Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle des phagocytes spléniques dans la physiopathologie et la réponse aux traitements de la leucémie aiguë myéloïde induite par transplantation de cellules tumorales dans un modèle murin (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 418 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules leucémiques qui envahissent moelle, sang, rate, foie et poumons en provoquant perte de poids et douleurs, subissent des gavages quotidiens pendant cinq à quinze jours et des injections répétées, avant la mise à mort pour prélever leurs organes. L'objectif est d'identifier les cellules immunitaires de la rate impliquées dans une leucémie aiguë myéloïde, dans un travail mené sur deux établissements. Le porteur affirme que ces interactions ne peuvent pas être étudiées in vitro, y compris avec des organoïdes.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde touche différents organes dont la rate et est le type le plus fréquent de leucémie chez l'adulte, avec un pronostic effroyable. L'identité des cellules immunitaires de la rate impliquées dans l'élimination des cellules leucémiques est inconnue. Tous comme celle des cellules responsables de l'efficacité des traitements pour induire la rémission, courament utilisés ou actuellement en cours d'essai thérapeutique chez l'homme. Nous proposons d’identifier et caractériser ces cellules par l'étude d'un modèle de leucémie aiguë myéloïde murine induite par la transplantation de cellules leucémiques dans des souris transgéniques. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des cellules immunitaires de la rate impliquées dans la progression ou la rémission d'un modèle murin de leucémie aiguë myéloïde, ou dans l’efficacité des traitements de référence ou en cours d'essai chez l'homme permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie humaine, ou de proposer de nouvelles stratégies de traitement ciblant plus spécifiquement les cellules immunitaires impliquées.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les procédures : une biopsie d'oreille/queue pour génotypage (durée du geste 10 secondes/souris), une injection intraveineuse de cellules leucémiques (durée du geste 10 secondes/souris) sous anesthésie gazeuse par isoflurane ; gavage oral quotidien à l'aide d'une sonde en silicone (durée du geste 1 min/souris) en condition vigile pendant 5 à 15 jours consécutifs ; inclusion d'un traitement dans l'alimentation des souris ; injections intrapéritonéales de molécules ou véhicules sur des animaux vigiles en contention manuelle (durée du geste 30 secondes/souris) sous la forme de 5 injections avec une injection tous les deux jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont : 1) légers. Les biopsies d'oreille/queue réalisées par des zootechniciens expérimentés génèrent des douleurs négligeables. Les injections de molécules ou de cellules leucémiques sont associées à des douleurs minimes prévenues par une anesthésie gazeuse par isoflurane de durée la plus courte possible pour les intraveineuses. Le recours aux gavages oraux sera remplacé si possible par l'administration du traitement dans l'alimentation des souris, laquelle s'associe à une perte de poids transitoire, réversible et modérée qui sera surveillée et corrigée le cas échéant. 2) modérés. La leucémie induite par l'injection intraveineuse de cellules cancéreuses infiltre différents tissus (moelle osseuse, sang) et organes (rate, foie, poumons…) causant une perte de poids, d’une altération du comportement et éventuellement des douleurs. Ces évènements significatifs seront limités par la définition de points limites cotés à l’aide d’un scoring spécifique et la mise en place d’un plan d’action graduel (utilisation d’antalgiques, correction de la perte pondérale et hydrique, mise à mort).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever différents organes pour étudier le système immunitaire et/ou le développement de la leucémie
Remplacement
Tous les modèles de leucémie impliquent un envahissement progressif de la moelle osseuse, du sang, du foie, de la rate et des poumons. Par ailleurs, il existe des interactions dynamiques entre les cellules leucémiques et les cellules du système immunitaire au sein de ces différents organes. Ces phénomènes ne peuvent pas être étudiés in vitro y compris en utilisant des organoïdes. Il n'y a donc pas d'alternative à ce jour au recours à des modèles animaux vivants.
Réduction
Dans le cadre des procédures exploratoires nous avons inclus le nombre minimal d'animaux permettant d'effectuer un test statistique pertinent. Pour les études de survie nous avons utilisé des outils statistiques pour déterminer une taille d'échantillon nécessaire. Nous conserverons tout échantillon non utilisé. Nous avons mis en place une stratégie "stop and go" pour identifier si l'administration d'un traitement mélangé à l'alimentation peut remplacer le gavage oral. Cette stratégie permet également de ne pas entreprendre de tests de durées de traitements supplémentaires si l'objectif fixé est atteint pour des durées plus courtes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté et enrichit de l’environnement (nids en coton, cylindre en plastique, copeaux de bois). Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basé sur un score composite d’items (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, perte pondérale) d’observations cliniques. L’atteinte de points-limites de gravité variable conduit à une décision immédiate ou différée (utilisation d’antalgiques, correction de la déshydratation par de l’eau gélifiée, mise à mort) et à un renforcement de la surveillance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux représentent un organisme de choix dans l’étude des réponses immunitaires en contextes physiologiques et pathologiques, notamment dans les réponses anti-tumorales. Ils permettent une étude dynamique, spatiale et temporelle, contrôlée des mécanismes immunologiques in vivo. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait des nombreuses similitudes dans l’organisation anatomique, cellulaire et fonctionnelle de la rate avec la rate humaine. Par ailleurs, le modèle de leucémie murine récapitule la maladie humaine. Des souris de fond génétique C57BL/6 adultes âgées entre 6 et 14 semaines en début de procédure seront utilisées car le système immunitaire est mature et la transplantation de cellules leucémiques permet d’induire une leucémie à cet âge semblable à la maladie humaine adulte.
Ciblage du canal potassique KCNN4 pour traiter la neuroinflammation dans le CAPS
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles expriment une protéine mutée qui provoque une neuroinflammation avec douleurs, fièvre, baisse de mobilité et perte de poids, et reçoivent des injections quotidiennes pendant plus de deux semaines ainsi que des prélèvements de sang par incision de la queue. L'objectif est de vérifier si le blocage d'un canal potassique réduit la neuroinflammation d'un syndrome auto-inflammatoire rare, le CAPS. Le porteur affirme que l'effet ne peut être validé que sur un modèle vivant et administre des antalgiques toutes les huit heures aux animaux les plus atteints.
Objectifs
L’inflammation est un phénomène normal de défense lorsqu’elle est bien régulée. La mutation d'une protéine peut entrainer une réaction inflammatoire exacerbée qui n'a pas lieu d'être. Ce mécanisme est à l'origine de maladies autoinflammatoires appelées Syndrôme Périodique Associé au Froid (CAPS) dont certains symptômes sont un grave déficit intellectuel et un retard de croissance dû à une réaction inflammatoire provoquée par les cellules immunitaires du cerveau (neuroinflammation). Dans notre laboratoire, au cours d'études in vitro, nous avons découvert de nouvelles protéines impliquées dans le déclenchement de l'inflammation. Dans un modèle de souris dans lesquelles on peut induire le CAPS, nous voulons confirmer que le ciblage de ces protéines par des molécules peut réduire la neuroinflammation. Les molécules que nous allons tester font déjà l'objet d'études cliniques dans le cadre d'autres maladies comme l'anémie et la sclérose en plaque.
Bénéfices attendus
L'industrie pharmaceutique réalise beaucoup d'effort pour soigner les maladies autoinflammatoires. A l’heure actuelle, aucun traitement n’existe pour traiter la neuroinflammation des patients atteints de CAPS. La neuroinflammation due au CAPS est responsable de graves déficits intellectuels et de retards de croissance importants. Si nous validons in vivo un effet des molécules testées sur la neuroinflammation, alors de nouvelles perspectives thérapeutiques s'ouvriraient non seulement pour le traitement de la neuroinflammation dans le CAPS, mais également dans les maladies neurodégénératives liées au vieillissement, y compris la maladie d'Alzheimer.
