Système immunitaire

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à deux injections intra-péritonéales par jour pendant dix jours sur animal vigile, puis un prélèvement de sang intra-cardiaque avant l'euthanasie pour récupérer organes, rate et ganglions. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'une protéine, qui font l'objet d'un dépôt de brevet, pour la greffe de poumon. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et "le seul modèle préclinique adapté".

Objectifs

BOB1 est un facteur de transcription exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associée au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. Notre hypothèse est que BOB1 est un déterminant transcriptionnel qui contrôle les réponses immunes allogéniques après greffe de poumons. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de modifier le programme transcriptionnel des lymphocytes activés et fournir un bénéfice thérapeutique pour la prévention et le traitement des dysfonctions chroniques du greffon. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune spécifique d’un alloantigène, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Ces souris développent une réponse immune complète (humorale et cellulaire) spécifique d’un alloantigène que nous pouvons quantifier. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique et innocuité in vivo chez la souris. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une allogreffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 2 minutes, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intrapéritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, des tests statistiques adequats sont utilisés et le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

1432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen, dont un agent pro-inflammatoire qui peut faire perdre 10 à 15 % du poids, subissent un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par incisions répétées de la queue, avant un prélèvement de sang terminal. L'objectif est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes limitent l'inflammation cérébrale via la microglie et freinent l'obésité. Le porteur renvoie le bénéfice, une "nouvelle possibilité de lutte contre l'obésité", au conditionnel et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris pour ces échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. L’inflammation est un facteur qui favorise l’apparition de l’obésité. L’hypothalamus est la région du cerveau impliquée dans les régulations métaboliques. Les cellules immunitaires responsables de l’inflammation dans le cerveau s’appellent cellules microgliales. In vitro les hormones thyroïdiennes ont un effet anti-inflammatoire dans ces cellules. L’objectif de ce projet est d’abord de verifier qu’in vivo aussi les hormones thyroïdiennes sont capables de limiter l’inflammation provoquée par un agent bactérien ou un régime trop gras, via leur action dans la microglie. Puis nous évaluerons l’importance de ces hormones dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime obésogène.

Bénéfices attendus

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. Cette étude permettra de déterminer si cibler le pouvoir anti-inflammatoire des hormones thyroïdiennes dans l’hypothalamus constitue une nouvelle possibilité de lutte contre l’obésité

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans la première expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Toutes les souris sont ensuite injectées dans l’abdomen (1 fois, 15s) et analysée après 0, 1 ou 5 jours. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans la deuxième expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Puis L’alimentation normale sera remplacé par un régime obésogène pour 3 ou 7 jours) pour certains des animaux. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans une troisième expérience, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1 fois/jr, 15s, 5 jr). Pour certains, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène (2 mois). Toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s)

Impact sur les animaux

Ne travaillant que sur les mâles et les animaux mutants et contrôles issus d’une même portée devant être répartis dans les différents groupes expérimentaux (nourriture), certains peuvent être isolés pendant l’ensemble de la procédure. Une douleur temporaire peut apparaitre suite aux injections quotidiennes d’hormones ou de tamoxifène 5 jours d’affilées. Il y a aussi un risque d’inflammation de la cavité péritonéale suite à ces injections répétées. Les prélèvements à la queue dans les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur plus légère. Après l’injection de LPS (procédure 1), la perte de poids peut être importante (entre 10 et 15% du poids pré-injection) le premier jour pour remonter en suite. Pour la procédure 3, sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de tolérance à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser par histologie ou biologie moléculaire ou pour récupérer des cellules

Remplacement

Nous avons déjà étudié et pu établir l’effet anti-inflammatoire de l’hormone thyroïdienne in vitro. Le but ici est de comprendre l’impact de cet effet anti-inflammatoire dans un contexte physiologique d’inflammation et son impact sur les conséquences métaboliques de cette inflammation L’hypothalamus est une région du cerveau qui présente une grande diversité cellulaire. Les différents types cellulaires interagissent entre eux pour élaborer les réponses physiologiques adaptées. Les outils génétiques nous permettent aujourd’hui d’inhiber sélectivement la signalisation thyroïdienne dans un type cellulaire donné chez la souris, ici la microglie. Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal, pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre différents organes, en réponse à différentes conditions physiologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 6 animaux (mâles) par condition expérimentale en fin d’expériences sont nécessaires et suffisants. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. Pour certaines expériences, on augmente le nombre d’animaux à 8 par groupe car dans ces expériences des animaux devront peut-être être retirés avant la fin suite à l’atteinte de points limites. Cette étude est aussi séquentielle : l’ensemble des expériences proposées ne seront pas forcément menées à bien. En particulier, nous n’étudierons l’importance des hormones thyroïdiennes dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime riche en gras que si les premières études montrent que les hormones thyroïdiennes régulent l’inflammation dans l’hypothalamus.

