Système immunitaire
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Evaluation de candidats vaccins contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo dans le modèle de la souris IFNAR-/-
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour comparer cinq candidats vaccins contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo. Elles sont vaccinées puis infectées par le virus, les douze souris non vaccinées devant développer perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, faciès émacié et léthargie jusqu'à un point limite atteint en quatre à cinq jours. Trente-six animaux sont tués au pic de la maladie, les autres subissant des prélèvements sanguins rétro-orbitaux avant mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de tester in vitro le degré de protection d'un vaccin et que le recours à des "organismes entiers" reste "indispensable".
Objectifs
Le projet se réalise dans 2 établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de développer un vaccin contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHF). Il s’agit ici de déterminer quels seront les meilleurs candidats vaccins contre le virus CCHF parmi ceux que nous avons développé au laboratoire. En effet, des constructions vaccinales ont été réalisées et produites en quantité injectables mais seule une expérimentation animale peut permettre de tester leur efficacité à protéger contre CCHF. Pour cela, des souris, qui ont déjà été validées dans un modèle d’infection par le virus CCHF seront vaccinées à l’aide d’une première dose de vaccin environ 2 mois avant infection et une dose de rappel un mois après la première injection. Les animaux seront ensuite infectés par le virus pour tester le niveau de protection conféré par les vaccins. Cinq candidats vaccins seront testés en comparaison avec un groupe de souris n’ayant reçu que le milieu de resuspension des candidats vaccins, qui ne confère aucune protection contre le virus CCHF. Cette expérimentation permettra non seulement de valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais aussi de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
L’aire de répartition du virus CCHF s’étend et atteint déjà l’Europe de l’Ouest. Cette progression est principalement liée à la circulation des tiques du genre Ixodidae qui sont vecteurs de ce virus. Le virus CCHF infecte les humains et peut provoquer une fièvre hémorragique dont le taux de mortalité atteint 40%. Les humains se contaminent soit par morsure de tique soit par contact avec des fluides contaminés d’animaux infectés. En effet, les animaux d’élevage (bovins, caprins…) s’infectent suite à des morsures de tiques et peuvent répliquer le virus et le transmettre même s’ils ne sont pas symptomatiques. Les éleveurs et les personnels d’abattoirs sont donc à risque accru de contracter la maladie. Ce virus représente donc un problème de santé publique contre lequel il faut se prémunir. Comme très souvent dans le cas des infections virales aigües, la vaccination constitue une prophylaxie efficace en absence de traitements antiviraux. A ce jour, aucun vaccin contre le virus CCHF n’est commercialisé. Notre projet met à l’étude des candidats vaccins pour lesquels la plateforme vaccinale a déjà été éprouvée et l’innocuité du vecteur testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons produit plusieurs candidats vaccins contre le virus CCHF et la phase suivante pour déterminer leur efficacité est de démontrer leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus. Parmi les cinq candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale et mesurer la synthèse d’anticorps spécifiques du virus. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’analyse des résultats de ce protocole permettra de mieux comparer l’efficacité des différents vaccins (quels candidats vaccins permettent la survie de tous les animaux d’un même groupe) et d’évaluer leur immunogénicité (quels sont les antigènes qui promeuvent la meilleure protection contre le virus).
Procédures
Les animaux seront en expérimentation pour deux périodes successives dans deux animaleries distinctes pour une durée totale d’environ 3 mois. Animalerie 1 : Dans cette animalerie, après répartition en 6 groupes de 12 animaux (6 mâles + 6 femelles par groupe, 5 vaccins testés soit 1 vaccin différent pour chaque groupe et un groupe non vacciné), les 72 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - Quatre anesthésies, deux pour l’injection des vaccins (primo-vaccination + rappel) à un mois d’intervalle et deux pour des prélèvements sanguins pour analyse génétique. Chaque animal sera anesthésié pendant environ 10 à 15 minutes le temps d’être vaccinés ou prélevés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie A1 ne durera pas plus de 2 à 3 minutes. Animalerie 2 : La seconde période est celle de l’infection avec le virus pour évaluer l’efficacité de protection des vaccins testés. - Tous les animaux subiront une première anesthésie au cours de laquelle une puce leur sera implantée pour mesurer leur température corporelle et où ils seront infectés avec le virus. Cette anesthésie durera environ 15 à 20 minutes pour chaque animal. - A J4 post infection, c’est-à-dire au pic des symptômes de la maladie provoquée par le virus, 36 animaux seront anesthésiés puis mis à mort afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes. - A J10 post infection, les animaux survivants seront anesthésiés pour leur prélever du sang. Cette anesthésie durera environ 10 à 15 minutes pour chaque animal. - Enfin, tous les animaux survivants à la date fixée de fin de protocole seront anesthésiés avant mise à mort afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes pour analyses anatomopathologiques. Au cours de chaque anesthésie, les animaux seront pesés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie A2 ne durera pas plus de 4 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans l’EU1/2, peu d’effets indésirables sont à prévoir. Les animaux subiront quatre anesthésies au cours d’un protocole d’environ deux mois et demi au cours desquelles il sera procédé à deux injections de vaccins et deux prélèvements de sang. Les plateformes vaccinales testées dans ce protocole ont déjà été utilisées et n’ont pas causé d’effets secondaires chez les animaux à l’exception d’une fièvre modérée dans les heures suivant l’injection. Les nuisances attendues devraient donc être très faibles. La prise de sang peut causer des hématomes mais la faible fréquence de prélèvements devrait limiter l’impact sur les animaux. Dans l’EU2/2, tous les animaux (n=72) subiront une anesthésie au cours de laquelle ils seront implantés d’un puce télémétrique sous-cutanée ente les épaules et ensuite infectés avec un virus pathogène. Les animaux non-vaccinés (n=12) devraient manifester rapidement les signes cliniques de l’infection avec perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, faciès émacié et léthargie pour atteindre un score clinique limite ou un point limite en 4 à 5 jours environ. Les animaux vaccinés ne devraient pas présenter de signes cliniques durant cette même période. Après la mise à mort des animaux à J4 (n=36), les animaux survivants (n=30) seront anesthésiés et un prélèvement sanguin rétro-orbital sera pratiqué. Les nuisances associées à ces gestes seront les mêmes qu’en post-vaccination.
Devenir
Certains animaux seront mis à mort au cours de la procédure afin de comparer au pic de la maladie induite par le virus si les vaccins les ont bien protégés en comparant leurs paramètres virologiques et anatomopathologiques avec ceux du groupe contrôle. Tous les animaux survivants seront mis à mort à la fin de l’étude dans les locaux de l’animalerie 2. Les animaux ayant survécus à l’infection grâce aux vaccins devront être étudiés en détail à travers l’étude de leurs organes et de leur sang qui seront prélevés en fin de protocole afin de vérifier si le virus inoculé persiste ou non dans l’organisme des animaux vaccinés.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro le degré de protection que peut conférer une solution vaccinale et donc de conclure sur l’efficacité de celle-ci. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour éprouver les candidats vaccins.
