Système immunitaire

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis une injection de lymphocytes T par voie rétro-orbitale, avant le prélèvement de leurs tumeurs, rate et ganglions, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'efficacité de l'immunothérapie du cancer. Le porteur fixe un point limite à un volume tumoral de 2 500 mm3, seuil au-delà duquel les souris qui l'atteignent sont mises à mort. Il indique avoir mené des expériences in vitro au préalable mais conclut que les interactions entre cellules tumorales et microenvironnement immunitaire "ne peuvent actuellement pas être remplacées" par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

La progression du cancer est grandement influencée par un équilibre délicat entre l'immunité et la tolérance aux tumeurs. En particulier, les lymphocytes T (LT) CD8 ont pour fonction de détruire les cellules tumorales. Leur étude a conduit au développement de deux types d’immunothérapies du cancer, qui ont révolutionné la prise en charge des patients : l’administration d’anticorps anti- PD-1 qui ciblent la fonction défectueuse des LT CD8, ainsi que l’injection de LT spécifiques d’un antigène tumoral et capables d’éliminer directement la tumeur. La combinaison de ces deux traitements est testée actuellement en clinique mais les mécanismes moléculaires régissant la réponse ou la résistance à ces thérapies sont mal connus. La protéine X joue un rôle critique dans la tolérance immunitaire dans le cancer et nos données préliminaires suggèrent qu’il pourrait également être un régulateur majeur de l’activité des LT CD8+. Dans ce contexte, nous émettons l’hypothèse que l’élimination des tumeurs par l’injection de LT spécifiques, en combinaison ou non avec une thérapie par anti-PD-1, requiert l’activation de X.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un mécanisme moléculaire impliqué dans l’effet curatif des thérapies du cancer par injection de LT. D’autre part, ces études pourraient révéler des activités spécifiques de la protéine X qui peuvent être ciblées par de nouveaux agents thérapeutiques pour améliorer la fonction des LT, seule ou de concert avec des immunothérapies existantes.

Procédures

- Rasage du flanc des souris après désinfection a l’alcool 70% sous anesthésie isofluorane (1x 2 minutes/souris) -Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie isofluorane, de cellules tumorales resuspendues dans du PBS1X stérile, dans un volume total de 100uL (1x 2 minute/souris) -Injection intraveineuse par voie rétro-orbitale, sous anesthésie isofluorane, de cellules LT resuspendues dans du PBS1X stérile, (ou du PBS1X comme témoin) dans un volume total de 100uL. (1x 2 minute/souris)

Impact sur les animaux

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Chez la souris, l’injection d’anti-PD-1 ne provoque pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, effectuées sous anesthésie isofluorane, mais susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux 2 fois par semaine. Un enrichissement (morceau de coton) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsqu’un des points limite (volume tumoral de 2500 mm3, nécrose de la tumeur ou altération de l'état général de la souris) sera en passe d’être atteint, par dislocation cervicale ; les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous allons tout d’abord effectuer un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine X dans l’immunothérapie par transfert de LT. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Dans des études antérieures décrivant les lignées cellulaires utilisées ici, il a été démontré un écart-type de 150 mm3 au point final (1250 mm3). L'effet minimal souhaité de l’ablation de X serait une augmentation > 50% de la croissance tumorale, donc une taille de 2500 mm3 au point final. En prenant en compte une puissance de 90% et un alpha de 0.05, nous calculons une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un test ANOVA à 2 voies suivi du post-test Bonferroni sera utilisé pour analyser la significativité des résultats. L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin du protocole (au plus tard à J21) ou dès l’atteinte d’un point limite par un individu pour réduire la variabilité expérimentale. Pour assurer la reproductibilité des résultats, nous répéterons l'expérience une fois. Il n’y a pas de double emploi des souris.

