Système immunitaire

1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées dès la vie intra-utérine à des additifs alimentaires ou à des pesticides contenant des nanoparticules, elles reçoivent ensuite une injection de toxine bactérienne qui peut perturber leur état général. Le porteur signale un stress lié aux manipulations, à la contention et à l'injection. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" pour obtenir cette exposition chronique dès l'utérus et qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les interactions entre microbiote, intestin et réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet fait suite à un projet précédant qui a permis de montrer une perturbation du fonctionnement du système immunitaire intestinal et extra-intestinal lors d'une exposition à des nanoparticules (TiO2 et SiO2) avec notamment une altération des réponses fonctionnelles des cellules immunitaires. Pour déterminer si cela pourrait conduire à une perturbation de la réponse immunitaire à un challenge infectieux in vivo, nous étudierons la réponse de souris soumises à une infection à une toxine bactérienne lipopolysaccharidique (appelée LPS) après qu'elles aient été exposées de façon chronique à des additifs alimentaires ou à des contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en évidence l’impact d'additifs et de contaminants de type pesticide sur les défenses immunitaires dirigées contre une infection de type bactérien. Il apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques.

Procédures

Les animaux seront exposés aux additifs alimentaires ou aux contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules à des doses encandrant l'exposition humaine. Puis, ils seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.

Impact sur les animaux

La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera atténué par l'habituation des animaux aux manipulations hebdomadaires (suivi de poids, observations). Ensuite, la contention et l'injection de toxine peut engendrer un court stress. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre la toxine bactérienne.

Remplacement

Le projet étudie les effets des nanomatériaux alimentaires contenus dans des contaminants de type pesticide sur la réponse à une infection après une période d’exposition périnatale et jusqu'à l'âge adulte,. L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les interactions microbiote-intestin et intestin-réponse immunitaire et aucun modèle alternatif ne permet de recréer toutes ces interactions. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire.

Réduction

Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en collectifs (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris et les femelles gestantes seront isolées (1 par cage) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin d'améliorer leur bien-être. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de poils, elles reçoivent des injections sous la peau et dans l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour étudier comment le système immunitaire réagit aux cellules vieillissantes dites sénescentes. Le porteur qualifie les nuisances de légères, entre gêne liée à l'absence de poils, douleur d'injection et inconfort de la sédation. Il annonce que bloquer un sucre présent à la surface des cellules sénescentes pourrait relancer leur élimination par l'immunité, piste renvoyée à un stade ultérieur.

Objectifs

Ce projet fait partie d'une étude plus globale visant à comprendre comment le système immunitaire, c’est à dire l’ensemble de nos globules blancs, réagit face à des cellules âgées. Au cours du vieillissement, certaines de nos cellules rentrent dans un état dit de sénescence ou les cellules sont toujours vivantes mais incapables de se dupliquer et présentent un fort pouvoir inflammatoire. Il est proposé que ces cellules sénescentes s’accumulent avec l’âge et soient responsables de nombreuses maladies liées à l’âge et du cancer. Ce projet est basé sur une première étude démontrant un lien entre la surexpression d’un sucre particulier à la surface des cellules sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer si le blocage de ce sucre pourrait favoriser la réactivation des cellules immunitaires et donc l’élimination des cellules âgées. L’interaction et le dialogue entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiés. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surface associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer.

Bénéfices attendus

Par cette étude on s’attend à mieux comprendre comment le système immunitaire et les cellules sénescentes interagissent au cours du vieillissement. Plus largement, nous espérons mieux comprendre comment les cellules sénescentes s’accumulent dans nos tissus avec l’âge et comment elles modulent leur immunosurveillance. Notre projet pourra contribuer à terme au développement de solutions thérapeutiques contre les maladies liées à l’âge (maladie d’Alzheimer, fibrose pulmonaire, artériosclérose etc…) et le cancer et à l’augmentation de l’espérance de vie en bonne santé.

