Système immunitaire

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante une sonde thermique dans le ventre sous anesthésie, puis elles reçoivent un vaccin, parfois un rappel, six injections d'une molécule faisant baisser la température et des prises de sang répétées, la mise à mort se faisant par prélèvement sanguin important. Le projet mesure l'effet de la fièvre sur la production d'anticorps. Le porteur décrit une douleur possible, une fièvre de un à deux degrés et une perte de poids, et affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier cette réponse chez la souris.

Objectifs

La température du corps des mammifères dont l’homme est régulée, mais peut augmenter notamment dans tout le corps lors de la fièvre induite par une vaccination ou un microbe. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate). La réponse humorale est également caractérisée par sa capacité à mettre en place une mémoire contre la cible vaccinale ou le microbe, qui perdure plusieurs mois à plusieurs années, et dont le maintien nécessite l’interaction avec différents types cellulaires dans différents organes (rate, moelle osseuse). Le développement de la réponse humorale et la mémoire immunologique sont donc difficiles à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet de l’augmentation de la température lors de la fièvre sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Dans un premier temps, nous déterminerons la dose de molécule qui permet de diminuer la température des souris lors d’une fièvre induite par vaccination, sans diminuer l’inflammation. Dans un second temps, nous étudierons l’effet de la baisse de la température induite par cette molécule sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de la température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, cela permettra d’établir si la prise de médicaments faisant baisser la fièvre suite à une vaccination n’empêche pas la mise en place d’une réponse humorale efficace et durable.

Procédures

Les souris seront implantées avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Une semaine plus tard, les souris recevront une injection par voie sous-cutanée de vaccin ou d'une solution contrôle (durée de l'injection : 1 minute) sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris recevront en plus deux mois plus tard un rappel vaccinal au même endroit (durée de l'injection : 1 minute) sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Pour faire baisser la fièvre, les souris recevront des injections sous-cutanées de molécules abaissant leur température (6 injections dans les 2 jours suivant l’immunisation). Du sang sera prélevé à différents temps (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes).

Impact sur les animaux

La vaccination peut induire une douleur au niveau du jarret postérieur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire, associée à une élévation de la température (fièvre) de 1 à 2°C pendant 2 jours. L'implantation des sondes thermiques et les injections de molécules faisant baisser la fièvre peuvent induite une douleur. Ces injections et implantations peuvent également conduire à des saignements ou des infections. La répétition des prélèvements sanguins est une source de stress.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire et de l'inflammation.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocyes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo et de devenir des cellules mémoires capables de survivre pendant plusieurs mois. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris.

Réduction

Le nombre de souris a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L’implantation des sondes thermiques ainsi que la vaccination se fait sous anesthésie générale. Les animaux sont observés tous les jours, et un suivi clinique des souris est réalisé suite aux différentes interventions. Dans ce but, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris, suivant différents critère comme la perte de poids et le comportement des souris. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie sauf la première semaine (étude de la fièvre), soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. L'euthanasie est réalisée par une prélèvement de sang important sous anesthésie générale et traitement analgésique. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson).

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule sa température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte).

1 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale, une irradiation puis l'injection d'un produit radioactif au lutétium-177, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur n'attend qu'une "perte de poids légère" et décrit peu d'effets, tout en fixant la gravité à modérée. Il justifie le choix de la souris par sa "petite taille", sa "grande fécondité" et son "coût de production peu élevé", et affirme que l'in vitro ne simule pas la complexité de l'organisme.

Objectifs

Nous proposons dans cette étude de développer, dans une première étape, un nouveau vecteur de TRT (radiomarqué avec le lutétium-177 - 177Lu) ciblant des protéines cibles radioinduites par une radiothérapie (RT) externe de 8 Gy. La RT va ainsi réchauffer la tumeur et induire l’augmentation des antigènes cibles mais aussi l’infiltration de la tumeur par des cellules immunitaires. Dans la seconde étape, nous évaluerons cette réponse immunitaire intra-tumorale et systémique induite par la combinaison de RT et TRT pour deux modèles syngéniques de cancer colorectal de souris

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer un nouveau radiopharmaceutique (candidat-médicament) de TRT marqué au 177Lu qui pourra être administré en combinaison avec une fraction de RT externe +/- une immunothérapie

Procédures

- Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prends 10 jours à partir de la date d'injection. - Ensuite le radiopharmaceutique est injecté par voie intra-veineuse (une seule injection sera faite sur les souris, durée d'injection =1h à 2h dépendament du nombre de souris à injecter) - Prélèvement d’organes en fin de manip ou à des temps d’étude bien définis (durée = environs 3 h).

