Système immunitaire
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Développement d’une stratégie de ciblage des macrophages synoviaux pour le traitement personnalisé des différents pathotypes d’arthrose dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
3 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie de déstabilisation du ménisque du genou, une autre reçoit des injections de collagénase dans l'articulation pour induire une arthrose, et toutes reçoivent des injections intra-articulaires d'un traitement ciblant les macrophages. Le porteur indique que l'arthrose peut provoquer douleur, prostration et isolement, et que des infections des sutures ou des points d'injection restent possibles. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit simultanément tous les paramètres de la maladie.
Objectifs
L’arthrose est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50% de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble de l’articulation (cartilage, os, membrane synoviale) et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’arthrose est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements traitant les symptômes de la douleur et non les causes précises de l’arthrose existent, ne permettant pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’arthrose. L’inflammation de la membrane synoviale (tissu entourant la zone d’interface entre deux os, lubrifiée par du liquide synovial) semble être un mécanisme clé dans l’initiation et la progression de l’arthrose. Les macrophages, cellules immunitaires impliquées dans la surveillance de notre organisme et dans certaines réactions inflammatoires, représentent la population immunitaire la plus importante dans la membrane synoviale et plusieurs études ont montré leur rôle pathologique au cours du développement et de la perpétuation de l’arthrose. De plus, nos résultats préliminaires ont identifié plusieurs sous-populations de macrophages d’intérêt au sein d’échantillons de membranes synoviales de patients atteints d’arthrose. L’objectif de ce projet vise donc (1) à valider chez la souris l’identification d’une ou plusieurs populations de macrophages de la membrane synoviale impliquées dans l’arthrose ; et (2) à développer une stratégie de ciblage de ces macrophages pour le traitement spécifique de l’arthrose. Pour cela, l’utilisation de trois modèles murins différents est nécessaire afin de représenter au mieux les différents sous-groupes de patients atteints d’arthrose observés en clinique. L’ensemble de ces données ouvrira la voie à l’étude de cette stratégie de ciblage spécifique des macrophages dans l’arthrose pour une utilisation thérapeutique. Enfin, dans la littérature, des données montrent une association entre les modifications du microbiote intestinal (ensemble des microorganismes du système digestif) et le développement de l’arthrose. Ainsi, nous mettrons à profit les expérimentations précédentes et nous analyserons le microbiote intestinal des trois modèles murins d’arthrose afin d’étudier le lien, à l’heure actuelle incompris, entre composition de ce microbiote et développement de l’arthrose.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose est à ce jour peu efficace et, compte-tenu l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le développement de traitements de l’arthrose représente un défi majeur. Ce projet permettra d'une part, de confirmer l’implication des macrophages de la membrane synoviale dans le développement et la progression de l'arthrose ; et d'autre part, d’apporter la preuve de concept de l’efficacité d’un nouveau traitement spécifique de cette maladie, ciblant les macrophages de la membrane synoviale dans différents modèles murins représentant la diversité des manifestations cliniques et biologiques observées chez les patients. Ces travaux pourront, à plus long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques personnalisées pour des essais cliniques chez le patient chien (animal présentant naturellement de l’arthrose, de façon similaire à l’Homme) puis chez l’Homme. En parallèle, ce projet permettra également d’approfondir l’axe de recherche du microbiote dans l’arthrose. Il permettra, pour la première fois, d’évaluer l’impact du développement de l’arthrose sur la composition microbienne intestinale. Ainsi, ces résultats préliminaires ouvriront la voie à des études ultérieures et leur impact pour les patients sera majeur.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d'un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs à l’articulation) du genou droit. Une autre partie sera soumise à deux injections intra-articulaires de collagénase (molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage) dans le genou droit. L’ensemble des animaux recevra une ou plusieurs injections intra-articulaires du traitement spécifique, appelé lipoplexes, permettant de modifier l’activité des macrophages de la membrane synoviale pour le traitement de l’arthrose. Ces opérations seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer se proster, s’isoler des autres animaux et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le modèle d'induction chirurgicale de l'arthrose, une déchirure de la peau, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant la chirurgie, pourrait avoir lieu. De plus, dans de rares cas, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales, au niveau du point d’injection du modèle d'induction chimique de l'arthrose ou au niveau du point d’injection des lipoplexes servant au ciblage des macrophages de la membrane synoviale. De façon générale, les animaux sont suivis régulièrement et différents indicateurs précoces d’une éventuelle douleur et/ou détresse (points limites) seront attentivement observés (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter des tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires, ainsi que d’un liquide synovial. L'ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant, dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d'une pathologie, comme dans le cas de l'arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour laquelle il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences pertinentes (statistiquement significatives) et reproductibles entre les groupes. De plus, pour mettre au point l'utilisation des lipoplexes, permettant le ciblage des macrophages dans les animaux, des tests préliminaires in vitro seront réalisés sur des cellules en culture et sur des cultures de membrane synoviale, ainsi que des tests préliminaires in vivo sur des souris non arthrosiques, permettant in fine de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. L’association du projet principal, concernant le ciblage des macrophages dans les trois modèles murins d’arthrose, avec le projet secondaire, portant sur l’étude préliminaire du microbiote intestinal dans l’arthrose, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l'obtention de conclusions fiables concernant les deux questions de recherche distinctes.
Raffinement
De façon générale, un suivi hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-opératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux. Les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec des frisottis et un dôme, permettant de l'amélioration ou enrichissement du milieu de vie. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de chacun 12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptée, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils et méthodes d'analyse sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose, plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autres part, elle permet la constitution de groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des analyses pertinentes et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation, assurant la faisabilité de notre stratégie. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose est possible et documentée dans la littérature. Dans le cas du développement d’une arthrose spontanée, les protocoles débuteront chez des souris âgées de 12 mois (âge minimum à partir duquel une arthrose spontanée se développe).
Interactions entre lymphocytes T innés et microbiote et rôle dans l’inflammation intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 112 après des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit chimiquement une inflammation intestinale puis un cancer colorectal, par gavage de tamoxifène, sulfate de dextran dans l'eau de boisson et injection d'un agent cancérigène, ce qui provoque diarrhées et pertes de poids. Le but est de caractériser une interaction entre le microbiote et des lymphocytes T et d'en définir le rôle dans ces maladies. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" pour établir un lien de causalité que les données humaines et in vitro ne permettent pas.