Procédures
1) 360 souris test subiront 1 injection intrapéritonéales quotidienne pendant 4j, puis une injection intrapéritonéale et 3 injections sous cutanées par jour pendant 14 j.Sur ces 360 animaux, 216 subiront en plus 1 prélèvement de 100 µl de sang tous les 6j. 2) 90 souris contrôles subiront 1 injection intrapéritonéales quotidienne pendant 4j, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 14 j. Sur ces 90 animaux, 54 subiront en plus 1 prélèvement de 100 µl de sang tous les 6j Chaque injection prend environ 10 secondes. Les prélèvements sanguins durent environ 1 minute: une légère incision est pratiquée sur la queue en moins d'1 seconde puis le sang qui perle est prélevé à l'aide d'un tube capillaire. Il faut environ 1 minute pour récupérer les 100 µl de sang nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les souris que nous testerons vont exprimer une protéine mutée dans les cellules immunitaires du cerveau. En conséquence, ces souris présenteront une neuroinflammation qui va altérer leur état général en impactant plusieurs organes et provoquer des douleurs, de la fièvre, une réduction de la mobilité et une perte de poids. Les souris pourront ressentir une légère douleur de piqure lors des injections. Les souris pourront également ressentir une légère douleur lors des prélèvements sanguins réalisés en pratiquant une incision superficielle sur la queue.
Devenir
Les animaux ne pouvant pas être réutilisés, ils seront tous mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu'en inhibant des protéines particulières nous pouvons affecter l'activation de l'inflammasome qui constitue la première étape de la réaction inflammatoire. Cette observation a été réalisée dans un système simple (cellules en culture) dont le paramètre quantifiable est la production de molécules pro inflammatoires. Dans un contexte physiologique, ces molécules pro inflammatoires constituent en fait un relais car elles vont à leur tour activer d'autres effecteurs de l'inflammation et de la réponse immunitaire innée. Afin de vérifier le potentiel thérapeutique de cette observation, nous devons maintenant la valider dans un modèle in vivo en montrant que le blocage d'une des premières étapes de l'inflammation suffit à exercer un effet sur la réaction inflammatoire exacerbée mimant celle présentée par les patients atteints de maladies autoinflammatoires et qui met en jeu des interactions entre différents organes et différents types cellulaires.
Réduction
Ce projet nécessitera 450 souris. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour une comparaison statistique fiable de la mortalité et des niveaux sanguins des différents marqueurs de l'inflammation. Des groupes de 18 animaux seront nécessaires pour comparer les niveaux sanguins des marqueurs de l'inflammation. Pour les mesures de survie après induction de la mutation, les groupes seront comparés statistiquement sur des échantillons de 18 souris par groupe. Nous allons aussi étudier les dommages tissulaires par histologie au jours 8 et 14 après l'induction de la neuroinflammation. Le paramètre mesuré sera le nombre de cellules immuntaires infiltrés dans les tissus qui sera comparé statistiquement entre les groupes sur des échantillons de 18 souris.
Raffinement
Dans ce projet, les animaux développeront une inflammation induite par l’expression d'une protéine mutée. Cette inflammation est sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants seront administrés toutes les 8h aux animaux testés. Après l'induction de la neuroinflammation les animaux seront surveillés 3 fois par jour et leur état état général sera scoré. Nous avons défini un point limite qui est un score au dela duquel l'état de l'animal est considéré irréversible et entrainera sa mise à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation. Par ailleurs, une lignée génétiquement modifiée, porteuses d’une mutation conditionnelle d'un gène, analogue à celle retrouvée chez les patients atteints de CAPS est disponible. Pour ce modèle d’inflammation induite par les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace.
Rôle des cellules du foie dans les manifestations hépatiques de la colite dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées, elles développent une colite provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, subissent un jeûne puis un gavage et une injection de toxine bactérienne, avant la mort pour analyse du foie. Le porteur indique des diarrhées parfois sanglantes et une déshydratation, et précise qu'aucun antidouleur n'est donné pour ne pas modifier la maladie observée. Il étudie les atteintes du foie liées à la colite et juge la souris "nécessaire" comme modèle intégré.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICIs) sont des pathologies touchant plus de 2 millions de personnes en Europe, et elles sont caractérisées par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal. Bien que l’étiologie de ces pathologies soit encore mal caractérisée, il semblerait qu’elles soient multi factorielles (implication de facteurs génétiques, environnementaux et du microbiote). Les MICIs s’accompagnent de manifestations extra-intestinales touchant notamment le foie. Ce projet a pour but de mieux comprendre les altérations hépatiques qui se développent lors de la colite et plus particulièrement de tester le rôle des différents types cellulaires présents dans le foie dans la survenue de ces altérations. Les résultats obtenus pourront contribuer à identifier de nouveaux gènes candidats ainsi qu'à définir de nouvelles approches thérapeutiques afin de limiter les conséquences extra-intestinales de la colite. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous étudierons particulièrement le rôle de l’inflammation médiée par les hépatocytes, les cellules endothéliales et les cellules de Kupffer dans la survenue des conséquences extra-intestinales de la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’identifier quels sont les acteurs cellulaires responsables des manifestations hépatiques lors de la colite dans un modèle murin. La colite induite par le dextran sulphate de sodium (DSS) dans notre modèle murin étant similaire à la pathologie humaine, les résultats de cette étude apporteront à plus long terme de nouvelles opportunités pour le développement de stratégies thérapeutiques pour l'Homme visant à limiter les effets de la colite sur le foie ainsi que les diverses complications associées à cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement dans l'eau de boisson en continu pendant 7 jours au maximum induisant une colite expérimentale. Les animaux seront également soumis à un test de perméabilité intestinale 5 jours après le début du traitement. Pour cela, les animaux seront mis à jeun pendant 5h, puis gavés (1 fois, sur animal vigile) avec une solution détectable par spectrophotométrie puis un faible volume de sang sera prélevé prélevés 4 heures après gavage à la veine caudale (entaille sur la queue) à l'aide d'un capilaire hépariné (1 fois sur animal vigile, 1 min). Enfin, les animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des toxines bactériennes (une seule injection par animal de 100ng sur animal vigile). L'ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
La colite expérimentale induite chez les animaux entraîne une perte de poids modérée en fonction de la durée du traitement. De plus, la colite expérimentale induit une perte de consistance des selles, ainsi que diarrhées, parfois sanglantes pour les formes les plus graves. Les diarrhées causées par le traitement peuvent également induire une déshydratation chez l'animal. Pour notre étude, le traitement n'excèdera pas 7 jours et entraîne une perte de poids inférieure à 20% du poids initial. Le suivi de poids effectué pour chaque animal peut occasionner un stress physique dû au contact entre animal et expérimentateur, notamment lors de la contention. Les souris seront mises à jeun lors du test de perméabilité intestinale afin de ne pas interférer avec la solution de gavage possédant une molécule qui se dégrade facilement. La mise à jeun ainsi que le gavage peut entrainer respectivement la faim de l'animal et un certain stress. La dose de toxine bactérienne injectée est très inférieure aux doses léthales pour la durée de la procédure (16 heures) et n'induit qu'une réaction inflammatoire. Les injections de toxine bactérienne peuvent engendrer des douleurs abdominales au niveau du site d'injection.
Devenir
L'analyse des phénomènes inflammatoires et métaboliques impliquant divers types cellulaires hépatiques lors de la colite nécessite l'euthanasie de l'ensemble des animaux à l'issue des procédures permettant une analyse approfondie.