Raffinement

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de NF-kB dans les réponses immunitaires anti-tumorales. D’autre part il existe un certain nombre de modèles de tumeurs transplantables chez la souris, largement décrits et utilisés par le passé. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 10 semaines.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'un sérum d'auto-anticorps qui déclenche une arthrite, avec gonflement des articulations des pattes d'intensité variable, pour étudier le rôle des neutrophiles dans le déclenchement de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur prévoit une mise à mort des souris dont l'épaisseur des pattes dépasse 3,5 mm au pic de la maladie, et affirme que l'expérimentation animale est "indispensable" car les études in vitro ne peuvent que la compléter. Les bénéfices annoncés se limitent à poser les bases de travaux ultérieurs sur ces mécanismes.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement les articulations. Dans cette maladie des anticorps pathologiques (appelés " auto-anticorps" car il s'agit d'anticorps reconnaissant des molécules du soi) participent à l’induction et la pérennisation de la maladie. Certaines cellules immunitaires sont activées par ces auto-anticorps pathologiques et, de par ce fait, jouent un rôle dans l’induction de cette pathologie. Cependant les mécanismes impliqués restent méconnus. Notre objectif est donc d’identifier les mécanismes par lesquels différentes cellules immunitaires sont impliquées dans l’induction de l'arthrite suite à l’administration d’autoanticorps pathologiques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus poseront les bases pour réaliser par la suite une étude plus appronfondie des mécanismes impliqués dans l’induction de la pathologie par les auto-anticorps et qui sont dépendants des neutrophiles.

Procédures

Les souris seront injectées avec un sérum provoquant le développement de l'arthrite, par injection intra-péritonéale à J0 (début de l’expérience) et J1 (le lendemain). Avant injection, l’épaisseur des pattes postérieures sera mesurée à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Chaque souris sera suivie quotidiennement pour évaluer la cinétique et la sévérité de l’arthrite, par mesure de l’épaisseur des pattes (pied à coulisse électronique, non invasif).

Impact sur les animaux

L'induction de l'arthrite provoque un gonflement des articulations des pattes des animaux, dont l'intensité varie d'un animal à l'autre et d'une articulation à l'autre. Du gel de nourriture hydratée est placé dans la cage pour faciliter l'accès à la nourriture des animaux arthritiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents temps après induction de l'arthrite pour pouvoir prélever différents organes et récupérer les cellules immunitaires d'intérêt dans les différentes phases de la maladie.

Remplacement

Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction de la PR qui sont dépendants des neutrophiles, afin de développer à terme, des nouvelles interventions thérapeutiques pour traiter cette maladie auto-immune. Ceci nécessite un modèle expérimental doté d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique. Ceci étant difficilement possible chez l'homme, afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables. Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complementaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus est basé sur des expériences réalisées précédemment au laboratoire. Grâce à l’expertise de l’équipe dans ce modèle expérimental, nous nous sommes basés sur le paramètre le plus variable pour estimer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant. L’utilisation d’un minimum de 5 animaux par lot à chaque expérience est nécessaire car il garantit l’obtention d’un nombre suffisant de cellules immunitaires pour étudier leur rôle. Pour des raisons de reproductibilité et confirmation des résultats obtenus, les expériences doivent être réalisées en triplicat, d’où le nombre de 15 animaux par lot indiqué (3X5).

Raffinement

Les actes techniques réalisés (injections, suivi du gonflement de pattes) sont peu invasifs et conformes aux recommandations des textes de référence. Des mesures destinées à réduire la contrainte des animaux ont été prévues : enrichissement du milieu (carrés de cellulose, cabanes, …), gels de nourriture hydratée placés dans la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Tout au long des expériences, une observation régulière du bien être des souris sera effectuée. Tout animal présentant un événtuel signe de souffrance sera soigné ou euthanasié. Par ailleurs, nous maîtrisons les gestes expérimentaux et nous surveillerons le site d'injection. Nous avons mis en place des points limites. Notamment, l’arthrite sera évaluée quotidiennement par la mesure de l’épaisseur des pattes postérieures. Si l’épaisseur de pattes suite à l’inflammation induite devient supérieure à 3,5 mm au pic de la maladie (7-8 jours), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris pour lesquels des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet (C57/Bl6) disponible commercialement. Le choix de cette souche (C57/Bl6) est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer l'arthrite dans notre modèle expérimental. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 10 et 14 semaines) pour que le système immunitaire soit mature et pour permettre une induction de l’arthrite avec une incidence de 100% de façon synchronisée.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont vaccinées puis soumises à une infection par Staphylococcus aureus, avant un prélèvement sanguin et une mise à mort à trois ou vingt-quatre heures pour dénombrer les bactéries dans le foie, la rate et les reins. Le porteur fixe des points limites, une température inférieure ou égale à 33 °C et une perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" pour tester si l'antigène administré sous forme d'ADN protège mieux que sous forme de protéine.

