Système immunitaire
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Prise alimentaire et inflammation chronique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
5 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, des incisions répétées de la queue et des prélèvements de sang, et sont soumises à des régimes gras ou à un jeûne intermittent, pour étudier le lien entre alimentation et inflammation chronique. Le porteur indique que ces régimes peuvent provoquer une prise de poids, un diabète ou, pour le jeûne, une perte de poids prolongée, avec mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Sur le remplacement, il décrit des travaux sur lignées cellulaires, mais affirme que la complexité d'un système "corps entier" rend le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
L'inflammation, processus naturel permettant d'éliminer des pathogènes tels que des bactéries ou des virus, peut dans certains cas s'installer à long terme. On parle alors d'inflammation chronique qui peut alors être causal pour de nombreuses affections tel que l'arthrite, le diabète ou encore le cancer. L'activation de l'immunité innée, responsables de la production de molècules inflammatoires, participe à l'installation et la persistance de l'inflammation chronique. La cause et les acteurs responsables de l’activation de ces voies inflammatoires sont souvent inconnus et les traitements ciblent la plupart du temps les symptômes et non les causes. Il existe donc un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients présentant des pathologies inflammatoires. Les interventions diététiques ont déjà montré qu'elles pouvaient moduler l’inflammation chronique. Cependant les effets sont difficiles à quantifier sur les populations humaines car l’administration de régimes spécifiques et l'indentification des voies modulées sont complexifiés, notamment, par le fait que les patients suivent mal ou abandonnent. Ainsi une meilleure compréhension des effets des interventions diététiques dans des environnements contrôlés sont nécessaires. Ce projet permettra d’identifier des nouvelles cibles qui donnera le jour à de nouveaux traitements pour des groupes de populations et de patients donnés.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies inflammatoires chroniques dans les sociétés occidentales est estimée à 5-7%, pesant considérablement sur les systèmes de santé. Il est connu de façon empirique que certaines interventions alimentaires permettent d'améliorer certains symptômes des maladies chroniques inflammatoires. Cependant le mécanisme d'action et les acteurs impliqués sont peu ou pas connus. Il apparait donc nécessaire d’identifier ces cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ainsi, une meilleure compréhension du lien mécanistique entre la nutrition et l’inflammation pathologique est nécessaire. Notre projet permettra d’identifier de nouvelles cibles interconnectées entre métabolisme et inflammation, mesurant ainsi l’impact des interventions diététiques sur l'activation des voies inflammatoires. A terme, ce projet ouvrira la voie à l’identification de composés pharmacologiques ou régimes alimentaires susceptibles de cibler l’interconnexion entre ces différentes voies et d’améliorer les symptômes des maladies chroniques inflammatoires.
Procédures
Gestes techniques de cette demande sont les suivants : - injection en intrapéritonéal sur animal vigile (15 secondes) - incision caudale sur animal vigile (10 secondes) - prélèvement sanguin sur animal vigile (1 minute). Chaque animal subira 3 injections en intrapéritonéal à au moins 15 jours d’intervalles, 3 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute), prélévements sanguins toutes les 4 à 6 semaines selon la procédure (soit 3 ou 4 prélévements au total).
Impact sur les animaux
L’administration de régimes specifiques ou le jeûne intermittent sont susceptibles d’avoir des effets indésirables ou bénéfiques sur les animaux, notamment en fonction du génotype considéré. L’administration d’un régime gras, ou à façon avec des lipides particuliers, sont particulièrement susceptibles de mener à une prise de poids ainsi qu’à une inflammation chronique délétère. Cette prise de poids pourrait engendrer une activité réduite chez les souris et/ou un développement d'un diabète. De même, le jeûne intermittant pourrait engendrer une perte de poids sur des durées prolongées. Aucun effet délétère des régimes à façon n’est attendu. Les tests métaboliques, ainsi que la prise de température rectale, sont aussi des circonstances où un stress transitoire pourrait être ressenti par les individus. Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine sauf pour le jeûne intermittent où les animaux seront pesés tous les jours. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre du remplacement, visant à réduire l’utilisation de modèles animaux dans les procédures expérimentales, nous avons déjà réalisé des expériences in vitro sur lignée cellulaire. Ceci a permis de mettre en évidence un lien entre les voies métaboliques et inflammatoires ciblées. Bien que ces modèles basés sur de la culture cellulaire et des approches de biochimie permettent d’étayer nos hypothèses, ils ne permettent pas de récapituler la complexité des mécanismes mis en œuvre dans un système intégré (corps entier) et prenant en compte la diversité des acteurs cellulaires présents au sein des tissus. Ainsi, pour mesurer l’impact tissulaire et systémique des voies étudiées et l’impact d’interventions diététiques, une approche sur modèle animal est indispensable.
