaceum ou S. Typhimurium responsables de sepsis. Afin de comprendre et d'étudier les aspects par lesquels ces pathogènes altèrent la réponse immunitaire et la physiologie de l'hôte, nous souhaitons utiliser un modèle d'infection chez des souris sauvages et génétiquement invalidées pour des gènes de la réponse antibactérienne. L'ensemble de ces gènes est commun a l'Homme et la souris. L'utilisation de modèles génétiquement invalides pour des effecteurs de la réponse immune nous permet d'isoler les cibles essentielles quant à l'élimination des bactéries pathogènes par l'organisme mais également de pouvoir, à terme, moduler la réponse antibactérienne de manière appropriée. Compte tenu de la susceptibilité aux infections microbiennes des patients, nous avons identifié́ une molécule qui permet de limiter in vitro les effets inflammatoires induits par les pathogènes. Ce projet vise à la fois à étudier et approfondir les connaissances quant à la dérégulation de la réponse immune mais également évaluer le potentiel anti-inflammatoire et antibactérien d’une molécule prometteuse.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous distinguons deux types de bénéfices : - Scientifique : les connaissances générées seront utiles quant à la compréhension de notre immunité au regard des bactéries étudiées - Santé : Notre molécule pharmacologique d’intérêt pourra démontrer son efficacité quant à la réduction de l’inflammation pathologique induite par ces bactéries dans nos modèles infectieux.
Procédures
Durant cette étude, les animaux seront prétraités à la molécule d’intérêt ou avec l’excipient seul (dose unique pour laquelle l’administration nécessite une dizaine de secondes de manipulation). 3 heures post traitement, après avoir provoqué un état de narcose, les animaux seront infectés. La dose infectante sera administrée en 1 fois. La durée de l’opération est de l’ordre de 30 s. Après infection, les individus seront transférés dans leur cage et le réveil sera vérifié. 72h post infection, tous les animaux seront anesthésiés par injection afin de procéder au prélèvement sanguin terminal et tissulaire.
Impact sur les animaux
Du stress pourra être engendré lors de la préhension et la contention des animaux afin de procéder aux administrations (10 à 30s). Concernant la fréquence des nuisances, il y aura une nuisance modérée due à l’injection unique de bactéries d’une durée de 10 à 30 secondes et une nuisance due à l’injection du traitement d’une durée de 30 secondes. L’infection en tant que telle peut produire une nuisance chronique légère en lien avec la réaction inflammatoire générée durant 3 jours (temps maximal de suivi du protocole).
Devenir
Tous les animaux seront, après anesthésie, mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sanguins et de tissus.
Remplacement
Dans ce projet, nous étudions l'activité anti-inflammatoire et anti bactérienne d’une molécule d’intérêt dans un système complexe. Les études in vitro ont déjà été réalisées sur des cellules de patients et ont montré une activité antibactérienne et anti inflammatoire prometteuse. Il n'existe, aujourd’hui, aucun modèle alternatif et le recours à l’utilisation de l’animal est inéluctable afin d’étudier l’impact des infections au niveau tissulaire et organique.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 1680 souris sera utilisé. Nous utiliserons des cohortes d'individus réduites à la taille minimum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos tests statistiques à l’aide de modèles murins déjà validés par plusieurs publications au sein de notre équipe, à savoir 10 individus par groupe (7 pour les analyses anti inflammatoires/antibactérienne et 3 pour les analyses histologiques). L’étude sera réalisée en tripliquât afin de reproduire et confirmer les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans une structure zootechnique adaptée et répondant aux normes règlementaires en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Ils sont hébergés selon les normes réglementaires et éthiques en vigueur et bénéficient d'un enrichissement pendant la stabulation. Une surveillance quotidienne des animaux et une inspection de leur état général (posture, pelage) seront effectuées tout au long de l'expérience par des membres du personnel formés de l'équipe zootechnique et par le personnel de l’équipe scientifique, Nous disposons d’une structure en charge du bien-être animal avec un vétérinaire, qui assiste les expérimentateurs notamment pour gérer le stress et/ou la douleur des animaux.
Choix des espèces
La mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire est extrêmement développé chez la souris adulte car le modèle murin (de par son utilité, sa versatilité, la présence de modèles génétiques proches de l'humain et les équipements scientifiques disponibles) demeure alors incontournable. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique un grand nombre des observations faites chez l’humain. De plus, de par la présence de nombreux outils génétiques développés chez la souris, la diversité des modèles utilisés ne peut être obtenue que dans l’espèce murine. Cependant les modèles cellulaires sont couramment utilisés au sein de notre laboratoire et constituent un préalable avant la mise en place de modèles animaux. Néanmoins, ces modèles cellulaires sont limités quant à l'information obtenue sur la complexité et l'intégration de la réponse immune dans son ensemble.