Objectifs
L’ensemble des microbes colonisant l’organisme est appelé le microbiote. Ces microbes assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique et peuvent contribuer au développement du cancer colorectal, qui représente la deuxième cause de décès par cancer en France et dans le monde. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs issus du thymus et appelés lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote notamment intestinal, et dans la réduction de l’inflammation du colon. Déchiffrer les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains et en cas d’inflammation intestinale, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et de cancer du colon, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Cependant des éléments essentiels sont manquants pour bien comprendre cette interaction entre les lymphocytes T et le microbiote : - Quelle est la distribution de ces antigènes dans le corps après production par les bactéries du microbiote? - Quelle est la durée de vie des antigènes fabriqués par le microbiote ? - Quel est le rôle (bénéfique ou délétère) de cette interaction dans l’inflammation intestinale et le cancer colorectal ? L’objectif général du projet est donc de caractériser une intéraction entre le microbiote et le système immunitaire et de définir son rôle (bénéfique ou délétère) en cas d’inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et le microbiote intestinale. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le développement du cancer colorectal. Le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Procédures
Dans une première procédure visant à mesurer la distribution d’un antigène microbien dans le corps, cet antigène sera administré soit par voie intrapéritonéale ou orale (1 fois au cours de l’expérience) sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes), soit par voie cutanée, intranasale ou intrarectale (1 fois au cours de l’expérience) sur animaux anesthésiés pendant 20 min. Dans une 2e procédure visant à mesurer la durée de vie in vivo d’un antigène microbien, cet antigène sera administré par voie intrapéritonéale (injection dans l’abdoment)(1 fois au cours de l’expérience) sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes). Dans une 3e procédure visant à évaluer l’effet de la reconnaissance d’un antigène microbien sur l’inflammation intestinale, un produit (tamoxifen) sera administré par voie orale (gavage) quotidiennement pendant 5 jours sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes). Puis les animaux recevront un second produit (sel de sulfate de dextran) dans l’eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours. Chaque cycle est suivi de 4 jours sans traitement. Dans une 4e procédure visant à évaluer l’effet de la reconnaissance d’un antigène microbien sur le cancer colorectal, un produit (tamoxifen) sera administré par voie orale (gavage) quotidiennement pendant 5 jours sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes). Puis les animaux (vigiles) recevront une injection d’un agent carcinogène directement dans l’abdomen (injection intrapéritonéale). Puis les animaux recevront du sel de sulfate de dextran dans l’eau de boisson pendant 3 cycles de 4 jours. Chaque cycle est suivi de 16 jours sans traitement.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration de l’antigène microbien par voie intrapéritonéale seront celles liées à l’injection d’un produit non toxique directement dans l’abdomen (gêne de courte durée). Suite aux administrations de tamoxifène, une perte de poids pouvant atteindre 10% du poids initial est attendue. Le poids initial est retrouvé une semaine plus tard. L’inflammation intestinale est induite par administration de sel de sulfate de dextran (DSS) dans l’eau de boisson, et peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids. Le poids initial est retrouvé 7 jours après la fin du traitement. Le cancer colorectal est induit par une injection intrapéritonéale d’azoxymethane suivie de 3 périodes de traitement au DSS pour induire une inflammation intestinale pendant 7 jours, qui peut engendrer des diarrhées et une réduction du poids jusqu’à 7 jours après la fin du traitement. Les souris retrouvent leur poids initial 7 jours après la fin du traitement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par microscopie ou cytométrie en flux.
Remplacement
Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes lignées cellulaires humaines et de cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules in vivo. Le projet a pour but maintenant d’étudier la distribution de l’antigène in vivo chez la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour définir les propriétés de cet antigène dans un organisme vivant intégré. Concernant le rôle de cet antigène dans l’inflammation intestinale, les données obtenues chez l’humain ont permis de documenter un enrichissement en bactéries capables de fabriquer l’antigène chez les patients atteints de maladie inflammatoire chronique de l’intestin et de cancer colorectal par rapport aux sujets sains, ainsi qu’une activation des lymphocytes spécifiques dans l’intestin. Ces données sont intéressantes mais ne permettent pas d’établir un lien de causalité entre changement du microbiote et activation des lymphocytes T. Le rôle (bénéfique ou délétère) de cette interaction hôte-microbiote ne peut pas non plus être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.
Réduction
Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale et de cancer du côlon induit par l’inflammation chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place dans l’équipe et présentent une pénétrance de 100% (toutes les souris incluses dans le protocole peuvent être étudiées), limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés avant toute administration intranasale ou intrarectale. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux seront suivis 3 fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. L’inflammation intestinale et le développement de tumeurs sont induits par administration de produits chimiques et peuvent causer des diarrhées. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. En cas d’atteinte d’un point limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale et du cancer du côlon, du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.
Étude du rôle de l’érythropoïétine sur l’homéostasie digestive chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent douze injections sous-cutanées d'EPO ou de solution témoin et trois prélèvements sanguins à la queue en contention vigile, avant la mise à mort pour prélever l'intestin et étudier ses populations immunitaires. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle reproduisant la complexité des interactions entre cellules immunitaires intestinales et microbiote, et conclut que l'expérimentation animale est "nécessaire". Les retombées annoncées pour les patients traités par EPO restent formulées comme une piste possible.
Objectifs
L'érythropoïétine (EPO) est une hormone utilisée pour corriger l'anémie chez les patients atteints d’insuffisance rénale ou de cancer. Elle agit en stimulant la production de globules rouges au niveau de la moelle osseuse. Bien que l'anémie soit considérée comme un facteur de mauvais pronostic, il a été rapporté que le traitement à l'EPO était source d’effets secondaires pouvant, chez certains patients, entrainer une réduction de la survie globale. Plusieurs hypothèses suggèrent que ces effets indésirables, seraient du au fait que l’expression des récepteurs à l’EPO n’est pas uniquement restreinte aux cellules de la moelle osseuses mais est également retrouvée à la surface d’autres types cellulaires de l’organisme telles que les cellules du système immunitaire. Il est désormais établi que l’EPO présente un rôle immunosuppresseur capable de réduire l’efficacité des réponses immunitaires anti-infectieuses et anti-tumorales. Bien que quelques données soutiennent un rôle de cette hormone au niveau du tractus digestif notamment en renforçant l’intégrité de la barrière intestinale, aucune étude ne c’est intéressé au rôle de l’EPO sur le système immunitaire intestinal. Notre projet a donc pour but d'évaluer l’impact de l’EPO sur l’homéostasie de la muqueuse digestive. Pour cela, nous souhaitons explorer les altérations phénotypiques et fonctionnelles induites par l'EPO sur des populations immunitaires lymphocytaires clefs de l'intestin ainsi que son impact sur la composition du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les compartiments immunitaires et microbiens digestifs sont des acteurs majeurs de la santé humaine. Des altérations de l’un comme de l’autre sont décrites pour favoriser l’appariation de pathologies et pour réduire l’efficacité de certaines thérapies notamment dans le traitement des cancers. Ainsi nos travaux pourraient représenter une piste dans la compréhension des mécanismes impactant la survie globale des patients atteints de cancer traités par l'EPO.
Procédures
L’ensemble des souris recevront un total 12 injections sous-cutanées de PBS ou d’EPO (3 injections par semaine). Ces injections seront réalisées lors d'une contention sur des souris vigiles. Trois prélèvements sanguins, espacés d'une semaine, seront effectués au niveau de la veine de la queue. Ce type de prélèvement sera réalisé sur des souris vigiles dans un tube de contention. Des selles seront récoltées les jours d’injection par une contention de la souris.