Procédures

-Anesthésie gazeuse (2 minute 30 après induction) - 2 injections sous cutanées (en une fois, bilatérale pour tous les animaux, environ 1 min 30 par souris) sous anesthésie gazeuse et simultanément 1 injection intra péritonéale (1 fois pour tous les animaux ; environ 30 sec par souris) -2 administrations par injections intra péritonéales (2 fois par animal, 1 fois à J2 et 1 dois à J4) sur animal vigile (pour tous les animaux) (environ 2 min par souris)

Impact sur les animaux

Nos souris présentent une perte de poils totale provoquant potentiellement une gêne légère et subiront des injections sous-cutanées de produit non-irritant (2 injections/animal pour l’ensemble des animaux prévus) générant une douleur légère. La sédation par anesthésique gazeux (pendant environ 1 min 30 après induction à 2%) pendant quelques minutes est également source d’un léger inconfort.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures car nous devons faire des analyses sur leurs tissus et leurs cellules.

Remplacement

Nous avons déjà observé dans des études précédentes que les cellules âgées dites sénescentes qui s’accumulent avec le vieillissement présentent des capacités inflammatoires très puissantes. Ces cellules sénescentes seraient à l’origine de nombreuses maladies liées à l’âge, y compris le cancer. Ceci serait possible par une capacité à modifier l’activité des cellules immunitaires innées, c’est-à-dire nos globules blancs qui jouent un rôle essentiel dans la surveillance de nos tissus. En exprimant à leur surface un sucre ayant un potentiel immunosuppresseur, les cellules âgées sont capables de bloquer complètement la fonction de nos globules blancs appelé NK ou cellules tueuses naturelles. Cette inhibition favorise l’apparition de fibrose pulmonaire ou de cancer avec l’âge. Nous souhaitons maintenant étudier l’interaction de ces cellules avec le système immunitaire global et plus précisément comment les cellules sénescentes arrivent à recruter localement les globules blancs et les bloquer dans leur fonction. Il n’existe malheureusement pas de bon modèle in vitro pour cela, la sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Dés que les mécanismes seront identifiés, nous remplacerons les expériences chez l’animal par des expériences de co-cultures in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Une étude statistique prévisionnelle nous permet également de prédire le nombre minimal d’animaux à inclure dans chaque groupe. Nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif (nombre d’animaux par groupe) nécessaire pour notre étude en fonction de l’estimation des effets biologiques attendus. Ainsi, nous avons pu réduire les groupes d’animaux au minimum possible tout en maintenant une puissance statistique nécessaire à la validation des résultats. Enfin, la maîtrise du protocole expérimental permet d’éviter les problèmes techniques et la perte d’animaux non désirée et donc de réduire au maximum la gêne et le nombre d’animaux nécessaires

Raffinement

Ces expériences ont été raffinées en tenant compte du bien-être animal et ainsi réduire à un niveau minimum le stress, la douleur, la souffrance, l’angoisse ou l’inconfort potentiel. Pour cela, nous utiliserons une série de mesures : -un double enrichissement (des maisons en coton et des bâtons à ronger) -séparation des cages d'expérimentation et d’élevage -suivi quotidien des animaux en expérimentation -injections sous anesthésie - analyses cellulaires sophistiquées après l’euthanasie des souris pour obtenir un maximum de résultats avec le minimum d’échantillons et d’animaux - une grille de score avec un score maximum et une liste de points limites adapté au modèle entrainant l'euthanasie immédiate. L’ensemble de ces mesures de raffinement vise à assurer le bien-être des animaux, éviter toute souffrance inutile et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter tout reproduction expérimentale inutile liée à un défaut de design expérimental.

Choix des espèces

Nous utilisons un type spécial de souris comme modèle pour notre recherche car elle partage des similitudes avec les humains et a une durée de vie relativement courte. Chez la souris, nous pouvons étudier en détail comment les tissus se réparent et comment leur physiologie change. Cela nous aide à comprendre les différentes étapes des événements biologiques. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines. Ceci correspond à des animaux matures, pleinement formés et avec un système immunitaire innée fonctionnel. Ce modèle de souris est le meilleur choix car il nous permet d'étudier tous les processus impliqués dans les maladies liées à l'âge simultanément. Nous pouvons simultanément examiner les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, la progression des maladies et l'expression d'une molécule spécifique appelée ganglioside. En utilisant ce modèle de souris, nous pouvons obtenir des informations précieuses sur les mécanismes des maladies liées à l'âge, ce qui pourrait nous aider à développer de meilleurs traitements et à améliorer la santé humaine

