Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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Etude de la réponse immunitaire contre les stades sanguins de l’infection humaine par Plasmodium chez la souris et mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la plupart dans des procédures classées modérées. Rendues immunodéficientes et greffées avec des cellules humaines, elles reçoivent des injections intra-hépatiques dès la naissance, des injections et prélèvements de sang parfois quotidiens, des repas sanguins de moustiques sous anesthésie et une phalangectomie pour le génotypage, afin d'étudier la réponse immunitaire contre le paludisme. Le porteur affirme que l'infection par les Plasmodium humains n'aura "aucun impact" sur les souris et les maintient en confinement sanitaire dont elles ne sortent pas. Il présente ces souris greffées comme un moyen de s'affranchir des modèles simiens, dont l'accès reste complexe "en termes d'éthique et de coût".
Objectifs
Ce projet vise à mieux caractériser la biologie des stades érythrocytaires des Plasmodiums humains, responsables des symptômes du paludisme (ou malaria), et leurs interactions avec l’hôte humain, en particulier avec le système immunitaire, afin de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. En particulier, l’accès à de nouveaux modèles de souris contenant les cellules humaines cibles des Plasmodiums humains et un système immunitaire humain permettra de répondre à des questions nécessitant une étude in vivo, telles que l’induction de réponses immunitaires anti-parasitaires au sein de différents tissus réservoirs du parasite, comme la moelle osseuse ou la rate, difficiles d’accès chez l’homme. Ces modèles permettront de s’affranchir des modèles simiens, utilisés jusque-là pour ce type d’études, mais dont l’accès reste complexe en termes d’éthique et de coût. De plus, ces nouveaux modèles murins seront plus spécifiques dans la mesure où ils permettront l’étude de cellules humaines infectées par le parasite et non celles de cellules simiennes, et cela même si ces dernières sont permissives à l’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de caractériser différents paramètres encore mal définis de la biologie des parasites Plasmodiums et de leur interaction in vivo avec l’hôte infecté. En particulier, il permettra de définir la localisation des parasites dans les différents tissus de l’hôte (pour certains des « réservoirs » des parasites sexuées ou asexuées), et leur interaction avec le système immunitaire au niveau de ces tissus. Grâce aux résultats obtenus, le projet permettra d’approfondir les connaissances actuelles sur la biologie des parasites Plasmodiums humains, dont certains restent encore très mal connus, et les différents acteurs de la réponse immunitaire impliqués dans la défense contre ces parasites. A plus long terme, les connaissances acquises permettront de mettre au point de nouvelles stratégies anti-parasitaires thérapeutiques et vaccinales.
Procédures
- 1 Injection intra-hépatique de cellules humaines à des souris nouveau-nés (2 secondes) par animal. - 1 injection hydrodynamique - 6 Injections de cellules intraveineuse (quelques secondes) maximum par animal sous anesthésie gazeuse. - Injections intrapéritonéales (quelques secondes) maximum 6 par animal. - Prélèvements de sang (quelques secondes) : 1 prélèvement à 10-12 semaines de vie de 50µl, puis 1 / jour pendant 1-4 semaines de 10 µl par animal. - 2 repas sanguins maximum (piqûre de moustiques) de 5-10 minutes sous anesthésie générale par injection. - Imagerie sous anesthésie gazeuse (isofluorane) 10 minutes maximum. 1 à 3 par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liés à leur statut immunodéficient et le risque d’infection, aux injections et prélèvements de sang, dont certains quotidiens, qui incluent également les repas sanguins par des moustiques. Une légère douleur peut être associée avec l’identification par phalangectomie avant l’âge de 8 jours sur les animaux greffées ou non afin de réaliser un génotypage de tous les individus,. Il est à noter que les infections par les Plasmodium humains n’auront aucun impact sur les animaux car n’induisant aucun des évènements qui provoquent des symptômes (en particulier l’obstruction des vaisseaux sanguins) chez la souris.
Devenir
Tous les animaux (même contrôles non infectés) seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés du fait de leur implication dans des expériences d’infection par un pathogène humains et de leur hébergement dans une animalerie A3 de laquelle ils ne peuvent pas sortir pour des raisons de sécurité sanitaire.
Remplacement
Ce projet vise à mettre au point et à valider des souris contenant des globules rouges et/ou des cellules de foie humains et un système immunitaire humain comme modèles d’étude in vivo du cycle de vie des parasites humains Plasmodium dans différents organes dits « réservoirs » des parasites. Nous étudierons en particulier la moelle osseuse, et la rate et la réponse immunitaire humaine associée à l’infection en fonction de ces organes. Or, à l’heure actuelle, il n’existe aucun moyen in vitro de reproduire une réponse immunitaire, en particulier celle qui se déroule dans un organe. Ces organes (moelle osseuse et rate) sont d’autre part pour des raisons éthiques évidentes difficiles d’accès chez les patients infectés par des parasites Plasmodium. Le recours à ce type de modèles de souris greffées par des cellules humaines permettra donc de disposer d’un modèle expérimental d’infection par les parasites humains autre que simiens d’une part d’analyser à court/moyen termes le parasite et la réponse immunitaire in vivo, et à plus long termes pour tester de nouvelles approches thérapeutiques anti-parasitaires et vaccinales.
Réduction
- Une analyse statistique rigoureuse permettant d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque procédure a permis d’établir au mieux chaque procédure. L’analyse statistique se fera par « Student t test » ou par test ANOVA. Si la distribution des variables ne suivait pas une loi normale, un test de Mann-Whitney serait utilisé. - De plus, les modifications génétiques apportées dans nos animaux permettront d’augmenter la production de cellules humaines dans ces animaux et donc d’accroitre la reproductibilité des animaux chimères, ce qui pourra permettre au final de diminuer le nombre d’animaux à éliminer car trop faiblement porteurs de cellules humaines, et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. La reproductibilité des résultats sera également renforcée par l’utilisation de cellules humaines issues du même donneur pour un même lot de souris.
