Système immunitaire

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la mutation de la mucoviscidose, elles reçoivent dans la trachée des fragments de la bactérie Pseudomonas aeruginosa pour déclencher une inflammation pulmonaire, plus une injection d'un candidat anti-inflammatoire, avant une ponction cardiaque, un lavage des poumons et la mise à mort. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer une gêne respiratoire sur une durée courte de 24 heures. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne reproduit cette réponse inflammatoire complexe entre le poumon et la rate.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique incurable qui touche 1 enfant sur 4500 naissances en France. Elle atteint le système digestif et l’appareil respiratoire mais l’atteinte pulmonaire est responsable du décès dans 90% des cas. La faible espérance de vie de ces enfants résulte majoritairement de leurs prédispositions génétiques et des infections chroniques pulmonaires contractées qui aggrave leur pathologie pulmonaire. Afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces infection chroniques, nous avons établi un modèle murin permettant de mimer l’inflammation présente chez les patients. Pour mener notre étude, nous allons valider notre modèle d’inflammation. La mutation génétique la plus fréquemment rencontrée chez les patients atteints de mucoviscidose est la mutation F508del du gène CFTR. Nous avons donc utilisé le modèle murin portant la même mutation F508del. Les poumons de ces souris seront exposés à des extraits de bactéries mortes Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie est celle qui contamine majoritairement les patients atteints de mucoviscidose. Nous travaillons sur le composé CIGB-552, un peptide synthétique qui a montré son efficacité contre l’inflammation liée au cancer et aux infections généralisées. Notre objectif est de mesurer les paramètres de l’inflammation par des méthodes scientifiques robustes, afin de montrer l’effet anti-inflammatoire du CIGB-552 sur les infections pulmonaires dans le contexte de la mucoviscidose. Cela permettra de proposer un nouveau médicament pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : 1) D’obtenir un modèle murin de la mucoviscidose qui se rapproche des patients. La mesure des différents paramètres de l’inflammation pulmonaire permettra de mieux identifier les phénomènes inflammatoires sur lesquels agis le CIGB-552. 2) Que ce modèle murin d’inflammation soit suffisamment caractérisé, validé et reproductible. Cela permettra d’utiliser ce modèle pour mieux caractériser les futures molécules anti-inflammatoires développées par notre équipe ou par la communauté scientifique. 3) D’évaluer l’efficacité anti-inflammatoire du CIGB-552 sur plusieurs paramètres de l’inflammation qui sont observable seulement à l’échelle d’un individu.

Procédures

Pesée des souris : les souris vigiles seront pesées sur une balance conçue pour les petits animaux. Sera réalisée sur les 112 animaux, 4 fois par animal, pendant la durée de l’expérimentation (25h). Injection intra-péritonéale de CIGB-552/véhicule : les souris vigiles seront maintenues par contention par l’expérimentateur dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale. Il sera injecté un volume de 100µl à une dose de 1,4 mg/kg avec une seringue. Sera réalisée sur les 112 animaux, 1 fois par animal au début de la procédure. Instillation oro-pharyngée de LPS de p.a. : les souris sont anesthésiées (Buprénorphine (0.05mg/Kg), Zoletil (40mg/Kg) et Xylazine (4.2mg/Kg) (150 μL par voie IP)). Injection dans la trachée à l’aide d’un cathéter, d’un volume de 20µl de LPS de pseudomonas aeruginosa 4mg/kg et 2mg/kg (ou du véhicule). Après ce geste, l’instillation d’un petit volume d’air via le cathéter permet de dégager les voies respiratoire en favorisant le dépôt du LPS (ou du vehicule) sur les paroies des voies aériennes. Sera réalisée sur les 112 animaux, 2 fois par animal à 1h et 22h après le démarrage de la procédure. Le geste technique par animal ne dure que quelques minutes et est réalisée dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une gène respiratoire causée par l’exposition de leurs poumons aux bactéries mortes de Pseudomonas aeruginosa (P.a). Les morceaux de bactérie vont induir la réponse immunitaire des souris, et développer l’inflammatoire pulmonaire comparable à l’observation chez les patients atteints de mucoviscidose. Notre maitrise des gestes techniques montre que la méthode d’exposition des poumons des souris (instillation oro-pharyngée) n’est pas un geste invasif, ce qui garranti que le déclencheur de l’inflammation sont les morceaux de bactérie P.a. Dans l’état de nos connaissances, nous ne pouvons prédire l’effet de l’inflammation sur la perte de poids des souris. Du moins, nous n’anticipons pas de perte de poids sur une exposition aussi courte à la bactérie P.a (24h). Nous peserons les animaux au cours de la procédure. Si une nuisance de l’animal est observée, elle sera déclenchée seulement après l’exposition au LPS jusqu’à la fin de la procédure, soit un temps maximal de 24h.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l’issu de notre seule procédure par injection d’Euthasol 40 (140mg/kg). Nous récupèrerons le sang par ponction intra-cardiaque, le lavage broncho-alvéolaire et les lobes des poumons pour étudier la signature moléculaire et cellulaire liée à l’inflammation. Ces paramètres seront évalués par la méthode d’ELISA, d’histochimie, de RT-qPCR et de cytométrie de flux.