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par un parasite intestinal par voie orale, reçoivent des injections, sont mises à jeun, puis subissent une chirurgie du ventre sous anesthésie sans réveil pour prélever le contenu de l'intestin. Le porteur affirme que la balance "bénéfice/risque" est "clairement favorable" et présente l'enjeu comme une piste de santé publique contre les parasites. Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui d'étudier ces interactions et qu'il privilégiera les modèles ex vivo quand c'est possible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est simple, et consiste à démontrer que certaines cellules épithéliales du tractus digestif, nommées cellules tuft, sont capables de produire des composés antiparasitaires. Cette démonstration est d’une importance majeure en termes de santé, puisqu’ouvrant la voie à de nouvelles pistes en matière de lutte contre les parasites, qui touchent des millions de personnes dans le monde. Nos données obtenues montrent clairement que les souris dont les cellules tuft sont dans l’incapacité de produire de l’acétylcholine sont très sensible aux infections parasitaires. L’idée de ce projet consiste à montrer le lien direct entre cellules tuft, acétylcholine et ciblage des parasites, en démontrant spécifiquement la présence d’acétylcholine produite au sein de l'intestin. Notre stratégie expérimentale consistera à infecter des souris avec un parasite classiquement utilisé comme modèle expérimental, utilisé avec succès dans notre équipe par le passé. Nous doserons, en fin de procédure, le taux d’acétylcholine produite, via une procédure contrôlée sous anesthésie générale, pour récupérer le contenu intestinal. Ce travail devrait nous permettre de revisiter les modalités de la réponse de l’hôte contre des parasites entériques, dans une étude originale et potentiellement impactante en termes de santé publique.

Bénéfices attendus

La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Cette procédure nous permettra d’obtenir les données nécessaires pour démontrer le rôle des cellules tuft comme cellules productrices de composés antiparasitaires. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, les infections entériques avec des parasites touchant des millions de personnes dans le monde.

Procédures

Contention lors de l'étape d'infection parasitaire, administration de substances par voie intra-péritonéale, procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les étapes susceptibles d’être une source de stress pour les souris sont principalement celles de l’inoculation des parasites par voie orale, les injections de substances par voie intra-péritonéale, la mise à jeun de 4 heures, la réaction immunitaire liée à l'infection parasitaire, ainsi que la procédure de chirurgie viscérale sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les tissus digestifs et la ponction luminale.

Remplacement

Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains parasites. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse lors d’une précédente étude, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. De manière claire, toute possibilité d’utilisation des modèles ex vivo sera priorisée pour compléter les données acquises avec cette étude.

Réduction

A ce jour, nous avons le recul nécessaire d’un projet précédent, ce dernier nous ayant permis d’obtenir des données encourageantes. Les résultats seront obtenus via des analyses statistiques comparant la réponse antiparasitaire de nos groupes d'animaux. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction du nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité, selon des points limtes ayant été précdemment validés et déterminés. Afin de réduire le stress pendant les infections, les animaux seront anesthésiés. La phase expérimentale de prélevement durera 60 minutes, sous anesthésie générale contrôlée dans le cadre d’une procédure de chirurgie sans réveil. Cette procédure sera réalisée avec des substances anesthésiques, un analgésique local, ainsi qu'un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal.

Choix des espèces

Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l'homme et nos modèles génétiquement modifiés nous permettent de répondre à nos questions et finaliser notre étude. Ces dernières seront utilisées à l'âge de 8 semaines, lorsque le système digestif est mature.

Environ une souris sur cinq de la partie service, celles dont le sang compte moins de 25 % de globules blancs humains, est mise à mort dans les jours qui suivent le contrôle qualité, les autres étant expédiées à des laboratoires. 5 120 souris immunodéficientes de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le champ structuré en déclare 5 000 réutilisées, soit 120 seulement mises à mort. Elles reçoivent une molécule chimique deux jours de suite ou une irradiation de 218 secondes, puis une injection intraveineuse de cellules souches humaines sous anesthésie, et jusqu'à neuf prises de sang en 23 semaines pour les nouvelles lignées, dont les souris sont tuées à l'issue de 32 semaines. Six mois après la greffe, environ 5 % des souris maigrissent, blanchissent aux extrémités et perdent leur énergie. Le porteur décrit une production destinée à "un large panel d'utilisateurs finaux", académiques et industriels, et range le transport jusqu'à eux parmi les sources de stress.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Bénéfices attendus

Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).

Procédures

Aucune procédure chirurgicale ne sera faite sur les animaux dans cette demande. Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.

Devenir

Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >25% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux. Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).

Remplacement

Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.

Réduction

Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. Le projet utilisera des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines) pour une meilleure prise de greffe.