Réduction
Dans ce projet, 6 groupes de 12 animaux seront constitué : 5 groupes reçoivent chacun un vaccin différent, le sixième groupe constituant le groupe contrôle. Après vaccination, tous les animaux sont infectés avec un virus qui provoque la létalité dans ce modèle de souris. Afin de mesurer la protection induite par les vaccins au cours de l’infection, la moitié de l’effectif de chaque groupe est mise à mort au pic de la maladie afin de collecter le maximum d’échantillons biologiques pour analyser qualitativement et quantitativement la protection par rapport aux animaux non vaccinés. La mise à mort de six animaux par groupe constitue un minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser des tests statistiques robustes de comparaison de groupes. La comparaison de la survie entre animaux vaccinés et non vaccinés est donc établie sur un effectif de 6 animaux dans chaque groupe ce qui garantit également une analyse statistique de qualité : courbes de survie et analyse comparative des données issues de l’analyse des prélèvements biologiques effectués sur les animaux au moment de la mise à mort. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des données, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour évaluer l’efficacité de ces vaccins.
Raffinement
EU1/2 Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes (SPF) avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique (PSM) et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de vétédine. Tous les gestes techniques (injections et prélèvements) sont réalisés sous anesthésie afin de protéger les expérimentateurs des risques liés à la manipulation d’OGM MOT de classe 2. Ces anesthésies permettront de diminuer la douleur qui aurait pu être provoquée par l’injection du vaccin ou le prélèvement sanguin. Après chaque anesthésie, les animaux peuvent présenter transitoirement une fatigue post-anesthésie et/ou un déshydratation transitoire. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique par voie sous-cutanée, l’ajout de gel hydrique ainsi que de friandises peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. EU2/2 La réalisation des gestes techniques sous anesthésie (injections et prélèvements) permet de réduire grandement le stress des animaux et d’éviter des contentions longues. Le faible nombre de prélèvements effectués permet de réduire le nombre d’anesthésie et les effets associés (perte d’appétit, fatigue post-anesthésie). Malgré le confinement strict lié aux activités de l’EU 2/2, les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Des observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. En période de week-end avant challenge viral, un système de vidéosurveillance permettra de visualiser si les animaux ont toujours de la nourriture et de la boisson. À tout moment, en cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.
Choix des espèces
Il a été démontré qu'une ligné ede souris était susceptible à l’infection par le virus de la fièvre hémorragique de Crimée Congo (CCHF) et en reproduisait la physio pathogénèse observée chez l’Homme. Ce modèle de souris a également été utilisé dans le cadre de plusieurs essais vaccinaux contre le virus CCHF. Il s’agit donc d’un modèle adapté pour comparer les différents candidats vaccins et évaluer leur efficacité. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Etude d’effets physiologiques de l’administration d’une solution probiotique lactofermentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, pour étudier l'effet d'un jus de fruit probiotique lactofermenté sur l'intestin. Elles reçoivent la solution par voie orale à la pipette après dix jours d'habituation, subissent des prélèvements de sang, de selles et d'urine, et passent des tests d'anxiété en champ ouvert, en labyrinthe en croix surélevé et en boîte clair-obscur. Le porteur vise à terme le développement d'aliments probiotiques "à effets dirigés" pour les humains, un bénéfice renvoyé au long terme. Sur le remplacement, il affirme que les organoïdes ne permettent qu'une étude cellulaire et que les prélèvements de tissu intestinal total ne sont "pas possibles chez l'homme".
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de l’administration d’un jus de fruit probiotique lactofermenté sur la physiologie du microbiote et de l’intestin. Le projet a recours à un modèle de souris afin de permettre l’étude de la physiologie de l'intestin et du comportement. La physiologie des animaux sera étudiée à partir d’analyse des selles, des urines, du sang, et de prélèvements intestinaux, ainsi que sur un plan comportemental avec une batterie de tests pour évaluer leur état d’anxiété. Un maximum de 100 souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’améliorer la connaissance sur l’impact de produits probiotiques alimentaires vivants sur la physiologie de la muqueuse intestinale. Les bénéfices seront à destination des humains, pour valider l’effet sur la santé d’une administration de probiotiques vivants. Les bénéfices à long terme consistent à développer des aliments probiotiques vivants à effets dirigés et connus dans un but de personnalisation.
Procédures
Des prélèvements de sang, de selles et d'urine seront réalisées au moment des manipulations des animaux (3 fois pendant la durée du protocole et espacés de 14 jours). Les tests comportementaux consistent a l'étude de l'anxiété d'exploration. L'ensemble des tests dure 40 minutes. L'animal dans une boite blanche pour étudier son déplacement, dans un labyrinthe en forme de croix, avec deux bras donnant sur le vide et deux bras protégés, et enfin dans une boite présentant une zone d'ombre et une zone fortement éclairée.
Impact sur les animaux
L’administration manuelle de la solution peut entrainer un stress chronique car répété. Cependant, la qualité sucrée de la solution peut aussi induire un conditionnement de l’animal, de plus une période d'habituation de 10 jours d'administration d'eau à la pipette sera réalisée avant le début de l'étude. Les tests comportementaux peuvent induire un stress temporaire le temps de la passation.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir recueillir le matériel biologique pour les études au laboratoire.
Remplacement
Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes pour étudier le retentissement à un niveau physiologique de l'administration de probiotiques (actuellement recours à des organoïdes permet seulement l'étude au niveau cellulaire voir tissulaire). L'étude nécessite des investigations sur des prélèvements non possible chez l’homme (tissu intestinal total, tissu cérébral). L'utilisation d'animaux permet de garantir une qualité scientifique optimale, en contrôlant a maxima les influences du milieu extérieur, ce qui est impossible chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour le protocole a été réduit au minimum mais reste élevé du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition à la solution sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter la souffrance lors de l’administration de la solution, celle-ci n’est pas faite par gavage mais par délivrance orale à la pipette lors d’une manœuvre de contention manuelle. Pour limiter le stress engendré par la contention manuelle et l'administratin à la pipette, une période d'habituation de 10 jours d'administration de 20µL d'eau à la pipette lors d'une manoeuvre de contention manuelle sera réalisée, de plus l'habituation permettra de prévenir un biasi d'administration du volume par salivation ou régurgitation. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger). Dans le cas où les souris mâles viendraient à se battre, il est prévu de les isoler en cages individuelles.
Choix des espèces
La connaissance de la physiologie intestinale et immunologique de la souris est avancée. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. 1 lot d'animaux sera acheté à l’âge de 6 semaines, et sera utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines, ce lot correspond à l'âge adulte jeune, et permet d'étudier le retentissement physiologique sur un organisme pleinement fonctionnel. 1 lot d'animaux « âgés » de 48 semaines sera utilisé pour l’étude afin d’étudier l’impact des produits sur la physiologie des sujets âgés.