Objectifs

Les differentes stratégies vaccinales développées à ce jour vis-à-vis de S. aureus – un pathogène bactérien représentant un enjeu majeur de santé publique chez l’homme – se sont révélées décevantes. La principale raison invoquée aujourd’hui est que ces stratégies ciblaient uniquement une réponse immune humorale et ne stimulaient pas l’immunité cellulaire. La voie de recherche actuellement privilegiee consiste ainsi a obtenir une reponse immunitaire a la fois humorale et cellulaire, comme cela est le cas par vaccination ADN ou ARN. Dans une etude recente, nous avons identifie une proteine de S. aureus constituant un antigène vaccinal prometteur. Néanmoins, lorsqu’elle est utilisée pour immuniser les souris sous forme de protéine purifiée, elle n’a qu’un effet protecteur partiel vis-à-vis d’un challenge infectieux de S. aureus (diminution significative de la charge bactérienne uniquement dans les reins). Le present projet vise a etudier si l’utilisation de cet antigène candidat sous forme ADN permet d’accroître le pouvoir protecteur de cet antigène (baisse significative de la charge bactérienne dans les reins, mais aussi dans le foie et la rate des animaux), et ce dans le meme modele murin d’infection a S. aureus que celui que nous avons utilise precedemment. Le vaccin utilisé consiste en l’antigène candidat sous forme ADN associé au véhicule Nanotaxi®, qui est administré par voie intramusculaire tibiale antérieure ; les animaux témoins reçoivent une injection du véhicule seul selon le même protocole.

Bénéfices attendus

Les différentes stratégies vaccinales développées à ce jour vis-à-vis de S. aureus – un pathogène bactérien représentant un enjeu majeur de santé publique chez l’homme – se sont révélées décevantes. La principale raison invoquée aujourd’hui est que ces stratégies ciblaient uniquement une réponse immune humorale et ne stimulaient pas l’immunité cellulaire. La voie de recherche actuellement privilegiée consiste ainsi a obtenir une réponse immunitaire a la fois humorale et cellulaire, comme cela est le cas par vaccination ADN ou ARN. Dans une étude recente, nous avons identifié une proteine de S. aureus constituant un antigène vaccinal prometteur. Néanmoins, lorsqu’elle est utilisée pour immuniser les souris sous forme de protéine purifiée, elle n’a qu’un effet protecteur partiel vis-à-vis d’un challenge infectieux de S. aureus (diminution significative de la charge bactérienne uniquement dans les reins). Le présent projet vise a étudier si l’utilisation de cet antigène candidat sous forme ADN permet d’accroître le pouvoir protecteur de cet antigène (baisse significative de la charge bactérienne dans les reins, mais aussi dans le foie et la rate des animaux), et ce dans le même modele murin d’infection a S. aureus que celui que nous avons utilise précédemment.

Procédures

Un prélèvement sanguin sub-mandibulaire est effectué juste avant l’euthanasie à H3 ou H24 post-challenge. Un volume maximum de 500 microL de sang sera prélevé.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons aucun effet délétère sur les animaux. Néanmoins : - La prise de température permettra d’être réactif (point limite : température égale ou inférieure à 33°C). - En cas de perte de poids, la surveillance sera renforcée et l’alimentation complémentée par de la nourriture gélifiée ; une perte de poids trop importante (supérieure à 20% par rapport au poids le jour de la première intervention/injection) constituera un point limite. Enrichissement du milieu : carrés de cellulose et à bâtonnets de bois (même matériau que la litière).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les organes (foie, rate, reins) pour dénombrement des « UFCs ».