Impact sur les animaux
Lors des injections sous-cutanées, les souris peuvent être légèrement stressées au moment des premières contentions. Cependant, les injections sous-cutanées répétées d’EPO de PBS n’induisent pas de douleur supplémentaire à une piqure. Concernant les prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue, ils seront effectués 3 fois sur chaque souris et seront espacés d'une semaine. Ce type de prélèvement est stressant pour les souris, mais n’induit qu’une très faible douleur. L'expérience acquise sur ce type d'expérience nous a permis d'établir que l'injection d'EPO n'induisait pas de phénotype dommageable chez les souris.
Devenir
L'ensemble des souris sera mis a mort à la fin de la procédure de notre étude afin de prélever les organes d'intérêts pour l'étude des populations immunitaires intestinales.
Remplacement
Notre projet vise à évaluer l’effet de l’EPO sur l’interaction hôte-microbiote au niveau de la muqueuse digestive. A ce jour, il n’existe pas de modèles et de systèmes permettant de refléter la complexité des interactions entre les cellules immunitaires intestinales et le microbiote. L’expérimentation animale s’avère donc nécessaire.
Réduction
Dans notre étude, nous récupérons chez chaque souris l’ensemble de l’intestin afin de récolter les cellules immunitaires. L’objectif sera sur ces différents organes de décrire les altérations induites par le traitement à l’EPO d’un point de vue phénotypique mais aussi fonctionnel. Pour l’étude du microbiote intestinal, nous allons congeler les selles afin de quantifier et d’identifier les micro-organismes présents et impactés par le traitement à l’EPO. Nous allons récupérer un maximum de données afin de réduire le nombre d’animaux employés, le tout en conservant une validité statistique appropriée. Étant donné que nous travaillons sur des populations cellulaires minoritaires et que certaines souris sont réfractaires au traitement à l’EPO (jusqu’à 30 %), cette étude nécessite par lot traitée avec de l'EPO 20 souris. Pour les souris contrôles, traitées avec du PBS, nous n'aurons besoin que de 16 souris, car nous n'aurons pas de souris réfractaires. Ce nombre d’animaux a été calculé selon notre expérience acquise en tenant compte de la variabilité interindividuelle et afin d’obtenir des résultats statistiquement représentatifs.
Raffinement
Toutes les souris du projet bénéficient des conditions d'hébergement, conforme à la réglementation et contrôlée pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. L’expérience acquise sur ce type d’expérience nous a permis d’établir que l’injection d’EPO n’induit pas de phénotype dommageable chez la souris. De plus, nous avons mis en place une grille de points limites adaptées afin d’évaluer le bien-être de l’animal et de limiter sa souffrance.
Choix des espèces
La souris Mus musculus est l’espèce la plus utilisée en expérimentation en immunologie et dans l’étude du microbiote. De nombreuses bases de données sont disponibles dans la littérature et nos propres résultats servent de base expérimentale pour nos protocoles. C’est pourquoi nous utiliserons des souris C57BL/6J. Les souris que nous utilisons sont âgées de 6 à 12 semaines (les souris doivent être jeunes mais le système immunitaire mature).
Impact de l’inflammation sur la structure tissulaire et la surveillance immunitaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 722 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un agent inflammatoire est appliqué sur l'oreille sous forme de goutte, de piqûres superficielles ou d'injection, suivi de sessions d'imagerie sous anesthésie pouvant durer jusqu'à deux heures et répétées jusqu'à sept fois, pour étudier la migration des cellules immunitaires dans la peau enflammée. Le porteur compare la gêne à celle ressentie après un vaccin et l'affirme "limitée en temps et intensité". Il reconnaît l'existence de modèles in vitro mais affirme que la souris reste "indispensable" pour disposer d'un tissu et d'un système immunitaire complets.
Objectifs
La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice, maintient la température corporelle stable et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches : l’épiderme, le derme et l’hypoderme. L’épiderme, la couche externe, est principalement constitué de kératinocytes qui synthétisent la kératine, une protéine qui protège la peau contre les dommages et la déshydratation. Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. Enfin, l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique et agit comme un coussin pour les organes internes. Dans le derme et l’épiderme des tissus, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Dans les tissus, la migration des cellules immunitaires est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation ou d’infection par exemple. Notre projet vise à comprendre comment les propriétés de la peau sont modifiées par différents signaux inflammatoires, et comment cela affecte la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans ce tissu.
Bénéfices attendus
Comprendre comment l’inflammation modifie les tissus et la migration des cellules immunitaires permettra à la fois d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus, mais également de déchiffrer certains des mécanismes déterminants dans les stratégies de vaccination, où une inflammation est générée artificiellement afin de stimuler la réponse immunitaire mémoire. Nos résultats pourraient par exemple aider aux choix des composés d’un vaccin, en particulier de l’adjuvant utilisé, ou de la voie d’administration. Ces résultats permettront aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies inflammatoires chroniques comme le psoriasis.
Procédures
La première procédure vise à évaluer l’effet d’une inflammation locale aigue de la peau sur la structure du tissu et l’infiltration du tissu par les cellules immunitaires. Les souris sont anesthésiées. Un agent inflammatoire est appliqué sur une des 2 oreilles (goutte de liquide, goutte de liquide + piqures superficielles, ou injection sous cutanée), 1 seule fois par expérience. Les souris sont ensuite remises dans leurs cages pour le réveil. L’anesthésie de chaque animal dure au maximum 10 minutes. La seconde procédure vise à déterminer comment la modification de la structure du tissu par l’inflammation aigue impacte la migration des cellules immunitaires dans le tissu (derme et épiderme) au pic de l’inflammation. L’inflammation est réalisée comme dans la première procédure. 5 minutes avant la mise à mort, les souris sont anesthésiées et un marqueur des vaisseaux est injecté en intraveineuse, 1 seule fois par expérience (durée du geste inférieur à 30 secondes). La troisième procédure vise à évaluer les effets de l’inflammation aigue sur la migration des cellules immunitaires depuis l’application de l’agent jusqu’à la résolution totale de l’inflammation et le retour à l’état normal du tissu. L’inflammation est réalisée comme dans la première procédure. Pour l’imagerie, les souris sont anesthésiées, un marqueur des vaisseaux est injecté en intraveineuse, puis les souris sont placées sur le flanc dans une enceinte chauffée et l’oreille est immobilisée sous le microscope. Chaque session d’imagerie dure maximum 1h30. L’anesthésie dure maximum 2h. Chaque souris est imagée au maximum 1 jour sur 2, au plus 7 fois. Les mêmes procédures sont réalisées sur un autre groupe d’animaux, mais pour induire une inflammation chronique, l’agent inflammatoire est appliqué sous forme de crème, tous les jours pendant 5 jours (durée du geste inférieur à 30 secondes).
Impact sur les animaux
Pour cette étude, une inflammation sera induite par application d’un agent inflammatoire : - Par dose unique avec différentes posologies : goutte de liquide, goutte de liquide + piqûres superficielles ou injection sous cutanée. - Par plusieurs doses appliquées sous forme de crème. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur. Induire une inflammation artificiellement engendre ces 4 caractéristiques, qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et de faible intensité, comparable à ce qui peut être ressenti après un vaccin, et donc la gêne sera présente mais limitée en temps et intensité. Les animaux seront suivis pendant 4 semaines afin d’étudier également la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets forts pendant plus de 5 jours. Dans certaines procédures, les animaux subiront une injection intraveineuse, sous anesthésie gazeuse, dont les effets indésirables sont limités à l’intensité et la durée d’une piqure.