Réduction
L’analyse des données par individu sera maximisée par la réalisation de tests métaboliques sur les mêmes groupes d’animaux. Les pesées, prises de température et autres analyses (prélèvement sanguins) peu invasives seront réalisées de façon longitudinale. Les prélèvements d’organes qui se feront post mortem, concerneront les organes métaboliques et les compartiments immunitaires majeurs.
Raffinement
Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine sauf pour le jeûne intermittent où les animaux seront pesés tous les jours. Une crème analgèsique sera utilisée afin de réduire la douleur lors des prélévements sanguins. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expériementales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. Des souris de 7 à 12 semaines seront utilisées en début de manipulations expérimentales afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr).
Impact de la dynamique mitochondriale sur une infection bactérienne à Escherichia coli
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou une injection intraveineuse de bactéries Escherichia coli, avec prélèvements de sang, avant mise à mort pour récupérer leurs cellules immunitaires, afin d'étudier le rôle d'un gène dans l'inflammation liée à l'infection. Le porteur indique attendre une inflammation systémique accompagnée de douleurs légères à modérées environ une semaine après l'injection. Sur le remplacement, il décrit des résultats obtenus in vitro sur cultures de cellules, mais juge la vérification in vivo chez la souris nécessaire.
Objectifs
Les maladies infectieuses représentent un enjeu majeur en santé publique. Nous choisissons d’étudier l’impact d’une infection à Escherichia coli (E.coli), une bactérie connue pour augmenter la sévérité de l’infection et engendrer des septicémies dans le cas où l’infection est mal traitée, traitée tardivement ou en cas de résistance aux antibiotiques. Sans traitement, la plupart des personnes qui souffrent de septicémie meurent. L’infection à E.Coli peut également induire d’autres conséquences moins graves tels que des infections urinaires ou des péritonites, constituant un état inflammatoire souvent non traité malgré l’utilisation d’antibiotique limitant le développement des bactéries mais pas les conséquences de l’infection. Il est donc nécessaire de mettre au point des traitements innovants pour lutter contre l’inflammation successives à l’infection. Pour cela, une meilleure connaissance du dialogue entre les bactéries et l’hôte qu’elles infectent est indispensable pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prévention et prise en charge. Nous avons récemment identifié un gène d’intérêt impliqué dans la dynamique jouer un rôle anti-inflammatoires dans des macrophages murins pour lesquels ce gène a été invalidé. Notre projet vise confirmer ces résultats dans un modèle de souris chez lesquelles la fonction de notre gène d’intérêt a été sélectivement supprimé dans les cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Nous voulons étudier l'impact de la déficience de notre gène d’intérêt sur la dynamique infectieuse des cellules immunitaires et son lien avec les conséquences inflammatoires de l’infection bactérienne à Escherichia coli sur les organes de la souris. Ce travail pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans l’inflammation induite par l’infection à Escherichia coli et ainsi d’identifier un nouvel acteur participant aux conséquences pathologiques de cette infection (i.e, septicémie, infections urinaires, diarrhées ou péritonites) afin d’en limiter les effets
Procédures
Par animal, sur 120 animaux : une contention (10 secondes) afin de réaliser une injection intrapéritonéale. Les animaux seront ensuite euthanasiés 48h post-injection afin de procéder au lavage péritonéal afin de récupérer les cellules immunitaires. Par animal, sur 120 animaux : une contention (30 secondes) par animal afin de réaliser une injection intraveineuse de bactéries. Par la suite, deux contentions (1 minute) afin de réaliser les prélèvements sanguins aux temps 6h et 24h.
Impact sur les animaux
Les nuisances expérimentales prévues sur les animaux sont celles liées : à leur manipulations/contentions qui peuvent générer du stress ou de l’anxiété ; aux douleurs légères causées par les injections intrapéritonéales ; aux douleurs légères causées par les injections intraveineuses et les prélèvement sanguins. Aucun effet adverse n'est attendu pendant le croisement des souris, puisque qu’aucun phénotype n'est dommageable. Des signes pathologiques accompagnées de douleurs légères à modérées sont généralement attendus beaucoup plus tard (i.e, après une semaine) correspondant à une inflammation systémique.
Devenir
L‘ensemble des animaux des deux procédures seront euthanasiés afin de pouvoir prélever les cellules immunitaires et certains organes pour quantification et analyses et pour la réalisation d‘expérimentations moléculaires et cellulaires in- vitro.
Remplacement
L’absence d’un gène d’intérêt impliqué dans la dynamique infectieuse des cellules immunitaires a récemment été identifié dans un modèle d’invertébrés suggérant un rôle anti-inflammatoires en réponse à une infection bactérienne. Des expériences réalisées in vitro ont confirmé le rôle anti-inflammatoire de ce gène d’intérêt lors de la stimulation de cultures de cellules immunitaires de souris qui démontrent une meilleure capacité d’élimination des bactéries. Ces expérience suggèrent que l’invalidation du gène d’intérêt identifié pourrait permettre de lutter contre les conséquences pathologiques d’une infection bactérienne. Il convient maintenant de vérifier ces données in vivo chez la souris dans un contexte d’infection bactérienne intégrant les interactions multi-organes.