Remplacement

•Le recours a des animaux est indispensable à ce stade du processus d’évaluation préclinique dans une perspective de développement réglementaire du vaccin envisagé.

Réduction

•Limitation du nombre d’animaux utilisés : étude uniquement de l’antigène d’intérêt (pas de comparaison avec l’antigène d’intérêt sous forme de protéine (expérience précédente), ou avec d’autres antigènes connus) ; sous-groupes de 6 souris par temps et par dose, de manière à obtenir des analyses statistiques amenant à une significativité (p ≤ 0,05 par le test de Kruskal-Wallis). •Les expériences utilisent le nombre minimal d’animaux par sous-groupe nécessaire à une analyse statistique amenant à des résultats significatifs (variabilité individuelle) : 6 animaux sont, en effet, utilisés pour chaque point d’analyse, soit un total de 36 animaux vaccinés par l’antigene d’interet et 36 animaux contrôles.

Raffinement

•Enfin, concernant le bien-être des animaux : - Les animaux sont anesthésiés avant de recevoir les injections de vaccin et le challenge infectieux, et aucun effet délétère n’est attendu jusqu’à leur euthanasie (utilisation de doses non létales de S. aureus et euthanasie au plus tard 24 heures après l’inoculation de S. aureus) ; - Le bien-être proprement dit des animaux sera assuré a tous les stades des expériences, qu’il s’agisse de l’espace d’hébergement, des soins ou des modes operatoires. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu (carrés de cellulose et bâtonnets de bois). Les soins et les gestes operatoires seront effectués par du personnel expérimenté et qualifié. La surveillance des animaux reposera sur une évaluation quotidienne utilisant une grille de scoring. La prise de température permettra d’être réactif (point limite : température égale ou inférieure à 33°C). Une perte de poids trop importante (supérieure à 20% par rapport au poids de référence de l’animal) sera également un point limite.

Choix des espèces

Les souris, et particulièrement les souris BALB/c, sont très sensibles à l’infection par S. aureus et sont donc des animaux particulièrement pertinents pour juger de l’efficacité d’une protection vaccinale. Les souris utilisées auront 6 semaines au moment de leur arrivée à l’UE-IERP, recevront leur première dose de vaccin ADN à 7 semaines, et seront âgées de 15 semaines au moment du challenge infectieux.

2 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie ou sont irradiées puis greffées de moelle pour reproduire une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et diarrhée attendues, avant d'être tuées par dislocation cervicale sous anesthésie pour prélever l'intestin. Le porteur teste divers facteurs censés renforcer la barrière intestinale et améliorer la survie. Il affirme qu'un "système biologique intégré" est "indispensable", la souris restant selon lui le modèle de choix.

Objectifs

L'étude de la barrière intestinale étant difficilement réalisable en pratique chez les patients, nous souhaitons utiliser des modèles murins de chimiothérapie/radiothérapie et de GvHDa. Notre objectif est de mieux comprendre et de renforcer l’effet de barrière de l’intestin de ces souris en intervenant sur leur microbiote/flore, leur mucus et leur trophicité épithéliale. Pour cela nous testerons individuellement chaque facteur susceptible de renforcer la barrière intestinale, puis l'association des facteurs ayant individuellement fait la preuve de leur efficacité.

Bénéfices attendus

Nous attendons que un ou plusieurs des facteurs testés (alimentation hyperprotéique, glutamine, vitamine D, Zinc, prébiotique et facteurs de croisssance intestinaux) permette : i. la diminution du retentissement clinique, de la perméabilité intestinale, du score histologique des dommages intestinaux, de la translocation intestinale et de la dysbiose ; ii. l' amélioration de la survie, de la citrulline plasmatique.