Devenir
Les animaux sont mis à morts pour des analyses post-mortem
Remplacement
De nombreuses études in vitro ont pu montrer l’influence du microenvironnement sur la migration des cellules immunitaires. L’ajout de composant bactérien sur certaines cellules immunitaires par exemple les fait migrer plus vite in vitro. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu. Il est donc difficile d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permet d’autre part d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Cela permettra aussi de déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que l’oreille). Une procédure pilote sera réalisée afin de déterminer le meilleur temps expérimental et la dose minimale à utiliser pour observer un remodelage du tissu. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Pour chaque expérience, les ganglions lymphatiques, qui ne sont pas utilisés pour le présent projet, seront prélevés et cryopréservés afin de pouvoir être utilisés dans un potentiel second projet permettant de voir l’effet d’une inflammation locale sur le ganglion drainant. Les échantillons « oreilles inflammées » seront toujours comparés à l’autre oreille n’ayant pas subi de traitement inflammatoire local. Ceci permettra de réaliser des tests statistiques plus puissants et donc permettant de limiter le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront mis à mort. Pour la procédure pilote visant à déterminer les meilleurs temps expérimentaux et la meilleure dose d’agent inflammatoire à utiliser, les animaux seront suivis quotidiennement pendant 5 jours après stimulation, puis tous les 2-3 jours jusqu’à résolution complète de l’inflammation (ou à la mise à mort de l’animal). Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans la procédure pilote. Les souris sont identifiées individuellement par tatouage sur les coussinets et toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Implication de vaisseaux sanguins spécialisés dans l’effet thérapeutique sur la tumeur de souris de l’électrotransfert d‘un plasmide porteur d’un gène codant une cytokine immunomodulatrice.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré, pour 352 d'entre elles, et sévère, pour 1 368. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis des injections dans la tumeur suivies d'une électroporation répétée jusqu'à trois fois, pour étudier des vaisseaux sanguins particuliers dans l'effet d'une immunothérapie. Le porteur indique que l'accumulation de ces gestes a été classée comme une nuisance sévère "en soi", et laisse croître les tumeurs jusqu'aux prélèvements. Il affirme que l'étude ne peut se faire qu'in vivo dans un modèle recréant le microenvironnement tumoral et une réponse immunitaire complexe.
Objectifs
L’immunothérapie utilisant des anticorps représente une révolution dans le traitement du cancer. Ces anticorps, en réactivant les cellules immunitaires devenues inefficaces, les rendent à nouveau capables de reconnaître et de réagir contre les cellules cancéreuses. Cependant, l’immunothérapie ne fonctionne pas toujours et l’absence d’infiltration de lymphocytes T dits « tueurs » dans certaines tumeurs contribuerait en partie à cette inefficacité. L’interleukine 12 (IL-12) a cette fonction de recruter et d’activer les lymphocytes pour augmenter la réponse immunitaire. Une nouvelle stratégie permet de faire exprimer l’IL-12 localement par la tumeur de façon sure (sans effets secondaires), ceci par électro-transfert de gène (GET-IL-12). Cette stratégie a conduit à des réponses cliniques favorables chez des patients porteurs de mélanomes métastatiques, en combinaison ou non avec une immunothérapie. Une étude dans un modèle murin a montré que faire exprimer l’IL-12 par la tumeur améliorait l’infiltration lymphocytaire, rendant la tumeur plus sensible à l’immunothérapie. Par ailleurs, notre équipe a montré que des vaisseaux sanguins très spécifiques constituaient la porte d’entrée principale des lymphocytes dans la tumeur traitée ou non par immunothérapie. Nous avons démontré que l’augmentation de la proportion de ces vaisseaux dans la tumeur améliorait l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, dans une étude rétrospective sur des patients atteints de mélanome métastatique, nous avons établi que la présence de ces vaisseaux spécifiques était corrélée à une meilleure réponse à l’immunothérapie. Développer des traitements permettant d’augmenter la proportion de ces vaisseaux particuliers dans les tumeurs, et donc de recruter plus de lymphocytes T tueurs, représente un véritable challenge pour améliorer l’efficacité de l’immunothérapie. Notre projet cherche donc à savoir si l’effet bénéfique du GET-IL-12 observé sur les patients traités par immunothérapie, pourrait passer par une induction de ces vaisseaux spécifiques. Si le rôle de l’infiltration lymphocytaire est bien établi dans l’effet bénéfique du GET-IL-12, le rôle de ces vaisseaux particuliers dans ce recrutement n’a jamais été étudié.
Bénéfices attendus
Mettre en évidence un lien entre l’induction de vaisseaux spécialisés et la génoélectrothérapie par l’interleukine 12 (GET-IL-12), permettrait de mieux comprendre les mécanismes d’action de ce traitement sur la sensibilisation des tumeurs lors de l’immunothérapie. De plus, si ce lien existe, le traitement GET-IL-12 pourrait constituer une nouvelle stratégie pour augmenter ces vaisseaux spécialisés et rendre l’immunothérapie plus efficace chez un plus grand nombre de patients.
Procédures
Dans une première procédure indépendante, les animaux n’auront qu’une injection de cellules (durée inférieure à 2 minutes). Dans une deuxième procédure indépendante, d’autres animaux auront une injection de cellules soit seule soit suivie quelques jours après d’une intra-tumorale (durée 5 minutes) associée à une électroporation d’une durée de 10 secondes. Cette combinaison de traitement (intra-tumorale + électroporation) sera répétée une deuxième fois, 4 jours après le 1er traitement pour 2/3 des animaux, et une troisième fois, 7 jours après le 1er traitement pour 1/3 des animaux. Dans une troisième procédure indépendante, d’autres animaux auront une injection de cellules suivie quelques jours après, soit d’une intrapéritonéale seule (durée 5 minutes), soit d’une intrapéritonéale et d’une intra-tumorale (durée 5 minutes) associée à une électroporation d’une durée de 10 secondes. Ce choix de traitement sera répété une deuxième fois, 4 jours après le 1er traitement pour 2/3 des animaux, et une troisième fois, 7 jours après le 1er traitement pour 1/3 des animaux. Dans les deuxièmes et troisièmes procédures, un cinquième des animaux aura un prélèvement sanguin avant d’être mis à mort. L’ensemble de ces interventions sera réalisé sous anesthésie gazeuse. L'électroporation sera réalisée via un gel échographique permettant ainsi d’éviter les brûlures au niveau de la peau.