Rôle de la clusterine dans une modèle murin de syndrome hémolytique urémique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une toxine bactérienne reproduisant le syndrome hémolytique urémique, ainsi que des prises de sang répétées, pour tester une molécule censée améliorer la survie. Le porteur décrit une asthénie, une diarrhée et des tremblements marquant le point limite, et s'appuie sur l'article 14 de la directive pour réaliser certaines injections sans anesthésie. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", cette pathologie systémique ne pouvant s'étudier sur un modèle uniquement cellulaire.
Objectifs
Le syndrome hémolytique urémique (SHU) est une maladie infectieuse grave le plus souvent d’origine alimentaire. Elle est une forme de microangiopathies thrombotiques (MAT), un ensemble de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. Chez l’enfant, ce syndrome est le plus souvent causé par une infection due à une bactérie appartenant à la famille des Escherichia coli (E. coli) producteurs de toxines, appelées les Shiga-toxines (STx1 et 2). Ces toxines entraînent l’inflammation et la mort cellulaire massive. Le traitement de première intention repose sur les échanges plasmatiques. Actuellement, il n’existe pas d’options thérapeutiques ayant fait leurs preuves pour le traitement d’un SHU autres que des soins supports. La mise au point d’une véritable thérapie afin de traiter le SHU est nécessaire et primordiale afin de diminuer la mortalité et la morbidité. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires : le déficit en CLU était associé à une mortalité accrue et la supplémentation en CLU a amélioré la survie des souris. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de la CLU dans la physiopathologie du SHU et son rôle protecteur potentiel afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.
Bénéfices attendus
Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance renale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.
Procédures
1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner 182 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 3/ L’Injection intra veineuse est utilisée dans 2 procédures du projet. Elle concerne 116 animaux, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.
Impact sur les animaux
L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. A une dose plus importante de Stx-2, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie, selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.
Réduction
Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (244) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront agées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.
Elevage de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
6000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour gérer un élevage de souris génétiquement altérées. Chaque animal subit sous anesthésie un prélèvement au bout de la queue ou de l'oreille pour son génotypage. Le porteur indique que les souris au génotype voulu sont versées en continu dans d'autres projets et que celles au génotype non requis sont mises à mort ou réutilisées. Il présente cet élevage comme une "réduction" du nombre d'animaux, tout en programmant le génotypage de 6000 individus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la caractérisation génétique des rongeurs (souris) dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés. L'élevage est réalisé par une plateforme au service des activités de recherche utilisant des animaux à des fins scientifiques comme modèle expérimental dans le domaine des neurosciences, de la physiologie, la compréhension de la réponse immunitaire dans certaines pathologies humaines ou encore dans les mécanismes liés au développement de cancers. Certains de ces projets sont amenés à utiliser des animaux génétiquement altérés (génétiquement modifiées ou avec des mutations spontanées) en l'absence de solutions alternatives disponibles n'utilisant pas d'animaux. L'élevage des animaux génétiquement modifiés nécessite la détermination de la constitution génétique (appelé génotype) de chaque individu par une amplification précise et localisée des séquences d’ADN modifiées à partir des cellules de tissu facilement accessible et avec une approche la moins invasive possible. Cette caractérisation précoce au moment du servage ou plus tardive des animaux nés sur site, est indispensable et contribue au respect de la règle des 3R, notamment en termes de réduction.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet repose sur la réduction du nombre d'animaux utilisées. La mise en place d'une procédure de caractérisation génétique fiable et reproductible permet: d'utiliser des individus avec un génotype défini et requis dans les projets scientifiques, de maitriser la production du nombre d'individus au strict minimum et la qualité génétique des animaux élevés sur site.
Procédures
un prélèvement tissulaire (extrémité de la queue ou pavillon de l'oreille de 2mm) sous anesthésie générale pour 6000 souris; durée inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront en utlisation continue dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées. Les individus ne possédant pas le génotype requis seront mis à mort ou seront réutilisés dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.
Remplacement
Les animaux élevés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Il n'existe pas non plus de technique in vitro ou in silico pour déterminer le génotype d'un animal sans prélèvement de son ADN contenu dans ses propres cellules. L'ADN est spécifique à chaque individu.
Réduction
La stratégie d'accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter la production d'animaux au strict minimum. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Selon les lignées et les projets, un certain nombre d’animaux n'ont pas le patrimoine génétique requis. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype. La réutilisation participe à la réduction du nombre d'animaux utilisés globalement pour les projets scientifiques. De plus, le génotypage en amont des projets et non pas à la fin des projets scientifiques participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une alternative non-invasive pour la récupération de cellules (prélèvement buccal) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables et reproductibles. Des techniques alternatives de biopsie non invasives n'ont pas permis à ce jour d'obtenir des résultats satisfaisants. Le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Pour les jeunes individus, ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue précocement, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisées dans l'animalerie. Ils font appel à des souris génétiquement modifiées. Pour les individus nécessitant une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage, ils sont âgés de 21 à 30 jours maximum. Pour les individus nécessitant un prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille, ils sont agés de plus de 6 semaines.
Identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour la modulation de la réponse immunitaire post-greffe de cellules souches hématopoïétiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
844 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 Gy puis greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes, pour développer une maladie du greffon contre l'hôte et chercher des cibles contre la leucémie. Le porteur décrit une perte de poids, un pelage terne et des atteintes cutanées, les souris atteignant 20 % de perte de poids ou un score clinique de 5 étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients restent générales, et les souris qui n'atteignent pas les points limites sont tuées deux à trois mois après l'irradiation faute d'évolution attendue.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles dans le traitement des rechutes de leucémie aigue myéloblastique ainsi que dans la maladie du greffon contre l'hôte (maladie induite par la greffe de cellules souches hématopoïétiques lors de traitement des hémopathie malignes). Tout d'abord dans la mise en place du modèle murin de leucémie aigue myéloblastique. Ensuite dans l'identification de nouvelles cibles avec des outils technologiques innovants. Par la suite, nous tenterons de traiter les animaux avec des traitements visant les nouvelles cibles identifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider une ou plusieurs molécules thérapeutiques qui auront été identifiés via différents processus autant chez la souris que chez l'homme.
Procédures
Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Le temps total d'irradiation est de 10 minutes par souris. L'irradiation s'effectue dans une pièce adjacente à l'animalerie. Les animaux sont installés par 11 dans une cage à irradiation avec couvercle filtant. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seule ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses (+ ou - cellules leucémiques) pour un total de 100µl par souris. Le temps d'injection des cellules en comptant l'anesthésie est d'environ 1 minute par animal. Dans un second temps, les souris seront traitées selon le schéma adapté à la molécule avec des injections de 100µL de solution diluée dans une solution saline administrée par voie intrapéritonéale. Le temps d'injection des traitements est d'environ 30 secondes par animal. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois par expérience. Le temps de prélèvement est d'environ 1 minute par animal. Le volume maximale prélevé sera de 100µL. Le nombre d'intervention par souris est de minimum 2 à maximum 6.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pelage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi t. Ce score a été évalué par nos pairs spécialistes de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale. Concernant les souris simplement irradiées qui servent de validation de l'expérience, elles meurent d'aplasie. Elles auront de l'anémie et de la perte de poids. Lorsque le poids de ses souris atteint moins 20% du poids initial, ces souris seront mises à mort.