Remplacement
Comme nous étudions des phénomènes inflammatoires et métaboliques affectant plusieurs organes, nous avons besoin d’utiliser un modèle intégré, tel que la souris. Cette étape est essentielle pour la compréhension du processus biologique étudié. L’évaluation de gènes candidats nécessite l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Au total, 3620 animaux sont impliqués dans ce projet. Pour chaque condition expérimentale des calculs de puissance seront effectués afin de déterminer la taille minimale des effectifs (mâles et femelles) nécessaires pour obtenir des résultats interprêtables et significatifs. Pour l'analyse statistique, divers tests seront employés afin de comparer les différents groupes entre eux. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude, permettant une réduction importante du nombre d'animaux requis pour l'étude. D’autre part, comme nous analysons plusieurs organes, nous récolterons un maximum d’organes au moment de la dissection afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à l’animalerie pendant deux semaines et sont habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. De plus, les animaux issus des mêmes portées sont regroupés par 5 maximum. Au sein de leur habitacle, les souris disposent d'enrichissement fabriqué en papier, développé pour ressembler à des fines tiges d'herbes, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Cet enrichissement est accompagné de petites maisonnettes cartonées pour les souris mâles diminuant les risques de conflits au sein de l'habitacle. Un suivi journalier est réalisé dès le premier jour du traitement au dextran sulphate de sodium (DSS) et permettra de surveiller l’évolution de l’induction de la maladie ainsi qu'une éventuelle atteinte des points limites. Comme nous étudions les effets de l’inflammation de l’intestin sur le foie, nous ne pouvons pas utiliser de traitements analgésiques qui sont susceptibles de modifier le phénotype observé.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. D’autre part, la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme et elles sont faciles à manipuler. Pour notre étude, nous aurons recours a des lignées génétiquement modifiées et qui permet notamment l'exploration fonctionnelle approfondie de processus biologiques complexes. L'utilisation de lignées transgéniques pour ce projet est nécessaire car elles permettent d'étudier spécifiquement l'implication de divers partenaires protéiques, moléculaires et cellulaires impliqués dans la colite. L'étude d'un systéme immunitaire mature nécessite d'avoir recours à des souris adultes (entre 12 et 15 semaines) pour l'ensemble des expérimentations.
Evaluation de la biocompatibilité d’une matrice biologique œsophagienne décellularisée d’origine porcine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée des plaies dans le dos pour y implanter sous la peau quatre échantillons d'une matrice d'œsophage d'origine porcine, avant de les tuer à sept ou vingt-huit jours pour analyser la réaction des tissus. Le porteur décrit une chirurgie de quinze à vingt minutes avec traitement antidouleur et des démangeaisons possibles à la plaie. Il teste la tolérance d'un futur substitut d'œsophage et affirme que la réaction immunitaire ne s'apprécie que sur un être vivant.
Objectifs
Les chirurgies pour la reconstruction de l’œsophage suite à l’ablation de l’organe chez des patients atteints de pathologies ou victimes de traumatisme sont reconnues unanimement comme très insatisfaisantes par la communauté médicale. En effet, les complications post-opératoires sont nombreuses. C’est pourquoi, le développement d’une matrice biologique œsophagienne présente de nombreux avantages afin de répondre aux besoins cliniques actuels. La disponibilité des greffons œsophagiens humains étant limitée, le porcin est le modèle animal choisi afin de développer notre matrice. Avant son implantation chez l’homme, cette matrice biologique œsophagienne doit être testée pour vérifier sa capacité à s’intégrer sans être rejetée et sans dégrader son environnement. Ces données doivent être étayées par des données scientifiques qui ne peuvent pas être obtenues in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant. C’est pourquoi, il est nécessaire d’exposer la matrice à un mammifère vivant afin d’évaluer son acceptation dans un environnement physiologique. Il sera possible d’évaluer ces critères selon des méthodes ex-vivo en laboratoires, permettant d’étudier la structure des tissus d’un point de vue microscopique. L’objectif principal de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle une matrice œsophagienne décellularisée engendre une réaction inflammatoire compatible avec son environnement physiologique.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de montrer que l’utilisation d’une matrice biologique en tant que substitut d’œsophage est acceptable en termes de tolérance en regard de la thérapie actuelle, lourde et source de complications post-opératoires, ayant pour conséquence une mauvaise qualité de vie pour les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure chirurgicale suivante : - création des plaies cutanées au niveau de la zone dorsale - implantation des matériaux en sous-cutané. Les animaux recevront un nombre de 4 échantillons, espacés de minimum 1 cm, selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. Cette norme spécifie les méthodes d'essai pour l'évaluation des effets locaux après une implantation de biomatériaux destinés à être utilisés dans des dispositifs médicaux - fermeture des plaies. Le temps de chirurgie est estimé à 15-20mn par animal. A cela, ajouter le temps d’anesthésie et de réveil de l’animal (ce temps est variable selon les individus). Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique, la buprénorphine durant les 48 heures après l’opération. Le groupe 1 sera euthanasié après 7 jours d’implantation, et le groupe 2 sera euthanasié après 28 jours.
Impact sur les animaux
L’expérimentation implique la réalisation de la plaie , la pose de la matrice dans la poche, refermée avec une suture. La réaction à la chirurgie pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont réveillés et suivis cliniquement. Les animaux sont euthanasiés à 7 jours (Groupe 1) et 28 jours (Groupe 2) pour explanter la peau en vue des analyses de la réaction inflammatoire et de la cicatrisation.
Remplacement
Des tests in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant, ont été réalisés préalablement sur les matrices biologiques d’origine porcine, selon la norme ISO 10993-5 concernant l’évaluation biologique des dispositifs médicaux. Néanmoins, en raison des interactions complexes entre l'hôte et la matrice, ces systèmes ne peuvent pas reproduire de façon fidèle les conditions d’intégration ou de rejet de la matrice. La confirmation de la bonne intégration de la matrice étant indispensable avant son implantation chez l’homme, il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux pour évaluer la réaction immunitaire qui ne peut être appréciée que sur l’être vivant, disposant d’un système immunitaire compétent Cette évaluation est faite sur des échantillons biologiques extraits de l’animal, après sa mise à mort.
Réduction
Cette étude comportera 12 rats (dont 2 en cas de mort prématurée lors du déroulé de l’étude) répartis en 2 groupes, G1 (7 jours d’implantation) et G2 (28 jours d’implantation). Chaque rat recevra 4 échantillons, ce qui fera n=12 échantillons/temps pour chaque condition selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. En effet, la norme précise l’utilisation d’au moins trois animaux pour chaque matrice et suffisamment de sites pour obtenir un total de 10 échantillons d'essai et de 10 échantillons de contrôle pour chaque matrice et chaque période d'implantation. Le nombre de rats fixé comprend des animaux supplémentaires dans le but de conserver un nombre d’animaux et d’échantillons suffisant à l’issue du protocole, dans le cas d’éventuelles complications. Cela permettra à l'étude de s'aligner sur l'approche 3R (replace, reduce, refine) de l'expérimentation animale, réduisant ainsi le nombre d'animaux et le nombre de procédures d'expérimentation animale, en tenant compte de la recommandation ISO 10993-6.
Raffinement
- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Tous les individus seront acclimatés à leur environnement 7 jours avant l’intervention. Cela permet de réduire le stress des animaux le jour de l’implantation. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de la qualité de l’environnement de l’animal, pas de diminution de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. - L’hébergement est réalisé en cages ventilées. Ces cages sont stérilisées. L’environnement de l’animal est adapté. S’il y a nécessité d’isoler les animaux, ce que nous éviterons au maximum, l’environnement des animaux sera enrichi (maison). - Pendant l'opération, les cages seront amenées les unes après les autres dans la salle de chirurgie qui est séparée de la zone d'hébergement des animaux afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. - Des protocoles précis de prémédications permettant la diminution de la douleur, l’anesthésie de l’animal et de sa mise à mort sont mis en place. Un traitement anti-douleur avant, pendant et après l’opération est mise en place à l’aide d’une injection de buprénorphine sous la peau de l’animal. - Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique en sous cutané, durant les 48 heures après l’opération.
Choix des espèces
Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais permet d’évaluer la capacité de l’étude à être transposable à une implantation chez l’homme car elle est réalisée chez le mammifère. L’utilisation du rat permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique ainsi que la réponse biologique. Les réactions immunitaires et inflammatoires du rat sont similaires et transposables à l’homme. Ces données sont validées dans la littérature faisant du rat l’espèce de choix pour cette étude. Les rats seront âgés de 10 semaines et pèseront environ 250gr. Tous les rats auront le même âge pour une meilleure comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille des rats. Des rats âgés de 10 semaines sont choisis afin qu'ils aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques à la suite de l’anesthésie et pour faciliter l'intervention chirurgicale. De plus, le stade de développement devra permettre une cicatrisation optimale grâce à la qualité des tissus.