Impact sur les animaux

Une perte de poids légère pourra être observée chez les souris traitées avec la radioactivité durant les trois premiers jours qui suivent l’injection. Aucun autre effet secondaire ou nuisance n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : - Les animaux dont la greffe n’aura pas prise - Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude - Euthanasiés si points limites atteints

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de biodistribution « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie par SPECT (Single photon emission computed tomography), nous permet de suivre la biodistribution/pharmacocinétique de la molécule sur une longue période (7 jours) chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées en vigile en IP ou en per os. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires.[1] De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature. [1]- Schuc et al., “Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice" Toxicol Pathol (2004)

188 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de tumeur, quatorze injections et plusieurs prélèvements sanguins, plus des séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux types de cellules CAR-T dans un cancer du sang et un cancer du pancréas. Le porteur renvoie les retombées pour les patients, une immunothérapie mieux tolérée, au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de mesurer les effets secondaires chez la souris. Sur le remplacement, il affirme que ses résultats doivent être validés dans un "organisme vivant entier", seul système qui montrerait cette baisse des effets indésirables.

Objectifs

Les cellules CAR-T représentent une avancée majeure en immunothérapie du cancer. Cependant, si ce traitement donne des résultats remarquables dans le contexte des cancers du sang, 30% des patients traités rechutent. De plus, ce type de traitement induit très fréquemment des effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, notamment une tempête cytokinique et une toxicité neurologique. Ces effets secondaires découlent d’une hyperactivation de la réponse innée induite par les cellules CAR-T. L’analyse de ces processus nécessite donc l’utilisation de modèles de souris humanisées, dans lesquelles les cellules CAR-T pourront interagir avec notamment un compartiment myéloïde également humain autologue. Nous avons récemment établi un nouveau protocole permettant de générer des cellules CAR-T ayant un potentiel antitumoral fortement augmenté. Le projet proposé consiste à comparer la survenue de ces effets secondaires après l’injection de cellules CAR-T classiques ou des cellules CAR-T obtenues suivant notre protocole. Nous comparerons la survenue de ces effets secondaires dans deux modèles tumoraux : un modèle de cancer du sang et un modèle de cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre à terme d’établir les bases expérimentales permettant le repositionnement du médicament anti-diabétique en immunothérapie. En effet, initialement décrit dans la prise en charge du diabète, ce traitement pourrait être à la base d’un protocole permettant d’obtenir une nouvelle génération de cellules CAR-T . Ces cellules, en levant les verrous liés à la faible persistance et l’anergie induite par le microenvironnement tumoral mais également en minimisant la survenue d’effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, pourraient induire une nette amélioration de la prise en charge des patients traités par l’immunothérapie basée sur l’utilisation de cellules CAR-T.

Procédures

Suivant les conditions expérimentales, les animaux seront soumis à une irradiation légère (durée 3 minutes), 7 injections (

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress léger consécutif aux manipulations fréquentes (suivi de croissance tumorale, suivis par prises de sang). Les souris subiront des injections sous anesthésie locale engendrant un stress temporaire léger. Les souris subiront une irradiation légère sans effet retardé et des séances d'imagerie sous anesthésie générale ayant un impact léger (préhension, déplacement). Enfin, la croissance tumorale elle-même peut induire une gêne physique légère ou modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses sur organes nécessaires à l'étude.

Remplacement

L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’un nouveau protocole d’élaboration de cellules CAR-T que nous avons mis au point, notamment la minimisation de la survenue d’effets secondaires délétères pour la santé du patient. Nous avons, en amont des expériences exposées ici, réalisé un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une diminution de l'activation de certaines cellules en présence de cellules CAR-T obtenues suivant le protocole que nous avons développé par comparaison avec des cellules CAR-T classiquement obtenues. Nous avons notamment pu établir que des monocytes cultivés en présence ces cellules CAR-T produisent moins de cytokines pro-inflammatoires et présentent un phénotype moins activé que ceux cultivés en présence de cellules CAR-T classiques. A présent, afin d'obtenir des résultats au plus proche d'un essai clinique, nos résultats doivent être validés dans un organisme vivant entier, seul système qui puisse montrer que cette moindre activation du compartiment myéloïde se traduit par une diminution des effets secondaires (perte de poids, fièvre, atteinte neuronale).