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement dans leur cage. Nous veillerons au bien être et la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsque des injections quotidiennes doivent être faites dans l’abdomen nous changeons chaque jour le site d’injection pour minimiser les risques d’inflammation. Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids après injection de l’agent pro-inflammatoire, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois par jours jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins et des derniers traitements avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique et contrôlent la température. La souris est un modèle de choix pour les manipulations génétiques et les expériences de physiologie. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous utilisons des souris adultes car nous ne voulons pas d’interférence entre les processus de croissance et métaboliques.

8 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sensibilisées à un allergène puis soumises à un déclenchement provoquant une réaction allergique pouvant devenir systémique, elles reçoivent des composés dont la voie et la fréquence d'administration sont fixées "selon le choix du sponsor", avec prélèvements de sang et de fèces. Le projet, mené pour des partenaires commerciaux, vise à évaluer des candidats médicaments contre le choc anaphylactique. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire les mécanismes de l'allergie alimentaire.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement curatif de l'allergie alimentaire, seuls les symptômes sont pris en charge. Cette pathologie peut affecter la qualité́ de vie des patients mais également avoir des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke. Le choc anaphylactique est un réaction immunitaire allergique grave en réponse à l’exposition à un allergène. Cet allergène peut venir des aliments, de certains médicaments, d’une piqûre d’insecte, du contact avec du latex, voire d’un effort physique intense après ingestion d’un aliment légèrement allergène. Si le risque de décès par suite du choc anaphylactique existe, il demeure rare, de l’ordre de 0,3 %. Cette réaction peut atteindre le système cardiaque, respiratoire, cutané, gastro-intestinal, entrainant notamment des difficultés respiratoires, des réactions cutanées, des nausées/diarrhées, une baisse de la tension artérielle et possiblement la mort. La recherche menée ici a pour objectif de tester de futurs candidats médicaments ou substituts alimentaires qui pourront permettre de mieux prendre en charge cette pathologie et de la traiter de façon durable. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles expérimentaux permettant une meilleure compréhension et analyse des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de ces maladies inflammatoires ainsi que l'efficacité́ de nouvelles molécules thérapeutiques visant à̀ améliorer la santé des patients. Pour cela nous proposons plusieurs modèles de sensibilisation présentant comme allergène : l'ovalbumine, la bétalactoglobuline bovine (BLG), des extraits contenant de l’arachide, du gluten, du blé, du sésame, des fruits à coques, du sésame, des coquillages, des crustacés, des poissons (liste non exhaustive). La molécule à tester sera administrée par différentes voies recréant les diverses possibilités d’administration médicamenteuses chez l’Homme et selon la voie d'administration conseillée pour ce composé.

Bénéfices attendus

Les modèles animaux d'allergie alimentaire utilisés dans cette étude sont pertinents pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de l'allergie alimentaire afin de répondre à un besoin important de santé, celui des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke pouvant porter atteinte à la vie des patients souffrants d'allergies alimentaires.

Procédures

Dans le but de réaliser une réaction allergique plus importante un jeûne de 4 heures pourra être réalisé avant chaque sensibilisation et/ou lors du challenge final. La molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injection intra péritonéale, intravasculaire, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire selon le choix du sponsor. La fréquence de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires. Les animaux seront pesés quotidiennement. Au cours de l'étude, le sang sera prélevé en respectant un volume maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pour une période de récupération de 7 jours. Les fécès pourront également être prélevés maximum 1 fois par semaine au cours de l’étude. D'autres prélèvements seront possibles en fonction des demandes du sponsor. Des relevés de température rectale ainsi qu'un scoring clinique pourront être effectués quotidiennement pour surveiller l’inconfort des animaux. Les animaux sont ensuite anesthésiés sans réveil et le sang total est prélevé au niveau de l'aorte abdominale ainsi que d'autres organes.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est le développement d'une réaction inflammatoire à un niveau local et possiblement systémique en fin d'étude, lors du challenge.

