Système immunitaire

2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée chaque jour pendant onze jours pour induire un psoriasis, après tonte ou épilation, avec deux prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour analyser peau, rate et ganglions. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne sera administré car il fausserait la réponse immunitaire étudiée, alors que l'inflammation peut provoquer des plaques cutanées et, dans les cas les plus graves, une atteinte articulaire gênant les déplacements. Il décrit ces expériences comme des prestations réalisées pour des laboratoires privés et publics cherchant à valider des modèles génétiquement modifiés.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation cutanée sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. Les maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique et le psoriasis touchent près de 3% de la population mondiale. Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui se manifeste par des plaques rouges présentant des squames. Il s'agit le plus souvent d'une maladie bénigne, mais il existe des formes sévères (environ 20% des cas), associées à une atteinte généralisée et/ou à des douleurs articulaires. Bien que la pathogenèse ne soit pas entièrement comprise, d'intenses recherches sont en cours pour explorer les mécanismes sous-jacents impliqués. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction de psoriasis de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Le modèle de souris traité via une crème inflammatoire est l’un des modèles les plus largement utilisé pour étudier le psoriasis. Ainsi, nous utiliserons ce modèle et nous appliquerons localement de la crème inflammatoire sur la peau des souris au niveau du dos ou des oreilles afin d’induire une dermatite de type psoriasis pour évaluer la réponse immunitaire suite à la modification de gènes cibles.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation cutanée.

Procédures

Pour induire une inflammation cutanée de type psoriasis, les souris seront soumises à plusieurs interventions : 1) La préparation de la peau par tonte d’une durée de 30 secondes en vigile ou par épilation d’une durée de 15 minutes par anesthésie générale gazeuse en fonction de la demande du partenaire. La préparation de la peau se fait qu’une seule fois au début de l’expérimentation. 2) L’application quotidienne de crème inflammatoire d’une durée de 3 minutes par anesthésie générale gazeuse, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 3) Deux collectes de sang d’une durée de 30 secondes sur souris vigiles par voie submandibulaire à l’aide d’une lancette pour recueil du sérum. 4) Des pesées un jour sur deux d’une durée de 30 secondes, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 5) A la fin de l’expérimentation les souris sont mises à mort pour l’analyse de la peau, la rate et les ganglions.

Impact sur les animaux

L’induction de psoriasis par application quotidienne de crème inflammatoire cause une inflammation localisée sur la peau des souris. Cette inflammation se reflète par des érythèmes (léger à très marqué) ainsi que des plaques cutanées, et ce, sur une durée de 11 jours maximum. Dans les cas les plus grave, une atteinte articulaire peut être observée pouvant causer des difficultés à se déplacer pour se nourrir et s’hydrater. Ces signes cliniques ne pourront être soulagés par la prise d’analgésique car nous étudions la réponse immunitaire et toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Lors de l’expérimentation les animaux sont suivis quotidiennement et une grille de score et des points limites sont préalablement établis afin de réagir rapidement face aux premiers signes de souffrance chez la souris. L’ajout de Gel Diet / pâtée SAFE Energy et d’hydrogel pourront améliorer les conditions de vie des animaux. Les manipulations des souris pour la tonte, le recueil de sang ou pour l’application quotidienne de la crème inflammatoire peuvent générer du stress chez la souris mais sont indolores. Nous veillerons dans chacun de nos actes au respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées dans la veine de la queue pour former des tumeurs dans les poumons, suivies de traitements, avant une mise à mort à treize ou dix-sept jours pour prélever les poumons. Le porteur indique que chaque poumon porte alors de cent à deux cents foyers tumoraux, qu'il affirme sans conséquence sur la vie des animaux au vu de son expérience. L'objectif est de confirmer in vivo une observation faite in vitro sur le recrutement de globules blancs, qu'il juge non transposable sans passer par l'animal entier.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en intra veineux sur souris anesthésiées par isoflurane (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en intra péritonéal sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un cytomégalovirus, reçoivent jusqu'à six injections et deux irradiations aux rayons X, avant prélèvement des organes. Le porteur indique que les effets de l'irradiation, stress, douleur et baisse d'alimentation, ne pourront pas être atténués par un analgésique, celui-ci modifiant les réponses immunitaires étudiées. Il décrit une grille de score de la douleur menant à l'euthanasie au-delà d'un seuil et présente la souris comme le "modèle de référence en immunologie".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes contrôlant la génération et le renouvellement de cellules du système immunitaire au cours d’une infection virale : les cellules innées lymphoïdes de type 1 (ILC1). Les ILC1 jouent un rôle important dans le contrôle précoce d’une infection virale et du développement tumoral. Cette efficacité repose sur le développement de fonctions effectrices adéquates, mais également sur le maintien, l’expansion, et le renouvellement du nombre de cellules effectrices disponibles. Notre laboratoire étudie le développement des cellules du système immunitaire à l’état basal, notamment des ILC1, dans le but d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de moduler l’activité de ces populations cellulaires. Nous souhaitons maintenant étudier les mécanismes contrôlant la taille de la population d’ILC1 en conditions pathologiques. Pour mener cette étude nous utiliserons le modèle classique et couramment utilisé d’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV), bien caractérisé sur le plan physiopathologique.