Production d’anticorps chez le lama immunisé (lama glama)
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Immobilisés dans un couloir de contention par un licol et des sangles passées sous le ventre, les lamas subissent une prise de sang finale de 250 à 400 ml, après six injections d'antigènes et d'adjuvant en général, huit au plus, le tout sans anesthésie. 375 lamas, classés parmi les autres mammifères, vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger, puis 200 restent à l'élevage et 175, mâles et autres femelles, sont placés chez des détenteurs. Le porteur décrit une "prestation de services" : produire des anticorps "à la demande de clients", qui mènent leurs propres recherches thérapeutiques. Il indique que les injections peuvent provoquer des "douleurs aiguës transitoires", et que l'impact léger des procédures "ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal.
Bénéfices attendus
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée.
Procédures
Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile.
Impact sur les animaux
L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.
Devenir
Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.
Remplacement
Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.
Réduction
En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces.
Raffinement
Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens.
Choix des espèces
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.
Etude du lien entre perturbations du microbiote et l’arthrite inflammatoire.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 225 d'entre elles et modéré pour 61. Elles appartiennent à une lignée transgénique qui développe spontanément une arthrite : les articulations, surtout aux pattes arrière, gonflent jusqu'à rendre la marche douloureuse, et une partie des souris reçoit des antibiotiques dès la naissance, par une voie que le résumé ne précise pas. Chaque semaine, des recueils d'urine et de selles et une prise de sang à la joue sont pratiqués, y compris sur les mères gestantes puis allaitantes, dont le lait peut aussi être extrait par massage des mamelles, et les nouveau-nés peuvent subir une biopsie dès la naissance pour vérifier leur génotype. Les souris d'élevage sont tuées à partir de 160 jours, quand l'arthrite est installée, et les souris traitées aux antibiotiques à 12 semaines au plus tard. Le porteur attend des résultats qui "pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants", et affirme que "le modèle animal ne peut pas être remplacé".
Objectifs
Les rhumatismes inflammatoires correspondent à une inflammation articulaire, appelée arthrite, dans le cadre de maladies générales de l'organisme avec un risque de handicap et une baisse de la qualité de vie. Les mécanismes aboutissant aux rhumatismes inflammatoires restent mal connus. Le corps humain est l'hôte d'une communauté microbienne, dont la plus importante est le microbiote qui réside dans les intestins. Les micro-organismes présents sont capables d’interagir avec différentes cellules immunitaires, qui agissent comme des sentinelles. Des études antérieures ont montré que les traitements antibiotiques étaient associés au développement de l'arthrite chez les enfants. Néanmoins, la méthodologie de ces études ne permet pas d’établir un lien causal, et les mécanismes par lesquels ces médicaments influencent la physiopathologie de l'arthrite restent inexplorés. D'autres études ont observé que la translocation de fragments de bactéries, présentes dans l'intestin, vers le système sanguin de l'organisme était augmentée chez les souris arthritiques. Un plus grand nombre de fragments de bactéries ont également été retrouvés dans le sang de patients atteints d'arthrite. Sachant que l'un des mécanismes d'action des traitements antibiotiques est la destruction des bactéries de l’intestin, cela provoque une augmentation de fragments bactériens dans l’intestin. Nous formulons alors l'hypothèse que le traitement antibiotique peut être responsable d'une augmentation significative de fragments bactériens libres capables de pénétrer dans l’organisme et d'augmenter la sévérité de l'arthrite. Ainsi, dans cette étude, nous étudierons le rôle des antibiotiques dans la physiopathologie de l'arthrite. L'exploration complexe du lien entre le tube digestif et l'arthrite inflammatoire nécessite d’être réalisée sur des animaux puisqu’à ce jour aucun système cellulaire in vitro ne permet de reproduire ces interactions complexes. Nous utiliserons un modèle murin transgénique qui développe spontanément une arthrite ressemblant à l'arthrite humaine. Seront étudiés les effets de différents types d'antibiotiques sur la translocation de fragments de bactéries, l'activation immunitaire et le développement de l'arthrite.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un lien mécanistique entre le traitement antibiotique à un jeune âge et le développement ultérieur d'une arthrite inflammatoire. Les résultats pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants, et éventuellement guider le choix des molécules à utiliser dans les populations à risque de développer une arthrite.
Procédures
L'urine sera collectée une fois par semaine chez les mères (enceintes et allaitantes) et les nouveau-nés après le sevrage, soit après contention avec la main du manipulateur et placement d'un tube collecteur au niveau de l'urètre ; soit en isolant la souris quelques instants dans une cage séparée pour une courte durée si nécessaire (moins de 30 minutes), l'urine présente dans la cage sera alors aspirée à l'aide d'une pipette. Une fois par semaine, les selles sont recueillies en isolant les souris quelques instants dans une cage séparée (moins de 30 minutes). Des échantillons de sang sont prélevés sur la mandibule (sous-maxillaire) une fois par semaine. Il s'agit de piquer, à l'aide d'une aiguille fine, une zone de la joue de la souris connue pour avoir une veine facilement accessible. Cela permet de récupérer facilement 2 à 3 gouttes de sang, avec une cicatrisation rapide et un traumatisme limité pour la souris. La souris pourra être endormie à l'aide d'un anesthésique gazeux, afin de réduire le stress et l'inconfort de la procédure pour la souris. Conformément aux recommandations actuelles, le volume prélevé sera inférieur à 7,5 % du volume sanguin total de l'animal. Le lait maternel peut être prélevé pour l'analyse post-traitement, conformément aux procédures existantes dans la littérature. Les souris seront endormies comme décrit ci-dessus et placées sur le dos afin d'avoir accès à leur estomac et à leurs mamelles. Les souris peuvent être endormies à l'isoflurane (anesthésie gazeuse) si la procédure est inconfortable pour elles. Les mamelles seront massées pour stimuler la sortie du lait, qui sera récupéré à l’aide d’une pipette. Seule la moitié des mamelles sont utilisées, afin de laisser suffisamment de lait à la mère pour nourrir ses petits. Une biopsie peut être prélevée sur les nouveau-nés dès leur naissance, afin d'effectuer une étude génétique de la souris, pour s'assurer que la mutation génétique est toujours présente.
Impact sur les animaux
Ce projet de recherche a comme effet indésirable attendu l’augmentation de la sévérité de l’arthrite provoquant la douleur chez les souris selon les traitements reçus et leurs durées. L’arthrite évoluera par une augmentation du gonflement des articulations (principalement des pattes arrières) plus ou moins rapide et forte, pouvant devenir douloureuse lors de la marche. Les souris seront alors surveillées quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs. Pour cela, une grille de score de bien-être est mise en place afin de juger l’état douloureux de l’articulation ainsi que la souffrance animale. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir de la grille est supérieur à la limite établie.
Devenir
Pour les souris en élevage, après 160 jours de vie, l’arthrite sera bien installée. Ainsi, prolonger leur durée de vie ou leur donner de nouvelles portées, risque de les rendre plus douloureuses. Pour éviter ce risque de diminution du bien-être, les souris seront euthanasiées à partir de 160 jours de vie. Concernant les souris nées sous différents traitements antibiotiques, les souris seront euthanasiées à 12 semaines de vie maximum. Les mères ayant mi-bas pourront être réintroduit dans la procédure d’élevage pour avoir une nouvelle portée, à partir de 160 jours de vie, elles seront euthanasiées.