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 464 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime gras ou alcoolisé, des injections de CCl4 pour induire une fibrose du foie, des prélèvements sanguins et un gavage. Le porteur indique que la défaillance hépatique peut provoquer une perte de poids de plus de 20 %, seuil qui déclenche la mise à mort. Il affirme devoir étudier la protéine CD44 dans un "organisme entier", aucune approche in vitro ne tenant compte des interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines. Une mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. Comme conseillé dans la revue laboratory animals, le CCl4 sera administré par voie intra péritonéale (vs inhalation) avec alternance du point d’injection. Ce traitement est associé au développement de la fibrose hépatique sans perte de poids ni développement d’ascite ni trouble digestif attendus. Potentiellement, la conséquence la plus grave que les animaux pourraient subir serait une défaillance des fonctions du foie entrainant une difficulté pour s'alimenter et donc une perte de poids brutale de plus de 20% par rapport à la dernière pesée. Cependant, d'après nos expériences passées ainsi que celles de nos collaborateurs, ceci arrive rarement. Si une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente est observée mais sans signe de souffrance (dos voûté, poil non entretenu, indifférence au milieu extérieur…), l’animal sera surveillé et repesé tous les 2 jours. Les animaux auront à disposition dans la cage des croquettes ainsi qu'un boudin de réhydratation. Si aucune reprise de poids la semaine suivante, il sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la protéine CD44 dans les fonctions des cellules immunitaires impliquées dans divers aspects de la physiopathologie des NAFLD et ALD, notamment dans la stéatose, l'inflammation, les lésions hépatocellulaires, la fibrogénèse et l’hépatocarcinogénèse. Les études in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement nutritionnel et métabolique ou encore des interactions entre différents types cellulaires ou entre organes. Il nous est donc nécessaire d'étudier le rôle de cette protéine dans un organisme entier.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour les procédures 2, 3, 4 et 7(souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 5 (souris mâles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour la procédure 6 (souris mâles et femelles), l’isolation des cellules sera effectuée sur des souris adultes à partir de 7-8 semaines d’âge.
Etude de l’intérêt d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés chaque jour pendant quinze jours et une partie est rendue allergique par trois injections intrapéritonéales, le déclenchement de l'allergie provoquant une baisse de température et des douleurs abdominales. L'objet est d'évaluer l'ajout d'une composante microbienne proche du lait maternel dans des formules infantiles, avec en vue le développement de produits laitiers fermentés pour les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro.
Objectifs
Les allergies touchent 30 à 40% de la population mondiale et parmi elles, les allergies alimentaires (AA) affectent plus de 6% de la population Européenne. Il n'existe pas à ce jour de stratégie préventive efficace et validée. Elles sont liées à un dysfonctionnement du système immunitaire (SI) et à une diminution de la diversité du microbiote intestinal chez les nouveau-nés. Ce point suggère l’intérêt des stratégies au début de la vie pour induire un microbiote intestinal optimal et ainsi prévenir les allergies. Des études ont suggéré que l’administration de probiotiques (1 à 4 souches) en périnatal avaient un effet bénéfique pour la prévention de l’eczéma. Le microbiote du lait maternel fournit un apport en bactéries dans le tube digestif du nouveau-né. Il est très divers, riche en candidats probiotiques potentiels et représente un intérêt santé certain pour le futur enfant. Il serait potentiellement protecteur des allergies mais les études restent controversées. Aujourd’hui, les formules infantiles n’intègrent pas (ou très peu), de composante microbienne par rapport au lait maternel. L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt d’une composante microbienne issue du lait maternel dans les formules infantiles en comparant l’effet de différentes formules chez des souriceaux sur la prévention de l’allergie alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfiques pour des populations à risque de pathologies chroniques telles que les allergies. Ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.
Procédures
Les femelles reproductrices seront pesées tous les 2 jours après la fin de la reproduction pour déterminer la gestation. Gavages tous les jours pendant 15 jours chez la descendance. Lors de la récupération des fèces, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. Chez la descendance, les groupes rendus allergiques alimentaires reçoivent 3 injections intrapéritonéales (aiguille 22G) et 1 gavage, espacés chacun d’une semaine.
Impact sur les animaux
Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable SBEA et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendrons la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à l’euthanasie. Les souris sont hébergées avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches et servent de modèle pour l'allergie alimentaire. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses immunologiques des différentes populations cellulaires (lymphocytes T et B) seront réalisées et l’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles et males reproducteurs seront utilisés à 8 semaines de vie afin qu’ils soient matures sexuellement. Afin d’étudier s’il y a une action précoce d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires, nous utilisons des souriceaux en début de diversification alimentaire (sevrage) c’est-à-dire à 2 semaines de vie.
Modulation de l’activation lymphocytaire T par une enzyme immunosuppressive
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
126 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une irradiation, une injection de lymphocytes et une vaccination, puis des prélèvements de sang, pour étudier une enzyme qui freine la réponse immunitaire contre les cancers. Le porteur indique une perte de poids transitoire, puis les souris sont mises à mort au huitième jour pour prélever les organes lymphoïdes. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro l'activation d'un répertoire de lymphocytes du fait de leur rareté.