Devenir

Tous les animaux du protocole sont euthanasiés à la fin et des prélèvements sont réalisés pour l'analyse.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude des allergies alimentaires. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - réduire le nombre des animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 6 animaux nécessaire à une étude statistique. Basé sur la bibliographie et notre précédente expérience du modèle le nombre de 10 animaux permet de répondre à la fois à l’hétérogénéité et la variabilité individuelle tout en respectant la puissance statistique et la nécessité de réduire les animaux.

Raffinement

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - raffiner en apportant du soin et une observance accrue aux animaux en souffrance ou en angoisse suite à l'induction des maladies. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à̀ réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué́ quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé́ dans le paragraphe. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63/UE en unités individuelles ventilées de type III ou IV avec enrichissement de l’environnement (composants de nidification et igloo). L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire.

Choix des espèces

Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'allergie alimentaire sont complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. La souris est largement décrite dans la littérature pour être une espèce de choix dans ce modèle. Les allergies alimentaires pouvant survenir à tout moment de la vie d'un individu, les souris seront préférentiellement utilisées à l'âge adulte (8-12 semaines) au début des investigations, car elles présentent un système immunitaire mature. Cependant selon la population ciblée, l’âge pourra être laissé à l’appréciation du sponsor, les animaux pourront être plus jeune ou plus âgés. L'âge minimal étant de 3 semaines et l'âge maximal sera déterminé par l'âge de la population ciblé et peut être de 3 ans.

Toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus et organes, 1 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une prise de sang par ponction sous anesthésie générale, une injection de cellules tumorales et jusqu'à cinq injections de traitement sous anesthésie locale, certaines deux gavages, et une partie d'entre elles une irradiation localisée à faible dose sous anesthésie générale, que le porteur dit sans "nuisance". L'hypothèse vient d'un essai clinique de l'équipe associant radiothérapie et immunothérapie, où les patients dont l'intestin avait reçu une irradiation non voulue comptaient davantage de survivants à long terme, et le projet cherche chez la souris si cette irradiation renforce l'immunothérapie en modifiant le microbiote intestinal. Pour le choix de l'espèce, le porteur décrit les souris comme "génétiquement proches de l'Homme" et de "parfaits organismes-modèles", du fait de "leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie" plus courte.

Objectifs

Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.

Bénéfices attendus

L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.

Procédures

Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire de courte durée due à la préhension et au geste lui même.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.

1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles sont greffées avec des cellules leucémiques humaines puis reçoivent des molécules candidates, avec des prises de sang hebdomadaires, pour mettre au point un modèle de leucémie liée au virus HTLV-1 et tester des traitements. Le porteur décrit les effets attendus de la greffe, amaigrissement, perte d'équilibre, difficultés motrices, gonflement du ventre et poils hérissés, suivis par une grille bi-hebdomadaire. Il juge de nouvelles approches thérapeutiques "indispensables" et affirme qu'il n'existe "pas de modèle cellulaire satisfaisant" pour cette maladie.

