Système immunitaire

3 433 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent pendant leurs cinq premiers jours de vie des injections d'une cytokine inflammatoire qui provoquent déshydratation, retard de croissance et, dans cinq à dix pour cent des cas, la mort, puis subissent une série de tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature. Le projet étudie le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux liés à l'inflammation périnatale, chez les mâles et les femelles. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés que sur l'animal vivant et fixe pour objectif le transfert des résultats à l'humain.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la vie périnatale et une augmentation du risque de développer des troubles neurodéveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation périnatale. L’objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle sur modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible, mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par l'utilisation d'une drogue permettant la recolonisation microgliale permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.

Procédures

Tests comportementaux à la période juvénile et à l'âge adulte (6 tests en juvénile et 5 à l'âge adulte) – quelques minutes par test. Injections intrapérionéales pendant les premiers jours de vie - quelques secondes

Impact sur les animaux

Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation avec leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de cytokine inflammatoire induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent montrer des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris injectées avec une solution neutre. Ces effets perdurent environ jusqu’au quinzième jour de vie. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des microglies (cellules immunitaires du cerveau) au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des microglies humaines et des souris permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons choisi un nombre minimal permettant d'observer des différences menant à des conclusions statistiques. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile (P3-P16) et à l'âge adulte (après P60) pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.

420 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une allergie alimentaire ou respiratoire par gavages quotidiens, injections intrapéritonéales, sensibilisations cutanées et instillations nasales, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'implantation d'une puce dans l'abdomen. L'objet réel est de développer des produits laitiers fermentés à propriétés immunomodulatrices pour une "population cible", les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro et présente l'expérimentation animale comme un "élément vital" du projet.

Objectifs

Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’OMS et leur prévalence est en constante augmentation. Elles constituent ainsi un vrai problème de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Les mécanismes en œuvre dans le développement des allergies et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence ne sont pas totalement connus. L’une des explications possibles de cette prévalence accrue repose sur l’hypothèse hygiéniste, qui postule qu’une exposition insuffisante à des antigènes protecteurs aux premiers stades de la vie augmente le risque d’allergie. La dysbiose intestinale observée dans les allergies favorise la persistance d’un statut pro inflammatoire prédominant à la naissance, et empêche le passage vers une réponse pro tolérogène ainsi que le développement du phénomène de tolérance. De plus, la perte de biodiversité microbienne intestinale est associée à l’augmentation des allergies et d’autres maladies inflammatoires. La colonisation du tube digestif par des microorganismes est essentielle au développement immunitaire et la nature de ces microorganismes module ce développement. Par ailleurs, un rôle immunomodulateur bénéfique a été observé pour des souches sélectionnées de microorganismes qualifiés de probiotiques. Pour ce projet nous avons sélectionné des bactéries sur la base de leurs propriétés immuno modulatrices in vitro. Ce nombre de solutions bactériennes a été défini via ces tests in vitro afin de ne sélectionner que les souches présentant un effet immunomodulateur significatif. Nous allons étudier l’efficacité de ces derniers comme moyen de prévention de l’allergie et de son évolution dans des modèles précliniques d’allergies alimentaire et respiratoire. Nous étudierons également les mécanismes d’action de ces bactéries sur la barrière intestinale et son microbiote ainsi que la réaction immunitaire qui en découle.

Bénéfices attendus

Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfique pour des populations à risque de pathologies chronique telles que les allergies. Sans être nécessairement des « novel-food », ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.

Procédures

Gavages tous les jours pendant 16 ou 25 jours (si procédure allergie alimentaire 16 jours, procédure allergie respiratoire 25 jours). Lors de la récupération des fécès, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. 3 piqûres intrapéritonéales et 1 gavage, espacés d'une semaine pour les souris allergie alimentaire. 4 sensibilisation percutanées et 2 challenges par voie nasale pour les souris allergie respiratoire. Anesthésie tous les 7 jours pour l’induction de l’allergie respiratoire pendant 6 semaines. Pour 84 souris, chirurgie pour implantation de la puce anipill: anesthésie par voie gazeuse, ouverture du ventre, suture, et suivi post opératoire.