Objectifs
La molécule que nous étudions est une enzyme immunosuppressive, c’est-à-dire qu’elle freine la réponse immunitaire. La production de cette molécule au cours du cancer rend donc la réponse immunitaire moins efficace à éliminer les cellules cancéreuses, ce qui accélère la croissance des tumeurs de souris. Chez l’homme, la production de cette molécule dans les tumeurs réduit la survie. Nous savons déjà que sa production par des cellules immunitaires appelées « cellules présentatrices » limite l’activation des « lymphocytes T », qui sont les acteurs de la défense de l’organisme contre les infections et les cancers. La rencontre avec la cellule présentatrice est l’étape essentielle qui permet au lymphocyte de reconnaitre la cible à attaquer, sous forme d’un fragment moléculaire appelé antigène. Lors du développement d’un cancer, les lymphocytes T activés par la reconnaissance des antigènes des cellules cancéreuses ont pour fonction de les tuer. Nous cherchons à comprendre comment la molécule que nous étudions freine l’activation des lymphocytes T. Nous pensons que la force de l’interaction entre l’antigène et le lymphocyte joue un rôle important. En effet, dans le vaste répertoire de lymphocytes T d’un individu, certains lymphocytes T peuvent reconnaitre un antigène particulier, mais très peu ont la capacité de le reconnaitre fortement tandis que beaucoup plus le reconnaissent plus faiblement. Il est important de déterminer quel type d’interactions la molécule que nous étudions peut freiner, car les conséquences sur la qualité de la réponse immunitaire (et donc la capacité à éliminer les cellules cancéreuses) ne sont pas les mêmes. Ce projet est donc important pour comprendre le rôle de la molécule que nous étudions dans l’échappement des cellules du cancer à la réponse immunitaire. Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro les conditions d’activation d’un répertoire physiologique de lymphocytes T
Bénéfices attendus
Nous souhaitons démontrer que la molécule que nous étudions restreint le répertoire des lymphocytes T capables de répondre à une stimulation par une cellule présentatrice d’antigène. En présence de cette molécule (souris qui l’expriement), seuls les lymphocytes T reconnaissant fortement l’antigène sont probablement capables de s’activer et donc secondairement tuer des cellules malades, par exemple cancéreuses. Bien que cela puisse être suffisant pour faire cesser une infection aigue, au cours de laquelle la réponse est de brève durée, cela n’est pas souhaitable dans le cas du cancer. En effet, du fait de la grande rareté dans l’organisme des lymphocytes de forte affinité pour les antigènes du cancer, cette restriction est contre-productive au maintien à long terme d’une réponse anticancéreuse active. L’immunothérapie connait un développement fulgurant dans le traitement du cancer, car elle permet de réactiver la réponse du système immunitaire contre les antigènes du cancer. Néanmoins l’efficacité des immunothérapies actuelles reste limitée à certains types de cancer et un pourcentage restreint de patients. La molécule que nous étudions représente une cible potentielle pour de nouvelles stratégies d’immunothérapie. Afin de permettre le développement de traitements visant cette molécule, il est nécessaire de comprendre ses mécanismes d’action sur l’activation des lymphocytes T, acteurs clés de l’élimination des cellules tumorales.
Procédures
Irradiation en 1 séquence de 5,8 minutes. Le lendemain, injection d’une suspension lymphocytaire et vaccination (moins de 30 secondes chacun). Les animaux sont endormis à l’isoflurane lorsque les deux injections sont couplées. Trois jours après les deux injections, ponction de sang (animaux vigiles, anesthésie locale, moins de 20 secondes). Avant mise à mort (jour 8) : prélèvement de sang dans les mêmes conditions.
Impact sur les animaux
Concernant l’axe peur/détresse : il existe un stress lié aux manipulations. En effet, l’irradiation nécessite de regrouper les souris dans une boite pendant quelques minutes. Concernant l’axe de stress physique/thermique : pas de stress spécifique à l’expérimentation car l’irradiation est indolore. Concernant l’axe douleur, lésions et maladie : on s’attend à observer une perte de poids transitoire et modérée (
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les organes lymphoïdes utiles à l’analyse.
Remplacement
Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale d’un individu (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro notre hypothèse. En effet, les outils de détection dont nous disposons ne permettent pas d’analyser de façon robuste un très faible nombre de cellules. De plus, les conditions expérimentales in vitro sont très éloignées de la physiologie.
Réduction
Pour chaque expérience, 3 tests indépendants devront être effectués pour assurer la validité des observations. Chaque test devra indépendamment permettre d’observer une différence statistiquement significative entre les lymphocytes des souris exprimant ou non notre molécule pour une même condition expérimentale. En effet, les résultats varieront très probablement trop d’une expérience à l’autre pour qu’ils puissent être accumulés dans une même analyse statistique. Du fait de la variabilité individuelle accentuée par les différentes étapes de la manipulation, il est souhaitable d’inclure plusieurs animaux par groupe de souris exprimant ou non notre molécule. Trois animaux par groupe seront inclus dans les expérimentations sans vaccination, et 5 animaux par groupe lorsqu’une étape de vaccination est ajoutée. Dans les expérimentations sans vaccination, deux types de transfert de lymphocytes T seront effectués (lymphocytes monoclonaux et polyclonaux). Il y aura donc 6 souris par expérience (3 souris exprimant notre molécule et 3 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes, effectuées avec deux types de transfert lymphocytaire, soit 36 animaux. Dans les expérimentations avec vaccination, trois conditions de transfert des lymphocytes T seront testées. Il y aura donc 10 souris par expérience (5 souris exprimant notre molécule et 5 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes effectuées avec trois types de transfert lymphocytaire, soit 90 animaux. Au total pour les deux types d’expérimentation, il y aura donc 126 animaux.