Objectifs

La leucémie/ lymphome T liée au virus HTLV-1 (ATLL) est une maladie du sang agressive qui est rapidement mortelle dans la majorité des cas malgré des protocoles de traitement intensifs. Ceci est principalement lié à une résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie chez environ 50% des patients. Il est donc indispensable de proposer aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATLL dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATLL de patients, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie induite. Par conséquent, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux traitements sur d’autres modèles, qui de plus représentent la diversité des mutations cancéreuses observées chez les cellules leucémiques des patients. Ce projet fait suite au précèdent projet dont l’objectif initial était l’établissement de lignées à partir de cellules primaires de patients atteints de lymphome/leucémie lié au virus HTLV-1 ou de cellules sur le même modèle de qui est réalisé dans d’autres maladies du sang. Depuis 2019, une vingtaine de cellules primaires d’ATLL ont été injectées à des souris fortement immunodéprimées. Il a été possible d’obtenir 4 lignées stables (après plusieurs réinjections). De manière intéressante, il a été possible de cultiver in vitro pendant quelques jours (2-3 semaines environ) 3 de ces lignées. Ce projet a un double objectif : 1. Mise au point d’un nouveau modèle de leucémie/lymphome T liée à HTLV pour permettre une meilleure compréhension de la maladie induite (poursuite de l’étude débutée en 2019). 2. Evaluer in vitro et in vivo l’efficacité de nouvelles thérapeutiques potentielles qui seront testées seules ou en association pour contrecarrer la résistance primaire des cellules d’ATLL à la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’identification d’une ou plusieurs molécules d’intérêt qui a (ont) un effet potentiel anti-tumoral sur les cellules d’ATLL. Cette (ces) molécule(s) fera (feront) l’objet d’études approfondies sur son (leur) mécanisme d’action. Enfin à terme, l’objectif est de proposer une étude clinique étant entendu que l’ATLL est une maladie orpheline qui concerne moins de 50 nouveaux patients par an en France mais environ 1000 cas par an au Japon et que l’ATLL est un modèle pour d’autres maladies du sang.

Procédures

Les souris seront greffées avec des cellules leucémiques d’origine humaine par voie intrapéritonéale, intraveineuse (queue) ou sous-cutanée (durée du geste : quelques secondes). Ce geste ne sera réalisé qu’une seule fois. Des prises de sang (50 microlitres maximum) seront réalisées de façon hebdomadaire pour évaluer la prise de greffe (durée du geste : quelques secondes). Des candidats molécules thérapeutiques seront administrées aux souris selon un schéma propre déjà décrit dans la littérature dans le cadre d’autres études sur d’autres cancers ; les doses injectées et les fréquences décrites n’engendrent pas d’effets secondaires néfastes. Différents modes d’injections seront utilisés (en respectant les volumes maximaux associés à chaque voie) : - Intrapéritonéal (quelques secondes) - Intraveineux : sous anesthésie gazeuse ou médicamenteuse (durée quelques minutes entre l’anesthésie et l’injection) - Gavage (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à la greffe de cellules tumorales humaines ont été observés et mesurés au cours du projet précédent et ont conduit au développement d’une grille de suivi spécifique bi-hebdomadaire : amaigrissement, ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, perte de poils ou poils hérissés. L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. Les molécules candidates ont toutes déjà été utilisées dans des modèles murins et la quasi-totalité ont fait l’objet de publications scientifiques. Pour la majorité de ces molécules, il n’est pas rapporté d’événement indésirable notable en lien avec leur administration. Quelques-unes ont conduit à une dégradation de l’état des souris imputé à l’apparition d’un syndrome de lyse tumorale en cas d’administration à un stade de prise de greffe avancé ; pour ces molécules, nous privilégierons leur utilisation dans le cadre d’un traitement avant la prise de greffe afin de limiter ce risque et monitorerons de manière plus rapprochée les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car immunodéficients, infectés par le virus HTLV-1 et développant une tumeur.

Remplacement

Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATL (lignées TLOMI et MT1) dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATL primaires, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie liée au virus HTLV-1 (conclusion tirée après concertation entre laboratoires travaillant sur cette pathologie et analyse de la littérature). Les molécules que nous utiliserons auront toutes été préalablement testées et validées in vitro sur des cultures de cellules avant leur administration chez la souris. Cependant, cette étude in vitro, qui permettra de fortement limiter le nombre de molécules candidates à tester, ne peut remplacer une étude préclinique sur modèle animal pour tester leur efficacité in vivo.

Réduction

Nous utiliserons une double stratégie de réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un premier temps, toutes les molécules candidates seront testées in vitro sur des cultures de cellules, et seules les molécules ayant démontré une efficacité sur la viabilité des cellules tumorales in vitro seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un deuxième temps, nous évaluerons l’efficacité des molécules les plus efficaces dans le cadre d’un traitement avant greffe de tumeurs sur souris. Seules les molécules efficaces dans la procédure 2 seront ensuite éventuellement testées dans le cadre d’un traitement curatif (après la greffe), seules ou en association avec une chimiothérapie. Au niveau statistique, le nombre d’animaux prévu pour les procédures 2 et 3 est compatible avec la mise en évidence d’effets expérimentaux forts, ce qui est l’objectif recherché. Une hétérogénéité est attendue entre les différentes lignées (hétérogénéité génétique selon les patients), donc l’analyse des données devrait faire appel à des modèles statistiques spécifiques.