Devenir
Les animaux dont la perte de poids aura atteint 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront mis à mort ainsi que les animaux qui n'auront pas atteint les points limites deux à trois mois après l'irradiation. Pour les procédures 1, 2 et 3, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus. Pour la procédure 4, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 3 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier l’effet de molécules thérapeutiques sur le développement de la maladie du greffon contre l’hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l’utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l’hypothèse émise. Toutefois, toutes les expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo seront réalisées sur des cellules in vitro.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupées le plus possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été calculé par une approche statistique à l'aide du document « Estimation du nombre d’animaux nécessaires » de Hugues Jacobs.
Raffinement
Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 4 ou une perte de poids de 20% seront mises à mort. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établir le score clinique associé à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute souffrance. L'enrichissement et l'hébergement des animaux dépend entièrement des conditions imposées par l'animalerie. Ce qui consiste à déposer 3 enrichissements différents dans les cages comme les Nestlets, un smart home, ainsi que des Bed-r’nest. Le nettoyage des cages a lieu une fois toutes les deux semaines par les zootechniciens, mais les souris étant contrôlées tous les 2 jours par l'expérimentateur, les cages souillées sont changées rapidement.Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront mis à mort quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane et un anesthésique local type collyre d'oxybuprocaïne sera utilisé.
Choix des espèces
La maladie du greffon contre l'hôte a été étudiée depuis des décennies dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, ils possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doses d'irradiations auxquelles ils seront soumis.
Le rôle des macrophages dans le maintien d’homéostasie du testicule
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie suit un régime supprimant un gène d'intérêt, d'autres subissent une chirurgie d'injection d'une toxine, avec tatouage des phalanges et prélèvement de la queue pour l'identification, pour étudier le rôle des macrophages du testicule dans la fertilité. Le porteur qualifie ces atteintes d'"inconfort léger" en s'appuyant sur l'absence d'effets observés lors de projets antérieurs. Il affirme que la complexité des interactions cellulaires rend le modèle animal "indispensable" et repose exclusivement sur des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Notre étude se concentre sur la compréhension des interactions entre les cellules immunitaires appelées macrophages, situées dans les testicules, et les cellules avoisinantes. Nous cherchons à mieux comprendre comment ces interactions influent sur le bon fonctionnement des testicules. Les macrophages jouent un rôle clé dans la protection contre les infections et le maintien de l'équilibre dans différents organes. Le développement et le maintien des macrophages résidents dans les tissus dépendent de la disponibilité et de la localisation de facteurs de survie. Dans les testicules, nous avons identifié deux types de macrophages : ceux situés sur les tubes séminifères, appelés macrophages péritubulaires (périMac), et ceux présents dans le tissu conjonctif entre les tubes, appelés macrophages interstitiels (interMac). Ces macrophages pourraient avoir des rôles importants liés à la fertilité. Elles pourraient aussi influencer le devenir des cellules non différenciées voisines en sécrétant des substances spécifiques. Nous avons découvert que les macrophages péritubulaires dépendent de deux molécules spécifiques produites par les cellules du tube séminifère, qui constituent leur source nutritionnelle. Nous avons également identifié trois gènes potentiels qui seraient essentiels dans l'interaction entre les macrophages péritubulaires et leur source nutritionnelle. Nos objectifs sont les suivants : 1. Examiner le rôle des macrophages péritubulaires dans le processus de production des spermatozoïdes et, par conséquent, dans la fertilité. 2. Explorer la possibilité que les macrophages péritubulaires influent sur le recrutement et la différenciation des cellules du tube séminifère, qui constituent leur source nutritionnelle. 3. Investiguer les mécanismes moléculaires des interactions entre la source nutritionnelle et les macrophages péritubulaires, et confirmer l'implication de ces trois gènes potentiels dans cette interaction.
Bénéfices attendus
Les testicules ont un double rôle qui est de 1/ libérer des hormones masculines comme la testostérone et 2/ produire les spermatozoïdes. Si une des deux fonctions est perturbée, la fertilité de l’individu est grandement impactée. Les PeriMacs ont été suggérés comme des cellules importantes et essentielles à la fertilité masculine. Comprendre comment ces interactions ont lieu pourraient avoir un rôle très bénéfique pour le développement de divers traitements contre l’infertilité masculine, qui selon des estimations représenterait près de la moitié des cas de l’infertilité au sein d’un couple .
Procédures
480 souris seront sous régime alimentaire enrichi en une molécule spéciale qui supprimera notre gène d’intérêt. Ce régime durera un mois. 60 souris subiront une procédure chirurgicale pour injecter une toxine qui permettra de supprimer localement des cellules d’intérêt.
Impact sur les animaux
Lorsque les phalanges sont tatouées et des échantillons de queue sont prélevées pour identifier les souris, cela peut leur causer un léger inconfort. Cependant, dans nos expériences passées, aucune conséquence majeure n'a été observée. Quand la molécule spéciale est introduite par voie orale à travers des croquettes spéciales, cela peut entraîner une légère perte de poids temporaire chez les souris en raison d'une diminution temporaire de leur appétit pour ces croquettes. Cependant, aucune conséquence grave n'a été constatée dans nos expériences antérieures. Dans le cadre du projet précédemment validé, qui utilisait des modèles murins impliquant la suppression du gène d’intérêt dans tous les sous-types cellulaires, aucun effet secondaire n'a été observée. Cela suggère qu'il est très peu probable qu'une mutation de ce gène, ciblant un type cellulaire spécifique, ait des effets néfastes. En ce qui concerne les interventions chirurgicales, bien qu'elles puissent causer une légère douleur au niveau de l'incision après la chirurgie, cela n'a généralement pas de conséquences graves sur les souris.
Devenir
A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les différents tissus pour analyse.
Remplacement
L'utilisation de modèles in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre les macrophages et le microenvironnement (cellules stromales) au sein d’un organe (testicule). Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées. La mise en œuvre d’expériences in vitro sera réalisée quand elle fait sens comme par exemple l’étude su rôle des PeriMacs dans la différenciation vis-à-vis de leur niche nutritive à savoir les cellules péritubulaires myoïdes (ou PTMC).
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide du logiciel http://biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (80%), le niveau de risque acceptable (5%) et l'écart de moyenne attendu entre les groupes expérimentaux et contrôle (40%).
Raffinement
Le statut EOPS de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les conditions d'hébergement des souris respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE. Les souris sont élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Du coton ou du sizzel pad ainsi que des dômes pour confectionner des nids seront introduits dans chaque cage. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur et veiller à ne pas dépasser des points limites. Pour les souris qui subissent une procédure chirurgicale, un antalgique sera mis dans les biberons des cages 24H avant l’opération et 72H post opération pour minimiser la douleur suite à l’opération.