Impact sur les animaux
De par notre expérience sur les différents traitements lors de projets précédents, nous n’avons pas reporté d’effets indésirables sur les animaux. Seule une dépigmentation a été observée chez les souris possédant un pelage noir. Elle est localisée au site de traitement par GET-IL-12 lors de la repousse des poils. cependant, le projet est susceptible d’induire des nuisances. L’injection sous anesthésie gazeuse de cellules tumorales en sous cutanée ainsi que la croissance tumorale peuvent induire une douleur modérée. L’injection sous anesthésie gazeuse du plasmide IL-12 en intra-tumorale (IT) et de l’anticorps en intrapéritonéale (IP) peut induire une douleur légère le temps de l’injection. L’électroporation (EP) du plasmide induit une contraction transitoire des muscles peauciers entre les électrodes le temps du protocole électrique (~10s) susceptible d’induire une légère douleur. Cette nuisance (IT+EP et IP) sous anesthésie sera subie d’une à trois fois par animal (J0, J4 et J7) selon le jour de prélèvement (J4, J6, J9) et durera moins de 10 minutes. Enfin, l’injection d’un anesthésique pour le prélèvement cardiaque en terminal peut induire une douleur légère. L’accumulation de ces nuisances légères et modérées sur un même animal a été considérée comme une nuisance sévère en soi.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour les prélèvements et les analyses des tumeurs et des ganglions drainants.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, nous souhaitons identifier les mécanismes de la réponse anti-tumorale associée aux traitements GET-IL-12 et d’immunothérapie, en analysant les effets sur les vaisseaux HEV (induction) et l’infiltration lymphocytaire. L’étude ne peut donc se faire qu’in vivo dans un modèle permettant de recréer le microenvironnement cellulaire tumoral mais aussi l’induction d’une réponse immunitaire complexe.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 15 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour réaliser les tests statistiques. Quand cela est possible, les différentes parties du projet sont regroupées pour réduire le nombre de groupes observés et ainsi le nombre d'animaux utilisés dans le projet. Les dosages d’IFN et d’IL-12 seront réalisés sur les animaux utilisés pour l’immunofluorescence. Les suivis de croissance tumorale (effet des traitements) seront réalisés sur les groupes de souris ayant les trois traitements.
Raffinement
Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées visent à réduire tout stress. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Pour les tumeurs sous cutanées, un suivi journalier sera mis en place avec une fiche de suivi de croissance et arrêt de la procédure en cas de point limite atteint. Pour évaluer la douleur, une grille de scoring a été établie. Pour l’enrichissement, une sizzle ball (boule de bandelettes compressée), un tube et une bûchette sont placés dans chaque cage.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux murins dans lesquels nous voulons quantifier les cellules endothéliales cuboïdales et l’infiltration lymphocytaire se développent dans la souris. Cette espèce est largement utilisée par les équipes de Recherche dans le domaine de l’oncologie et a un système immunitaire bien caractérisé. Elle permet de reproduire le développement tumoral, le développement des vaisseaux et la mise en place d’une réponse immunitaire similiaire à celle de l’espèce humaine. Des souris adultes de 6-8 semaines seront utilisées. Ceci correspond à l’âge de maturation du système immunitaire.
Immunothérapie du cancer du rein chez la souris humanisée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
192 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'environ vingt minutes pour greffer des cellules tumorales sous la capsule du rein, puis des anesthésies répétées tous les deux jours pour suivre la tumeur par imagerie, la moitié recevant en plus des injections hebdomadaires d'anticorps. Le porteur décrit une chirurgie "invasive" entraînant douleur et stress, un risque de décès au réveil et des douleurs liées à la croissance tumorale et aux métastases. Il affirme que la souris humanisée est le "seul modèle pertinent" et que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité".
Objectifs
Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer chez la souris humanisée, nous prévoyons d'implanter des lignées tumorales génétiquement modifiées dans le site primaire d'origine de la tumeur étudiée, à savoir le rein. Après greffe sous la capsule rénale, la croissance de la tumeur ainsi que son éventuelle dissémination metastatique sera mesurée par bioluminescence sur animaux anesthésiés. Ces expériences seront réalisées dans des lignées de souris immunodéficientes ou dans cette même souche de souris préalablement humanisées par transfert de cellules progénitrices humaines. Ces souris dites humanisées régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel après quelques semaines. L'objectif du projet est donc d'évaluer la croissance sous la capsule rénale de lignées tumorales génétiquement modifiées en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. La comparaison de la croissance des tumeurs exprimant ou non les molécules d'intérêt dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur le rôle intrinsèque de la molécule étudiée sur la qualité de la réponse immunitaire associée et sur l'impact de celle ci sur le contrôle de la croissance de la tumeur.
Bénéfices attendus
La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes nous renseignera sur le rôle biologique d'une molécule exprimée par la tumeur sur la qualité de la réponse immunitaire contre la tumeur dans un modèle de souris humanisées. Un anticorps monoclonal est développé pour bloquer l'interaction entre cette molécule et son récepteur pour des applications thérapeutiques chez l'homme, après la validation de son efficacité dans des souris humanisées. En cas de résultats favorables, le bénéfice attendu du projet est donc de proposer un nouveau traitement pour le cancer du rein.
Procédures
La procédure implique une chirurgie sous anesthésie générale pour implanter les tumeurs sous la capsule rénale dans 192 animaux. La durée de l'acte est de 20 minutes par souris environ. Les souris sont traitées avec un analgésique 2h avant et deux fois après la chirurgie (24 et 48h). La procédure implique aussi que les souris greffées soient anesthésiées par voie gazeuse pour mesurer la croissance de la tumeur grâce à une injection dans le péritoine d'une molécule pour visualiser les tumeurs greffées et mesurer leur volume. Cet acte est de 10 minutes par souris. Il sera répété tous les 2 jours pendant un maximum de 45 jours. Tous les animaux de la procédure seront greffés et injectés avec la molécule permettant de visualiser les tumeurs. Dans la moitié des souris, soit 96 souris, une immunothérapie sera évaluée. Pour cela, les anticorps seront injectés une fois par semaine pendant 3 semaines en commencant 7 à 10 jours après la chirurgie pour une durée maximum de 45 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant douleur et stress. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. L'anesthésie présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu'à l'arrêt cardiaque. Le réveil de l'anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs sous la capsule rénale pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien ou avant si un point limite est atteint afin de réaliser les prélèvements et analyses nécessaires dans le cadre de ce projet.
Remplacement
Ce projet étant basé sur l'observation in vivo des croissances tumorales, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par d'autres types d'expériences. Seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet sur la fonction de molécules ciblées sur la réponse immunitaire contre la tumeur et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (n=192) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous utiliserons six animaux par groupe pour toutes les procédures et on répétera l’expérience 2 fois. Les différents groupes expérimentaux seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux contrôles nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.
Raffinement
L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs habilités de l'équipe de recherche. Une grille de score sera remplie à chaque visite pour évaluer l'état général des souris tout au long du maintien. Tout animal atteignant un point limite défini dans la procédure sera immédiatement euthanasié. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (administration d'analgésiques, euthanasie ou arrêt du protocole). Les animaux sont anesthésiés avec des anesthésique injectables ou gazeux dans les différents actes de la procédure. Les souris sont traitées avec un analgésique vétérinaire en pré et post opératoire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité.