Remplacement

Notre étude porte sur l’évaluation de l’inflammation pulmonaire. Ce phénomène se prépare à l’échelle d’un individu par des échanges de messagers chimiques et cellulaire entre le poumon et la rate. Les modèles disponibles en laboratoire (cellule et prédiction bio-informatique) ne permettent pas à ce jour d’étudier cette réponse complexe de l’inflammation. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de comprendre et la réponse anti-inflammatoire, et d’évaluer la part bénéfique du CIGB-552 dans la modulation et la résolution de la réponse inflammatoire locale pulmonaire. En revanche nous limiterons cette étude préliminaire à un seul modèle de souris qui est le modèle F508del, le plus pertinent de la communauté scientifique pour étudier le processus complexe de l’inflammation.

Réduction

Précédemment au laboratoire nous avons optimisé les procédures afin d’observer sur un même animal, les paramètres clés de la mesure de l’inflammation. Les deux expositions aux morceaux de bactérie P.a. à deux temps différents de la procédure sur un même animal, permettent d’étudier deux moments de la réponse inflammatoire dans un même individu : les messagers chimiques ainsi que les messagers cellulaires qui permettent de répondre à l’infection. De ce fait, nous divisons par deux le nombre d’animaux nécessaires pour observer l’effet du CIGB-552 sur ces deux phénomènes de l’inflammation distincts dans le temps. D’après les expérimentations animales antérieures de l’équipe, nous estimons que 14 souris (7 mâles et 7 femelles) par groupe sont nécessaires pour révéler statistiquement l’effet bénéfique du CIGB-552.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des cages ventillées de 5 animaux maximum, pour favoriser leur vie sociale. Un enrichissement de l’habitat sous forme de maisonnettes, de briquettes de bois et de morceaux de cotons permettra de réduire le stress des animaux et de favoriser leur bien-être. Les souris F508del possèdent une alimentation en croquettes Teklade plus riches en protéines pour éviter la perte de poids liée à la mucoviscidose. Les souris sont abreuvées avec une eau contenant de faibles doses de laxatifs (movicol) pour favoriser l’évacuation des selles. Les zootechniciens ainsi que les expérimentateurs sont tous formés et familiers aux soins particuliers à donner à notre modèle d’étude. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum le caractère invasif. L’ensemble des geste technique est maitrisé au sein de notre équipe. Les souris seront placées dans un caisson de réveil à 25°C après anesthésie, et nous contrôlerons particulièrement les paramètres température, respiration et battement cardiaques pour mener au réveil et à la reprise d’activité normale des animaux. Les souris d’une même cage appartiendront au même groupe expérimental, afin d’homogénéiser le comportement social des animaux lié aux injections et instillations. Par ailleurs, les souris recevant les morceaux de bactéries P.a. seront dans la même cage afin d’éviter la contamination croisée lors du toilettage des souris. Nous raffinons cette partie de l’expérimentation pour atteindre efficacement nos objectifs. Notre étude se concentre sur un phénomène inflammatoire court, ce qui limite la durée d’exposition et la douleur liée à des phénomènes d’exposition répétée et long. Nous pourrons modéliser l’effet de l’inflammation par des méthodes de prédiction mathématique lorsque nous aurons les conclusions de notre étude. L’évaluation permanente de la souffrance des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort à l’atteinte d’un point limite. Enfin, nous raffinons notre étude en observant deux phénomènes inflammatoire distincts dans le temps, sur un même individu sans en affecter la qualité des résultats. Nous étudions les effets du CIGB-552 sur la réponse inflammatoire en évaluant plusieurs paramètres sur un même individu, ce qui nous permet de comprendre les phénomènes inflammatoires et leurs liens.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. 1) Le modèle murin F508del est le plus utilisé dans la recherche sur la mucoviscidose et est très bien caractérisé. Ces souris sont fournies et recommandées aux chercheurs français par l’association de patients Vaincre la Mucoviscidose. 2) Les modèles murins peuvent facilement être exposées aux morceaux de bactéries de Pseudomonas aeruginosa. Cela permet le développement d’un modèle plus affiné pour répondre à notre objectif qui est d’évaluer les propriétés anti-inflammatoire du CIGB-552 dans un contexte d’inflammation pulmonaire proche de celui des patients mucoviscidose. Il est donc pertinent d’utiliser ce modèle. 3) La génétique de la souris compte parmi les meilleures connaissances de la communauté scientifique. Les souris utilisées pour notre procédure seront âgées d’au moins 8 semaines (adultes). Nous choisissons cet âge pour deux raisons expérimentales : 1) La trachée des souris adultes est plus grande. 2) les souris F508del ont une anomalie de la trachée. Le choix de l’âge adulte facilite la procédure d’exposition des poumons aux morceaux de bactéries (instillation oro-pharyngée).