Choix des espèces
L´utilisation du modèle animal est indispensable ici car il n´est pas possible de reproduire la complexité des interactions cellules stromales/macrophages in vitro. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées repose exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte entre 8-24 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages de testicules à l’âge adulte.
Identification des mécanismes compensatoires du Csf1 dans la survie des macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue à la naissance et des administrations de tamoxifène par gavage, une partie d'entre elles étant en outre irradiées aux pattes avant une greffe de moelle osseuse et un prélèvement sanguin rétro-orbital. L'objectif est de comprendre comment les macrophages survivent lorsque les fibroblastes produisent moitié moins de Csf1, une question de recherche fondamentale sur l'immunité. Les retombées thérapeutiques annoncées, de nouvelles cibles contre des maladies comme l'ostéopétrose, restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés qu'in vivo et juge la souris "cruciale".
Objectifs
Les macrophages sont des cellules immunitaires présentes dans divers tissus, tels que la peau et le pancréas. Ils ont pour rôle d'ingérer les débris cellulaires et les agents pathogènes. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, une cytokine produite par les cellules environnantes. Sans Csf1, le macrophage n'est pas capable de survivre et disparaît de manière permanente et complète du tissu ciblé. Des résultats préliminaires du laboratoire ont montré que la survie des macrophages pancréatiques et cutanés dépend du Csf1 produit par les fibroblastes. En effet, lorsque les fibroblastes ne produisent plus de Csf1, tous les macrophages pancréatiques et cutanés disparaissent. Cependant, si nous bloquons seulement la moitié de la production de Csf1 par les fibroblastes (ce qui signifie qu'ils produisent seulement la moitié de la quantité habituelle de Csf1), les macrophages pancréatiques et cutanés survivent normalement. L'objectif de ce projet sera donc de comprendre les mécanismes compensatoires mis en place au sein du pancréas et de la peau pour permettre la survie des macrophages avec seulement la moitié de Csf1 produit par les fibroblastes. Ce projet nous permettra ainsi d'approfondir notre compréhension des interactions entre les fibroblastes et les macrophages dans les tissus, ainsi que des mécanismes permettant aux macrophages de survivre dans des conditions de carence en Csf1.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à comprendre comment les macrophages parviennent à survivre avec une quantité réduite de Csf1. Cela pourrait permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, les souris avec une mutation dans le gène Csf1 ont une quasi-absence de tous leurs macrophages. Ces souris présentent des symptômes tels que nanisme, surdité, infertilité, ostéopétrose et une mortalité élevée quelques semaines après la naissance. Cependant, l'injection de Csf1 à ces souris permet de rétablir en grande partie le nombre de macrophages présents dans les tissus ainsi que les pathologies associées. De plus, chez des souris de 2 mois avec des fractures fémorales, l'administration de Csf1 perturbe la cicatrisation et semble induire une ostéopétrose. En revanche, la régénération osseuse chez les souris âgées a pu être ramenée à des niveaux normaux uniquement en stimulant l'activation des cellules souches du squelette et bloquant le Csf1. Ces résultats mettent en évidence l'importance de réguler finement les niveaux de Csf1 dans les tissus. Ce projet permettrait ainsi d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies liées à une perturbation de la signalisation du facteur Csf1, comme l'ostéopétrose. De plus, ce projet vise à développer des outils pour manipuler les macrophages que ce soit au cours de contexte physiologiques et pathologiques.
Procédures
Procédure 1 : 846 souris seront tatouées, et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. 162 souris seront réutilisées pour les procédures 2 et 3. Procédure 2 : 90 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : 72 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront irradiées pour dépléter la moelle osseuse endogène puis injectées par voie intra-veineuse avec des cellules de moelle osseuse exogène pour reconstitution, puis mises à mort 2 mois après la greffe. Ces mêmes souris seront prélevées par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration de tamoxifène par voie orale, à l'aide d'une canule à embout flexible peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes ( nuisances légères). - Les animaux subiront une irradiation partielle des pattes arrières ainsi qu'une injection intraveineuse pour transplantation de moelle osseuse. Pendant toute la durée de l'irradiation ainsi que l'injection de moelle osseuse, les animaux seront maintenus sous anesthésie (envrion 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après l'irradiation, les aimaux se retouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées.
Devenir
A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.
Remplacement
La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, telles que la peau et le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment les macrophages peuvent s'adapter en présence de niveaux réduits de Csf1 produits par les fibroblastes ne peut être réalisé qu'in vivo puisque les facteurs compensatoires mis en place pour la survie des macrophages peuvent provenir non seulement des fibroblastes, mais également d'autres types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans le maintien des macrophages pancréatiques ou cutanés. De même, l'étude du renouvellement des macrophages au sein des tissus requiert l'utilisation de modèles animaux, car les signaux permettant la migration des monocytes à travers les tissus et leur différenciation en macrophages ne peuvent être reproduits in vitro
Réduction
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Dans le cadre de cette étude, les accouplements seront faits pour permettre que toutes les femelles soient utilisées pour les expériences concernant ce projet, et que les mâles puissent être utilisés pour d’autres projets du laboratoire. Ceci permettra d’utiliser tous les animaux générés dans les élevages.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines puisque nous nous intéressons au rôle compensatoire du Csf1 sur les macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.
Mise au point et utilisation d’un modèle expérimental d’inflammation cérébrale dans des souris immunodéficientes humanisées.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
358 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intraveineuses, une injection dans le cerveau et des injections répétées dans l'abdomen, ainsi que des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour analyser les organes touchés. Le porteur met au point un modèle d'inflammation cérébrale médiée par des lymphocytes humains, présenté comme une alternative à l'usage de primates. Il affirme que cette étude animale est "la seule" à pouvoir valider son hypothèse.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mettre au point un modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par des lymphocytes T humains. Une fois le modèle mis au point, nous pourrons questionner le rôle d’une autre population lymphocytaire présentant in vitro un caractère cytotoxique et que nous avons trouvé accumulé dans le sang, le liquide céphalorachidien et les zones inflammatoires de patients atteints de maladie neurodégénérative. In fine, nous évaluerons une thérapie à base d’anticorps pouvant spécifiquement cibler cette population lymphocytaire agressive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront doubles : (1) mise au point d’un nouveau modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par les lymphocytes T humains qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant particulièrement les cellules humaines. (2) évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant une population lymphocytaire exacerbant les signes d’inflammation cérébrale chez l’homme.
Procédures
Les souris anesthésiées seront injectées en intraveineuse (i.v.), cet acte est rapide (
Impact sur les animaux
Effet de l’injection en i.v. et de la prise de sang sur les souris=> stress lié à l’anesthésie. Effet de l’injection i.p. =>stress lié à la contention. Effet lié à l'induction de l'anesthésie profonde pour l’injection intracérébrale sur les souris => stress lié à la contention. Douleurs post-opératoires potentielles minorées par des antalgiques =>stress lié à la contention pour l'injection d'antalgiques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cibles de la maladie induite.