Impact sur les animaux

Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge) par gavage oral, une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée. Lors du déclenchement de l’allergie respiratoire (challenge) par dépôt intra-nasal, certaines souris peuvent ressentir une gêne respiratoire suite au deuxième dépôt intra nasal.

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et du microbiote.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.

Réduction

Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles Balb/C utilisées auront 4 semaines à réception et auront 5 semaines au début des procédures, ce qui correspond à des souris sevrées ayant un système immunitaire mature et un poids correct permettant l’implantation d’une puce type Anipill.

588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps déclenchant une maladie rénale, des injections répétées et des prélèvements sanguins, dont des prélèvements dans l'orbite de l'œil que le porteur reconnaît associés à un risque de lésions oculaires. Il fixe comme points limites une perte de poids importante et des saignements urinaires, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les conditions de circulation sanguine ne peuvent être reproduites in vitro, les biopsies humaines étant rares et limitées.

Objectifs

Les vascularites humaines (maladies inflammatoires des petits vaisseaux sanguins) sont associées avec le développement de maladies rénales. Celles-ci sont induites par des anticorps dirigés contre les petits vaisseaux du rein et provoquent des lésions, de l'inflammation, de l'activation des plaquettes et le remodelage du tissue. La chronicité de cette lésion vasculaire rénale provoque une perturbation des fonctions rénales (insuffisance rénale), et peut nécessiter une greffe d'organe pour remplacer le rein défaillant. Nous avons montré récemment que l'inflammation rénale provoque la production de molécules qui stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires dans la moelle osseuse. Les objectifs de ce projet sont : 1/de comprendre quelles molécules stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires au cours de la maladie. 2/ d'identifier les cellules immunitaires qui participent à l'inflammation rénale au cours de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples : 1- mieux comprendre le rôle de l'inflammation dans la maladie rénale. 2- cibler l'inflammation pour prévenir le développement de la maladie rénale et améliorer la santé des patients. 3- Proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de médicaments plus spécifiques ayant moins d'effets secondaires.

Procédures

Nous effectuerons des prélèvements d'urines à l'aide d'un dispositif de collecte (pendant la nuit) permettant de ne pas changer les animaux d'environnement (adaptation à la cage), et les animaux recevront une injection de liquide contenant les anticorps dans une veine (5 minutes); cette injection se fera au niveau de la queue sur animal vigile. 3 injections dans l'abdomen seront effectuées par semaine, pendant 2 semaines (3 x 2 minutes) pour les traitements pharmacologiques. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront effectués sur une période de 3 semaines (3 prélèvements, 5 min par prélèvement). Les prélèvements seront effectués sous l'oeil . Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de chaque procédure afin d'étudier les organes d'intérêts avec différentes techniques.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien-être de l'animal. Une injection en intraveineuse de sérum contenant les anticorps qui induisent la maladie sera réalisée à la veine caudale sur animaux vigils. La collection d'urine se fera sur la nuit, pendant une période de temps restreinte (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour une utilisation post-mortem (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les pièces opératoires (biopsies rénales) chez l’homme sont limitées en nombre et en nature (petite quantité de tissue, une seule biopsie/patient). De plus, l'étude des facteurs de croissances produits par le rein et agissant sur la moelle osseuse, et l'étude du role des cellules immunitaires pendant la maladie rénale nécessite la présence des conditions mécaniques et fluidiques caractéristiques de la circulation. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux au strict minimum, tout en garantissant l'obtention de résultats fiables, une étude statistique a permis de determiner que 12 animaux/groupe seraient necessaire pour obtenir une différence significative entre 2 groupes. Pour confirmer ces résultats, une étude cinétique sera effectuée par la suite, et nécessitera 5 animaux/groupe.