Remplacement
Aujourd’hui, il n’existe pas de système permettant d’évaluer l’arthrite en dehors du modèle animal. En effet l’arthrite apparait selon des facteurs génétiques, environnementaux et hormonaux qui ne sont pas clairement connus et difficiles à reproduire en dehors du modèle animal. De plus, l’arthrite du modèle animal est très proche de celle retrouvée chez l’homme. Il n’existe pas non plus de modèle permettant de comprendre l’effet systémique des antibiotiques sur la sévérité. Notre modèle cherche à comprendre l’implication et l’interaction entre le système digestif et l’apparition ou le développement de l’arthrite. Il n’existe pas de méthode alternative pour comprendre l’interaction entre plusieurs organes différents. Pour cela, le modèle animal ne peut pas être remplacé.
Réduction
Le nombre d'animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type et sur notre volonté à utiliser le moins d’animaux possible tout en nous permettant d’avoir assez de résultats pour réaliser une interprétation fiable des données. Ainsi, le nombre de souris est réduit au strict minimum pour obtenir des résultats pertinents statistiquement. Ce nombre tient compte du nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi éviter des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Chaque souris aura à sa disposition du coton et/ou un abri dans sa cage pour se former un nid. Des morceaux de bois pourront être donnés à des souris isolées ou en faible effectif afin de permettre le jeu et l’exploration d’objet. Les souris seront hébergées en groupe de 6 individus maximum dans des cages sur des portoirs ventilés. Une exception existe, où les souris pourront être isolées durant leur gestation et selon les traitements. Dans ce cas, une surveillance accrue et davantage de coton et bois seront donnés à la souris isolée. En cas de souffrance d’un animal, une grille de score a été établie pour juger de l’intensité de la douleur. Ainsi, en fonction du score, des dispositions seront prises pour améliorer le bien-être. Cela peut aller de l’augmentation de l’enrichissement (coton, tunnel, buchettes), au dépôt de nourriture et d’eau dans la cage, à l’augmentation de la surveillance, arrêt de la procédure ou euthanasie de l’animal si le score de douleur est jugé trop important.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont la physiologie et le système immunitaire sont très proches de ceux de l'homme, et il existe des lignées avec des modifications conduisant à une inactivation des gènes, ce qui permet de reproduire des maladies et étudier les mécanismes sous-jacents. Les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ont donc de fortes chances d'être transposés à l'homme. Le modèle murin d'arthrite inflammatoire chronique spontanée utilisé dans ce projet est très proche de l'arthrite observée chez l'homme. Il s'agit d'une souris chez laquelle est invalidé un gène qui empêche l'activation d'un récepteur impliqué dans l'inflammation, appelé récepteur de l'interleukine 1 (IL1). Par conséquent, ce récepteur est constamment stimulé, ce qui entraîne une suractivation de l'inflammation et la sécrétion de substances inflammatoires, tel que le l'interleukin-1. Dans le cas de ces souris, l'inflammation est présente dans les articulations, ce qui provoque leur inflammation. Dans la précédente demande d’autorisation de projets, nous avons remarqué que plus les souris recevaient des antibiotiques à un âge jeune, plus l’arthrite devenait précoce et sévère avec le temps. C’est pourquoi dans ce projet, nous donnerons des antibiotiques à des souris dès la naissance pour étudier le phénomène d’apparition de l’arthrite et les mécanismes biologiques impliqués chez l’enfant et au cours du temps. Ce projet permettra de mieux comprendre l’arthrite juvénile idiopathique (AJI) observée chez l’homme.
Compréhension de la leucémogenèse, développement de modèles de remplacement et tests précliniques pour les leucémies pédiatriques humaines agressives
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Greffées de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou dans le fémur, les souris reçoivent ensuite, selon les études, des molécules par injection jusqu'à deux fois par semaine ou par gavage quotidien pendant quatre semaines, avec jusqu'à douze prises de sang et trois prélèvements de moelle chacune. 3 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Beaucoup développent une leucémie qui, à un stade avancé, les amaigrit et les affaiblit. Des greffes peuvent aussi se faire sur des souriceaux nouveau-nés, pour étudier les leucémies de l'enfant. Le porteur annonce des points limites et des "critères d'arrêt précoces de souffrance" sans en préciser aucun.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvments de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries.
Devenir
Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.
Réduction
De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.
Choix des espèces
Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.
Rôle des canaux ioniques dans les réponses anti-infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, avant d'être infectées par la grippe par voie nasale à une ou deux reprises et suivies deux semaines, pour étudier si des canaux ioniques renforcent la mémoire immunitaire. Le porteur indique que l'irradiation provoque diarrhée et perte de poids, et qu'une souris perdant 30 % de son poids est mise à mort. Il envisage d'utiliser des activateurs de ces canaux comme adjuvants de vaccination et juge le modèle souris "indispensable".
Objectifs
Parmi les cellules du système immunitaire, les lymphocytes T jouent un rôle majeur dans la réponse aux infections. Lors d’une infection, les lymphocytes T prolifèrent et se différencient soit en cellules effectrices soit en cellules mémoires. Les cellules effectrices migrent vers le site de l’infection afin d’éliminer l’agent responsable. Les cellules mémoires assurent quant à elles une protection contre de nouvelles infections par ce même pathogène en permettant une deuxième réponse immunitaire plus rapide. Une fois la première infection résolue, les cellules effectrices sont éliminées tandis que les cellules mémoires survivent dans les tissus jusqu’à des dizaines d’années, assurant une protection à long terme. C’est ce processus qui est à la base du principe de vaccination. L‘activation des lymphocytes T repose sur leur interaction avec des cellules dendritiques qui leur présentent des petits morceaux de pathogènes, ce qui permet de n’activer que les lymphocytes T spécifiques de cette infection. L’ensemble de ces processus requiert la migration des cellules dendritiques et des lymphocytes T. Différents canaux ioniques, des pores dans la membrane cellulaire qui permettent le passage des ions comme le calcium à travers la membrane cellulaire, sont impliqués dans la migration de ces cellules. Notre étude vise à déterminer s’il est possible de manipuler l’activité de ces canaux pour augmenter la réponse mémoire contre les infections.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer si les canaux ioniques testés sont nécessaires à l'établissement d'une réponse cellulaire T CD8 mémoire dans le tissu/organe. Si c’est le cas, nous pourrions envisager d'utiliser des activateurs de ces canaux comme adjuvants dans les stratégies de vaccination.
Procédures
Afin de générer des animaux dont seules les cellules immunitaires sont dépourvues du canal ionique que nous testons, les souris sont irradiées, puis reçoivent une injection intraveineuse de cellules de moelle osseuse sous anesthésie. La moitié des souris est ensuite infectée par une première souche d’Influenza par voie intranasale. Toutes les souris reçoivent une « seconde » (ou première selon le groupe) infection 30 jours après la première infection, à un moment où les souris sont complètement rétablies de la première infection. Les souris sont suivies pendant 15 jours après la 2ème infection.
Impact sur les animaux
L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids légère chez les souris pendant quelques semaines. Les souris peuvent présenter une perte de poids dans les 15 jours qui suivent une infection avec influenza avant de commencer à se rétablir. Dans notre étude, les souris seront suivies quotidiennement après l'infection grippale et mises à mort lorsqu'elles atteignent 30 % de perte de poids corporel ou si les souris atteignent les points limites de la procedure.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'expérience.
Remplacement
Nos résultats in vitro ont démontré le rôle de canaux ioniques dans la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes associés. Pour analyser les effets sur le système immunitaire, composé de nombreux types de cellules différents, nous avons besoin d’un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser par expérience tient compte de : - la nécessité d'utiliser le moins de souris possible, - pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés en fonction de l’hétérogénéité attendue entre souris. Trois expériences indépendantes seront réalisées afin d'assurer la robustesse des résultats.