Raffinement
L’hébergement se fait dans les conditions habituelles de l’animalerie locale : cinq souris sont hébergées par cage et le milieu est enrichi par des carrés de coton et fibres végétales permettant la formation de nids et des maisonnettes pouvant servir de refuge aux animaux. L’irradiation (une seule séquence de 5,8 minutes sur animaux vigils) est effectuée dans une boite de contention adaptée pouvant contenir 11 souris au maximum, isolées les unes des autres. Pour limiter le stress qui accompagne la manipulation au moment de l’irradiation, l’injection de lymphocytes sera réalisée le lendemain. Lorsque cette injection sera couplée à une vaccination, les souris seront endormies avec de l’isoflurane sur une plaque préchauffée à 37°C. Les prélèvements de sang seront précédés d’une anesthésie locale. Les animaux seront manipulés par du personnel expert de l’équipe de recherche. Les souris élevées dans notre animalerie seront transférées en zone d’expérimentation au minimum 48h avant d’être manipulées. Les souris achetées dans un élevage extérieur seront installées en zone d’expérimentation au minimum une semaine avant d’être manipulées.
Choix des espèces
Nous disposons de trois modèles de souris : 1. Transgéniques : tous les lymphocytes T de ces animaux reconnaissent le même antigène. Elles seront mises à mort sans manipulation et leurs lymphocytes T seront extraits de la rate afin de préparer une suspension injectable aux souris des deux modèles décrits ci-dessous. 2. Génétiquement déficientes pour la production de notre molécule. 3. Exprimant naturellement notre molécule. Souris âgées de plus de 6 semaines. Le travail s’intéresse à l’activation des lymphocytes T dans un organisme adulte
Etude in vivo chez la souris des effets immunitaires produits par l’exposition à des micro-ondes modulées et pulsées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
628 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par des trypanosomes, exposées à des ondes radiofréquences huit heures par jour pendant cinq jours et prélevées au sang à la queue, pour tester un effet immunostimulant des ondes contre cette parasitose. Toutes les souris étant infectées, elles sont mises à mort avant que leur parasitémie n'atteigne un seuil jugé irréversible. Le porteur affirme qu'il "n'y a pas de substitution possible au modèle animal" pour étudier l'évolution d'une parasitose.
Objectifs
Les maladies parasitaires ou parasitoses représentent un lourd fardeau pour les populations des pays en émergence. Elles constituent des affections multifactorielles dépendant de la constitution génétique de l’hôte, de son alimentation et de son environnement physique et chimique. Toute modification d’un des facteurs peut avoir des répercussions sur la charge parasitaire. Les études des relations hôte-parasite ont mis en évidence le rôle essentiel du système immunitaire de l'hôte dans la protection contre ces maladies. Ce système peut être stimulé par des molécules chimiques ou des moyens physiques dont certains ont montré leur efficacité. Cette deuxième possibilité considérée comme moins toxiques pour l'organisme que l'introduction de molécules étrangères doit être privilégiée, non seulement pour son intérêt éventuellement thérapeutique, mais également pour approfondir nos connaissances sur le système immunitaire. Les ondes électromagnétiques ont déjà montré un effet immunostimulant dans différentes situations. De plus, leur innocuité vis-à-vis des mammifères aux doses proposées a également été démontrée. Le projet présenté vise à identifier et optimiser les caractéristiques d’ondes électromagnétiques susceptibles d'avoir un effet protecteur dans un modèle de parasitose appelée trypanosomose expérimentale .Pour cela, des souris infestées par des trypanosomes seront exposées à des ondes électromagnétiques et le suivi de leur parasitémie (nombre de parasites circulants dans le sang) sera considéré comme un indicateur de la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Une réponse positive aux ondes avec diminution de la charge parasitaire sera étudiée au niveau immunitaire. Cet effet peut permettre de mettre en évidence un moyen de défense encore mal connu dans les maladies infectieuses. De plus, de nombreuses stimulations physiques se sont révélées intéressantes et dénuées de toxicité dans différentes conditions pathologiques chez l’homme, en particulier en cancérologie.
Procédures
Les souris seront exposées, libres de leurs mouvements, 8 h/ jour, 5 jours consécutifs pendant 1 semaine à différents signaux radiofréquences. Trois prélèvements de sang seront réalisés pour évaluer la parasitémie. Pour cela, une goutte de sang d'un animal parasité est prélevée à la queue, après section fine à l'extrémité, avec un capillaire (5 µl) pour comptage des parasites .