Raffinement
Pour chaque procédure, du fait de leur immunodéficience, les animaux utilisés seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes (SPF) avec des cages autoclavées, et nourriture et boisson stériles, pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements, repas sanguins, imagerie) seront réalisés sous poste de sécurité microbiologique (PSM) et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de Vétédine. Les animaux seront observés quotidiennement et évalués au minimum 3 fois par semaine pour quantifier tout signe d’inconfort (posture de souffrance ; texture de poil non soignée ; activité réduite), qui seront notifiés dans une grille pré-établie pour le calcul d’un score, avec pour chaque score une intyervention associée (surveillance accrue, mise à mort des animaux). Tout signe d’infection remettant en cause à la fois le bien-être des animaux et la qualité des résultats scientifiques conduira à la mise à mort des animaux. Les réveils post-anesthésie seront suivis, en particulier ceux impliquant une anesthésie. L’utilisation de crème analgésique sera utilisée après repas sanguin si des signes de grattage étaient observés. Du gel hydrique sera donné aux animaux si des signes d’inconfort existant mais ne nécessitant pas la mise à mort des animaux, étaient observés. Un igloo sera systématiquement rajouté dans les cages pour permettre aux animaux de rester au calme, un besoin spécifique aux lignées murines utilisées. De nouvelles mutations génétiques non dommageables seront tester pour synergiser ou remplacer un traitement, en général non délétères, et destinés à éliminer les cellules phagocytaires des souris, mais délicat à injecter pour les liposomes. Les modifications génétiques généralement utilisées en recherche et visant à éliminer des cellules de foie des souris afin favoriser la greffe d’hépatocytes humain, sont généralement très délétères. Elles seront remplacées dans notre projet par 2 approches beaucoup moins dommageables pour les animaux : soit un traitement par des anticorps à une dose optimisée, soit une seule injection intraveineuse d’une construction virale, ayant également pour objectif d’éliminer des cellules de foie de souris.
Choix des espèces
La manipulation génétique des souris de laboratoire a permis la mise au point d’animaux immunodéficients uniques permettant la greffe de cellules humaines sans qu’elles soient rejetées, en particulier des cellules sanguines. Cette greffe aboutit à la présence dans ces souris d’un système immunitaire humain mais également de globules rouges humains, les seules cellules infectables par Plasmodium humains avec les globules rouges de certaines espèces simiennes. De tels modèles de souris contenant des cellules humaines permettent la mise au point et la validation de nouvelles stratégies thérapeutiques et de vaccins, en permettant d’évaluer la protection des animaux traités ou vaccinés après leur infection par des Plasmodium. Ces modèles de souris chimériques permettront donc d’effectuer des tests dits pré-cliniques vaccinaux et thérapeutiques contre une infection par un Plasmodium humain, sans que les animaux ne souffrent des symptômes de la maladie, du fait d’attachement des globules humains parasités aux vaisseaux sanguins des animaux. Les animaux seront greffés par des cellules humaines entre 1 et 4 jours après la naissance. En effet, de nombreux travaux antérieurs ont montré que la prise de la greffe des cellules progénitrices de cellules sanguines humaines était supérieure lorsque les animaux étaient greffés quelques jours après la naissance. Cela s’explique par la présence à cet âge de facteurs favorables au développement de ce type de cellules et également par le fait que les cellules des souris sont moins aptes à cet âge de rejeter les cellules humaines greffées. Egalement, le fait de greffer les cellules sanguines en même temps que les cellules de foie humaines permettra de s’assurer que les cellules sanguines humaines ne rejetteront pas les cellules de foie humains qui seront greffées ultérieurement. Les souris greffées devenues adultes (au moins 12 semaines) seront infectées par des globules rouges humains parasités de Plasmodium.
Infection à Staphylococcus aureus : nouvelles thérapies et réponses de l’hôte dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par Staphylococcus aureus en intraveineuse, puis reçoivent des composés par voie intrapéritonéale chaque jour pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang répétés à la queue sur animal vigile, pour tester de nouvelles molécules antibactériennes. Le porteur suit la survie des animaux et indique que les injections et prélèvements provoquent une douleur légère et un stress lié à la contention. Il justifie le recours à la souris par un nombre croissant de souches résistantes qui font de la recherche de nouvelles molécules un "véritable challenge thérapeutique".
Objectifs
Staphylococcus aureus est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste. C’est l’une des bactéries le plus souvent isolée à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. L’incidence annuelle des bactériémies à Staphylococcus aureus (BSA) dans la population générale est évaluée à 28 pour 100 000 en Europe avec un taux de létalité variant de 22 à 26%, et la BSA est un facteur de mauvais pronostic au cours des pneumonies nosocomiales à Staphylococcus aureus. Également, les infections ostéoarticulaires à Staphylococcus aureus sont caractérisées par un risque élevé d’échec thérapeutique, de séquelles, et de morbidité à long terme. En effet, si un traitement antibiotique existe contre les infections à Staphylococcus aureus, on observe un nombre croissant de souches résistantes (10 à 40 % des cas de BSA) faisant de la recherche de nouvelles molécules actives contre ce type d’infection un véritable challenge thérapeutique. Dans le cadre d’une collaboration, nous avons identifié un certain nombre de nouveaux composés de synthèse ayant une forte activité antibactérienne contre différentes espèces de bactéries parmi lesquelles Staphylococcus aureus. Le but de ce projet est donc de confirmer les résultats obtenus in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus dans un modèle murin d’infection.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Staphylococcus aureus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection, de plus en plus de souches résistantes apparaissent, et la découverte de nouveaux traitements constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.
Procédures
Les souris seront infectées une fois par voie intraveineuse, puis traitées une fois par jour pendant 5 jours par voie intrapéritonéale avec les composés à tester. Des prises de sang seront effectuées sur les souris vigiles par prélèvement de 5 microlitres dans la veine caudale, 4h, et 1, 2, 3, 5, 7 et 10 jours post infection. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées par ailleurs. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront au cours de ce projet une injection intraveineuse et des injections intra péritonéales répétées (une fois par jour pendant 5 jours) ainsi que plusieurs prises de sang par incision de la veine caudale. Tous ces actes entrainent une douleur légère et un stress dû à la contention.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure. Ces animaux ayant été infectés, il n’est donc pas possible de les réutiliser, de les replacer ou de les adopter.
Remplacement
Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats précédents.
Raffinement
En termes de raffinement, les animaux seront réceptionnés à l’animalerie une semaine avant le début des expériences pour adaptation et hébergés par groupe de 5 dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Les animaux seront surveillés quotidiennement et à chaque intervention par les responsables du projet. En cas d’apparition de signes de souffrance et/ou de lésions, la surveillance serait renforcée et les plaies désinfectées. En cas de persistance de l’un ou l’autre de ces signes au-delà de 24h, le ou les animaux concernés serai(en)t immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs.
Le TWEAK soluble, un nouveau biomarqueur de la neuro-inflammation au cours de la sclérose en plaques ?