Choix des espèces
Les procédures expérimentales chez l'animal décrites dans le projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. La souris humanisée est le seul modèle pertinent in vivo d'une réponse immunitaire de cellules humaines contre des tumeurs humaines in vivo. A ce titre, il permet la transposition des résultats à la situation physiologique chez l'homme mais aussi d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques destinées à la clinique, ce que ne permettent pas les modèles habituels. Nous travaillons depuis de nombreuses années avec les souris humanisées, ce qui nous a permis de proposer et de valider une nouvelle combinaison d'immunothérapie et de chimiothérapie dans le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 20 et 25 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des cellules immunitaires chez la souris. Pour les animaux non humanisés, nous utiliserons des souris de 8-10 semaines.
Etude et visualisation de la réponse immunitaire au cours de la croissance tumorale et durant l’immunothérapie dans un modèle de tumeur solide.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau ou dans le côlon, certaines une chirurgie d'imagerie sous anesthésie sans réveil, pour analyser la réponse immunitaire et le mode d'action d'immunothérapies anticancéreuses. Le porteur indique attendre peu d'effets de la tumeur sous-cutanée et fixe la mise à mort au dépassement d'un volume tumoral limite. Les bénéfices avancés pour les patients sont renvoyés au moyen et long terme, tandis que les souris reçoivent d'emblée des cellules tumorales et ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des traitements cancéreux ainsi que de leurs répercussions sur l’organisme. Pour cela nous tenterons d'identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur (ex. les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T). Nous tenterons d'évaluer leur contribution directe ou indirecte sur l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, nous souhaitons mettre en lumière les limitations de ces thérapies afin d’apporter de nouvelles hypothèses de travail pour l’amélioration des traitements. En résumé, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des immunothérapies dans les cancers primaires de la peau et du colon pour ainsi contribuer, au moyen/long terme, à l’amélioration de la prise en charge des patients en clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet offrira des pistes de travail pour générer des immunothérapies capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
La greffe de la tumeur consistera à une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h mais cette procédure sera sans reveil.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et aussi au niveau du colon. Le bien-être de chacune des souris sera contrôlé fréquemment. Notre connaissance précédente suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale sous-cutanée. La localisation (le flanc) de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, elles ne perdent pas de poids, leur pelage reste soyeux et leur comportement demeure inchangé. L’injection des thérapies que nous proposons d’étudier dans ce projet pourra ne pas causer d’effets indésirables ou avoir un effet à court terme (24-72h) par exemple sur la température corporelle de l’animal liée à l’élimination des cellules tumorales. Des mesures pour soulager l’inconfort des animaux seront mises en place et sont décrites plus loin dans ce protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires 2D ou des organoïdes (Structures 3D mimant les certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, les expériences de cytométrie et de dosage protéiques (ou d’imagerie multiplex) seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé, prostration, taille de la tumeur) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour la pousse de tumeur sous-cutanée, la tumeur sera mesurée 3 fois par semaine afin de contrôler la pousse tumorale et de mettre à mort l’animal si le volume de la tumeur atteint 1500mm2. Ce volume est calculé selon la formule longueur x largeur x hauteur. La hauteur est difficile à mesurer et une approximation en est faite. On considère la hauteur comme étant la longueur divisée par deux. La formule finale est donc : Longueur x largeur x (largeur/2). Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur au niveau du colon, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du dietget et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Impact du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique des cellules hôtes : rôle dans la santé et dans les maladies inflammatoires de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
12 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des gavages et des injections répétés et, pour certaines, une colite provoquant une inflammation intestinale douloureuse et des diarrhées, pour étudier l'effet du microbiote sur le métabolisme des cellules intestinales. Le porteur justifie ce nombre par la variabilité inter-animale et quinze ans d'usage de ces modèles, chaque animal étant euthanasié pour prélever plusieurs organes entiers. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité d'un "organisme entier", ce qui rendrait le recours à l'animal "nécessaire".
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), dont la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des maladies caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Leur incidence a augmenté de façon spectaculaire dans les pays occidentaux au cours des dernières décennies, ce qui démontre le rôle des facteurs environnementaux. Malgré le développement de nouveaux traitements, les MICI sont insuffisamment contrôlées chez une grande partie des patients, induisant une altération de la qualité de vie et un fardeau socio-économique. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le microbiote intestinal a été reconnu comme un acteur important au cours des MICI. Pour leur bon fonctionnement, nos cellules humaines ont besoin d’énergie et dépendent pour cela de plusieurs voies d’approvisionnement possibles que l’on appelle le « métabolisme énergétique ». Au cours des MICI, il a été observé une altération du métabolisme énergétique dans les cellules intestinales et immunitaires et cela pourrait jouer un rôle dans la maladie. Le métabolisme énergétique joue un rôle crucial dans la mise en place de la réponse immunitaire appropriée, et des données émergentes indiquent que le microbiote intestinal peut l'affecter directement. L'hypothèse principale est que l'altération du microbiote intestinal dans les MICI contribue à l'altération du métabolisme énergétique des cellules humaines intestinales et immunitaires, et au développement de la maladie. Le projet, en s’appuyant sur des expériences in vivo sur souris, a pour objectif (i) d'identifier les composant du microbiote ayant un impact sur le métabolisme énergétique des cellules et les mécanismes impliqués, (ii) de déchiffrer les conséquences des altérations du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique dans les maladies inflammatoires de l'intestin, et (iii) de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour manipuler l'état énergétique cellulaire. La compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la physiologie est d'une importance cruciale, car il est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment les MICI, mais aussi, le cancer, le syndrome métabolique et les troubles neuropsychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet avec de multiples bénéfices susceptibles de découler de ces travaux : (i) la caractérisation de la modulation fine du métabolisme énergétique des cellules hôtes par le microbiote intestinal ; (ii) l'identification des principaux acteurs microbiens dans ces processus ; (iii) l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dans les maladies inflammatoires de l'intestin et probablement dans plusieurs autres maladies humaines affectées par le microbiote intestinal (maladies inflammatoires rhumatologiques, maladies métaboliques, cancer…). Les résultats obtenus chez la souris seront confrontés à des données obtenues à partir d’échantillons humains, ce qui ouvrira la voie au développement de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce projet va donc relever des défis importants en produisant des résultats d’avant- garde pour une meilleure compréhension du dialogue entre microbiote et cellules humaines. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements dans les maladies inflammatoires de l'intestin d'abord, puis pour de nombreuses autres maladies affectées par une altération du microbiote.
Procédures
Les différents gestes réalisés sur les souris en fonction des groupes concernés seront les suivants : * Gavage (2 secondes) une fois par jour durant un à 20 jours * une injection unique (2 secondes) +/- un gavage (2 secondes) une fois par jour durant 1 jour à 12 semaines
Impact sur les animaux
Le projet comprend différentes interventions (gavages, injections intrapéritonéales ou encore intraveineuse) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale. Il peut s’y associer une diarrhée.