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le cadre de ce projet vont générer des retombées importantes dans plusieurs domaines. En termes de recherche fondamentale, elles vont permettre d’approfondir nos connaissances sur le développement de ce lignage cellulaire. Elles vont également nous fournir de précieux éléments nécessaires à la compréhension de la réponse immunitaire. En termes de recherche appliquée, ce projet s’inscrit dans le cadre de travaux visant à identifier de nouvelles cibles (cellulaires et/ou moléculaires) dont l’activité pourrait être manipulée à des fins thérapeutiques, tels que le développement de vaccins ou de traitements anticancéreux.

Procédures

Selon la procédure expérimentale, les animaux pourront recevoir une injection intraveineuse, plusieurs injections intra-péritonéales (jusqu'à 6 dans le cas d'un traitement au tamoxifène et d'une infection), être soumises à un prélévment de sang, et à 2 irradiations aux rayons X de 3.5 Gy chacune. Les injections et prélèvements intraveineux sont réalisés sous anesthésie générale. Le temps total de manipulation d’une souris ne dépasse pas 5 minutes. 80 animaux auront 1 injection intraveineuse et 1 prélèvement de sang. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles. Le temps de manipulation d’une souris ne dépasse pas 1 minute. La totalité des animaux (280) recevront entre 1 et 6 injections. Le temps de manipulation nécessaire à une irradiation au rayon X (comprenant l’irradiation elle-même) ne dépasse quelques dizaines de minutes. Les 2 irradiations sont espacées de 6h. 80 animaux suivront ce traitement.

Impact sur les animaux

Stress lié à la manipulation. Douleurs ponctuelles liées aux injections. Stress, douleur et altération de l’alimentation suite à une irradiation (< 2 semaines). Ces effets ne pourront être atténués par un traitement analgésique. Les analgésiques modifient les réponses immunitaires antivirales et peuvent influer sur l’histoire naturelle de la maladie, donc sur la finalité expérimentale. Il est important de noter ici que bien que certaines procédures incluent l’utilisation de produits référencés comme toxiques (tamoxifène et toxine diphtérique (DT)), ou des infections virales (MCMV), mais leur utilisation et/ou mise en œuvre n’ont pas de conséquences attendues sur le bien-être animal dans les conditions utilisées dans ce projet.