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection, provoquant une paralysie partielle, une perte de poids et des troubles du comportement, avec mise à mort dès un score clinique élevé maintenu deux jours. Le projet cherche à valider une protéine sanguine comme biomarqueur de suivi de la sclérose en plaques. Le porteur revendique un modèle "crucial et indispensable" tout en décrivant les modèles in vitro et la cohorte humaine qu'il utilise en parallèle.
Objectifs
L'objectif global de notre étude est de déterminer si la protéine TWEAK du sang peut être utilisée comme indicateur par les médecins pour le suivi des patients atteints de sclérose en plaques (SEP). À cette fin, nous devons d'abord déterminer quelle est la fourchette normale des valeurs de TWEAK dans le sang et quels sont les facteurs qui influencent son dosage (par exemple, les variations de la protéine au cours de la journée, la production d'anticorps contre TWEAK, etc.). Dans un deuxième temps, nous regarderons s’il y a une relation entre la quantité de cette protéine dans le sang et l'inflammation qui se produit dans le cerveau, et si/comment TWEAK pénètre dans le cerveau à partir du sang. Enfin, nous étudierons les avantages potentiels de la production d'anticorps dirigés contre TWEAK par certains patients et déterminerons s’ils les protègent de certains effets de la maladie. De plus, les symptômes gastro-intestinaux sont fréquents dans la SEP. Un de nos objectifs est aussi de déterminer si pendant la SEP chez la souris, des troubles des fonctions du tube digestif apparaissent en lien avec le système nerveux et TWEAK.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe pas d'outils non invasifs et fiables pour le suivi des patients atteints de SEP. Nous proposons cet outil de biomarqueur sanguin pour le suivi neuroinflammatoire de ces patients. L'utilisation du modèle murin d'EAE est cruciale et indispensable en ce sens. Actuellement, nous ne sommes pas en mesure de suivre les patients de manière rigoureuse et quantitative. Nous nous fions aux IRM utilisant un rehaussement à base de gadolinium pour indiquer la charge de la maladie. Cependant, nous ne sommes pas conscients des problèmes à long terme des agents de contraste utilisés durant l'IRM, et elles restent inaccessibles et coûteuses pour la plupart des patients, notamment ceux qui vivent loin des hôpitaux ou centres d’IRM. Enfin, en plus des IRM, les neurologues dépendent des symptômes cliniques du patient pour évaluer et réévaluer le succès des thérapies de modification de la maladie. Ces symptômes restent qualitatifs et des études ont montré qu'ils n'ont aucune corrélation avec ce qui se passe au niveau du SNC. Par conséquent, l'avantage de notre étude est de mettre au point un outil capable de mesurer la neuroinflammation et la progression de la maladie de manière quantitative, non invasive, peu coûteuse et accessible. De plus, l’étude exploratoire concernant les effets gastro-intestinaux de TWEAK pendant l'EAE nous permettra de comprendre les effets de cette cytokine sur un symptôme très courant chez les patients SEP et impactent la qualité de vie. Cette étude pourra fournir des informations precieuses pour comprendre les interactions entre l'axe cerveau-intestin médié par l'interaction du système immunitaire avec les deux qui sont sous-jacents à ces symptomes. En fin, toutes nos études peuvent aider à identifier de nouvelles cibles therapeutiques pour la neuroinflammation et les symptomes gastro-intestinaux chez les patients atteints de SEP, tout en contribuant à une meilleure comprehension des interactions entre ces differents systems durant la santé et la maladie.
Procédures
Parmi les 240 animaux, 150 seront induits en EAE. Ces animaux subiront deux injections pour induire l'EAE. Parmi ces 150, 30 recevront une injection de TWEAK murin recombinant une fois, et nous prevoyons de prélever du sang sur 30 autres animaux à trois reprises sur une période de 24h sous anesthésie gazeuse. Ces deux protocoles, seront réalisés par un manipulateur expérimenté.
Impact sur les animaux
Nos animaux modéliseront la SEP et on observera donc une diminution de la mobilité. Le modèle EAE est bien établi et constitue le modèle de SEP le plus utilisé avec plus de 15 000 publications depuis sa découverte . Le pic de sévérité de l'EAE se manifeste entre 21 et 23 jours après l'induction de la maladie, où on peut observer une paralysie partielle, ainsi qu’une diminution du poids corporel et de la consommation de nourriture et à des troubles du comportement. Ces effets indésirables peuvent persister tout au long de la période de la maladie. Une récupération partielle peut être observée à partir de 20 jours environ.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 21 à 23 jours après l'induction à l'EAE. Cependant, si les souris atteintes d'EAE présentent des manifestations cliniques graves, mesurées par un score clinique égal ou supérieur à 4 pendant deux jours consécutifs, elles seront mises à mort avant cette periode pour éviter une souffrance plus longue.
Remplacement
Notre équipe est engagée dans la réduction de l'utilisation des modèles animaux autant que possible, tout en garantissant que nos travaux de recherche soient pertinents et fiables. Nous avons déjà mis en place des modèles in vitro pour réduire au maximum le nombre d’animaux qui serviront au progres scientifiques dans notre projet, mais dans le cadre de notre étude, le modèle murin d'EAE est le mieux adapté à notre objectif. Notre exploration combine des modèles in vitro, des modèles de souris et des travaux cliniques. Nous allons donc réduire notre dépendance à l'égard de l'extrapolation de données provenant d'animaux en utilisant des lignées cellulaires qui imitent l'organisme humain au niveau cellulaire. Par exemple, nous n'utiliserons pas le modèle murin pour déterminer comment, au niveau transcriptomique et moléculaire, TWEAK module l'inflammation. Nous utiliserons plutôt des lignées cellulaires immortalisées humaines d'intérêt, telles que des lignées cellulaires permettant d’établir un modèle de barrière hémato-encéphalique, de macrophages, etc. Pourtant il est à l’heure actuelle impossible de retracer l'origine et le devenir de la molécule TWEAK dans un système in vitro suffisamment abouti pour reproduire la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, et multisystemiques dans l’organisme. En d'autres termes, il n'existe pas de cadre complet utilisant par exemple des organoïdes qui imiteraient le métabolisme d'une cytokine in vitro pour examiner sa cinétique à partir du cerveau, du foie, des reins, des poumons et d'autres organes pertinents. De plus, nos études d'IRM seront directement effectuées sur notre cohorte humaine, allégeant ainsi la charge d'utilisation de souris supplémentaires. Nous allons également directement incuber les cellules humaines avec les sérums de patients SEP au lieu d’injecter des souris avec
Réduction
Nous prenons au sérieux notre engagement à minimiser l'utilisation d'animaux et à respecter les principes des 3R dans nos recherches. Nous nous limitons donc réellement aux expériences et protocoles indispensables, évitant les répétitions inutiles et utilisant des méthodes alternatives lorsqu'elles sont disponibles. Comme on peut le constater dans la section 4.2, le nombre d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est adéquat et rigoureux : il n'implique pas un trop grand nombre d'animaux (et donc un gaspillage), tout en conservant sa force statistique. Nous avons déterminé le nombre minimal et nécessaire d’animaux à n = 240 (90 témoins et 150 EAE). Il est important de noter que nous utilisons les mêmes animaux pour réaliser diverses expériences plutôt que d'en utiliser davantage. Nous pensons que le partage des animaux et du matériel biologique est nécessaire pour réduire le nombre d'animaux requis. Ainsi, lorsque cela est possible, nous prélèverons tous les organes dont nous avons besoin sur les mêmes animaux que ceux utilisés pour d'autres protocoles. Il convient de noter que nous n'utiliserons que des femelles, car l'inoculation de l'EAE chez elles a un taux de réussite plus élevé que chez leurs homologues masculins, ce qui contribue une fois de plus à réduire le nombre d'animaux. De plus, nous utilisons des tissus cérébraux de souris EAE conservés d’études précédentes pour effectuer les mises au point techniques préliminaires.