Devenir
L’ensemble des animaux (n=12540) seront euthanasiés à la fin des expériences afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et réaliser les analyses nécessaires au projet de recherche. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation basales et inflammatoires. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Pour prendre en compte la variabilité biologique et assurer la robustesse des résultats obtenus, nous avons besoin de réaliser les expériences décrites dans des groupes expérimentaux de 10 souris et ce dans au minimum 2 expériences indépendantes (10 x2 = 20 souris en tout par condition, qui seront poolées dans les analyses statistiques si besoin). Le recours à une troisième expérience indépendante ne sera réalisé qu’en cas d’interprétation impossible des résultats après la 2eme expérience. Ce projet impliquera donc un maximum de 12540 animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (test de Kruskall-Wallis suivi par Mann-whitney) car les conditions de normalités ne sont fréquemment pas remplies.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Le personnel impliqué dans le projet est formé en continu pour garantir leur compétence et une veille scientifique et technique en continue. Il y aura une vérification quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (litière/abreuvement/nourriture). Les animaux seront hébergés dans des cages standards (4 à 5 souris par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et du sizzlenest seront ajoutés dans les cages comme enrichissement de milieu. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation à 25 kGy et de l’eau autoclavée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 14 semaines.
Évaluation d’un traitement anti-tumoral sur la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections répétées de quelques secondes, une vaccination et un inhibiteur dérivé d'une toxine bactérienne, pour mesurer l'effet de ce traitement anti-myélome sur la réponse immunitaire. Le porteur n'attend qu'une douleur légère au point d'injection et présente le projet comme une étude préliminaire répondant à une question posée par des industriels. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire doit être analysée sur un "organisme entier".
Objectifs
Le myélome multiple (MM) est un cancer caractérisé par l’expansion de plasmocytes. L'introduction des chimiothérapies reposant sur les inhibiteurs du protéasome (IP) et sur des immunomodulateurs (IMID) a amélioré la survie des patients. Cependant, ces molécules induisent des effets secondaires sévères et développent de chimiorésistances. Le MM reste donc un cancer incurable et il est essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons démontré qu’une toxine bactérienne bloque le translocon (Sec61) qui est le canal protéique assurant l’import dans le réticulum endoplasmique de la majorité des protéines secrétées ou membranaires synthétisées. En bloquant cet import, cette toxine entraîne leur dégradation par le protéasome et déclenche un stress protéotoxique conduisant à l’apoptose. Nous avons montré que le blocage de Sec61 par la mycolactone potentialisait les activités anti-MM des IP et des IMID et que la trithérapie associant mycolactone aux IP et IMID était supérieure aux mono- et bithérapies dans le contrôle de la croissance tumorale chez la souris, sans induire d'effets secondaires. Ces travaux ont donc révélé que le blocage de Sec61 constituait une piste thérapeutique innovante et prometteuse pour le MM. Cependant, par ces capacités à bloquer la production des protéines, un traitement basé sur l’utilisation de ce type d’inhibiteur pourrait avoir un effet délétère sur l’induction d’une réponse immunitaire. Étant donné que cette réponse joue un rôle important dans le contrôle de la croissance tumorale, il est donc essentiel de déterminer l’effet d’un tel traitement sur cette réponse. L’objectif de ce projet consistera donc à déterminer l’influence de ce traitement aux doses précédemment établies sur l’induction d’une réponse immunitaire chez des souris immunocompétentes. Ce projet constitue donc une étude préliminaire car, s’il s’avérait que les doses déjà identifiées de cet inhibiteur permettant de réduire la croissance tumorale bloquait, dans un même temps, la réponse immunitaire, il sera alors essentiel par la suite, d’établir un nouveau projet afin d’analyser le développement de cancer et la réponses immunitaire antitumorale chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeur afin d’adapter le traitement pour obtenir un réel bénéfice. Ce projet répondra à une question demandée lors des évaluations par les industriels impliqués pour l’utilisation éventuelle de notre approche dans le traitement de cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’évaluer in vivo si le traitement par l’inhibition de la translocation des protéines sécrétées et transmembranaires à des doses thérapeutiques déjà établies ont une influence sur la réponse immunitaire. Ce projet constitue une étude préliminaire sur la réponse immunitaire et les résultats obtenus nous permettrons d’établir un nouveau projet sur les conséquences d’un tel traitement sur les réponses anti-tumorales et d’établir s’il y a un réel bénéfice de développer une telle stratégie thérapeutique et d’en déterminer les conditions. Dans l’ensemble, les résultats nous permettrons de définir une stratégie thérapeutique basée sur l’inhibition de la translocation dans le cadre de traitement de certains cancers et tout particulièrement sur le Myélome multiple.
Procédures
Injections répétées de quelques secondes (5 à 10 secondes).
Impact sur les animaux
D’après notre expérience, la vaccination et le traitement ne devrait pas induire de douleur particulière, de stress ou d’inconfort mise à part une douleur légère sur le site d’injection lors de la vaccination et de l’administration du traitement qui se fera par injections à l’aide de seringue.
Devenir
Tous les animaux du projet, comprenant une procédure unique, seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux et donc de les prélever après leur mise à mort.
Remplacement
Nos études ont mis en évidence un effet thérapeutique des traitements sur des lignées et des cellules primaires humaines tumorales de MM in vitro. Ce projet vise maintenant à caractériser et comprendre les effets thérapeutiques d’un inhibiteur de la translocation des protéines sur l’induction des réponses immunitaires, réponses essentielles dans le contrôle de la croissance tumorale lors de développement de cancers. L’induction d’une réponse immunitaire est un phénomène complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans différent organes et ne peut être étudié que dans sa globalité. En effet, il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. L’effet d’un tel inhibiteur sur la réponse immunitaire devra donc être analysé et validé sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé et nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu plusieurs facteurs caractérisant la réponse immunitaire pour obtenir le maximum d’information en utilisant le moins d’animaux possible. Une analyse statistique sera réalisée afin de valider les résultats. Le protocole de vaccination établi et utilisé depuis une quinzaine d’année nous assure que 100% des souris répondent à la vaccination en donnant de faibles variations sur les tests utilisés pour l’évaluer. Ceci nous permet alors d’utiliser le strict minimum de souris sans avoir le besoin d’utiliser des souris supplémentaires pour palier le fait que des souris seraient susceptibles de ne pas répondre.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un environnement protégé et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification. Suivant notre expérience, la vaccination et le traitement ne devrait pas induire d’effets indésirables mise à part une douleur légère lors de la vaccination et de l’administration de l’inhibiteur qui se fera par injections à l’aide de seringue ne nécessitant pas de procédures particulières. La durée et les doses sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Néanmoins les souris seront attentivement observées lors de l’expérience, et si des animaux présentaient le moindre signe de douleurs ou de stress, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, de nombreux outils très performants sont disponibles pour l’analyse de réponses immunitaires chez la souris (anticorps monoclonaux, marqueurs) nous permettant d’avoir des réponses claires et précises en utilisant de faibles quantités d’échantillons et permettant ainsi d’analyser différents facteurs. De plus de nombreuses données sont déjà disponibles (par notre expérience et dans la littérature) nous permettant de valider les résultats par comparaison. Les cancers ciblés se développant généralement chez l’adulte, nous n’utiliserons que des individus adulte (> 10 semaines).