Impact sur les animaux
L’exposition aux ondes ne sera pas elle-même source de souffrance des animaux et de leur mort. Aucun effet biologique négatif de l’exposition aux radiofréquences n’a été confirmé sur la souris pour des niveaux de puissance reçus inférieurs ou égaux à 4 W/kg. A ce niveau de puissance, le potentiel échauffement des tissus induit par l'exposition aux radiofréquences est compensé par la thermorégulation physiologique et n'implique aucune souffrance chez les souris. La charge parasitaire des souris trypanosomées est très bien supportée, et les animaux ne présentent pas de signes cliniques. L’animal est euthanasié lorsqu’il présente des signes de souffrance ou lorsque la parasitémie atteint un seuil jugé irréversible (200 000 parasites par μl) antérieur à l’apparition des signes cliniques. Chaque souris subit 3 prises de sang réparties sur 2 jours. Elles sont réalisées très rapidement par une personne expérimentée et représentent un stress léger.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Toutes les souris sont infestées par des trypanosomes ce qui impose leur mise à mort avant l’atteinte du seuil jugé irréversible de la parasitémie.
Remplacement
Remplacer le modèle animal n’est pas possible pour ce projet qui étudie des processus dynamiques du système immunitaire qui ne peuvent pas être recréés sur des modèles in vitro. Ainsi, l’évolution d’une parasitose ne peut être étudiée que sur un modèle animal et ne peut être remplacée en aucun cas par d’autres méthodes alternatives expérimentales : in vitro, peu de parasites survivent, et les conditions de culture des parasites, modifiant la majorité de leurs propriétés, ne sont pas satisfaisantes pour atteindre les objectifs requis. Il n’y a pas de substitution possible au modèle animal
Réduction
Nous utiliserons le nombre d'animaux qui nous permettra de réaliser tous les tests, soit des groupes de 10 souris (7 exposées et 3 non exposées) par niveau d'exposition pour l'identification de la dose la plus active (24 testées) soit 24 X10 = 240 souris en duplicata soit 240 X2 =480 souris , plus 148 souris pour entretenir la souche parasitaire (260 semaines d’expérimentations , relance de la souche toutes les 7 semaines avec 2 souris en duplicata) et donc un total maximal de 628 souris. Si une condition s’avère efficace statistiquement, nous mettrons l’accent sur sa duplication. En l’absence d’effet, la condition d’exposition ne sera pas répliquée.
Raffinement
Les souris seront placées dans des cages en plexiglass utilisées dans l’animalerie, avec 7 souris par cage maximum. Les souris seront exposées aux ondes dans ces mêmes cages, ce qui supprimera la manipulation et évitera donc de les stresser. Elles bénéficieront d’un enrichissement avec une hutte en polycarbonate rouge, ainsi que du matériel de nidification et du matériel à ronger. Les conditions d'hébergement dans l’animalerie et dans la salle dans laquelle seront exposés les animaux présentent une ambiance contrôlée. Une surveillance quotidienne sera assurée par le personnel de l’équipe. Une fiche de suivi des animaux permettra d’évaluer l’atteinte de points limites et la mise en place de mesures adaptées (observation, analgésie conseillée pour score signe de douleur légère, observation accrue et analgésie obligatoire pour score correspond à une souffrance avérée et un score signe de douleur sévère entrainera la mise à mort de l’animal). Les points suivants seront vérifiés : - l’apparence physique externe, par exemple l'absence de signes d'agression (sang, morsure, lésions de la peau), les caractéristiques de la fourrure, qui doit être lisse et propre (blanche) - les changements du comportement et de l'interaction avec les partenaires, par exemple l'agitation, la prostration, etc. - les réponses comportementales aux stimuli externes, par exemple, la réaction au bruit, l'émission de cris anormaux - De plus, la variation du poids de l'animal sera surveillée avec une pesée quotidienne si les souris présentent des signes de souffrance. Des femelles seront utilisées, permettant ainsi d’éviter l’agressivité entre des groupes de mâles.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée dans ce type d’étude, ce qui a permis de constituer une base importante d’informations permettant de guider la conception de nos protocoles. De plus, il existe des analogies entre le système immunitaire des souris et celui des autres mammifères, rendant ces études pertinentes. Nous utiliserons les femelles pour s’affranchir des risques de blessures dans les groupes mâles. Nous commanderons des animaux âgés de 6 semaines afin d’avoir une habituation à l’animalerie de 2 semaines avant le début des expérimentations. Ils entreront ensuite dans les protocoles d’étude, à l’âge de 8 semaines, qui correspond à leur maturité immunitaire.
Traitement de la polyarthrite rhumatoïde par inhalation de la peptidyl arginine deiminase
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dix-sept interventions, dont trois injections d'une protéine avec adjuvant, sept anesthésies gazeuses, quatre prélèvements de sang et trois inhalations, pour tester un traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les souris sont ensuite mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme qu'un "modèle murin est nécessaire" et que les cultures in vitro ou les organoïdes ne reconstituent pas tous les acteurs du système immunitaire.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Notre laboratoire a identifié la protéine (PAD4) responsable de la production des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde. Un nouveau traitement pour bloquer la réponse immunitaire contre la protéine PAD4 sera utile pour traiter la polyarthrite.
Bénéfices attendus
Développer un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Cette maladie bénéficie de traitements qui traitent les conséquences de la maladie (l'inflammation) mais pas la cause principale qui est la production d'autoanticorps.