Raffinement
Nous sommes conscients que des souris en bonne santé sont essentielles pour mener une science de qualité, et nous nous engageons à prendre en compte le bien-être de nos animaux dans toutes les étapes de notre recherche. Nos protocoles d'induction de l'EAE se font par immunisation avec un peptide et l'administration d'une toxine (en sous-cutanée). Nous effectuerons des visites quotidiennes aux souris et les pèserons quotidiennement pour nous assurer qu'elles sont correctement nourries et nous surveillerons leur comportement et leur état général en nous basant sur la grille d’évaluation des symptômes cliniques de l'EAE dont le score va de 0 à 5. (0 : Aucune modification, 1 : queue molle, 2 : queue molle et faiblesse des pattes arrière, 3 : queue molle et souvent paralysie complète des pattes arrière, 4 : queue molle, paralysie complète de la patte arrière et partielle de la patte avant, 5 : la souris se roule spontanément dans la cage et la mise à mort et recommandée). Ainsi dès le score 2, nous surveillerons la prise hydrique et alimentaire et nous mettrons en place une analgésie, qui sera ajustée en fonction du score. Si les animaux n’arrivent pas atteindre la nourriture et l’eau du fait des troubles moteurs, nous mettrons la nourriture et l’eau à même le plancher de la cage. L’euthanasie est envisagée à partir d'un score 4 observé deux jours consécutifs. Le microenvironnement des souris sera enrichi de dômes en plexiglas ou en carton. Les souris auront accès à de la nourriture et de l'eau fraîches en permanence. Les conditions de logement pour les souris seront optimisées ; les cages seront aménagées pour permettre aux souris d'exercer leur comportement naturel et leur offrir des environnements enrichissants. Les stimuli de l'environnement extérieur seront réduits au minimum pour éviter de stresser les souris, et on maintiendra le nombre d’animaux par cage à 5.
Choix des espèces
Le modèle EAE a permis la publication de plus de 15000 articles et a servi de point de départ au développement de différentes thérapies pour la SEP. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de la SEP mais qui ne reproduisent pas tous les symptômes physiques ou les mécanismes physiopathologiquees de la SEP. Le modèle EAE MOG est pertinent pour étudier la SEP sur son versant inflammatoire. Les souris EAE ont des voies immunitaires et de signalisation similaires à celles des humains et sont plus facilement manipulables que d'autres animaux tels que les primates. Puisque nous nous intéressons à l'évolution clinique et l’aspect inflammatoire de la maladie, le modèle murin EAE est le plus pertient. Des souris âgées de huit à douze semaines seront utilisées pour l'induction de l'EAE. Ce stade de development est couramment utilisé dans de nombreuses études. À ce stade, les souris sont considérées comme étant à l'âge adulte et leur système immunitaire est développé, les rendant plus susceptibles à l'EAE. De plus, c'est à ce moment-là que la prévalence de l'EAE est maximale (i.e., plus prévisible), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilises. À mesure que les souris vieillissent, leur réponse immunitaire peut varier, ce qui rend l'induction de la maladie plus variable. D’autre part, il est préférable d'éviter d'utiliser des souris plus jeunes car leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé, et elles ont également une myéline plus immature. Ces facteurs peuvent entraîner une variation importante dans la susceptibilité de l'animal à développer la maladie.
Etude de la contribution neuroinflammatoire à la spasticité post-traumatique et de sa modulation par Stimulation Transcutanée dans un modèle murin de lésion de moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On implante à chacune une fenêtre vitrée, et 450 subissent une section de la moelle épinière qui paralyse leurs pattes arrière, avant une rééducation et une stimulation électrique dont le porteur veut optimiser les réglages. Il signale une paralysie postérieure, des difficultés à vider la vessie qui imposent des massages abdominaux deux fois par jour, et une douleur résiduelle malgré les antalgiques. Les retombées annoncées pour les patients paralysés sont formulées comme un espoir, appuyé sur l'actualité d'une équipe suisse.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement et d'optimiser les paramètres de stimulation en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Compte tenu de la diversité des paramètres électriques ajustables (fréquence de stimulation, durée et intensité des impulsions, nombre de répétitions quotidienne/hebdomadaire, positionnement des électrodes relativement à la lésion...), une approche rationnelle doit être mise en oeuvre sur modèle murin. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mettre en place et valider le premier modèle souris permettant de tester l’effet de la stimulation électrique transcutanée sur la récupération fonctionnelle après traumatisme de moelle épinière. Il permettra également d’évaluer l’effet anti-spastique de cette stimulation en vue d’application à d’autres pathologies comme la sclérose en plaques, les AVC, les hémorragies, la sclérose amyotrophique… Il permettra notamment de mieux comprendre les effets thérapeutiques en fonction de la fréquence de stimulation utilisée notamment en évaluant le potentiel immunomodulateur de ces différents protocoles et leur impact neurotrophique. Il est ainsi attendu qu’une optimisation rationnelle des traitements proposés aux patients puisse être mise en place sur la base de biomarqueurs circulants choisis pour caractériser à la fois la gravité du traumatisme et sa réponse aux traitements électriques. En clarifiant les actions directes et indirectes des impulsions électriques sur le système nerveux central, ce projet permettra également de clarifier les conditions dans lesquelles l’implantation d’électrodes est requis pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité. La prise en charge des patients humains pourrait devenir à la fois moins invasive et plus efficace.