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses espacées de deux semaines et subissent quatre tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable puisque les animaux sont tués avant six mois, âge où la forme grave apparaît. Il présente au conditionnel de futures stratégies thérapeutiques et justifie le recours à un "organisme vertébré" par les explorations comportementales.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront euthanasiés à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.

Devenir

Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et euthanasiés au plus tard à l'age de 6 mois. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale profonde préalable (mélange de Kétamine 180 mg/kg et de Xylazine 10 mg/kg en injection intrapéritonéale sous un volume de 0,01ml/g du poids de la souris). Cette méthode d'euthanasie respecte la réglementation européenne.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de six semaines seront utilisées.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la patte sous anesthésie, puis elles reçoivent un traitement par injection intrapéritonéale trois fois par semaine, l'implantation dans la patte pouvant gêner son usage et provoquer une nécrose cutanée. L'objectif est de comprendre le rôle de la protéine NLRP3 dans les lymphocytes T CD8 et la réponse antitumorale, recherche fondamentale rattachée à l'immunothérapie anti-PD1 à laquelle seuls 20 % des patients répondent. Le porteur affirme que le recrutement des cellules au site tumoral ne peut être étudié in vitro et que la souris est la seule espèce transgénique disponible.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour son rôle dans l’inflammation. L’inflammation va impacter alors d’autres cellules de l’immunité appelées lymphocytes T CD8. Il y a quelques années, nous avons démontré que NLRP3 possède des fonctions dites non-canoniques, c’est-à-dire indépendantes de l’inflammasome notamment dans les lymphocytes T CD4. Les cellules T CD8 ont beaucoup de caractéristiques communes aux lymphocytes T CD4. Nos données préliminaires obtenues in vitro, laissent penser que NLRP3 est présent dans les lymphocytes T CD8. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui comprendre le rôle de NLRP3 dans la biologie des lymphocytes T CD8 et l’effet sur la réponse immunitaire anntitumorale. Pour discriminer les effets dépendants de l’inflammation et de NLRP3 endogène aux CD8, nous avons croisé des souris CD8cre avec des souris NLRP3flox nous permettant d’obtenir des souris dans lesquelles seuls les CD8 sont déficients pour NLRP3. Ainsi, en comparant les cellules T CD8 infiltrant les tumeurs des souris C57Bl6, NLRP3 totalement déficientes pour NLRP3 et CD8cre x NLRP3flox, nous pourrons déterminer comment la déficience en NLRP3 impacte la biologie de lymphocytes T CD8 et la réponse immunitaire anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - A l’heure actuelle aucune étude n’a évalué le rôle de NLRP3 dans les lymphocytes T CD8. Cette étude permettra d’apporter des connaissances nouvelles. - L’immunothérapie par anti-PD1 est une stratégie thérapeutique de plus en plus utilisée en cancérologie humaine. Malheureusement seul 20% des patients répondent à cette thérapie. Cette étude pourrait permettre d’évaluer si le ciblage de NLRP3 pourrait être une alternative ou un complément pour réactiver les lymphocytes CD8 antitumoraux et améliorer la réponse immunitaire antitumorale. Plusieurs études ont tenté de décrire le rôle de NLRP3 dans la tumorigenèse et la réponse immunitaire antitumorale. Dans toutes ces études, seules les fonctions de NLRP3 dépendantes de l’inflammasome et de l’IL-1b ont été explorées. Grâce à notre étude, nous pensons pouvoir affiner les résultats de la littérature en dissociant les effets de NLRP3 dans ses fonctions canoniques et non canoniques