180 truites arc-en-ciel juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec cinq aliments différents, la moitié reçoit ensuite une injection simulant une infection bactérienne qui déclenche une réponse inflammatoire et un comportement de fièvre. Huit heures plus tard, toutes sont anesthésiées puis tuées pour prélever foie, intestin, rate et sang. Le projet cherche à valider des aliments aquacoles entièrement végétaux, le porteur indiquant avoir réduit les conditions par des tests in vitro préalables mais jugeant l'étape sur poisson vivant nécessaire pour la filière.

Objectifs

Les farines et les huiles de poisson sont des ingrédients traditionnels utilisés dans les aliments aquacoles pour nourrir les espèces de poissons carnivores comme les salmonidés. Issus principalement de la pêche, les volumes de production de ces matières premières marines sont stables depuis les années 80 et la mise en place des quotas de pêche. Aussi, la disponibilité en farine et l’huile de poissons devient de plus en plus limitante vis-à-vis de la demande croissante émanant de l’aquaculture. Pour assurer le développement durable de l’aquaculture, la farine et l’huile de poissons doivent faire l’objet d’un remplacement par des sources végétales abordables, adaptées aux besoins nutritionnels des poissons et respectueuses de l’environnement. Cependant, l’utilisation de régimes à base de plantes dépourvus de farine et d’huile de poisson ne favorise pas une croissance optimale de la truite arc-en-ciel. En nutrition animale, les extraits de levures sont souvent utilisés pour améliorer la santé des animaux et leur croissance. Après avoir démontré les effets anti-inflammatoires de certains extraits de levures en utilisant des cultures de cellules d’intestin de truite, nous souhaitons maintenant confirmer ces effets chez de jeunes truites arc-en-ciel en tant que complément alimentaire. Des jeunes truites arc-en-ciel seront donc nourries avec des aliments 100% végétaux contenant des levures. Après 12 semaines d’alimentation, nous évaluerons si l’utilisation des levures dans l’alimentation favorise la croissance et augmente la résistance du poisson en cas d’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette expérience permettra d’améliorer l’efficience des aliments végétaux destinés aux jeunes truites arc-en-ciel. La filière pourra ainsi bénéficier d’aliments aquacoles 100% végétaux tout aussi performants que ceux contenant actuellement des huiles et farines de poissons et d’un moyen d’améliorer la robustesse des poissons.

Procédures

Dans cette expérimentation, 180 jeunes truites arc-en-ciel seront maintenues dans des conditions classiques d’élevage pendant 12 semaines et nourries avec 5 aliments différents répondant aux besoins alimentaires des poissons. A l’issue des 12 semaines, une moitié des poissons sera soumise à une injection de produit simulant une infection bactérienne (groupe traité) et l’autre moitié sera soumise à une injection de solution saline (groupe contrôle). La durée de l'injection dure en moyenne une dizaine de secondes. Huit heures après injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour observer une réponse inflammatoire. Les poissons seront également mesurés et pesés afin d’évaluer un potentiel effet des différents régimes alimentaires sur la croissance des poissons.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Les effets connus de l’injection que nous allons appliquer sont une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’un comportement de fièvre chez la truite arc-en-ciel. Ces injections ne sont pas létales mais nous ne sous-estimons pas l’impact de cette inflammation déclenchée chez le poisson. Ainsi nous avons sélectionné la plus petite dose ainsi que le temps le plus court possible afin d’observer une réponse inflammatoire. Afin de réduire le stress potentiel engendré par la manipulation puis l’injection, chaque poisson sera capturé avec une épuisette puis placé sous anesthésie générale afin de procéder à l’injection. Les manipulations des truites arc-en-ciel seront effectuées par des personnes expérimentées et familiarisées avec l'espèce.

Devenir

Huit heures après l’injection, la totalité des poissons seront anesthésiés puis euthanasiés afin de prélever des échantillons de foie, d’intestin, de rate et de sang.