Procédures
Sur cinq ans, 750 animaux seront implantés avec fenêtre vitrée. 450 de ces souris seront soumises à une transection de moelle épinière thoracique . La paralysie transitoire des membres postérieurs sera prise en charge dans le cadre d’un protocole de rééducation et d’électrothérapie dont nous souhaitons optimiser les paramètres. Tous les animaux recevront des anti-inflammatoires en post-trauma comme en clinique humaine. 87% de ces animaux traumatisés recevront un traitement complémentaire : soit une rééducation fonctionnelle, soit une stimulation électrique transcutanée, soit la combinaison des deux traitements. La durée des expériences sera limitée à 62 jours post-trauma, sauf pour les animaux a forte récupération dont la stabilité sera évaluée sur 360 jours. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les animaux seront soumis à des sessions d’imagerie intravitale ni douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par semaine à raison de 50µl par prélèvement (sans dépasser un volume maximum de 7,5% de la volémie de l'animal de façon hébdomadaire). 20% des animaux seront soumis à une antibiothérapie préalable au traumatisme pour étudier l'impact du microbiote sur les phénomènes étudiés. La majorité des animaux sortiront du projet dans les 62 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. Les animaux ayant le mieux récupérer seront éventuellement gardé pendant 360 jours pour évaluation trimestrielle de la stabilité de leurs performances.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : diahrée post-prise antibiotiques, gêne locomotrice avec paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, stress et/ou douleur résiduelle modérée malgré la prise d’antalgique et anti-inflammatoires.
Devenir
Tous les animaux (750) seront sacrifiés soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. La majorité d'entre eux sera sacrifiée avant le jour 62. Les meilleurs récupérateurs seront conservés pendant un an pour évaluer de façon trimestrielle la stabilité de leurs facultés sensorimotrices.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. A ce jour il n’existe pas de méthodes de remplacement, mais l’actualité récente de la recherche en Suisse démontre l’intérêt de la recherche animale pour aider les patients tétraplégiques à retrouver une certaine utilisation de leurs membres. Notre modèle murin permettra de clarifier les mécanismes d’action du traitement par SET en réduisant au maximum les facteurs de variabilité (conditions traumatiques, gravité des lésions, diversité des genres, âges et conditions de vie des patients). Il permettra également de réaliser une optimisation rationnelle du traitement clinique à partir d’indicateurs difficiles d’accès chez le patient (évolution dynamique du phénotype de cellules inflammatoires).Un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test de Mann Whitney dédié aux petits échantillons. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J62. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 750 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après anesthésie gazeuse légére et injection d'antidouleurs, l'anesthésie est approfondie par injection intrapéritonéale d'anesthésique avant d'être positionnés sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant , et de l'anesthésique local appliqué avant toute incision. Après l'opération, une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton) et un accès non limité à la nourriture et l’eau. Le cycle jour/nuit, la température et l'humidité sont contrôlés. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs et dont le phénotype est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et de son comportement en font un modèle pré clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront des animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaires. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux.
Interaction neuro-immune dans les ilots pancréatiques chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras pendant douze semaines, des injections, des périodes de jeûne, une chirurgie abdominale et une perfusion dans le cœur, pour étudier des cellules immunitaires des îlots du pancréas. Le porteur indique que 3 630 souris sont tuées d'emblée parce que leur génotype est inutilisable, avant toute procédure. Il affirme que les modèles animaux sont "nécessaires" et rattache l'étude au diabète, sans bénéfice thérapeutique précis annoncé.
Objectifs
Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.
Procédures
Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).
Impact sur les animaux
-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.
Devenir
Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.
Remplacement
Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.
Etude de l’origine et de la fonction des fibroblastes associés aux tumeurs du poumon et de la vessie dans deux modèles murins de carcinogénèse chimio-induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 256 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit des cancers du poumon ou de la vessie par un carcinogène chimique présenté comme identique à celui du tabac, administré par injections ou dans l'eau de boisson pendant plusieurs semaines, pour étudier des fibroblastes qui entourent les tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs de vessie peuvent provoquer une occlusion, une rétention d'urine et des douleurs, contenues par une palpation régulière et des points limites. Il reconnaît que des cultures d'organoïdes sont à l'essai mais les juge insuffisantes, et renvoie à une perspective les retombées pour l'immunothérapie.
Objectifs
Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à une biopsie auriculaire, en vue de déterminer leur génotype, avant d’intégrer les différentes procédures. Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée est attendue lors des biopsies auriculaires nécessaire au génotypage des animaux. Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre). Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle.
Devenir
Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem
Remplacement
Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas pour l’instant de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. Seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’initier cette recherche fondamentale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici . Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure.
Raffinement
Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris seront génotypées à 3 ou 4 semaines (prélèvement auriculaire) Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.
Caractérisation du rôle de ALPK1 et du microbiote intestinal dans le traitement des dérèglements métaboliques et des maladies inflammatoires chroniques intestinales dans des modèles murins de prédiabète ou de colites induites.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages quotidiens pendant deux à treize semaines, des prélèvements de sang à la queue et une colite déclenchée par un agent chimique, qui provoque perte de poids et lésions du côlon, pour tester des bactéries censées protéger contre le diabète et l'inflammation intestinale. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule le système digestif et son microbiote, et conclut que le recours aux souris est "nécessaire". Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements des maladies inflammatoires de l'intestin, restent à l'état d'objectif.
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes et des antigènes alimentaires. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d’un système immunitaire sain. Un déséquilibre du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Les MICI sont des maladies très invalidantes dont l’incidence est particulièrement importante dans les pays industrialisés. Ces dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre et les dépenses de santé liées au diabète dépassent les 850 trillions de dollars au niveau mondial. Il est donc essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements. Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans ces maladies. Nos travaux montrent l’impact de certaines souches bactériennes sur une voie de l’immunité innée associée à l’obésité. Nous émettons l’hypothèse que l’activation de cette voie par des bactéries intestinales pourrait impacter la santé, notamment la mise en place du diabète et le développement des MICI. L’objectif de notre projet est donc d’explorer les propriétés protectrices de souches bactériennes qui activent cette voie immunitaire sur: i) l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse, ii) l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite et dans ce même modèle de colite induite après un régime riche en graisse. Ces expérimentations seront réalisées à chaque fois sur deux lignées de souris : des souris transgéniques chez lesquelles la voie imunitaire étudiée a été inactivée (et des souris ne présentant aucune mutation qui seront utilisées comme contrôles. Sur 5 ans, nous testerons 6 bactéries sur des souris contrôle et modifiées pour la voie immunitaire d’intérêt, recevant un régime riche en graisses ou/et soumises à une colite.