Raffinement

Pour prévenir la souffrance et détecter les points limites les animaux seront pesés et observés de façon journalière, du lundi au vendredi (suivi de poids). Si douleur avérée un analgésique sera injecté jusqu'à la disparition des signes de douleur. Ce modèle de maladie rénale est caractérisé par une perte d’appétit, une réduction de l'activité et du sang dans les urines. Les points limites que nous avons identifiés sont: une perte de poids importante, et des saignements urinaires associés à une réduction importante du nombre de globules rouges circulants. Pour prévenir l’apparition de ces signes, plusieurs approches sont en place: nourriture humidifiée dans la cage, injection de liquide pour hydrater, mesure des fonctions rénales (bandelettes urinaires) et prélèvement de sang pour évaluer le nombre de globules rouges. L'atteinte des points limites entrainera la mise à mort des animaux. Une phase d'habituation aux insert de collection d'urine sera effectuée la semaine précédant l'induction de la maladie afin de réduire le stress des animaux. Afin de réduire l'angoisse, les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie. Afin de prévenir la douleur, les prélèvements sanguins seront effectués en alternant les sites de prélèvements. Conditions d'hébergement: les animaux ont accès à la nourriture/eau ad libitum, alternance jour/nuit (12h/12h), accès à du matériel pour se nicher (coton, petite maison en plastique), litière classique, en portoir ventillé (système Techniplast). Lors de la collection d'urine, les animaux seront placés dans un système adapté aux cages d'hébergement, pendant la nuit, avec accès à de la nourriture/eau sous forme de gelée (CLEARH2O). Les animaux sont replacés dans leur environement après chaque periode de collection.

Choix des espèces

Les modèles murins de maladie rénale induits par des anticorps sont préférables aux modèles utilisant d'autres animaux dans le cas de ce projet car : - Ce modèle est déjà en place dans le laboratoire et maitrisé. -Les outils pour étudier ce modèle murin sont aussi maitrisés au laboratoire, en particulier les anticorps neutralisants et capable de supprimer les cellules immunitaires in vivo. -Nous avons montré avec ce modèle que la production de plaquettes et de cellules immunitaires contribuent au développement de la maladie rénale. Chez l'Homme, cette maladie se développe chez l'adulte, donc nous utiliserons des souris adultes.

2 268 souris vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie orale avec des salmonelles ou des Klebsiella, gavées, prélevées et génotypées, pour cartographier les cellules B mémoires de la muqueuse intestinale. Le porteur indique que les souris mal protégées peuvent développer diarrhée et perte de poids. Il affirme que l'expérimentation animale est "inévitable" et que les bénéfices attendus pour de futurs vaccins "justifient amplement" ces expériences sur le plan éthique.

Objectifs

Notre système immunitaire met en place des réponses protectrices pour contrer la menace exercée par les agents pathogènes lors d'une infection. Heureusement, ces réponses laissent une mémoire immunologique, une stratégie qui permet à notre organisme de se souvenir des agents pathogènes précédemment rencontrés. Les lymphocytes B mémoires sont un élément essentiel de cette stratégie : en cas de réinfection, ils peuvent se différencier rapidement en cellules plasmatiques sécréteurs d'anticorps et neutraliser l'envahisseur récurrent ou pénétrer à nouveau dans les centres germinaux, jusqu'à un certain point, et diversifier le répertoire des lymphocytes B mémoires. Malgré l'importance des lymphocytes B mémoires dans la lutte contre les expositions récurrentes aux agents pathogènes, la dynamique de ces cellules au niveau des barrières tissulaires, et en particulier dans la muqueuse intestinale, reste mal comprise. L'objectif principal de ce projet est de découvrir la cinétique, le positionnement spatial et la diversité tissulaire des cellules B mémoires dans le tractus gastro-intestinal lors d'une infection par Salmonella et Klebsiella. Dans cette optique, les objectifs spécifiques sont les suivants : 1. Faire la lumière sur la dynamique spatio-temporelle des cellules B à mémoire intestinale dans les compartiments inductifs et effecteurs au cours de l'infection par Salmonella. 2. Découvrir le positionnement spatial des cellules B à mémoire dans les tissus intestinaux à l'aide de techniques d'imagerie de pointe. 3. Identifier les différents programmes génétiques des lymphocytes B mémoires dans un même organe ou dans différents organes.