Remplacement
In vitro, nous avons observé une accumulation de cellules immunitaires particulières dans des d’échantillons biologiques de patients atteints de sclérose en plaque (sang, liquide céphalorachidien, coupe de cerveau). Cette observation nous amène à émettre l'hypothèse qu’elles pourraient avoir un rôle délétère dans la maladie. Cette étude chez l’animal est la seule à pouvoir nous permettre de répondre à l’hypothèse dans sa complexité et à valider la stratégie thérapeutique envisagée sans avoir recours aux grands animaux.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Deux études pilotes sont envisagées afin d'établir le protocole expériemental dans lequel seront évaluées nos hypothèses. Les procédures de cette DAP ne seront envisagées que si (1) les études pilotes sont validées et si (2) les GO/No GO inclus à la fin des expérimentations conduisent à des GO permettant de continuer l'étude pour vérifier les hypothèses. Enfin, les groupes ont été constitués grace au travail récent de scientifiques ayant présentés leurs résultats dans des journaux spécialisés et sujets à une évaluation par les paires. Les expériences pilotes et les GO/No GO permettront ainsi de réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur un certain nombre d’actes se feront sous anesthésie, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général, administration d'antalgique) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. On parle alors de souris humanisées. Le modèle expérimental proposé ici : l’humanisation de souris immunodéficientes (mâles et femelles) de 8-12 semaines de vie par l'injection de lymphocytes T CD4 +/- T CD8 humains est le seul qui nous permette de confirmer in vivo le pouvoir aggravateur des cellules CD8-NK-Like. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Rôle de l’interleukine 28 dans le rejet aigu d’allogreffe sous CTLA4-Ig
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe de peau sous anesthésie, puis des injections répétées et des prélèvements de sang, l'isolement en cage après la chirurgie ajoutant un facteur de stress. Le porteur présente une étude pilote sur l'effet d'une molécule intestinale sur le rejet de greffe et mentionne, parmi les retombées attendues, le dépôt d'un brevet. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'observer la complexité du rejet à partir des seuls échantillons de patients.
Objectifs
La transplantation d’organes est le seul traitement de certaines pathologies, elle augmente de plusieurs années la durée de vie des patients. Cependant, le système immunitaire du patient reconnaît l'organe greffé comme étranger ce qui provoque un rejet de l'organe. Plusieurs traitements sont utilisés pour contrer le système immunitaire et donc le rejet. Les traitements historiques de prévention du rejet de greffe présentent de nombreux effets secondaires, ils réduisent l'espérance de vie des patients. Un des derniers traitements développés présente moins d'effets secondaires que les traitements historiques, mais il est moins efficace pour prévenir certains rejets spécifiques. Le risque de subir un rejet avec ce traitement semble relié à l'environnement des patients et leur microbiote. Le microbiote est l’ensemble des bactéries présentent naturellement sur et dans le corps humain. Il influence la fonction des organes et cellules, il peut provoquer la production de certaines molécules. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'effet d'une de ces molécules sur le rejet de greffe. Cet effet étant totalement inconnu, cette étude sera une étude pilote. Dans un modèle de greffe de peau de souris, nous analyserons la durée de greffe et l'effet de cette molécule sur les systèmes immunitaire et digestif.
Bénéfices attendus
Les informations obtenues permettront de préparer une étude sur l’effet d’une molécule, produite par l’intestin sous l’influence de bactéries. L'influence de cette molécule sur le rejet de greffe n'est, à ce jour, pas connue. A partir du sang de patients, nous avons obtenu des résultats montrant un lien entre ces bactéries, une molécule produite par l’intestin et le risque de rejet. Il nous est nécessaire d'obtenir des informations sur ; la durée de greffe en présence de cette molécule, l’effet de cette molécule sur l’intestin, les globules blancs et sa persistance dans le sang selon la façon dont elle est donnée aux souris. Ces informations nous permettront de construire d’autres expériences s’intéressant à l’effet de la modification des bactéries de l’intestin sur le rejet de greffe et à l’effet de l’absence de cette molécule sur le rejet. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les causes du rejet de greffe des patients traités par un nouveau traitement ayant moins d’effet secondaire que les traitements historiques. Ces résultats permettront de mettre au point un test pour déterminer quels patients feront plus probablement un rejet de greffe avec ce nouveau traitement et ne donner ce traitement qu’aux patients les moins à risque. Ces résultats pourraient aussi permettre de mettre au point des traitements, qui ajouté au traitement du rejet, limiterait le rejet de greffe. Enfin ces résultats nous permettraient de déposer un brevet.
Procédures
Nous réaliserons une greffe de peau sur 42 souris, la chirurgie durera 30 min par animal. Les animaux recevront un ou deux traitements dans l'abdomen ou sous la peau ; tout les 2 jours pendant une semaine puis deux fois par semaines pendant 2 semaines (7 souris) ou tous les jours pendant 3 semaines (21 souris) ou recevront les deux types d'injection (14 souris). Les injections dureront moins d'une minute chacune. Les 42 souris seront soumises à deux prélévements de sang, à une semaine d'intervalle. Chaque prélévement durera entre 3 et 5 minutes.
Impact sur les animaux
La réalisation d'une greffe de peau peut provoquer une douleur et un stress. Les animaux seront également seuls en cage après la chirurgie ce qui peut provoquer un stress. La répétition des injections est un autre élément de stress pour les animaux. Les traitements utilisés dans cette étude ne sont pas décrits comme toxique ou douloureux.
Devenir
Mise à mort pour analyse.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats à partir du sang de patients. Mais il n'est pas possible d’observer toute la complexité du rejet de greffe à partir de ces échantillons. Le rejet de greffe est le résultat des échanges entre de nombreuses molécules et cellules. Des expériences de greffe de peau sur des souris permettront de valider les observations faites sur le sang des patients greffés. Ces expériences permettent de donner aux souris le même traitement que celui reçu par les patients et d’observer les effets de la molécule, ajoutée au traitement, sur les organes et les cellules des animaux. Nous pourrons aussi observer la durée de vie de cette molécule dans le corps.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisé dans cette expérience au maximum. Nous avons calculé que 42 souris seront nécessaire pour nos observations et nous avons réduit le nombre d'animaux contrôles. Cette étude est une étude pilote, car aucune expérience de greffe de peau n'a été réalisée avec ce traitement jusqu'à présent. Grâce à cette étude pilote nous obtiendrons des données qui serviront à calculer le nombre d'animaux nécessaire pour de prochaines expériences. Nous prélèverons du sang aux souris toutes les semaines en même temps que l'observation de la greffe, pour limiter le nombre d'animaux utilisé. Nous ferons l’expérience sur la moitié des souris pour chaque groupe dans un premier temps. Puis nous analyserons les résultats avant de faire l’expérience sur le restant des souris uniquement si nécessaire.