Raffinement

Une grille d’évaluation spécifique ainsi que des points limites spécifiques ont été développés au cours du projet précédent de génération des cellules, et seront utilisés afin de suivre de manière rapprochée et la plus précise possible la pris de greffe chez les animaux, et d’intervenir précocément en cas de signe de souffrance. Les points suivis sont : l’amaigrissement (grâce à l’aspect de la colonne vertébrale, le poids n’ayant aucune signification lors d’une prise de greffe), l’ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, l’aspect du pelage (perte de poils ou poils hérissés). L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. En lien avec les animaliers chargés du suivi, nous avons développé une grille d’intensité (+, ++ ou +++) de ces symptômes conduisant aux points limites des expériences. Toute observation inhabituelle est également répertoriée et évaluée. En cas d’injection de la tumeur par voie sous-cutanée dans dugel, le volume tumoral sera évalué par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet précédent a permis d’établir qu’un modèle ce cellule était réalisable dans le cadre de l’ATLL sur des souris femelles immunodéficientes, en conservant la plupart des caractéristiques de la tumeur initiale, ce qui en fait un modèle très pertinent pour étudier la maladie HTLV-1 induite et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous ne disposons pas à ce jour de modèle d’étude plus proche de la maladie initiale et représentatif de l’hétérogénéité clinique et moléculaire de la maladie. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines au moment de l’injection de cellules de patients ATLL (même stade de développement que dans le projet précédent de développement des lignées, et que dans d’autres projets d’études de leucémies/lymphomes). En l’absence d’apparition de signes de souffrance ou d’atteinte d’une prolifération suffisante de cellules cancéreuses dans le sang des souris, les animaux seront mis à mort au plus tard un an après injection.

5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une instillation de bléomycine dans la trachée déclenche une fibrose pulmonaire, puis les animaux reçoivent des traitements chroniques, pour tester les molécules de clients contre cette maladie respiratoire. Le porteur indique que le modèle provoque des difficultés respiratoires et une perte de poids massive qui mène généralement à la mort, une perte allant jusqu'à 30 % étant tolérée avant l'exclusion. Sur le remplacement, il reconnaît l'existence de cultures et de coupes de poumon in vitro en cours de mise en place, mais les juge insuffisantes et conclut au recours à l'animal "entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique est une cicatrisation anormale du tissu pulmonaire (bronchioles, alvéoles et vaisseaux sanguins pulmonaires) à la suite à une agression violente (par exemple une infection virale ou bactérienne) et/ou chronique. Le tissu pulmonaire s’épaissit et se rigidifie et des cicatrices non fonctionnelles apparaissent que l’on appelle fibrose. La conséquence est principalement l’insuffisance respiratoire puis dans des stades plus avancés une insuffisance cardiaque droite. Elle peut nécessiter à terme la transplantation pulmonaire et/ou cardiaque. Aujourd’hui les causes de la maladie ne sont pas connues, d’où le terme idiopathique, mais la pollution semble être un facteur privilégié. Elle concerne aujourd’hui 5500 patients et 1800 nouveaux patients sont concernés par an en France. La maladie touche davantage les hommes et le risque augmente avec l’âge et les maladies métaboliques. Les deux traitements actuellement sur le marché, la pirfénidone et le nintedanib, ont pour but de ralentir la progression de la fibrose et donc de la maladie mais n’atténue pas les symptômes. Il est donc nécessaire de mettre en place des modèles animaux d’études précliniques dans le but de développer de nouvelles thérapies mais également comprendre les mécanismes moléculaires mis en place.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en place dans le développement de la maladie, tout comme le développement de nouvelles thérapies