Procédures
17 interventions : 3 injections de la protéine ou de la solution saline pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute
Impact sur les animaux
3 injections de la protéine ou de la solution saline avec l’adjuvant complet et incomplet pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute.
Devenir
Les 180 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.
Remplacement
L’objectif de cette demande est de tester l’effet d’un traitement qui pourra être utilisé chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde pour bloquer la production des autoanticorps. Chez les patients, il est difficile d’analyser les autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Un modèle murin est nécessaire car il permet d’induire les autoanticorps afin de comprendre comment ils sont produits et de développer des traitements pour bloquer leur production. D’autres alternatives à l’expérimentation animale comme la culture de cellules in vitro ou des organoides ne permettent pas de reconstituer tous les acteurs du système immunitaire pour analyser les mécanismes de production des autoanticorps et tester les effets d’un traitement.
Réduction
Nous allons suivre pendant 50 jours l’effet de la protéine PAD4 sur des souris de deux fonds génétiques différents. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Le nombre total de souris sera 180.
Raffinement
Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera réalisée pour chaque inhalation (3 par souris) et chaque prélèvement de sang dans la veine mandibulaire (4 prélèvements par souris) pour analyser leur sérologie. Les souris seront mises à mort pour analyser leur réponse lymphocytaire. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens deux fois par semaine. Les effets des procédures seront suivis selon une grille d’évaluation de la souffrance qui combine l’apparence générale, le comportement, la locomotion et les signes neurologiques des souris. Si une souffrance est observée, elle sera chiffrée par une grille de score. L’injection d’analgésiques sera faite si besoin. Chaque cage contenant au maximum 4 souris sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole.
Choix des espèces
Nous allons choisir les souris en fonction des facteurs de risque connus chez les patients atteints de la polyarthrite. Nous voulons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite touche l’homme ou la femme adulte, des femelles car la production d’autoanticorps est meilleure que chez les males, des souris qui ont certains gènes à risque de développer une arthrite. Nous allons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite rhumatoïde touche l’homme ou la femme adulte. Nous allons utiliser des souris agées de 6 semaines.
Rôle, impact et modulation des cellules myéloïdes immunosuppressives dans les cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 570 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales dans la glande mammaire ou le poumon, puis des injections d'hormonothérapie, de facteurs de croissance ou de lymphocytes, pour étudier des cellules immunitaires qui favorisent les cancers. La croissance tumorale provoque une asthénie et les souris sont tuées par dislocation cervicale avant d'atteindre les points limites, pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système in vitro ni non-vertébré ne peut mimer ces interactions immunitaires.
Objectifs
Le système immunitaire protège généralement contre l'apparition des cancers. Cependant, dans certains cas, les cancers peuvent échapper à protection par le système immunitaire. Des cellules immunitaires particulières, appelées « cellules myéloïdes suppressives (CMS) » contribuent à cet échappement. Ces cellules sont en partie responsables du manque d’efficacité des immunothérapies chez de nombreux patients. De nombreux sous-types de CMS ont été décrites, ce qui rend leur identification problématique. En dehors de leur capacité à bloquer le système immunitaire, les CMS participent à la mise en place de vaisseaux sanguins dans les tumeurs ou au processus métastatique. La notion que ces cellules pourraient s’associer avec les cellules tumorales circulantes (cellules tumorales présentes dans le sang, migrant depuis la tumeur primaire vers des sites distants métastatiques) est un concept récent sur lequel notre laboratoire travaille activement. Ce projet a pour objectifs de caractériser l’influence des CMS sur l’immunité anti-tumorale, la préparation des sites pré-métastatiques et la réponse aux thérapies en utilisant des modèles de cancer murins établis, représentatifs de cancers humains et avec lesquels notre équipe a précédemment publié. Les objectifs principaux sont les suivants : 1) Déterminer la cinétique d’apparition de différentes sous-types de CMS dans différents organes au cours du développement tumoral. En parallèle, une caractérisation précise d’amas cellulaires associant cellules tumorales et cellules immunitaires (dont ces CMS) dans le sang sera réalisée. 2) Déterminer l’influence de sous-types distincts de CMS sur l’apparition de micro-métastases dans des organes distaux ; 3) Evaluer si l’hormonothérapie, des facteurs de croissance ou des chimiothérapies utilisées dans le traitement de nombreux cancers modifient le nombre et les fonctions de ces cellules dans un modèle de cancer mammaire et pulmonaire ; 4) Evaluer le rôle de ces cellules dans la réponse aux immunothérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des informations nouvelles concernant les multiples rôles des cellules myéloides suppressives dans les cancers. 1) Les données obtenues devraient d'abord permettre de mieux définir les fonctions protumorales de sous-populations différentes de cellules myéloides suppressives. 2) de nouveaux résultats devraient être générés concernant la capacité de ces cellules à préparer les organes situés à distance de la tumeur primaire à l'arrivée de cellules tumorales migrantes (métastatiques). 3) Enfin, ces travaux apporteront des informations essentielles sur l’impact de l’hormonothérapie et de facteurs de croissance (utilisés cliniquement pour prévenir les risques d'infection) sur les différentes sous-populations myéloïdes et le développement tumoral.