Raffinement
L'environnement des souris sera enrichi par des refuges, de la cellulose, des cylindres de coton tout au long de la vie des animaux. Les animaux seront en groupe jusqu'à la greffe de peau puis ils seront isolés. Les souris seront anesthésiées pour la greffe de peau et elles recevront un anti-douleur au moment de la greffe. De l'alimentation humide sera mise au fond de la cage après la greffe. La douleur sera estimée tous les jours après la greffe grâce à une grille de notation de la douleur et du stress. Si les animaux montrent des signes de douleur, ils recevront un anti-douleur plusieurs fois par jour et une alimentation humide au fond de la cage si besoin. Toutefois si une douleur se poursuit plus de deux jours ou si la souris perd plus de 20% de son poids ou si la greffe est rejetée, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de greffe de peau de souris est utilisé par de nombreux groupes de recherche depuis de plusieurs années. Ainsi nos résultats pourront être utilisés par d'autres groupes de recherche. Nous pourrons également les utiliser comme contrôles dans de futures expériences. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois car le traitement du rejet est plus efficace sur les animaux jeunes.
Évaluation de l’effet thérapeutique d’un facteur régulateur de l’immunité innée dans le cancer oral.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans la langue puis des traitements répétés, la tumeur linguale provoquant une perte de poids et des difficultés à s'alimenter, avant leur mise à mort pour analyses. Le porteur teste une molécule d'immunothérapie contre le cancer oral et prévoit une hydratation systématique pour limiter la déshydratation. Il affirme que l'étape animale est "indispensable" et qu'un "organisme vivant intégré" est nécessaire avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
L’immunothérapie est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. Dans le cas du cancer, elle ne s’attaque pas directement à la tumeur, mais stimule les cellules immunitaires impliquées dans sa reconnaissance et sa destruction. Dans certains cas cette thérapie n’est pas suffisante pour induire des réponses antitumorales et traiter la totalité des patients. Cependant, d’autres voies du système immunitaire peuvent jouer un rôle critique dans le traitement du cancer. La compréhension des mécanismes activés dans ces voies ainsi que la détermination des cellules immunitaires impliquées est nécessaire. Dans notre équipe, nous avons travaillé sur les mécanismes de stimulation d’une voie de signalisation, récemment identifiée, de l’immunité innée. Cette voie induit des réponses antitumorales efficaces en synergie avec l’immunothérapie et potentiellement avec la chimiothérapie pour détruire les tumeurs. Dans ce projet, nous évaluerons l’effet thérapeutique, d’une molécule qui active cette voie de signalisation, dans différents types de cancer oraux. Cette étape de développement préclinique est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement afin d’envisager une application thérapeutique en clinique chez l'homme.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie par activation de notre voie d’intérêt permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler tous les types de tumeurs, ii) elle induit des effets toxiques chez les patients. Nous proposons donc une stratégie pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, tout en limitant les effets secondaires. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action sous-jacent peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie intra-linguale aux animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Puis certaines de ces souris recevront ensuite le traitement par voie intra-tumorale ou sous-cutanée dans le palais de la bouche sous anesthésie (3 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Deux prélèvements de sang seront réalisés, le premier 3h après l’administration des traitements puis le second, 17 jours après (durée du geste inférieur à 30 secondes). Certaines souris recevront également un traitement directement dans l’abdomen à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines (durée du geste inf à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non toxique et non douloureux dans un site sensible sur des animaux anesthésiés. L’un des effets attendus de ces essais est la perte de poids due au développement de la tumeur dans la langue et aux difficultés à s’alimenter Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux dans un site sensible sur animaux anesthésiés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur de courte durée) Lors des prélèvements sanguins, une légère douleur liée à la piqure est attendue. Cette douleur sera de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet découlent de résultats obtenus in vitro à l’aide de lignées cellulaire en culture. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action de nos molécules d’intérêt Néanmoins, malgré les méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en immunothérapie. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de ce traitement.
Réduction
Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous suivrons la croissance des tumeurs dans la bouche à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Les analyses des populations de cellules immunes ou la comparaison des tailles de tumeurs à des points de cinétiques précis seront évaluées à l'aide des tests non paramétriques Anova et Kruskal Wallis. Si les résultats de la procédure 1 ne sont pas concluants, tout sera arrêté et donc les autres procédures ne seront pas réalisées.
Raffinement
Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés spécifiquement au moins deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur et appliquer les points limites décrits dans la procédure correspondante et selon la grille de score fournie en annexe. Si besoin, les souris seront surveillées quotidiennement en fonction de l’évolution tumorale. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Une hydratation systématique par injection de Ringer Lactate sera mise en place pour prévenir toute déshydratation induite par le développement de tumeurs dans la bouche. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques. Des compléments alimentaires seront mis à disposition dès la greffe des tumeurs pour habituation et afin de faciliter la prise alimentaire. Toutes les souris seront anesthésiées lors des manipulations et recevront des analgésiques pour les gestes douloureux.
Choix des espèces
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Après la démonstration in vitro et avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse, l'évaluation préclinique de ces traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Cette étape est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques, permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Par ailleurs, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées qui sont disponibles. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 semaines et 6 mois) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique. Enfin, l’âge adulte permet d’étudier un système immunitaire mature.
Barrière immunitaire aux produits de thérapie génique : mécanismes et nouvelles stratégies d’évitement chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injectées de cellules immunitaires puis d'un vecteur de thérapie génique dérivé d'un virus adéno-associé, 4 610 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Selon les parties du projet s'ajoutent une injection sous la peau ou dans le derme, des injections intrapéritonéales répétées d'agents immunomodulateurs, jusqu'à 15 pour le méthotrexate, et des prises de sang répétées, jusqu'à 9 en six mois dans la première partie. Le projet vise à comprendre la réaction immunitaire contre ces vecteurs, que le porteur dit "bien tolérés chez l'homme" et dont plusieurs ont déjà reçu une autorisation de mise sur le marché, et à mettre au point des co-traitements pour l'atténuer. Les prises de sang, mandibulaires, se font "sur animal vigile", sauf exception rétro-orbitaire sous anesthésie générale, et le porteur range l'"anesthésie préalable" parmi ses mesures de raffinement pour ces prélèvements.