Procédures

Afin d’induire le développement de fibrose pulmonaire, nous devons instiller dans la trachée des souris, sous anesthésie gazeuse, la bléomycine, un anti-cancéreux utilisé en clinique actuellement et qui induit de la fibrose pulmonaire chez l’homme. Les animaux contrôles seront instillés avec de la solution saline. Les animaux sont ensuite replacés au milieu de leurs congénères dans leur cage d’origine placée sur un tapis chauffant. Une surveillance particulière est réalisée jusqu’au réveil de l’animal afin de déceler au plus tôt tout signe de souffrance ou de douleur (étouffement, détresse respiratoire, etc.). Tous les animaux du projet seront soumis à ce geste. Afin de tester les molécules de nos clients, les souris seront traités de façon chronique afin de montrer l'efficacité des dits traitements. Tous les animaux du projet seront soumis à cette phase de traitement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont des difficultés respiratoires des animaux et la perte de poids massive qui est telle qu’elle mène généralement à la mort et le stress chronique liée à l'administration chronique des traitements. La perte de poids observée dans ce modèle est corrélée significativement au niveau d’atteinte pulmonaire et reste un criète à la fois d'acceptation de la pathologie et un critère d'exclusion si celle ci devenait trop importante.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Des alternatives non animale sont envisageable aujourd'hui comme la mise en place de culture de cellules pulmonaires in vitro mais ce modèle reste limitée car ne mime par l'organisation structurelle et cellulaire du poumons comme décrit dans un organisme. Cette dernière technique va être testée puis mise en place au sein de l'entreprise dans les prochains mois. Les tests de molécules peuvent être réalisé sur des coupes de poumons issue de l'animal évitant ainisi de traiter chroniquement ces derniers. Cependant, avec cette technique, la pathologie doit être induite chez l'animal vivant avant de réaliser les coupes de poumons. Bien que ces alternatives existent, elles ne sont pas suffisantes pour démontrer l'efficacité des traitements de façon complète. Comme la plupart des maladies et la validation des nouveaux traitements il est nécessaire d’utiliser des animaux à des fins expérimentales. En effet, les maladies qui se développent sont souvent la conséquence d’altérations multi-organes qui nécessitent l’utilisation d’un organisme dans son entier. De plus, ceci permet d’évaluer les conséquences des nouveaux traitements sur l’état général d’un individu et les possibles atteintes de certains organes.

Réduction

Afin d'obtenir des résultats interprétables et de montrer l'efficacité d'un traitement, il est nécessaire d'avoir un nombre d'animaux par groupe égale à 10 minimum.

Raffinement

La perte de poids tolérée pour ce modèle est de 30%. En effet, comme mentionné ci-dessous il s’agit d’un critère important pour évaluer l’atteinte pulmonaire. La mesure du poids étant faite 3 fois par semaine, le suivi est rapproché.Pour limiter la souffrance liée à la perte de poids, afin de faciliter la prise alimentaire, des croquettes humidifiées seront positionnées en fond de cages. Pour les souris âgées et obèses, des mangeoires suspensdus seront utilisés pour favoriser la prise alimentaire. Un ajout d'aspen brik permettra au souris âgées et obèses d'user leur dent et de favoriser la prise alimentaire. Pour favoriser la nidification et permettre une bonne régulation de la température corporelle souvant dérégulée en cas de perte de poids, de l'enirchissement supplémentaire sera apporté (sizzlenest, coton). Après l’instillation et pendant la phase de réveil, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Enfin, lors de l'euthanasie, pour limiter la souffrance lors du prélèvement terminal du sang effectué par ponction intracardiaque ou en veine cave sera réalisé de deux possibles façon: en option 1, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane, une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision et une injection de buprénorphine en sous cutanée 60 minutes avant; en option 2, les animaux seront anesthésiés avec un mélange kétamine/xylasine en i.p. et une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision.

Choix des espèces

Trois types de souris seront utilisées : Des souris C57Bl6 mâles âgées de 8 semaines. Des souris mâles sont utilisées car la fibrose pulmonaire touche plus les hommes que les femmes. L’utilisation de souris jeunes permet d’avoir un modèle de souris moins fragiles pour subir l’instillation. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 semaines et rendues obèses par ingestion d’un régime gras pendant 16 semaines. En effet, les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques du développement de la maladie. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 mois. Afin de limiter le transport de souris trop âgées, elles seront livrées à 18 mois puis hébergées jusqu’à 22 mois dans nos locaux. L’utilisation de souris âgées est totalement adaptée car le risque de fibrose pulmonaire est accru lorsque l’on vieillit. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte afin de se rapprocher de ce qui est observé chez l'homme à l'âge adulte.