Bénéfices attendus

Plusieurs lignes de recherche ont montré que l'immunité des cellules B contre Salmonella est remarquablement différente de celle suscitée contre d'autres agents pathogènes. Dans le cas de Salmonella, les réponses des cellules B se produisent massivement à l'extérieur des follicules de cellules B pendant le premier mois de l'infection. Il est remarquable que cette réponse primaire puisse établir une immunité à long terme composée de cellules productrices d'anticorps et de lymphocytes B mémoires. Alors qu'une étude récente a dévoilé la biologie du compartiment des cellules productrices d'anticorps, la dynamique des lymphocytes B à mémoire intestinale à la suite d'une infection par Salmonella reste inexplorée. Comme la plupart des vaccins humains homologués reposent sur l'induction de lymphocytes à mémoire de longue durée, la compréhension des mécanismes impliqués dans la génération et le maintien des lymphocytes B à mémoire intestinale est d'un intérêt capital pour la conception de vaccins protecteurs contre Salmonella et d'autres infections d’origine bactérienne se trouvant dans les intestins.

Procédures

- Infection oral de Salmonella typhimurium : 1134 souris (au jour 0 ou/et au jour 35) - Infection oral de Klebsiella pneumoniae : 1134 souris (au jour 0 ou/et au jour 35) - Gavage oral de Tamoxifen dans de l'huile de maïs : 168 souris (aux jours 6, 8 et 10) - Prélèvement sanguin avec anesthésie gazeuse : 1134 souris (aux jours 7, 14, 21, 28 et 35). - Genotypage avec biopsie de la queue et marquage des oreilles: 504 souris (252 souris CD23Cre Bcl6 flox/flox et 252 sourisCD19Cre Tgfbrii flox/flox). - Creation d'une lignée de souris transgéniques: 126 souris (souris KO pour la charnière IgA).

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souches de type sauvage pour le nouveau défi. Comme les souris ont déjà généré une mémoire contre les agents pathogènes, nous nous attendons à ce qu'elles soient protégées contre la réinfection. Cependant, comme l'induction de la mémoire peut varier entre les différentes souches de souris transgéniques que nous utiliserons, les souris qui ne sont pas bien protégées peuvent présenter de la diarrhée et une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis a mort par dislocation cervicale a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (intestin, rate et ganglions lymphatiques mésentériques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d'analyser rapidement des cellules lorsqu'elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d'anticorps.

Remplacement

La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu'aucune autre approche ne permet d'obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse intestinale lors d'une infection. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu'en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B intestinales et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l'homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d'accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre les microbes intestinales. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient amplement, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d'animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d'animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il serait utile d'utiliser les mêmes souris pour les expériences d'imagerie et de cytométrie de flux, mais cela n'est pas possible dans notre cas. Tout d'abord, les organes lymphatiques ne peuvent pas être coupés au milieu car nous perdons la structure. Deuxièmement, l'intestin héberge un nombre limité de cellules B mémoires, de sorte que nous avons besoin de tout l'intestin pour le passer en cytométrie de flux afin d'obtenir une centaine d'événements dans le compartiment mémoire.

Raffinement

L'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l'utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous fournirons également des aliments semi-solides aux animaux au cours de l'infection.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies inflammatoires de l’intestin car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 14 semaines seront utilisées.