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer la souffrance, et des points limites ont été définis. Les expérimentations seront arrêtées à l’atteinte des points limites. Les souris seront anesthésies avant d’être infectées par le virus de la grippe. Pour éviter l’hypothermie lié à l’anesthésie, les souris seront placées sur des tapis chauffants après l’infection et jusqu’au réveil. Les souris infectées par le virus de la grippe seront pesées tous les jours (week-ends compris) pendant les 2 semaines qui suivent l’infection et ne devront pas perdre plus de 30% de leur poids initial. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. En cas de déshydratation, nous prévoyons une réhydratation parenterale au Ringer lactate.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines d’intérêts spécifiques, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Enfin, il existe des souches d’influenza disponibles adaptés au modèle murin. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Développement d’un modèle de souris transgénique CX3CR1-GFP pour analyser dans le cortex cérébral in vivo par microscopie à deux photons les thérapies anti-inflammatoires et l’imagerie de neuro-inflammation
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
100 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des approches anti-inflammatoires sur le cerveau par microscopie à deux photons. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de deux heures puis trois séances d'imagerie sous anesthésie, certaines recevant une lésion inflammatoire au cortex, un implant délivrant du dihydrogène ou une stimulation magnétique transcrânienne. Le porteur indique que la stimulation peut causer de petites hémorragies cérébrales, que les chirurgies présentent un risque infectieux et que les souris peuvent aggraver leurs plaies, avant d'être tuées pour les analyses. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro d'un "cerveau complexe vivant" pour ces mécanismes.
Objectifs
Objectif 1 : Analyser les effets anti-inflammatoires du dihydrogène sur la neuro-inflammation. Objectif 2 : Valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3 : Analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus des projets sont multiples : objectif 1, valider ou pas l'effet du dihydrogène sur la diminution de la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est associée a beaucoup de neuropatologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Pour cette derniere , il a déjà été observé une ameliorations de symptomes chez les rats Parkinsoniens. Objectif 2 ,valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3: analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau. Ces effets sont à eviter chez l'homme, sauf dans le cas ou nous avons besoin transitoirement du passage d'un médicament.
Procédures
Toutes les souris subiront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale pendant 2 heures. Et, également sous anesthésie générale, 3 séances d'imagerie cérébrale sous microscope précédées d'une injection intra-veineuse d'agent de contraste, durant un maximum de 3 heures. Lors de leur chirurgie, pendant quelques secondes, certaines souris subiront une induction inflammatoire à l'aide d'une aiguille de biopsie à la surface du cortex cérébral. Certaines souris se verront implanter en sous-cutané dans le dos d'un électrolyseur délivrant du dihydrogène (chirurgie implantatoire de quelques minutes sous anesthésie générale). Enfin, quelques souris seront soumises pendant 30 minutes à un champ magnétique en disposant une bobine électrique au-dessus de leur tête.
Impact sur les animaux
Nous pouvons causer des petites hemoragies cérébrales lors de la stimulation magnétique transcrânienne. Les chirurgies présentent un risque infectieux. Les souris peuvent agraver leurs plaies en se blessant.
Devenir
La mise à mort des animaux est necessaire pour faire les analyses immunohistochimiques quantitatives de la neuroinflammation.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible avec des modèles in vitro ou in silico. La complexité des reactions neuro-inflammatoires in vivo ne permet pas de les étudier in vitro . Il n'existe pas de modèle in vitro d'un cerveau complexe avec les interactions intercellulaires et cellulaires-vasculaires en place. De ce fait, les mécanismes étudiés dans un cerveau vivant ne peuvent être analysés que dans un organisme complexe vivant.
Réduction
Les animaux sont suivis dans le temps par imagerie pour reduire leur nombre par groupe expérimental. Les nombres d’animaux par groupe ont été fixés en tenant compte d'une part de la complexité de la chirurgie et des implantations et d'autre part de la variabilité inter-individuelle. On utilisera les tests statistiques pour le calcul du nombre d'animaux minimum permettant l'obtention de résultats significatifs.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre en suivant toutes les règlementations en vigueur : animalerie agréée, personnel formé et autorisation de projet validée. Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement enrichi et contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. La fréquence de surveillance des animaux sera adaptée à la temporalité de l'expérience, impliquant si nécessaire l'arrêt des expérimentations. Si les points limites sont atteints : 1) Perte de poids , Perte de poids 5% > 10%> 20%, score 1/2/3 2) Etat du pelage, de la peau et des yeux, manque de soins / lesions, score 1/2, Grattage/ infection/ Ulcération / inflammation chronique, score 1/2/3/, adminstration d'une crême apaisante. 3) Mobilité anormale: claudication/ inactivité/ prostration , score 1/2/3. 4) Fèces liquides, score 1 5) respiration , anomalies, score 2. Score limit = 3, adminstration d'un antalgique dans le biberon systématique en post-chirurgie. S'il n'y a pas d'amélioration de l'état de la souris en 24h , elle sera sacrifiée sans demande d'autorisation au responsable scientifique du projet. Les différents gestes chirurgicaux et toutes les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie et analgésie générale et locale. La méthode chirurgicale la moins invasive sera retenue pour le bien-être animal, comprenant la sévérité des suites opératoires. Il y a un traitement antalgique (Carprofène) suite aux chirurgies dans toutes les procédures expérimentales selon les conseils de notre vétérinaire référent. Les animaux pourront être vidéosurveillés en continue si nécessaire (surtout en post-opératoire) grâce à la mise au point d'une caméra infra-rouge. Bien que génétiquement modifiée, le transgène étant transmis de façon systématique et stable, les souris seront identifiées par tatouage sans geste plus invasif.
Choix des espèces
L'espèce animale retenue correspond au modèle le plus pertinent pour la modalité d'imagerie utilisée : la microscopie intra-vitale. De plus, nous avons besoin d'un modèle in vivo qui exprime des cellules immunitaires rendues fluorescentes telles que chez une souris transgénique existante. Nous utilisons les souris adultes (> 6 mois ) pour faire une chirurgie osseuse sur la boîte cranienne. Ces operations ne sont pas possibles sur une souris en croissance pour laquelle la bôite cranienne n'est pas à sa taille definitive.
Rôle de l’inflammation sur les réponses anti-tumorales dans un modèle de chimère chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les réponses immunitaires contre les tumeurs. Chaque animal est irradié, reçoit une greffe de moelle osseuse puis des cellules tumorales, et une partie ingère un irritant intestinal par cycles de cinq jours. Le porteur indique que l'irradiation peut faire souffrir en cas de mauvaise reconstitution, que l'irritant colique provoque une perte de poids et une souffrance, et que tous les animaux sont tués pour prélever organes et tumeur. Il affirme que la complexité du micro-environnement tumoral "oblige" à recourir à l'expérimentation animale, les bénéfices restant formulés au conditionnel.
Objectifs
Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.
Procédures
Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.
Remplacement
La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.
Rôle des récepteurs Toll-like dans l’inflammation, l’autoimmunité et le syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Environ 1 200 sont tuées dès le génotypage pour ne pas porter le bon profil génétique, tandis que les 1 200 autres subissent un régime gras de cinq à six mois provoquant obésité et stéatose hépatique, des prélèvements sanguins et des tests de tolérance au glucose. L'objectif est d'étudier le rôle d'un récepteur Toll dans l'obésité et l'auto-immunité. Le porteur affirme que les souris partagent "99 % des gènes" avec l'humain et écarte les organoïdes, jugés incapables de reproduire l'atteinte de plusieurs organes.