Devenir

Toutes les procédures utilisées dans ce projet aboutissent à des prélèvements d'organes, et par conséquent à la mise à mort de la totalité des animaux

Remplacement

La multiplicité des populations cellulaires impliquées, le rôle de multiples tissus et structures tissulaires, ainsi que la complexité des interactions cellulaires et moléculaires dans le temps et l’espace, ne permettent pas le recours à des modèles in vitro pour l’étude du développement de la réponse immunitaire. Le recours à un modèle animal est donc essentiel à la réalisation de notre projet de recherche.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux requis pour ce projet : i) une étude préalable de la littérature a été réalisée pour éviter le recours à des expériences de mise au point, ii) nous utilisons des modèles de souris congéniques réduisant considérablement la variabilité inter-individus. L'utilisation de modèles statistiques applicables à des petits échantillons nous permettra d'évaluer la significativité et la robustesse des résultats sur des groupes d’animaux restreints et un faible nombre de répétitions, iii) nous utiliserons des techniques d’analyses à haut et très haut débits afin de maximiser l’acquisition de données pour chaque expérience.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles et de niveau 3, exemptes d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS). Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles (jusqu’à 5 animaux/cage), et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant leur entrée dans les procédures. Ils disposeront d’un environnement enrichi incluant du matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les doses infectieuses utilisées seront des doses non-létales n’entraînant pas de signes de souffrance chez des souris de type sauvage (contrôles). Toutefois, certains animaux génétiquement modifiés sont plus sensibles aux infections. Pour les procédures où ces animaux seront utilisés, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé en positionnant de la nourriture humidifiée au fond de la cage. Il ne sera pas possible de remédier à leur souffrance dans la mesure où les analgésiques modifient également les réponses immunitaires étudiées, et donc, influent sur l’histoire naturelle de la maladie et sur la finalité expérimentale. Cependant, dans toutes les procédures décrites, une grille d’évaluation de la douleur sera appliquée (ci dessous) pour détecter, quantifier et suivre tout signe de souffrance, stress et anxiété relatifs à l’expérimentation en cours. Tout animal dépassant un niveau modéré sera immédiatement euthanasié. Perte de poids : 0 à 10% = +1, 10 à 20% = +2, >20% = +11. Apparence physique : normale = 0, absence de toilettage, signes de barbering et perte de poils = +1, pelage hirsute, lésions de peau minimes peu évolutives, écoulement oculo-nasal = +2, pelage très ébouriffé, lésions de peau évolutives, dos rond, yeux mi-clos = +3. Modification du comportement non provoqué (à distance) : normal = 0, changement mineurs, boiterie, hyperactivité = +1, mobilité réduite, isolement, léthargie = +2, automutilation, prostration, tremblements = +3. Modification du comportement après stimulation (à la manipulation) : normal = 0, prostration transitoire = +1, tremblements ou convulsions intermittents = +2, tremblements ou convulsions persistants = +3. Masses : aucune = 0, petite, non évolutive, sans gêne associée = +1, grosse, modérément ulcérée = +2, nombreuses, évolutives, largement ulcérée, gêne la marche ou l'alimentation = +3. Score total 10 : euthanasie

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence en immunologie. Le choix de ce modèle repose sur la proximité de son système immunitaire avec celui de l’homme, les conditions d’élevage peu coûteuses, un temps de génération court, ainsi qu’un nombre important d’individus par portée. La facilité et la rapidité de génération de souches mutantes, la très large disponibilité de souches mutantes préexistantes, le très grand nombre d’outils et de techniques d’analyses dédiées permettent également de limiter le nombre d’animaux nécessaire à un projet. Notre projet utilisera des souris adultes âgées de 6 à 15 semaines ayant un système immunitaire mature. Pour réaliser des chimères hématopoïétiques à l’aide de cellules souches de foie fœtal nous utiliserons des fœtus dans le dernier tiers de gestation, au stade embryonnaire 18.5 (e18.5). A ce stade, le foie contient des cellules souches spécifiques n’étant pas retrouvées chez des souris adultes.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse, reçoivent des cellules tumorales ou un agent favorisant les tumeurs suivi d'un irritant de l'intestin dans l'eau de boisson, la croissance des tumeurs étant mesurée jusqu'à la fin. L'objet est de comprendre l'épuisement des défenses immunitaires face au cancer, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro, ce qui l'oblige à recourir aux souris.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".

Objectifs

La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.

Bénéfices attendus

La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.

Devenir

18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.

Raffinement

Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.