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanées dans la patte sous anesthésie générale à l’isoflurane. Puis 3 fois par semaines, les animaux, vigiles, recevront un traitement par injection intrapéritonéale. Nous profiterons de cette manipulation pour mesurer la taille des tumeurs grâce à un pied à coulisse. En fin d’expérience, es animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites en sous cutanées dans la patte. En effet, il a été observé que le recrutement des cellules immunitaires était de meilleur qualité à ce site d’injection. De ce fait, une des nuisances pouvant être observée est une difficulté à se servir de la patte en question. Une autre nuisance qui pourrait être observée est la formation de nécrose cutanée. Afin de limiter ces nuisances, les souris seront observées tous les 2 jours et les points limites tiendront compte de ces effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience car nous étudierons les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, rate et ganglions.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires. Une fois que nous aurons obtenus les résultats de cette étude chez la souris, le décryptage des mécanismes moléculaires mis en œuvre sera réalisé in vitro.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront réalisées que 2 fois et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience de croissance tumorale sera accompagnée d’une analyse de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal monterait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

410 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 150 reproductrices euthanasiées à six mois et 260 produites transférées vers un autre projet déjà autorisé. Cette demande porte sur le seul élevage d'une lignée à phénotype dommageable, dont les individus développent des plaies dorsales et une perte de poil à partir de six mois, sans autre intervention. La souffrance déclarée tient donc à la lignée génétiquement modifiée elle-même, produite pour étudier le rôle de l'enzyme KDM6B dans le diabète de type 2. Le porteur affirme que la souris est le "modèle de référence" de l'obésité et du diabète et qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut remplacer ces procédures.

Objectifs

L’inflammation est reconnue comme un déterminant majeur de la mise en place du diabète de type 2 (DT2) et de ses complications cardiovasculaires. L’inflammation est notamment conduite par une activation de certaines cellules du système immunitaire (monocytes circulants et des macrophages tissulaires). La susceptibilité à développer un diabète de type-2 et de souffrir des complications cardiovasculaires semble être également associée à des facteurs environnementaux. Des études récentes suggèrent que ces facteurs environnementaux se traduisent par une modification de l’expression des gènes (notamment inflammatoires) par des mécanismes dit épigénétiques (modification de l’expression d’un gène sans modification de sa séquence génétique). L’enzyme KDM6B (Histone Lysine Demethylase 6B) est impliquée dans ses modifications épigénétiques. L'objectif du projet est de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer l'importance des modifications épigénétiques dans la mise en place et le développement du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris. A terme, moduler l'activité de KDM6B pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2.

Procédures

Cette demande d'autorisation de projet est uniquement une demande pour l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable. Les animaux ne subirront pas d'intervention.

Impact sur les animaux

La lignée murine KDM6B MKO est une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les 150 animaux en accouplement seront euthanasiés à l'age de 6 mois. Les animaux produits par les accouplements seront utilisés pour créer les groupes expérimentaux d'un autre projet déjà autorisé.

Remplacement

Afin de prouver l'implication de la protéine KDM6B, dans le développement du diabète de type-2, la stratégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages a été utilisée. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum. 150 souris seront placées en accouplement : à raison de 5 accouplements en parallèle à renouveler tous les 6 mois durant 5 ans : 3 souris (1 mâles + 2 femelles) x 5 accouplements x 10 semestres = 150. 260 animaux seront produits afin d'être utilisés dans un autre projet déjà autorisé.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Les points suivants seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : ulcères, tumeurs, fractures... 4. Apparition de plaies/lésions au niveau du dos.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques utilisés ont déjà été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les animaux seront mis en accouplement à partir de l'age de 56 jours qui est l'age de maturité sexuelle des souris.