Greffées sous la peau de cellules tumorales, les souris reçoivent une injection intrapéritonéale chaque jour pendant environ quatorze jours, trois gavages et une irradiation de leur tumeur sous anesthésie générale. 1 100 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leurs tissus. Le projet teste contre des cancers bronchiques une triple combinaison de radiothérapie, d'inhibiteur et d'immunothérapie, qui "pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers". Le porteur décrit une gêne quand la tumeur grossit et une "douleur légère et temporaire" due aux injections et aux gavages, puis affirme que les protocoles d'exposition aux agents anticancéreux "ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux".

Objectifs

Le but du projet consiste en l’étude de l’efficacité antitumorale de la radiothérapie associée à un médicament inhibiteur ainsi qu’à une immunothérapie. Le rôle de la ferroptose dans les effets observés précédemment et comment mieux exploiter cette mort cellulaire afin de potentialiser les effets de la triple combinaison de traitement. L'immunnothérapie permet d'inhiber une molécule qui induit une polarisation des lymphocytes T du microenvironnement tumoral vers un phénotype anti-inflammatoire et pro-tumoral. De récentes études montrent que l’association de la radiothérapie et d’une immunothérapie ciblant cette voie est susceptible d’améliorer la réponse antitumorale en comparaison avec l’immunothérapie seule. De plus, d’autres études ont montré que l’utilisation de cet inhibiteur combiné avec la radiothérapie, entrainait une réponse antitumorale

Bénéfices attendus

Les résultats de ces expériences pourraient, en expliquant le mécanisme d’action des interactions des traitements, ouvrir la voie à de nouveaux schémas thérapeutiques, dans lesquels la triple combinaison thérapeutique pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers. De plus, l’utilisation d’inducteur ou d’inhibiteur pourront nous permettre (i) d’exploiter cette mort cellulaire dont les cellules sont particulièrement dépendantes et (ii) d’élucider la proportion que représente la ferroptose dans les effets observés en réponse à notre triple combinaison de traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (anesthésie locale) de cellules tumorales, à des injections intrapéritonéales quotidienne (anesthésie locale) durant environ 14 jours ainsi qu'à trois gavages lors des différentes procédures. Pour finir les souris subiront également sous anésthésie générale une irradiation localisée de la tumeur.

Impact sur les animaux

Le developpement de tumeurs sous-cutané chez la souris peut entrainer une gêne chez ces dernières lorsque la tumeur sous-cutané va grossir. De plus, les diférentes injections sous-cutanées, intra-péritonéales ainsi que les gavages sont suscetibles d'entrainer chez l'animal un stress du a la manipulation de l'animal et aux différents traitements appliqués ainsi qu'une douleur légère et temporaire. Il en est de même pour l'irradiation des tumeurs des souris qui va déclencher un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédures, pour examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car les interactions au sein du microenvironnement immunitaire tumoral est au centre des effets de la triple combinaison, impliquant des composantes cellulaires et moléculaires impossibles à reproduire actuellement dans des modèles ex-vivo. Nous allons donc procéder à des expériences in vivo utilisant des modèles murins, mais aussi des expériences in vitro complémentaires en utilisant le modèle de culture d’organoïdes murins.

Réduction

Pour chaque point expérimental nous utiliserons le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous comptons utiliser 4 lignées cellulaires tumorales (génétiquement modifié pour les différentes voies de signalisation étudiées). Le nombre mnimal d'animaux, nécessaire et suffisant, a été déterminé grâce à un calcul de puissance.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe, avec un équipement et des conditions sanitaires adéquates. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux seront en groupes sociaux de 5. Les protocoles d’exposition aux agents anticancéreux ont déjà été utilisés chez les souris et ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, ils recevront un antiinflammatoire non stéroïdien ou un analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre radiothérapie et immunothérapie au sein d’une tumeur obéissent à des processus cellulaires complexes impliquant de multiples voies immunitaires et métaboliques impossibles à reproduire in-vitro.