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie par bioluminescence afin de réduire le nombre d'animaux utilisés (l'animal est son propre témoin pour certains paramètres, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux) . Les groupes d'études sont mis en oeuvre le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées dans chaque procédure a été établi sur la base de l'experiences acquise au cours de 20 années de travaux antérieurs. Au cours de ce projet, nous utiliserons le nombre de souris minimal requis pour obtenir des résultats statistiquement représentatifs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un enrichissement constitué de sizzlenests et de maisonnettes en carton. Les interventions seront faites sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal et non invasif de la croissance tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Ceci permettra aussi de détecter au plus tôt les tumeurs pour arrêter le plus tôt possible les procédures. Les souris seront surveillées quotidiennement (examens cliniques) pendant toute la durée de la procédure expérimentale afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Afin de minimiser les douleurs lors des injections sous cutanée et intraveineuse au niveau de la veine caudale ou faciale, les souris seront anesthesiées localement par apllication d'un spray lidocaïne. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle de souris est humanisable ce qui permet de suivre les conséquences d'interactions complexes de nombreux partenaires cellulaires autologues au sein d'un organisme vivant. Il constitue donc le modèle le plus adéquat aux études précliniques. Pour générer les cellules d'intérêt pour l'humanisation, il est indispensable d'utiliser des souris âgées de moins de 2 jours. En effet, des travaux recents montrent que passé cet âge, la reconstitution de la lignée lcellulaire d'intérêt est fortement altérée. Pour les tests sur souris humanisées, les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines en début d'expérience: âge optimal pour obtenir une reconstitutton du système immunitaire inné.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.

Objectifs

De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Procédures

Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.

Remplacement

La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.

Raffinement

Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.

1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.

Bénéfices attendus

Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.

Procédures

Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.

Devenir

Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.

6620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des flavivirus neurotropes par injection, voie orale ou injection intracrânienne, subissent des biopsies de queue, des prises de sang et des tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier l'influence du fond génétique sur la sensibilité à l'infection. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, apathie et paralysie, et que les animaux sont tués parce qu'infectés par des pathogènes dangereux pour l'humain. Il affirme que ces phénomènes se développent à l'échelle de l'"organisme entier" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par les flavivirus neurotropes. En particulier, la survenue de formes sévères de la maladie et l’apparition de troubles neurologiques et comportementaux secondaires à l’infection restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par un flavivirus neurotrope ? 2. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par un flavivirus neurotrope ? 3. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de flavivirus ? 4. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 5. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier de nouveaux modèles de souris qui pourront être utiles pour étudier la physiopathologie des infections virales neuroinvasives ou pour le développement de mesures préventives et thérapeutiques. De plus, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection. La caractérisation poussée de l’infection par les flavivirus neurotropes dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser les connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement des infections virales neuroinvasives. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard de l’émergence ou la réémergence actuelle des flavivirus en Europe et dans le monde et des conséquences neurologiques dramatiques causées par ces infections.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par injection une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec un flavivirus neurotrope par administration orale dans la bouche à l’aide d’une seringue une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec flavivirus neurotrope par une injection intracraniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Des tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance).

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 4 procédures de sévérité modérée. Dans certains cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids faible et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par des pathogènes dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur le virus Zika montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne devrait pas nécessiter plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience avec le virus Zika. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. Certaines inoculations seront réalisées sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par les flavivirus neurotropes chez la souris. 2. La souris fait partie des espèces « réservoir » des virus de l’encéphalite à tiques. 3. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 4. La dangerosité des flavivirus neurotropes impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par les flavivirus neurotropes sur le développement post-natal du cerveau.

7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que 3 630 d'entre elles seront mises à mort dès le départ parce que leur génotype ne convient pas, les autres subissant un régime gras de douze semaines, des jeûnes, de nombreuses injections et prélèvements sanguins, une chirurgie abdominale et une perfusion intracardiaque. L'objectif déclaré est d'étudier le dialogue entre les macrophages et les nerfs des îlots du pancréas, en conditions normales et de diabète. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur des modèles animaux.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.

Procédures

Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.

Devenir

Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.