Procédures

1. Dans le modéle de chimiothérapie: les animaux recevront soit 5 jours de chimiothérapie par injection quotidienne intra-péritonéale. Il pourront également recevoir des gavages d'antibiotiques, de prébiotiques ou d'eau pendant une 10aine de jours. Le sacrifice sera réalisé à J6 ou J8 par rapport à l'initiation de la chimiothérapie. 2. Dans le modèle de gvHDa les animaux seront irradiés et recevront le lendemain une greffe de moelle par injection intrapétonéale ou injection dans le sinus retro-orbitaire (après anesthésie à l'isoflurane). Les animaux recevront le facteur testé sous forme de nourriture, de gavage ou d'injection sous-cutanée pendant 14 jours. Le sacrifice sera réalisé à J7. L'étude de la survie ne sera pas prolongée au delà d'un mois. Dans tous les cas, le sacrifice sera réalisé par discolation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

Perte de poids et asténie liée à la chimiothérapie, à l'irradiation et à laGvhDa qui peuvent également entrainer de la diarrhée. Administration par gavage ou voie sous cutanée de certains facteurs. Injection du greffon par injection intrapéritonéale ou dans le sinus retro-orbitaire (sous anesthésie par inhalation d'isoflurane concernant ce dernier).

Devenir

1. Modèle chimio: les animaux devront être sacrifiés à J6 ou J8 pour analyse de leur intestin. 2. >Modèle GvHDa: les animaux servant à la préparation des greffons sont sacrifiés sans aucune expérimentation au préalable. La majorité des animaux sont sacrifiés à J7 post-greffe pour étude leur intestin. L'étude de la survie n'est pas prolongée au delà de J30 post-greffe (euthanasie au delà).

Remplacement

Chez l’homme, il s'avère en pratique difficile d’évaluer l’atteinte intestinale avant ou lors de la déclaration d’une GvHDa du fait du risque et de la contrainte que constitue la réalisation d'examens endoscopiques digestifs répétés avec biopsies. L’utilisation d’un système biologique intégré est indispensable pour l’étude des conséquences de la chimiothérapie et de la GvHDa sur barrière intestinale. La souris reste un modèle de choix pour étudier la barrière intestinale (mucus/muqueuse/immunité) comparativement aux modèles plus éloignés dans l’évolution.

Réduction

Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques non appariés (test de Wilcoxon-Mann- Whitney, coefficient de Spearman). La littérature indique que les groupes doivent être constituées d'au minimum de 12 souris pour atteindre une puissance statistique suffisante. Le nombre prévu est de 15 souris par groupe contrôle et 25 par groupe traité. Une analyse intermédaire (sur le score histologique des dommages intestinaux) sera réalisée à 2/3 des inclusions par groupe, afin d'interrompre toute expérimentation montrant un résultat déjà significatif à ce stade. - La réalisation de l'étude i. de la perméabilité intestinale (FITC-Dextran), ii. de la survie sera toujours soumise à un GO/No GO et ne sera par conséquent réalisée qu'en cas d'effet positif de la condition testée sur le score histologique des dommages intestinaux. Ces mesures permettent de passer d'un effectif de 2368 animaux au maximum à un effectif de 947 animaux au mimimum.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie EOPS agréée avec une surveillance quotidienne. L’environnement sanitaire sera donc idéal pour l’hébergement (température et hygrométrie réglementaire et stables). Les animaux livrés seront laissés en quarantaine pendant une semaine avec de la nourriture ad libitum. Les souris, hébergées par 2 à 5 individus/cage avec un enrichissement (batonnets en coton permettant la confection de cocons) seront manipulées par des personnels formés en possession d’une habilitation à l’expérimentation animale. Les expérimentations seront effectuées par un duo, toujours identique, afin de minimiser des différences inter-individuelles. L'injection du greffon dans le sinus rétro-orbitaire sera réalisée sous anesthésie. Avant dislocation cervicale les animaux seront anesthésiés. Le sacrifice sera réalisé à J7 avant que la perte de poids et la prostration liées à l'irradiation et/ou laGvHDa ne soient trop importantes. Durant l'étude de survie, les animaux avec une perte de poids > ou = à 20% ou atteints d'une prostration importante seront euthanasiés.