Procédures
Model de souris de cancer du sein : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Model de cancer du poumon : injection intrapulmonaires de cellules tumorales (~2min). Des injections intrahépatiques, intraspléniques et intrapulmonaires de cellules myéloïdes seront effectuées (
Impact sur les animaux
Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la préhension et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une asthénie générales. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puis les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux.
Devenir
A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires
Remplacement
L'utilisation de modèles de souris de cancers est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives: en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permet pas la génération de résultats interprétables puisque ne prenant pas en compte les multiples interactions cellulaires et facteurs solubles jouant un rôle à distance dans l'organisme impliqués dans la régulation du système immunitaire. Il n'est pas possible de mimer in vitro les influences réciproque entre les très nombreuses populations de cellules présentes in vivo. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules myéloïdes suppressives in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs lorsque possible les groupes contrôles seront communs à différentes expériences. Les animaux sont hébergés e à raison de 5 souris par cage. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu.
Raffinement
La procédure majeure commune à toutes les expériences proposése consiste en l’implantation orthotopique de cellules tumorales syngénéiques. Cette procédure est largement reconnue et adaptée à l’étude des cancers in vivo. Elle présente les avantages suivants : • une mise en œuvre aisée ne nécessitant pas d’acte chirurgical. • un suivi longitudinal simple donc sans manipulation engendrant une douleur ou un stress important de l’animal D’un point de vue éthique cette méthode permet de : • restreindre le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal. En effet il n'y aura pas besoin de mettre à mort des animaux pour obtenir le suivi de points intermédiaires dans l'évolution tumorale, tout sera fait sur les mêmes animaux qui iront jusqu'au point final avant d'être mis à mort. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. Les animaux seront anesthésiés comme indiqué lorsque requis, lors de procédures spécifiques.
Choix des espèces
Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle (limité a des endpoints partiels, au niveau du compartiment sanguin). L'impact du microenvironnement tumoral sur le système immunitaire, et les modifications dynamiques de la fonction et du phénotype des cellules immunitaires étudiées sont impossibles éthiquement et techniquement à mettre en évidence chez l'homme. L'étude chez la souris (6-8 semaines) est la seule approche permettant une analyse spatio-temporelle de la régulation des réponses immunitaires antitumorales. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro (absence des complexes réseaux d'interraction cellulaire et cytokinique régulant l'immunité antitumorale) et sans l'utilisation de souris immunodéficientes. Des systèmes non-vertébrés ne sont en outre pas adaptés puisque ne possèdant pas de système immunitaire équivalent à celui des mammifères. La souris comme animal modèle est Sources: PubMed, CEVMA.
AMENDEMENT : Rôle des lymphocytes T non conventionnels dans des modèles murins de diabète de type 1
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
6 194 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection virale intra-péritonéale, un transfert de flore intestinale par gavage d'eau fécale et un suivi de glycémie, pour étudier le rôle de certains lymphocytes dans le diabète de type 1. Les souris devenues diabétiques développent une hyperglycémie et sont mises à mort dans les huit jours suivant sa détection, puis disséquées pour l'analyse du pancréas, du foie et de l'intestin. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" parce que ces cellules immunitaires ne s'étudient pas in vitro.
Objectifs
Notre projet porte sur le rôle des lymphocytes T non conventionnels dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune qui se caractérise par la destruction des cellules productrices d’insuline par le système immunitaire. Les cellules immunitaires infiltrent les îlots pancréatiques en déclenchant une inflammation qui aboutit à la destruction des cellules productrices d’insuline principalement par des lymphocytes T auto-réactifs. Cependant, les mécanismes de recrutement et d’activation de ces cellules par les îlots ne sont pas encore connus. Certaines infections virales et le microbiote sont impliqués dans la destruction des cellules productrices d’insuline mais aussi dans les altérations intestinales dont souffrent les malades atteints d’un diabète de type 1. Les lymphocytes T invariants associés aux muqueuses sont fortement perturbés chez les enfants et les modèles murins à l’apparition du diabète. De manière intéressante, ces cellules répondent à la fois face au microbiote, mais également aux infections virales.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes d'action par lesquels les cellules MAIT participent à l'apparition du diabète de type 1 et des complications associées aux infections virales.
Procédures
L'infection virale est induite par une injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Les différents traitements de molécules inhibitrices sont réalisés par injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Le transfert de flore intestinale est réalisé par gavage d'eau fécale (durée 1 minute). Certains animaux subirons une anesthésie de 5 minutes pour permettre une injection intraveineuse pour limiter le stress. Pour le suivi de la glycémie, une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent développer une hyperglycémie, mais cette hyperglycémie reste modérée car les animaux sont suivis quotidiennement et sacrifiés dans les huit jours après la détection d'une hyperglycémie. L'infection virale peut induire un état fébril modéré et transitoire. Les injections intra-péritonéales ainsi que la mesure de la glycémie sont une nuisance pour l'animal.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses des tissus implliqués dans le diabète (pancréas, foie, intestins) : histologie, cellules immunes présentes dans les tissus, cytokines.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas et l'analyse de leurs interactions dans l’organisme au cours du développement de la maladie ne peut être faite in vitro. Néanmoins ce projet est associé à de multiples manipulations in vitro visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.