Remplacement

Cette étude se propose d’étudier la robustesse de la truite arc-en-ciel nourrie avec des régimes 100% végétaux supplémentés avec des extraits de levures. En amont de cette expérience, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules d’intestin de truite afin de définir les doses d’extrait de levures potentiellement les plus efficaces pour induire une résistance à une inflammation cellulaire. Cette première étape in vitro nous a permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. Cependant, afin de valider les observations faites in vitro et envisager l’utilisation de ces produits en aquaculture, nous ne pouvons pas exclure cette étape d’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de poissons à utiliser pour cette expérience a été minimisé, en considérant les différences de réactions que chaque poisson peut avoir face à ce type d’injection. Pour ces calculs, nous avons utilisé un logiciel qui permet de s’assurer que le nombre de poissons sera tout de même suffisant pour que les résultats soient fiables.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur les animaux utilisés au cours de l’expérience les différents points seront assurés : le volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, le rythme jour/nuit naturel, et le nombre de poissons par bassin pour exprimer un répertoire comportemental riche. Du début de l’élevage et jusqu’au grossissement des poissons la taille des bassins sera adaptée de façon à respecter une densité d’élevage appropriée à la truite arc-en-ciel. Tout au long de la croissance, le comportement et les mortalités seront contrôlés quotidiennement, lors de chaque repas. Ce suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Cette évaluation est basée sur deux grands critères : comportemental et physique. Dans les critères comportementaux, il sera évalué (scores allant de 1 à 3 suivant la sévérité) : la prostration et l’isolement prolongé de l’animal, la nage anormale, la prise alimentaire perturbée et la position inhabituelle dans la colonne d’eau. Concernant les critères physiques, il sera évalué le changement du volume anormal (ex : maigreur observé par la tête plus grosse que le corps), les lésions comportementales dues aux blessures ou maladies, l’apparition de malformations (scoliose, exophtalmie, tumeur) ainsi que l’aspect général de la peau et des nageoires. Si une note de 3, qui correspond au point limite ultime, est scorée sur un des points à évaluer, l’animal sera euthanasié aussitôt via les procédures réglementaires. La manipulation des truites-arc-en-ciel sera effectuée par des personnes expérimentées et familiarisées avec cette espèce. Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront qu’une dizaine de secondes par poisson. Le stress au réveil sera évalué selon les comportements décrits ci-dessus.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale. L’expérimentation sera réalisée sur des truites arc-en-ciel de 10 à 15g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons tissulaires dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage cinq jours sur sept pendant vingt-deux jours et une inflammation cutanée provoquée aux oreilles sous anesthésies répétées, le gavage répété pouvant enflammer la trachée et entraîner une perte de poids. Le projet cherche à comprendre le mécanisme par lequel deux bactéries intestinales réduisent une inflammation de type psoriasis. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire de la peau et des organes associés.

Objectifs

Les maladies inflammatoires cutanées type dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique de contact, touchent une trés forte proportion de la population (plus de 20%). Il est largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle important dans les maladies allergiques. L’hypothèse de l’axe « intestin-peau » a été proposé et un mécanisme entre eux a été progressivement démontrés. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement notamment de la dermatite atopique. Une premiere expérience a été menée dans divers modèle d'inflammation cutanée (psoriasis, dermatite atopique et eczema allergique de contact). Les résultats de cette premiere étude ont montré, dans le psoriasis, une diminution de la réponse clinique de l'ordre de 30% aprés traitement avec ces bactéries par rapport à des animaux traités uniquement avec le véhicule. Cette nouvelle étude dans le psoriasis aura pour but de mieux comprendre la mécanistique anti inflammatoire de ces bactéries intestinales dans le psoriasis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser et de comprendre le mécanismes par lequel des bactéries intestinales sont capables de réguler une inflammation cutanée de type psoriasis, et à long terme de permettre le developpement d'un nouveau traitement probiotique chez l'homme pour améliorer cette pathologie.

Procédures

Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile. Il sera réalisé 5 fois par semaine pendant 22 jours (durée 30sec). L'application du composés servant à induire l' inflammation, sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives (6 injections =30sec). Le traitement utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du composé utilisé pour généré l'inflammation, et sur des souris anesthésiés pendant 30secondes. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30secondes. les animaux seront pesé une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le gavage répétée 5j/7 et répété sur plusieurs semaines pourrais induire une inflammation de la trachée et donc une perte de poids. Le modèls de psoriasis est bien connus et est utilisé dans l'equipe quotidiennement, celui çi engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gènent pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront regulierement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines ce qui peux génerer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récuperer les organes ce qui permettra de meiux comprendre les mécanismes anti inflammatoires des deux bactéries testées

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Dans le cas où des animaux perdrait du poids, des aliments réhydratées seraient disposé dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisés et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autre inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.