Choix des espèces

- La souris est un modèle de mammifère proche de l’Homme pour la physiologie intestinale. - Le laboratoire a créé une souris génétiquement modifiée pour renforcer le mucus intestinal. - La modélisation de la GvHDa chez des souris hybrides F1 est bien documentée. Adultes de 8 à 12 semaines (étude des animaux dont le systéme immunitaire est mature)

156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du sein leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules d'or et des séances de laser portant la tumeur à 41-43 °C, avec un prélèvement de sang intracardiaque terminal, les nécroses tumorales douloureuses déclenchant la mise à mort. Le porteur annonce espérer une "régression totale" des tumeurs et la "guérison des souris", bénéfices renvoyés à un éventuel passage en clinique. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" n'est disponible pour cette étude de biodistribution et de toxicité.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, une des stratégies thérapeutiques utilisées consiste à induire la mort des cellules cancéreuses, en ciblant notamment des récepteurs de la famille du TNF. Ce « suicide » cellulaire peut être activé à l’aide d’anticorps monoclonaux (Acm), ciblant des récepteurs membranaires. C’est ce qui est proposé dans ce projet où le greffage de ces Acm sur des nanoparticules d’or va permettre, suite à l’induction d’une hyperthermie induite par action d’un laser, d’augmenter leur activité cytotoxique. L’approche thérapeutique développée dans ce projet est basée sur des données expérimentales obtenues dans notre équipe qui démontrent notamment qu’une hyperthermie modérée sensibilise les cellules cancéreuses à la mort et que cette hyperthermie peut-être obtenue par excitation de nanoparticules d’or par un laser. : L'objectif de ce projet consiste donc à démontrer l’effet anti-tumoral de notre médicament dans des modèles de tumeurs mammaires chez la souris. Notre médicament est composé de nanoparticules d’or cylindriques sur lesquelles sont greffées des anticorps ciblant un récepteur membranaire, couplées à une molécule fluorescente. Une fois injecté aux souris, ce médicament présentera donc l’avantage de cibler les tumeurs exprimant le récepteur et de pouvoir être suivi par imagerie. De plus, la présence des nanoparticules d’or va permettre d’induire une hyperthermie modérée (41 à 43°C) grâce à un laser émettant dans le proche infrarouge, ce qui devrait en principe favoriser la mort des cellules tumorales. Afin de pouvoir proposer cette nouvelle thérapie en clinique, il nous faut maintenant déterminer l’effet anti-tumoral de cette thérapie dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous analyserons la toxicité de l’agent, sa bio-distribution et son efficacité thérapeutique dans des souris porteuses de tumeurs exprimant ou non le récepteur d’intérêt.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux mettent en évidence l’intérêt de cibler les récepteurs de mort, cette thérapie étant en essai clinique dans certains cancers de l’Homme. D’autres travaux obtenus in vitro montrent que l’induction d’une hyperthermie peut augmenter l’activation du signal de mort, l’activation de nanoparticules d’or par un laser étant un des moyens d’induire cette hyperthermie ciblée. Ce nouvel agent combine toutes ces propriétés puisqu’il est composé de nanoparticules d’or sur lesquelles sont greffées des anticorps (Acm) ciblant un récepteur de mort et une molécule fluorescente nous permettant de détecter cet agent par imagerie. Les résultats obtenus in vitro nous encouragent à tester cet agent dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous nous attendons à visualiser la présence de cet agent, injecté chez la souris, uniquement sur les tumeurs exprimant le récepteur de mort. L’effet anti-tumoral de cet agent devrait être augmenté par l’induction de l’hyperthermie induite par le laser. Nous nous attendons à avoir la régression totale des tumeurs exprimant le récepteur de mort et donc la guérison des souris. A terme, cette thérapie pourra être proposée en clinique aux malades porteuses de cancer du sein résistantes aux différents traitements proposés actuellement.