Réduction
Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisés in vivo pour valider ces donnés est calculé sur la base d'un plan expérimentale stéréotypé permettant d'obtenir la puissance statistique nécéssaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Notre stratégie vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant des tests staistiques appropriés à chaque procédure expérimentale, de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. De plus, en amont des procédures expérimentales, des expériences in vitro seront réalisées afin de mieux sélectionner les échantillons à tester in vivo. Chaque procédure fait l'objet d'analyses complètes qui permettent d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants et un panel large d’informations.
Raffinement
Pour chacune de ces procédures, le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement (maison et coton) est ajouté dans leurs cages de façon systématique. L’expertise des responsables de projet avec les procédures permet également de limiter le stress et l’inconfort des animaux. Pour les procédures necessitant une injection par intraveineuse, les souris subirons une anesthésie isoflurane d'une durée de 5 minutes. Toute souris diagnostiquée diabétique aura une attention plus poussée ainsi qu’un change de biberon d’eau et de litière plus fréquent. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les procédures expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Le modèle murin du diabète de type 1 est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : -Sa physiopathologie est très proche de la maladie humaine avec notamment une destruction auto-immune progressive des cellules productrices d’insuline de manière spontanée; -Ce modèle est une souris, ce qui permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour pouvoir isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie ; -Le système immunitaire de la souris est très proche de l’homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune, et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines d’âge (jeunes adultes), stade auquel on observe les premières anomalies du système immunitaire chez ce modèle de souris. AMENDEMENT : Les souris sous fond B6 permettent de déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections virales au delà du diabète.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intramusculaires répétées de vecteurs synthétiques et des prélèvements de sang hebdomadaires, avant euthanasie et autopsie pour doser les vecteurs et évaluer leur toxicité. Le projet vise à mettre au point des vecteurs transportant des fragments d'anticorps, notamment pour la reproduction et une alternative à la contraception hormonale. Le porteur affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reproduit l'organisme entier.
Objectifs
Le traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale pourraient potentiellement voir le jour sur la base de la modulation réalisée par des petits fragments d’anticorps communément appelés nanobodies, qui grâce à leur taille inférieure aux anticorps classiques peuvent pénétrer plus facilement au sein des tissus ciblés. Afin de permettre leur délivrance, nous souhaitons évaluer l’utilisation de vecteurs synthétiques facilitant l’adressage des « gènes » codant pour ces nanobodies et induisant leur production par le tissu ciblé. Dans ce contexte, nous cherchons à améliorer le ciblage de la thérapie à l’aide de vecteurs synthétiques. En effet, les acides nucléiques ne traversant pas spontanément les membranes biologiques, l’objectif de notre projet est d’inventer et d’optimiser de nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour faciliter l’entrée des gènes dans les cellules. C’est pourquoi, nous voulons injecter nos vecteurs synthétiques chez la souris adulte pour observer la réponse globale de l’animal. L’analyse des résultats, des différents prélèvements des sites d’injections, du sang, ou de différents d’organes permettra d’ajuster la composition des vecteurs que nous développons et de trouver le meilleur vecteur pour les thérapies futures. Le projet proposé ici a pour objet (1) de déterminer les meilleures voies d’administration de ces fragments d’anticorps, d’étudier leur comportement in vivo, (2) d’optimiser leur séquences et formulation pour leur utilisation in vivo ; et (3) de confirmer leurs effets fonctionnels sur la reproduction.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité des composés étudiés. De plus, l’efficacité des vecteurs synthétiques administrés dans différents organes sera caractérisée. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques de reproduction chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention et de traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale, chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Selon la procédure, les animaux subiront soit : - Procédure 1 : Des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min et sera répétée 7 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Des prélèvements sanguins sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. - Procédure 2 : Des injections intramusculaires (dans les deux muscles tibiaux) des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min sera répétée 1 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Cinq prélèvements sanguins sont prévus sur animal vigile sur toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés ont été anticipés avant la mise en œuvre du projet. Les vecteurs synthétiques testés possèdent des caractéristiques très précises et un degré de pureté élevé. Des études préliminaires de toxicologie et de biodistribution réglementaires ont déjà démontré la parfaite innocuité et absence de mortalité de ces nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour le transport intracellulaire de gènes thérapeutiques. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une formation de nodules au site d’injection… Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection (intra-musculaire) du vecteur. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des « gènes thérapeutiques » dans des cellules en culture. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteur a été récemment validée et est actuellement en phase de développement clinique chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Un premier tri in vitro a été réalisé afin de ne sélectionner que les vecteurs ayant démontré la meilleure efficacité de transfection. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 10 animaux par groupe au maximum ont été prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats des études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins, et des traitements antalgiques sont prévus en cas d’apparition de signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine. Les observations permettront d'effectuer une estimation de la douleur générée et, le cas échéant, de mettre en place des moyens adaptés pour la soulager de façon appropriée, efficacement et sans interférence avec le protocole (grâce à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées à ce projet). Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de sang).
Choix des espèces
Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents vecteurs seront utilisés.