Objectifs
L'obésité est une épidémie mondiale qui touche aussi bien les pays riches que les pays pauvres et constitue l'un des principaux problèmes de santé publique du XXIe siècle. Un lien entre l'obésité, le syndrome métabolique et les maladies auto-immunes et l'inflammation chronique associée a été suggéré, mais les mécanismes sousjacents sont encore inconnus. Toutes ces maladies ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies, continuent à augmenter, menacent de réduire l'espérance de vie et infligent un fardeau aux patients et à la société dans son ensemble. Les récepteurs de type Toll (TLR) des mammifères détectent des composants microbiens conservés, partagés par de nombreux micro-organismes, ainsi que des composants endogènes provenant de cellules mourantes ou blessées, et jouent un rôle essentiel dans le pilotage de l'immunité innée et adaptative. Récemment, les récepteurs de type Toll sont apparus comme un lien critique entre l'inflammation et la contribution à l'obésité et aux maladies auto-immunes, tant chez la souris que chez l'homme. En particulier, le récepteur 7 de type Toll, qui détecte l'acide ribonucléique simple brin, contribue au développement de l'obésité et des maladies auto-immunes, comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren. Ainsi, cibler les récepteurs Toll-like pourrait être une nouvelle approche thérapeutique dans la prévention ou le traitement de l'obésité et des maladies auto-immunes et inflammatoires. L'objectif du présent projet est de mieux comprendre comment l'augmentation de la signalisation du récepteur 7 de type Toll dans certains types de cellules contribue à l'obésité et à l'auto-immunité et d'émettre l'hypothèse que la réduction de la fonction du récepteur 7 de type Toll pourrait prévenir le développement de l'obésité et de l'auto-immunité et leurs effets néfastes. Plus précisément, nous cherchons à explorer la contribution du récepteur 7 de type Toll par les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales thymiques dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité en utilisant des modèles de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires. Au cours des dernières décennies, l'obésité et les troubles auto-immuns ont connu une augmentation parallèle significative dans les pays occidentaux/industrialisés. Il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies pour la prévention et le traitement de ces maladies. Le modèle murin d'obésité induite par le régime alimentaire est devenu l'un des outils les plus importants pour comprendre l'interaction entre les régimes alimentaires occidentaux riches en graisses et le développement de l'obésité, tandis que les modèles murins de lupus ont permis de faire d'importantes découvertes sur l'implication du récepteur 7 de type Toll dans les maladies auto-immunes. Le récepteur 7 de type Toll joue un rôle important dans le développement de maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren ainsi que l'obésité. Afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'obésité, des études animales plus mécanistes sont nécessaires pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires exacts qui sous-tendent l'auto-réactivité dans l'obésité, ainsi que la diaphonie adipeuseimmunitaire dans l'organisme. Nos études feront progresser notre compréhension de la contribution du récepteur 7 de type Toll par différents types de cellules dans l'obésité et l'auto-immunité et pourraient déboucher sur de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement de ces troubles qui réduisent l'espérance de vie et ont d'énormes conséquences socio-économiques.
Procédures
Les animaux pré-sevrés seront soumis à un prélèvement de tissus pour le marquage et le génotypage (2400 souris). Les animaux avec le génotype approprié (1200 souris) seront soumis à un régime riche en graisses ou à un régime standard à partir de l'âge de 1,5-2 mois et pour une période de 5-6 mois. Des prélèvements sanguins (durée : 4 minutes maximal) seront effectués sous anesthésie gazeuse une fois à l'âge de 3,4-4 mois et une fois à l'âge de 5-5,5 mois. Un test de tolérance au glucose sera effectué à l'âge de 6-7 mois et un test de tolérance à l'insuline sera effectué à l'âge de 7-7,5 mois, au cours duquel des prélèvements de sang seront effectués à 5 moments différents. La durée du test de tolérance au glucose et du test de tolérance à l'insuline est de 90 minutes, tandis que le prélèvement de sang durant ces procédures dure 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un prélèvement de tissus pour le génotypage et l'identification, ainsi qu'à une prise de sang. Ces procédures durent moins d'une minute et peuvent entraîner une gêne et un stress mineurs pour les animaux, comme une douleur ou un stress temporaire pendant la procédure, un risque d'infection ou de saignement si elle n'est pas effectuée correctement. Pour l'obésité induite par le régime alimentaire, les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime riche en graisses pendant une période de 4 à 6 mois. Le régime riche en graisses chez la souris peut entraîner une prise de poids importante, l'obésité, des troubles métaboliques, une stéatose hépatique et une inflammation de faible intensité. Il peut également avoir un impact potentiel sur les facteurs comportementaux et psychologiques et provoquer des troubles gastro-intestinaux en raison de l'altération du microbiote intestinal. En outre, la manipulation ou l'immobilisation des souris peut provoquer du stress et de l'anxiété, ce qui peut entraîner des changements physiologiques et comportementaux, tels qu'une augmentation du rythme cardiaque, des niveaux élevés d'hormones de stress et une modification des schémas d'exploration ou d'activité. Enfin, l'anesthésie chez les souris peut entraîner des nuisances potentielles ou des effets indésirables tels que la dépression respiratoire, la baisse de la température corporelle et des altérations de la fonction cardiovasculaire.
Devenir
Après le génotypage, les animaux avec le mauvais génotype seront mises à mort (~1200 souris), tandis que les animaux avec le bon génotype (~1200 souris) seront placés dans un régime riche en graisses ou un régime standard pendant une période de 5-6 mois et seront ensuite mises à mort pour une analyse plus approfondie. Si, au cours des procédures, les souris atteignent le point limite (score de gravité supérieur à 10), elles seront mises à mort.
Remplacement
L'obésité et les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques complexes, qui impliquent des décennies de changements physiopathologiques et d'adaptation. Le modèle d'obésité induite par le régime alimentaire chez la souris entraîne des modifications de plusieurs organes par rapport aux souris témoins. De plus, les maladies auto-immunes sont souvent systémiques et affectent plus d'un organe, comme dans le cas du lupus érythémateux systémique ou du syndrome de Sjögren. Ce projet propose d'étudier ces processus dans des modèles murins de récepteurs Toll (TLR) de l'obésité induite par le régime alimentaire et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ; ceci nécessite l'évaluation des changements physiologiques et immunologiques d'un organisme vivant. D'autres alternatives ont été envisagées, notamment la culture de tissus ou les organoïdes ex vivo (par exemple, le tissu adipeux sur une puce), mais l'objectif principal de ce projet est d'étudier les changements dans divers organes (tissu adipeux, foie, rein, pancréas, thymus) pendant une longue période et l'interaction entre l'obésité et les troubles auto-immuns, ce qui n'est pas possible avec les alternatives susmentionnées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux par expérience, nous suivons des protocoles actualisés et standardisés pour le modèle de souris obèse induit par le régime alimentaire et pour mesurer la résistance ou la sensibilité à l'insuline. Les calculs pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour les procédures ont été instruits par des études rapportées dans la littérature et notre expérience antérieure sur des souris transgéniques dans le cadre du syndrome métabolique et de l'auto-immunité. Le nombre d'animaux à utiliser permettra de générer des données scientifiquement robustes. Chaque souris sera soumise à de multiples tests (jusqu'à une sévérité modérée) au lieu d'utiliser des animaux différents pour chaque test, et des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de garantir que le maximum d'informations soit recueilli sur chaque animal. Afin de limiter la variabilité entre les différents génotypes de souris, nous utiliserons et comparerons toujours des souris de même origine génétique et appariées en âge et en sexe. En outre, et chaque fois que cela sera possible, nous comparerons des souris transgéniques avec des souris sauvages de la même portée, afin d'éliminer l'hétérogénéité due à la variabilité du microbiote.