Bénéfices attendus
Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans le développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Il est essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements.
Procédures
Pour mesurer la glycémie des 360 animaux, 6 goutes maximum de sang seront prélevées sur une durée de quelques secondes. Un prélèvement de sang sera effectué une seule fois au moment de la mise à mort sur une durée de 10 à 15 secondes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. La récolte de fèces sera réalisée lors de l’émission naturelle de fèces par la souris (avant traitement puis en fin de procédure) pour une durée de quelques minutes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. Les gavages, effectués quotidiennement sur une période de 2 à 13 semaines, nécessitent une contention pendant moins de 10 secondes et seront également réalisés sur l’ensemble des animaux.
Impact sur les animaux
Lors des gavages aucune nuisance n’est attendue hormis le stress dû à la contention (10 secondes maximum). Les animaux soumis aux tests glycémiques subirons un stress léger de très courte durée lors de l’incision au bout de la queue pour les prélèvements de sang (1 seconde). Le prélèvement de sang final sera réalisé juste avant la mise à mort en causant un stress modéré sur 10 à 20 secondes. Les effets indésirables dû à l’agent inducteur des la colite sont perte de poids, lésions coliques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de realiser les prelevements d'organes et de tissus necessaires.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, et la réponse immunitaire. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal, la composition en lien avec les données biologiques obtenues à partir du sang et des tissus intestinaux de l’hôte
Réduction
Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des tests statistiques (10 animaux par lot) sans nécessitée de répétition ultérieure de l’expérience.
Raffinement
Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés tous les jours durant la phase d’adaptation afin de diminuer leur stress lors des prélèvements. Toutes les souris auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l’ajout d’un abri obscur en polycarbonate. Les souris seront 5 par cage pour éviter l’isolement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de façon appropriée si un problème survenait. Les équipements utilisés sont adaptés à la physiologie du petit animal telle que l’utilisation de lecteur de glycémie performant (rapide et nécessitant un volume de sang faible). Enfin, des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie ainsi que sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles permettant une reproductibilité des résultats. De plus ce modèle nous permet d’appréhender la réponse immunitaire dans son ensemble et plus particulièrement la réponse de la voie d’intérêt. Des données publiées par un groupe britannique a montré l’importance du gène impliqué dans la voie immunitaire étudiée dans ce projet dans l’équilibre intestinal en utilisant ce modèle, justifiant de l’utilisation de ces mêmes souris pour nos expériences. Nous avons choisi de travailler sur des animaux en fin de croissance de 8-10 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 252 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 982 impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par chirurgie abdominale, puis des séances d'imagerie qui les maintiennent endormies deux à quatre heures, pour étudier le rôle de cellules immunitaires dans les cancers solides de l'intestin. Le porteur affirme que les souris rencontrent "peu d'effets indésirables" liés à la tumeur, et que, faute de lignées cellulaires d'ILC, le recours au "modèle murin" est "essentiel". Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles approches contre le cancer, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Ce projet propose de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des cellules lymphoïdes innées (ILCs). Nous souhaitons identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur afin d'évaluer leur contribution directe ou indirecte dans la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons particulièrement aux réponses immunitaires impliquées dans les cancers « solides » qui représentent la majorité des cancers, et plus particulièrement ceux touchant l’intestin. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des ILCs dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer, au long terme à améliorer de la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et suite à un défi inflammatoire. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
La greffe tumorale consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes et les animaux seront sous surveillance quotidienne. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. L’injection de molécules que nous proposons d’étudier dans ce projet aura peu d’effets indésirables ou à court terme (24-72h).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
La validation de facteur des cellules lymphoïdes innées (ILCs) seront faites au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires tumorales pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de ces potentiels molécules. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier leur mode d’action. Néanmoins, les lignées cellulaires d’ILC humaines ou murines n’existant pas, les tests in vitro ne pourront pour le moment pas être réalisés. De plus, les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. De ce fait, nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec des statisticiens, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. La nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s). L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dans la mesure du possible, les expériences utilisant différentes techniques ex vivo seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis quotidiennement fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort afin de contrôler la pousse tumorale. Le nombre de cellules tumorales injectées est volontairement faible afin de prévenir une pousse tumorale trop importante. L’injection se faisant dans la partie externe de l’intestin, l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du gel hydrique et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées. Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>6 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Rôle d’une voie de l’inflammation dans l’immunodépression suite à une infection chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, la quasi-totalité en gravité sévère. Elles subissent soit une péritonite provoquée par perforation du tube digestif, soit une injection d'un composant bactérien, pour étudier le rôle d'une voie de l'inflammation dans l'immunodépression qui suit une infection grave. Le porteur indique que la péritonite peut provoquer des douleurs, une perte de poids et une réduction de la mobilité. Sur le remplacement, il affirme que des cellules isolées ne refléteraient pas la complexité de la réponse immunitaire et conclut que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
Chez les patients de réanimation présentant une infection sévère, des altérations de la réponse immunitaire se développent responsables de la majorité des décès. Les mécanismes à l’origine de ces dysfonctionnements des cellules du système immunitaire restent mal connus. L’activation d’une voie de signalisation particulière de l’inflammation pourrait participer à ce phénomène. Cette voie est activée chez des patients présentant une infection sévère hospitalisés en réanimation. Dans d’autres contextes cliniques que les infections sévères et notamment en cancérologie, des données de la littérature associent l’activation de cette voie et la survenue d’altérations du système immunitaire. L’hypothèse de recherche est que cette activation au cours des infections sévères est responsable du développement des altérations du système immunitaire. Au cours de ce projet, le rôle de cette voie de l’inflammation dans le développement des dysfonctionnements du système immunitaire après le sepsis sera déterminé en utilisant un modèle murin d’infection sévère par péritonite ou par injection d’un composant bactérien (lipopolysaccharides). L’activation de cette voie et les altérations immunitaires présentées par ces souris dans différents organes (rate, moelle osseuse, sang, péritoine, poumon) seront étudiées. Des dosages sanguins de marqueurs d’activation de l’inflammation seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les infection sévères sont une pathologie fréquente à l’origine d’une morbi-mortalité considérable. Le pronostic des patients développant ces infections sévères est principalement grevé par le développement d’une immunodépression à l’origine à moyen terme d’infections secondaires nosocomiales et à long terme du développement de maladies cardiovasculaires et de cancers. Une meilleure compréhension des mécanismes de cette immunodépression post-septique est jugée nécessaire par l’Organisation Mondiale de la Santé pour progresser dans la prise en charge de cette pathologie. En focalisant les efforts sur une voie de l’inflammation clé au cours des infections, cela permettra de générer des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir les dysfonctions immunitaires et d’améliorer le devenir de ces patients. L’existence de médicaments capables d’inhiber cette voie de l’inflammation utilisés en pratique clinique et bien tolérés dans d’autres indications rend cette perspective très concrète. Ces stratégies thérapeutiques innovantes auraient un effet préventif des conséquences à moyen et long terme de ces infections sévères.