Objectifs
Les vecteurs dérivés de virus adéno-associés (AAV) sont les plus utilisés en thérapie génique dans le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont bien tolérés chez l’homme, et leur bénéfice thérapeutique est tel que plusieurs d’entre eux ont reçu des autorisations de mise sur le marché. Cependant, quelques barrières subsistent et viennent limiter leur efficacité et leur utilisation. L’une d’entre elles est la barrière de la réponse immunitaire. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de l'organisme en éliminant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration du vecteur de thérapie génique d’origine virale, puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer le produit injecté. Fort heureusement, certaines stratégies basées sur la modification des composants du vecteur ainsi que sur l’utilisation de médicaments immunomodulateurs visant à réduire la réponse immunitaire, peuvent atténuer ces effets immuns délétères en induisant une tolérance immune permettant ainsi un bénéfice thérapeutique pour le patient. Toutefois, ces stratégies sont encore mal maîtrisées. Afin d’élargir l’application de ces traitements au plus grand nombre de patients et de maladies génétiques différentes, notre projet vise, chez la souris, à caractériser certains paramètres impliqués dans l’établissement d’une tolérance immune à l’encontre des vecteurs AAV et à développer des co-traitements immunomodulateurs plus efficaces et moins toxiques pour le patient. Plus spécifiquement, nous étudierons à l’aide de différents modèles de souris les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T et B, et le rôle du ciblage par les vecteurs AAV de certains tissus tels le foie ou le muscle dans la balance immunité/tolérance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier certains aspects de la tolérance immunitaire vis à vis des vecteurs AAV en disséquant les réponses lymphocytaires qui sont induites de manière différentielle en fonction du tissu et des cellules ciblées par le vecteur. Il permettra aussi de définir les caractéristiques du vecteur AAV qui peuvent diminuer la réponse immunitaire, et idéalement, induire une tolérance robuste. Enfin, il permettra de proposer de nouveaux traitements immunosuppresseurs adaptées à ces traitements AAV innovants. Comme nous l’avons fait depuis 20 ans, les résultats que nous obtiendrons seront rapidement publiés dans des revues internationales afin de renforcer la connaissance de la communauté scientifique sur le sujet et, le cas échéant, d’accélérer le passage en phase préclinique de certains vecteurs AAV développés par notre institution ou par d’autres.
Procédures
__ Partie 1 du projet : Les souris receverons deux injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie après 24 heures par 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire). Les souris seront ensuite suivies sur une période allant de 2 semaines (avec 2 prélèvements de sang), à 6 mois (avec 9 prélèvements de sang). __Partie 2 Les souris receverons trois injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, 1x injection du vecteur médicament AAV après 24 heures (intraveineuse ou intramusculaire), et 1x injection après quelques semaines (voie sous-cutanée ou intradermique). Les prélèvements de sang seront bimensuels pour le 1er mois (2x); ensuite mensuels. Leur nombre total sera défini par le temps de suivi qui sera choisi en fonction des résultats de la partie 1. __Partie 3 Les souris receverons trois injections : 1x Injection de cellules immunitaires au niveau de la veine caudale, 1x injection du vecteur médicament AAV (veine caudale ou voie intramusculaire), 1x Injection de cellules à tolériser au niveau de la veine caudale. Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois (4x), puis plus espacées jusqu’à la fin. __Partie 4 Les souris receverons d’abord deux injections : 1x Injection de lymphocytes (intraveineuse), 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire) Avant ou après l’injection du vecteur, injections répétées par voie intrapéritonéale d’agents immunomodulateurs. Le nombre de ces injections variera en fonction des agents. Par exemple : 3 à 5 fois/ semaine pendant 1 à 3 semaines pour le methotrexate (3 à 15x en tout). Prélèvements de sang mensuels sur 6 mois (6x). __Partie 5 Mêmes interventions que les parties 1 à 4, mais réalisés sur des males.__ Injections intraveineuses (veine caudale), intrapéritonéales et sous-cutanées effectuées sur animal vigile, durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques pratiqués (injections intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, prélèvement de sang) pourraient conduire à de faibles nuisances pour l’animal, tel qu’un stress léger et une douleur aigue de très courte durée. Les administrations intramusculaires et intradermique, sous anesthésie légère, seront sans douleur. Lors de nos études précédentes, aucun effet indésirable ou toxicité n’ont été observés chez les animaux traités par les vecteur-médicaments AAV ou des cellules immunitaires
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des populations lymphocytaires dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement par rAAV (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement mis à mort. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, sur les mêmes individus, nous analysons le maximum de tissus des animaux post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal. (4) Dans la plupart des procédures, nous avons évité de répliquer les groupes contrôles en testant les vecteur-médicaments AAV deux par deux. Ceci réduit le nombre total de souris contrôles d’un facteur 2. Il n’est pas possible de tester plus de 2 vecteurs à la fois pour des raisons pratiques de lourdeur expérimentale.
Raffinement
De manière générale, les expérimentateurs qui travailleront sur ce projet ont en plus de leurs formations plusieurs années d’expériences quant à la manipulation des souris. Ils sont donc très sensibilisés au bien-être animal, ce qui permet de facto de limiter stress et angoisse des animaux afférents par exemple aux simples gestes de contentions. Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques préalable pour les injections intramusculaires et intradermiques, suivi vigilant de l’état des animaux). Il est à noter que ces types d’injection classiques sont pratiquées chez l’homme sans anesthésie, ni administration d’analgésique. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront quand même observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Chez la souris, le système immunitaire est considéré comme adulte à partir de 6 semaines d’âge. Nous utiliserons donc majoritairement des souris jeunes adultes de 6-12 semaines pour étudier les réponses immunes d’organismes adultes. Les souris seront analysées et/ou euthanasiées entre 6 semaines et 6 mois afin d’évaluer les réponses immunitaires précoces et tardives, respectivement. Le cas échéant, des évaluations à plus long-terme pourraient être menées.
Etude de l’efficacité des nouvelles cellules porteuses d’un récepteur antigénique chimérique dans le traitement des tumeurs hématologiques et solides dans un modèle murin immunodéficient. Établissement utilisateur 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
120 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines puis des injections de lymphocytes modifiés, la croissance des tumeurs étant suivie par imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre une grande taille, provoquer une détresse respiratoire ou une paralysie des membres arrière avant l'application du point limite. Il affirme que les études précliniques sur animaux sont "incontournables" et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité in vivo.
Objectifs
L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers agressifs. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre des antigènes de la tumeur (ou Adoptive Cell Transfer). Malgré son efficacité dans le traitement de cancers hématologiques, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Nous avons développé des cellules qui présentent une activité anti-tumorale supérieure aux cellules CAR classiques dans nos modèles in vitro. Nous hypothétisons que ces cellules CAR seront plus efficaces dans les tumeurs hématologiques mais aussi contre les tumeurs solides. Ce projet vise donc à étudier : L’efficacité anticancéreuse des nouveaux lymphocytes humains T activés in vitro et exprimant des récepteur CAR (Chimeric Antigen Receptor) dans un modèle de xénogreffe humaine de lymphome et deux modèles de cancer solide du poumon) et du pancréas. Nous étudierons l’effet de l’injection des lymphocytes T humains (issus des donneurs sains) et exprimant un récepteur chimérique (CAR) dans des souris immunodéprimées supportant une xénogreffe des cellules humaines de cancer du pancréas, lymphome ou de cancer du poumon et qui expriment le gène de la luciférase. Nous suivrons la croissance tumorale par imagerie luminescente.
Bénéfices attendus
La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.
Procédures
Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.
Réduction
Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.