Rôle du stroma dans les pathologies inflammatoires de la peau
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, des prélèvements de sang à la queue et une biopsie de peau sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules du derme dans l'inflammation cutanée à l'aide de lignées transgéniques portant un gène "suicide". Le porteur décrit un inconfort léger et n'attend aucun effet indésirable majeur. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de ces interactions multicellulaires "nécessite" un modèle murin in vivo, dont le système immunitaire serait proche de celui de l'humain.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser le rôle du stroma dans les pathologies inflammatoires et allergiques de la peau. Les cellules stromales constituent une fraction importante du derme, et sont des producteurs majeurs de facteurs immunorégulateurs. Lors d’une inflammation, elles deviennent très pro-inflammatoires. Afin d’étudier le rôle de ces cellules stromales dans l’inflammation, et en particulier les interactions avec les celllules immunitaires, nous étudierons le rôle de différentes populations stromales inflammatoires grâce à l’utilisation de lignées de souris transgéniques qui expriment des gènes « rapporteur » ou « suicide» (le récepteur à la toxine diphtérique) sous contrôle de promoteur de facteurs stromaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux pathologies inflammatoires de la peau. Notre étude permettra de mettre en valeur le rôle des cellules stromales dans ces processus afin de pouvoir proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des maladies chroniques inflammatoires ou allergiques de la peau, et blessures chroniques.
Procédures
- Un prélèvement sanguin a la veine caudale (durée : quelques secondes), 2x en 1 semaine, suivi d’une période de récupération de 1 semaine si besoin de refaire les prélèvements à l’identique. - Injection par voie intrapéritonéale quotidienne, ou tous les 3 jours. Durée : quelques secondes - Biopsie dermique localisée (1x par souris). Durée : 2 min sur souris anesthésiée
Impact sur les animaux
Inconfort léger dû aux injections ou prélèvement sanguin, rougeur peau. La biopsie dermique sera effectuée sur souris anesthésiée + analgésique local. Aucun effet indésirable majeur n’est attendu suite à ces procédures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les organes pour analyse
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction des cellules stromales avec leur microenvironnement à savoir les cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules immunitaires qui infiltrent le tissu. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est donc multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui ont un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, par exemple le T Test ou le test Anova en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les traitements, et les biopsies de peau seront effectuées sur animaux anesthésiés, couchés sur un tapis chauffant et sur une peau traitée avec anesthésique local Si un comportement associé à de la douleur est détecté après les biopsies, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies inflammatoires de la peau car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans l’inflammation chronique et sont semblables dans les pathologies inflammatoires humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux à moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 5 à 30 semaines car nous étudierons ces pathologies dans le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte
Etude de pharmacocinétique et de prélèvement de noeuds lymphatiques périphériques chez le chien
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
20 chiens vont être utilisés, gardés vivants et destinés à être réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un produit vétérinaire immunosuppresseur par voie intraveineuse à jeun, subit deux prélèvements de ganglions et dix-sept prélèvements sanguins répartis sur 44 jours. Le porteur décrit une prestation destinée à mesurer l'efficacité et la sécurité du produit et signale des vomissements comme effet possible. Il justifie le recours au chien par l'absence de méthode reproduisant la diffusion d'un produit dans "l'organisme entier" et par le fait qu'il s'agit de l'espèce cible.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques de l'élément d'essai testé (avec un effet cumulatif ou non) à six doses différentes ainsi que son efficacité et d'évaluer la sécurité du produit test . Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif ( la référence).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit test en le comparant au groupe contrôle , d'identifier à partir de quelle dose des signes cliniques apparaissent, d'évaluer la dose maximale que peut recevoir l'animal sans signe clinique et sans modifications des paramètres sanguins mais également de démontrer l'efficacité du produit administré grace aux prélèvements des cellules des noeuds lymphatiques.
Procédures
Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse pendant 30 minutes avec mise à jeun au moins 10h avant. Aministration répétée 14 jours aprés la première administration 2) Deux prélèvements au niveau des noeuds lymphatiques seront réalisés 6 jours avant administration et 20 jours après . Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute 3) Dix-sept prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigiles répartis sur 44 jours au total. Durée de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Le produit test fait partie de la classe thérapeutique anti inflammatoire/immunosuppresseur. L'effet indésirable susceptible d'être observé suite aux traitements est un vomissement qui a été observé en intraveineuse bolus dans un projet antérieur. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse avec mise à jeun au moins 10h avant. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables susceptibles, vomissement . 2) Prélèvements aux niveaux des noeuds lymphatiques . Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables irritation et inflammation post ponction au niveau du site de prélèvement. 3) Les prélèvement sanguins seront réalisés. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Les prélèvements seront réalisés par un personnel formé et conformément à la réglementation en vigueur. On ne s'attend pas à d'autre effet indésirable en particulier.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'un produit test chez le chien.
Réduction
Pour la phase 1; 6 animaux seront inclus pour la mise en place de la technique pour le prélèvement des noeuds lymphatiques. Necessité de déterminer le site de prelèvement (ganglion lymphatiques au niveau des membres ou au niveau des mandibules, technique par aspiration ou par un système de va et vient). Pour la phase 2; 14 animaux seront inclus pour le réalisation de l'étude. Ils seront réparti en 5 groupes: un groupe contrôle de deux animaux recevra l'élément de référence à deux occasions et 4 groupes de 3 animaux recevront l'élément d'essai. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables. Pas de test statistique réalisé aupréalable.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'administration jusqu'à 4h aprés. Cet hebergement en individuel est necessaire pour faciliter l'observation des animaux. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. De l'enrichissement ( exemple: balle, corde) sera présent autant que possible dans les boxes. Dans ce projet les points limites sont: - Des vomissements qui seraient trés fréquents et qui impacteraient le bien être de l'animal - Des douleurs, saignements, gonflements observés au niveau de la zone de prélèvement des noeuds lymphatiques - Des douleurs, irritation ou inflammation importantes au niveau de la zone des prélèvements sanguins. Si de nombreux vomissements sont observés, un traitement antivomitif pourra être appliqué. Cette décision sera prise par le vétérinaire désigné. Un maximum des 10 vomissements sur 24h sera toléré au delà de 10 vomissements cela sera consideré comme un critère d'arrêt. S'il y a une forte présence de sang dans les vomissements cela sera considéré comme un critère d'arrêt immédiat. Si un gonflement, un léger saignement ou une douleur est présente au niveau d'une zone de prélèvement de noeuds lymphatiques alors un autre site de prélèvement sera choisi et l'animal sera suivi pour suivre l'évolution de la zone douloureuse. Des antalgiques, anti inflammatoires pourront être utilisés si nécessaire. Décision prise par le vétérinaire désigné. Les sites de prélèvements sanguins ( au niveau des veines jugulaires) seront alternés autant que possible pour éviter toute douleur ou inflammation au niveau des sites de prélèvements.
Choix des espèces
Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.