Procédures
Le projet s’appuie sur 2 modèles murins d’infections. Le premier modèle est une infection au niveau abdominal (péritonite) créée par perforation du tube digestif (durée de la procédure : 5 minutes), les souris contrôles subissant exclusivement une incision de la paroi abdominale (durée de la procédure : 3 minutes). Cette intervention est réalisée une seule fois en début de procédure, à J0. Le deuxième modèle consiste en l’injection d’un composant bactérien (injection sur 10 secondes), les souris contrôles recevant une injection d’eau et de sel. Cette injection est réalisée une seule fois en début de procédure à J0. Les prélèvements sanguins seront réalisés exclusivement sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (1 mL, 10 secondes) et les différents autres prélèvements en post-mortem.
Impact sur les animaux
La péritonite peut être à l’origine de douleurs, d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Il existe également une douleur au point d’injection lors de l’injection d’anesthésique. L’injection du composant bactérien est à l’origine d’une perte de poids, d’une douleur au point d’injection lors de l’injection et d’une réduction de l’activité et de la mobilité.
Devenir
Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (poumon par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ne pourrait refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’utilisation d’un modèle murin est donc indispensable.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être, une prise en charge de la douleur (anesthésie générale lors de l'intervention, administration d’antalgiques) et une prise en charge de la déshydratation seront réalisées. A l'issue de la chirurgie, les souris seront replacées dans leurs cages avec un aménagement spécifique pour garantir leur confort. La cage sera placée dans une armoire chauffante. Une surveillance quotidienne avec pesée des souris et grille d'évaluation spécifique sera effectuée jusqu'à mise à mort. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Etude de la réponse du pathogène opportuniste humain Staphylococcus aureus au niveau des abcès à la suite d’une infection locale et systémique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
250 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par le staphylocoque doré, par voie sanguine ou sous la peau, pour étudier la compétition pour les métaux entre la bactérie et l'hôte, avant d'être tuées pour prélever les tissus. Le porteur indique que l'infection générale peut provoquer une perte de poids marquée, une baisse d'activité et des variations de température, et que l'infection cutanée forme une plaie purulente dès le troisième jour. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire coordonnée "ne peut être étudiée qu'au sein de l'animal".
Objectifs
Les métaux comme le fer et le manganèse sont des micronutriments cruciaux pour toutes formes de vie. L'hôte exploite ce besoin comme une arme contre l'infection, privant les organismes pathogènes comme le staphylocoque doré de ces ressources essentielles à sa survie lors d'un processus appelé "immunité nutritionnelle". Le projet vise à étudier le combat pour l’accès aux métaux entre l’hôte et le pathogène et comprendre comment S. aureus échappe à l’immunité nutritionelle. Afin d’identifier les facteurs impliqués dans l’adaptation aux changements de disponibilité en métaux, nous suivrons les réponses des deux protagonistes au cours de l’infection. Les niveaux de métaux variant selon l’organe infecté, nous utiliserons des modèles d’infection locale (infection de la peau) et systémiques (infection générale).
Bénéfices attendus
Les scientifiques du monde entier cherchent à développer de nouvelles stratégies pour lutter contre les bactéries pathogènes devenues résistantes aux antibiotiques actuels comme le staphylocoque doré. Ce dernier est une menace majeure pour la santé humaine et l'une des causes les plus courantes d'infections bactériennes. Une approche prometteuse est de perturber/empêcher l’accès du pathogène aux ressources essentielles telles que les métaux. Cependant, afin de développer et parfaire ces nouvelles approches thérapeutiques, mais aussi de limiter l’apparition de mécanismes de résistance, une compréhension détaillée des interactions complexes entre l’hôte et le pathogène pendant l'infection est essentielle. Ceci est particulièrement important au niveau des abcès car ils sont les principaux contributeurs à la pathogénicité du staphylocoque doré. En effet, il s’agit de réservoirs difficilement accesibles aux antibiotiques qui favorisent les infections chroniques chez l'Homme. Cette étude permettra donc d’établir une base solide pour le développement de nouveaux antibiotiques ciblés.
Procédures
Un groupe subira une injection intraveineuse sous anesthésie d'une durée de 5 minutes. Un autre groupe subira une injection sous la peau sous anesthésie d'une durée de 5 minutes puis 1 à 3 anesthésies d'une durée de 15 minutes pour suivre le processus infectieux.
Impact sur les animaux
Lorsque les souris sont infectées par cette bactérie, elles peuvent ressentir une certaine douleur lors de l'injection. Toutefois, cette procédure sera effectuée sous anesthésie. En raison de l'infection générale, les souris peuvent souffrir d'une perte de poids significative, d'une baisse d'activité et d'hyperthermie, voire d'hypothermie dans une phase très avancée de l'infection. Lorsque les bactéries sont injectées sous la peau, une petite lésion cutanée se forme dans les 24 premières heures en raison de la réponse immunitaire de la souris. Au bout de 3 jours, la lésion est beaucoup plus grande, et une plaie se forme. Les souris peuvent potentiellement montrer une baisse d'activité et avoir une plaie purulente à partir du 3ème jour après l'infection.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus/organes requis pour le projet.
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal telle que la souris est essentielle pour étudier les facteurs impliqués dans le combat entre le staphylocoque doré et l'hôte. En effet, la souris présente une réponse immunitaire bien caractérisée et proche de celle de l’Homme. Comme cette réponse implique l'action coordonnée de différents types de cellules de l’hôte, elle ne peut être étudiée qu’au sein de l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit autant que possible tout en conservant un nombre suffisant pour une analyse fiable. L'utilisation de chaque animal sera optimisée en réalisant différents types d'analyses sur un même animal. Une étude pilote sera menée pour déterminer le nombre de cellules infectées obtenues par souris, afin d'utiliser le plus petit nombre possible d'animaux.