Procédures

Les animaux recevront 1 injection en sous-cutané de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (en 5-6 secondes). Le traitement aura lieu une fois par semaine sur 4 semaines (4 injections au total), en IV sous anesthésie gazeuse. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale préalable (en 3-4 secondes), soit 7 injections. La stimulation laser localisée au niveau des tumeurs sera réalisée sur une durée de 5 à 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement de sang en intra-cardiaque nécessitera l’injection intrapéritonéale de l’anesthésiant (injecté en 3-4 secondes) et ce prélèvement sera réalisé en moins de 1 minute. L’irradiation par laser des tumeurs aura lieu pendant 5 à 10 minutes, la durée exacte étant déterminée par mesure de l’hyperthermie modérée (41-43 °C) mesurée par la caméra thermique.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales pour le développement d’une tumeur sous-cutanée au niveau des flancs de la souris n’est pas sensée induire d’inconfort notoire tant que le volume tumoral ne dépasse pas la taille de 2000 mm3 et que la tumeur ne gêne pas la motricité. Une diminution de mobilité des souris. La perte de poids engendrée par la réduction de capacité à se nourrir. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires. Le traitement localisé au laser (au niveau des tumeurs), qui aura lieu sous anesthésie à l’isoflurane, peut engendrer un peu d’irritation. Une potentielle déshydratation des yeux des souris.

Devenir

La croissance tumorale (point limite), ainsi que le prélèvement de sang final et des organes justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Toutes les expériences in vitro portant sur l’effet cytotoxique de l’agent théranostique associé ou non à une activation par laser ont été réalisées et ont montré l’effet désiré (synergie de l’induction d’apoptose spécifiquement dans les cellules exprimant le récepteur de mort). Pour aller plus loin dans la preuve de concept de l’utilisation de cet agent associé à l’induction d’une hyperthermie modérée comme traitement anti-cancéreux, l’utilisation des modèles de souris porteuses de tumeurs est nécessaire. Aucune méthode alternative n’est disponible pour réaliser cette étude. Ce projet nécessite la réalisation d’une étude de biodistribution et de toxicité, ainsi que l’évaluation du ciblage spécifique de la tumeur et de son potentiel antitumoral. Ce type d’étude n’est possible qu’avec des système complexes vivants. De plus, l’étude du rôle du système immunitaire dans l’approche thérapeutique proposée, et notamment sur les cellules tumorales murines exprimant le récepteur de mort humain, permettant de tester notre anticorps ciblant ce récepteur humain, n’est possible que dans des souris immunocompétentes.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum, tout en respectant nos objectifs scientifiques. Pour augmenter cette réduction, nous implantons deux tumeurs à la fois sur les souris, une tumeur n’exprimant par DR4 (tumeur contrôle) et une tumeur exprimant DR4 (tumeur test). Cette double implantation évite de devoir utiliser un groupe supplémentaire afin de tester la spécificité de ciblage de nos anticorps (expérience de compétition en injectant une quantité 100 X plus importante d’Ac non marqué). Le nombre d’animaux est déterminé à priori par une analyse de puissance et représente le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats statistiquement interprétables. En effet, des analyses de puissance statistique sur le logiciel G*Power ont été réalisées pour déterminer la taille d’échantillons minimum à utiliser. Le test de Wilcoxon est le plus approprié pour l’analyse de nos résultats. L’analyse de variance à un facteur peut être utilisée pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les groupes. Des tests post-hoc, tels que le test de Tukey ou la correction de Bonferroni, seront utilisés pour identifier les différences spécifiques entre les groupes.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés où ils bénéficieront du raffinement de rigueur. Les souris seront habituées aux gestes techniques (contention, injections…) avant l’expérimentation. La croissance tumorale sera mesurée tous les deux jours pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessives. En cas d’apparition de signes anormaux la fréquence de surveillance sera augmentée. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Une grille de score d’évaluation des points limites sera mise en place pour réduire la souffrance des souris utilisés. Différents paramètres seront observés pour limiter la douleur tels que : - Apparence physique (poils, oreilles, yeux, posture) - Perte de poids - Comportement / réponse aux stimuli - Volume tumoral - Nécrose tumorale - Déshydratation - Gêne à la mobilité L’addition du score de chaque critère donnera une note sur 21. Un score de 12 ou un critère atteignant 3 points entraînera la mise à mort des souris par dislocation cervicales après anesthésie à l’isoflurane.