Raffinement
Les souris seront manipulées de manière appropriée et elles interagiront fréquemment, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Le prélèvement de sang dans le plexus rétro-orbitaire sera effectué sous anesthésie à l'aide d'une station d'anesthésie à gaz, tandis que le prélèvement de sang dans la queue sera effectué après l'application d'un anesthésique local sur la queue. En outre, afin de préserver le bien-être des animaux au cours de la procédure, les souris seront contrôlées fréquemment à l'aide d'une feuille de score appropriée pour le bien-être des animaux, afin de s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement déterminé par le score. Des interventions humaines ou des points d'arrêt seront immédiatement mis en œuvre si l'on constate qu'un animal présente des effets indésirables inattendus.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies parce qu'elles sont très similaires aux humains, puisque les deux sont des mammifères et que 99% des gènes des souris sont similaires aux gènes des humains. En étudiant la physiologie des souris, nous pouvons obtenir des informations sur la façon dont les êtres humains développent des maladies. En particulier pour les maladies chroniques comme l'obésité et l'auto-immunité, les souris sont idéales car elles vivent peu (~2 ans). De plus, les souris génétiquement modifiées rendent cette espèce idéale pour l'étude des molécules individuelles du système immunitaire. Dans notre projet, nous étudions un récepteur de type Toll, qui est conservé au cours de l'évolution entre les humains et les souris, dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité, en utilisant des souris génétiquement modifiées. Ces souris sont donc le modèle le plus approprié pour atteindre les objectifs de cette étude. Pour les souris issues d'un accouplement hétérozygote, la collecte de tissus pour le génotypage et le marquage des souris sera effectuée à l'âge de 7-10 jours. En effet, les souris doivent être regroupées dans des cages en fonction de leur génotype au moment de leur sevrage (21 jours), et le génotypage doit donc être effectué avant cet âge. Les souris seront utilisées à l'âge de 2 à 8 mois afin d'étudier la progression de la prise de poids et de l'auto-immunité avec le temps, puisqu'il s'agit de troubles chroniques.
Evaluation du potentiel immunorégulateur des vésicules extracellulaires : EVReg
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections de vésicules extracellulaires, des mesures de glycémie et des prélèvements sanguins, certaines développant un diabète auto-immun ou une maladie du greffon contre l'hôte, avant le prélèvement de leurs organes lymphoïdes. L'objectif est de mettre au point une mesure de l'activité immunomodulatrice de ces vésicules, en vue de la transposer ensuite vers des tests in vitro. Le porteur affirme que cette réaction immunitaire n'est "pas modélisable in vitro ni in silico" à ce stade.
Objectifs
L’objectif général de notre projet est l'évaluation du potentiel immunomodulateur des vésicules extracellulaires (EV) de sources cellulaires variées, à usage thérapeutique. Il n'existe actuellement aucun test standardisé dans la littérature pour évaluer le potentiel immunorégulateur des EVs. Selon les études en effet, les chercheurs utilisent des métriques très différentes (dosage des protéines totales, quantité d'une protéine, nombre de particules, activité enzymatique ...). Notre projet vise d’une part à proposer une méthode de qualification et de mesure objective de l'activité immunomodulatrice des EV de toutes provenances, et d’autre part l’identification des cibles immunitaires précises in vivo en fonction de la voie d’administration, dans le but de pouvoir dans un 2ème temps transposer l’évaluation thérapeutique des EV de l’in vivo vers des tests in vitro ou ex vivo.
Bénéfices attendus
La publication d'un test robuste de mesure des effets immunomodulateurs des EV permettrait la standardisation des pratiques entre laboratoires et entre EV de différentes sources ; elle permettrait également de valider les méthodes de production et de purification de façon à préserver ou maximiser le potentiel des EV.
Procédures
Les manipulations prévues sur animaux vigiles consistent en des pesées (192 animaux max, hebdomadaires ou bi-hebdomadaires), mesures de glycémie (60 animaux, bi-hebdomadaire), et injections intrapéritonéales (60 animaux, maximum bi-mensuel). Les manipulations sur animaux anesthésiés inclueront des injections (192 animaux max, EV administrées en 2 injections ou en injection unique), et ponctions sanguines (192 animaux max, prélèvements hebdomadaires). Les injections, ponctions sanguines, pesées et mesure de glycémie sont des opérations rapides d'une durée maximale de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues sur les animaux ne doivent pas engendrer d’inconfort, de douleur ou de gêne notable, et sont de courtes durées. L’inconfort des injections i.d. ou des prélèvements au niveau du sinus rétro-orbitaire sera anticipé par une manipulation sous anesthésie générale gazeuse. Pour le suivi du diabète, la mesure de la glycémie sur microgoutte ponctionnée à la queue ne doit pas engendrer de douleur, et cette mesure ne nécessite qu’une contention légère et rapide. Dans le cadre du modèle de transfert de diabète, les symptômes et complications liés à une hyperglycémie (perte de poids, perte d’appétit, état clinique dégradé) sont évités par un diagnostic précoce. Les symptômes seront surveillés pour une prise en charge rapide le cas échéant. Dans le cadre du modèle d’humanisation, la maladie du greffon contre l’hôte engendre également des symptômes cliniques indésirables (perte de poids, apathie, symptômes digestifs…), mais le suivi du poids permet une détection rapide de l’apparition de la maladie, et les points limites décrits sont suffisamment précoces pour éviter une souffrance des animaux.
Devenir
Le devenir terminal des souris est la mise à mort pour prélèvement et analyse des cellules sanguines et des organes lymphoïdes, que le terme de l'expérience soit échu ou que les points limites soient atteints.
Remplacement
L'étude de la réaction immunitaire en fonction de la voie d'administration des EV n'est actuellement pas modélisable in vitro ni in silico. Le manque d'éléments de standardisation empêche le calcul à priori des doses équivalentes entre deux lots d'EV : notre projet vise précisément à améliorer cet état de l'art.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit par l'utilisation des noeuds lymphatiques individuels : chaque individu fournissant plusieurs noeuds lymphatiques, l'appariement des données avec contrôle interne par animal permet de réduire grandement le nombre d'animaux. Par ailleurs, l'utilisation d'une procédure de diabète accéléré permet, grâce à une pénétrance maximale de la maladie, de diminuer nettement le nombre d'animaux à observer dans le cas d'un diabète spontané. Les groupes ont été réduits au minimum pour permettre la validation de nos hypothèses. Des analyses statistiques permettront une exploitation des résultats d'incidence de diabète ou de maladie de greffon contre l'hôte, mais aussi de dosages des marqueurs immunitaires et inflammatoires du sang, et analyses ex vivo de la réactivité des organes lymphoïdes et populations cellulaires.
Raffinement
L'étude chez les souris traitées vs non-traitées comportera un suivi du poids, de la glycémie (selon les groupes), ainsi que systématiquement de ponctions sanguine terminale. Après l'euthanasie, les organes lymphoïdes, selon les groupes les pancréas, seront également prélevés pour études fonctionnelles in vitro, ou études moléculaires, biochimiques ou transcriptionelles. Les animaux ne sont pas manipulés avant une semaine d'acclimatation pour les nouveaux arrivants. Les animaux nés au sein de l'EU sont manipulés et habitués aux manipulations avant le début des procédures. Tous les animaux sont hébergés en cages par groupe de 5 maximum par fratrie et par sexe. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'EU et par les expérimentateurs de façon pluri-hebdomadaire. Les cages sont nettoyées chaque fois que nécessaire (minimum une fois par semaine) en génant les animaux le moins possible, tout en maintenant en permanence de l'enrichissement changé régulièrement, incluant de la cellulose compressée, des jouets en bois (bille, quille), des hamacs, des igloos, des roues, des tubes en plastique rouge ou en carton, sans exclure l'utilisation d'autre enrichissement selon les disponibilités. Ce matériel est autoclavé avant utilisation.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle de diabète de type 1 auto-immun chez la souris NOD, modèle très bien décrit dans la litérature et utilisé depuis longtemps en laboratoire, permet d'accélérer les procédures mises en place tout en réduisant le nombre d'animaux. Ce modèle de diabète accéléré chez la souris permettra d'évaluer précisément ce que le projet prévoit de quantifier : l'effet immunomodulateur des EV. Par ailleurs, les autres modalités expérimentales disponibles dans cette espèce sont facilement disponibles, ce qui garantit une exhaustivité supérieure aux autres espèces. Les souris utilisées dans ce projet seront majoritairement des souris jeunes adultes au-delà de six semaines. En effet, les souris obtenues du fournisseur à l’âge de 6 semaines peuvent s’acclimater pendant 2 semaines avant d’être utilisées en protocole. Au-delà de 8 semaines, elles ont un poids suffisant et stabilisé autour de 25g, permettant d’avoir des lots homogènes et des résultats reproductibles. Seules les souris issues du modèle d'humanisation seront traitées entre 4 et 6 semaines, afin de maximiser la réussite de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.