Raffinement
Le projet a été conçu en intégrant des mesures pour réduire le stress et, si possible, la souffrance des animaux. Une période d'acclimatation de 2 semaines est observée avant le début des expériences. De plus, les animaux seront logés en petits groupes d'individus compatibles dans des conditions contrôlées. Des méthodes pour réduire certains des effets du stress (objets de cellulose pour la nidification ou la mastication) seront mises en place sans toutefois interférer avec le déroulement de l'infection. Les animaux seront préalablement habitués à être manipulés dans un tunnel transparent afin de réduire leur stress. L'inoculation bactérienne sera effectuée sous anesthésie générale. Des points limites ont été établis pour soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris femelles agées de 7 et 10 semaines, modèle utilisé communément dans la littérature. Ceci permettra de comparer nos résultats aux études déjà réalisées. Le modèle d'infection des souris par le staphylocoque doré a été largement étudié et montre des signes similaires de maladie comparés aux infections humaines. Lorsque les humains contractent une infection grave à staphylocoques, ils peuvent avoir notamment des bactéries dans le sang et une formation d’abcès dans de nombreux organes. Ainsi, comme nous étudions la réponse immunitaire de l'hôte après une infection à staphylocoques, il est utile d'utiliser un modèle qui ressemble le plus possible au système immunitaire humain.
Evaluation de l’activité anti-inflammatoire d’une bactérie intestinale dans un modèle murin de psoriasis cutané
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un psoriasis provoqué par une crème appliquée sur les oreilles sous anesthésie, et un gavage répété cinq jours sur sept pendant quatre semaines, pour tester une bactérie intestinale censée atténuer les lésions cutanées. Le porteur indique que le gavage répété peut enflammer la sphère ORL et le haut de l'œsophage et provoquer une perte de poids par défaut d'alimentation. Il affirme qu'aucun test sans animal ne peut intégrer la réaction immunitaire de la peau et conclut que l'étude "ne peut être conduite qu'in vivo".
Objectifs
Le Psoriasis est une maladie cutanée chronique qui touche environ 5% de la population générale. De plus en plus d'études suggèrent un rôle du microbiote intestinal (bactéries intestinales) dans le développement des lésions de psoriasis. Ces découvertes permettent d'envisager le développement de traitements probiotiques, à base de "bonnes" bactéries intestinales, qui viendraient améliorer les lésions cutanées après administration orale. Dans cette étude, nous testerons l'impact d'une "bonne bactérie" administrée par voie orale chez une souris atteinte de psoriasis. Le but est démontrer que ce nouveau type de traitement fonctionne sur un modèle de souris (amélioration du psoriasis) avant d'envisager son développement chez l'homme.
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs, une étude chez l'homme sera envisagée : nous pourrons dans ce cas étudier si un traitement oral par P. distasonis (une "bonne" bactérie intestinale aux propriétés anti-inflammatoires) permet d'améliorer le psoriasis chez l'homme.
Procédures
Le traitement à base de P. distasonis, une bactérie intestinale bénéfique, sera réalisé par gavage sur animaux vigiles, 5 fois par semaine sur 28 jours (durée 30 sec). Afin de mimer des lésions de psoriasis, une crème (imiquimod) sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives et une derniere fois après resolution de l'inflammation 7 jours plus tard (7 injections = 30sec). La mesure de la réponse clinique (mesure de l'épaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le gavage répété 5j/7 sur plusieurs semaines pourrait induire une inflammation de la sphère ORL et de la partie haute de l'oesophage. Cette inflammation pourrait entraîner une perte de poids par défaut d'alimentation. Ce modèle engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gène pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront régulièrement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines, ce qui peut génerer un stress.
Devenir
Après anesthésie, tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récupérer les organes ce qui permettra d'analyser les propriétés anti-inflammatoires de P. distasonis
Remplacement
L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact d'un candidat médicament sur un modèle d'inflammation cutanée (psoriasis). Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe (3 dosages de P. distasonis et un groupe contrôle non traité) est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Trois dosages de P. distasonis seront testés, celle-ci n'ayant jamais été testée auparavant.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cas où des animaux perdraient du poids, des aliments réhydratés seraient disposés dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisées et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique, telle que l'inflammation cutanée et notamment le psoriasis, en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au moins une semaine au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.
Discrimination de l’importance de l’immunité adaptative sur une association thérapeutique dans le cancer du côlon chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis plusieurs injections, pour comparer une association de deux traitements anticancéreux chez des souris pourvues ou privées d'un système immunitaire complet. Le porteur indique que la tumeur dans la patte peut réduire la mobilité et l'alimentation, entraîner une perte de poids et parfois des nécroses cutanées. Les retombées pour les patients sont renvoyées au "long terme", l'objectif immédiat restant de décrire la cascade immunitaire qui rend l'association efficace.
Objectifs
Notre intérêt pour l’immunothérapie a explosé ces dernières années grâce à l’apparition de nouveaux types de traitement. Ces traitements sont capables de permettre la mise en place d’une réponse de longue durée contre le cancer mais chez un nombre limité de patients. Un autre traitement appelé anti-VEGFR2 empêche la création de nouveaux vaisseaux sanguins dans la tumeur, limitant ainsi la croissance tumorale en la privant des nutriments et de l’oxygène apportés par le sang. Plusieurs études ont montré que l’anti VEGFR2 était également capable d’augmenter l’efficacité des traitements d’immunothérapies. Cependant, les mécanismes permettant d’expliquer cette amélioration restent encore à découvrir et plus particulièrement ceux impliquant les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi nous souhaiterions étudier l’efficacité de cette association de traitements dans des souris possédant ou non un système immunitaire complet. Le but de ce travail est de définir la cascade d’événements menant à l’efficacité antitumorale de l’association d’un anti-VEGFR2 avec une immunothérapie. Notre hypothèse est que l’efficacité de cette association thérapeutique repose sur une réponse immunitaire précise. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant un système immunitaire complet ou non afin de comparer l’importance de certaines cellules sur l’efficacité de l’association thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 1 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis au maximum à 1 injection IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute sous anesthésie et 3 injections IP de 1 minute, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Des tests statistiques seront réalisés pour permettre d’analyser les données
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales et les traitements seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.