Choix des espèces

Dans un premier temps, cette étude sera réalisée avec des souris immunodéficientes BALB/c Nude. Ces souris immunodéficientes nous permettront de réaliser des greffes de cellules humaines de cancer de sein (exprimant ou non le récepteur de mort). Ces dernières seront injectées en sous-cutané afin d’évaluer l’effet antitumoral des traitements que nous allons tester. Des souris BALB/c WT de fond génétique identique à des cellules cancéreuses mammaires de souris seront également utilisées pour montrer le rôle du système immunitaire dans l’efficacité antitumorale Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g). Cela nous permettra la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire bien développé (BALB/c WT) ou du moins mature (BALB/c Nude).

1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de deux jours sont infectés par la bactérie Bacillus cereus puis traités par injection, et sont tués au bout de 48 heures avec les mères, susceptibles d'avoir été contaminées. Le porteur indique que l'infection provoque une baisse d'activité, une pâleur, puis le rejet par la mère et l'absence d'alimentation, la survie des animaux étant le critère suivi. Il affirme avoir déjà testé les composés in vitro mais conclut à la nécessité de vérifier l'effet dans un modèle d'infection vivant.

Objectifs

L’identification d’un nombre croissant de cas d’infections dues aux bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato, pathogène opportuniste (ne causant en général pas de maladie chez les personnes en bonne santé) présent dans l’environnement, représente un problème majeur en santé publique. Il s’agit de la 3ème cause d’intoxications alimentaires dans le monde (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments : EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA J, 2016), et de plus en plus de travaux font aussi état d’infections fatales chez le nouveau-né prématuré. Le traitement antibiotique de référence contre ces infections à Bacillus cereus consiste en une association vancomycin/aminoglycoside. Cependant, la recherche d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place serait un plus dans la prise en charge de ce type d’infections. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail) sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe Bacillus cereus et permettre la mise au point de nouveaux traitements contre ce type d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Bacillus cereus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection chez le nouveau-né prématuré, la découverte d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Aucune intervention ne sera effectuée sur les femelles gestantes avant, pendant ou après mise bas. Les souriceaux de 2 jours seront infectés par voie intrapéritonéale, puis, une heure plus tard, traités par injection par voie intrapéritonéale. Le temps nécessaire à l'infection ou au traitement, par voie intrapéritonéale, n'excéde pas 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, à savoir principalement chez les souriceaux, baisse de l'activité, pâleur, pouvant aboutir au rejet par la mère et à l'absence d'alimentation, visualisée par l'absence de lait dans l'estomac. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées dans un précédent projet. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au bout des 48 heures de la procédure, les souriceaux ayant été infectés et/ou traités avec différents composés chimiques et les femelles gestantes après mise bas ayant pu être contaminées par les souriceaux infectés.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Bacillus cereus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats d'un précédent projet. Il pourra être réduit encore en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

En termes de raffinement, afin de garantir le bien-être des souris, celles-ci seront hébergées dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Également, ce projet fait suite à un précédent projet au cours duquel les doses infectantes ont été déterminées. Après infection et après traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement (aux temps 2 heures post infection et 1, 2, 4, 6, 8, 24 et 48h post traitement) par les responsables du projet et par le personnel animalier, permettant de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection et pouvant être dus à une mauvaise injection. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris, dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa. Plus précisément, ce modèle d'infection chez la souris C57Bl/6JRj nouveau-née est celui que nous avons utilisé par ailleurs dans l'étude de l'infection à Bacillus cereus chez le nouveau-né prématuré. Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours, afin de coller au plus prés aux cas d'infections fatales observées en clinique chez le nouveau-né prématuré.