Réduction
Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible grâce à l’expertise et aux précèdent résultats de l’équipe infectieux du centre. Pour obtenir une puissance statistique suffisante par un test ANOVA ou de Student bilatérale entre les groupes, nous avons déterminé que 15 souris par groupe et par sexe seraient nécessaires ; cette estimation a été calculée grâce à un logiciel de biostatistique.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites en particulier lors des deux procédures sur des temps courts (24h-72h). Cinq paramètres seront étudiés : perte de poids mesurée au moment de chaque injection et/ou prélèvements, apparence physique, comportement, comportement dû à l’injection et/ou au prélèvement et état des sites d’injection et de prélèvement lors de cette procédure. La perte de poids sera mesurée toutes les 48h par rapport au poids de la souris avant injection. Concernant les points limites, un niveau trop élevé de douleur, par rapport aux scores, conduira à l’euthanasie de l’animal. Dans le cas où des signes de mal-être ne nécessitant pas d'euthanasie s’accumulent, tels qu’une perte de poids >20% (par rapport au poids initial), des égratignures, une agitation et des irritations cutanées, une prise en charge de chaque point individuellement sera réalisé (telle que la désinfection avec de la vétédine) et les souris seront suivies régulièrement sur 24h pour déterminer si leur état est temporaire ou les prémices d’un score supérieur.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car : 1) c’est un modèle largement reconnu dans la communauté scientifique pour sa pertinence dans l’analyse des réponses inflammatoires aux infection bactériennes 2) Les techniques de modifications génétiques ciblées disponibles chez la souris permettent de mettre en évidence l'implication de certains gènes dans des mécanisme physiopathologiques au sein de population cellulaire spécifiques. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 8 à 20 semaines dont le système immunitaire est mature.
Rôle des acteurs du cycle cellulaire dans la communication entre cellules immunitaires et cellules bêta pancréatiques au cours du diabète de type 2 et du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Génétiquement modifiées, elles subissent des gavages de glucose et des prélèvements de sang tous les deux mois, des injections d'insuline, de clodronate ou de tamoxifène, pour étudier le rôle de régulateurs du cycle cellulaire dans le diabète de type 2 et le vieillissement. Le porteur indique que les animaux perdant du poids ou présentant un état anormal sont euthanasiés, et que ceux modifiés génétiquement ne sont jamais gardés vivants. La retombée annoncée, de nouvelles cibles contre le diabète, reste formulée comme un espoir, et il présente la validation chez l'animal comme une "obligation".
Objectifs
L'objectif de ce projet est décrypter les conséquences physiopathologiques de l'inflammation lors d'un stress métabolique sur la fonction des îlots pancréatiques et la contribution du déficit de certains régulateurs de la transcription dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du diabète.
Procédures
La totalité des souris sera soumise un test de tolérance au glucose par gavage oral.Ce test sera réalisé tous les 2 mois. La totalité des souris sera soumise à un prélèvement sanguin à la veine caudale lors des test de tolérance au glucose (test réalisé tous les 2 mois) afin de determiner l'insulinémie. La totalité des souris sera soumise une injection intra péritonéale d'insuline. Ce test sera réalisée tous les 6 mois. 3 injections de clodronate par voie intra-péritonéale seront réalisées n= 240 souris. Injection intra péritonéale de tamoxifène (1injection/jour pendant 5 jours) n= 120
Impact sur les animaux
Du stress pourrait être généré en lien avec la manipulation des animaux. Cependant pour reduire la douleur suite aux experimentations, nous laisserons un minimum de 2 semaines entre les tests de tolerance au glucose et à l'insuline pour que les animaux puissent récupérer. En cas de douleur, les animaux seront exclus des protocoles et placés en stabulation. En cas de douleur detectée par les membres de l'equipe ou de la cellule du bien-être animal (perte de poids rapide, etat general anormal), les animaux seront euthanasiés immediatement.
Devenir
Les animaux utilisés étant génétiquement modifiés, aucun des animaux utilisés en fin de protocoles ne sera maintenu en vie. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin d'exploiter les résultats obtenus dan ces modèles génétiquement modifiés.
Remplacement
Nous avons étudié le rôle des acteurs du cycle cellulaire et de leurs cofacteurs transcriptionnels in vitro en utilisant des lignées cellulaires et les tests fonctionnels adéquats. Cependant, et compte tenu des résultats obtenus in vitro, nous ne pouvons nous baser sur ces résultats pour définir ces protéines comme étant impliquées dans le diabète et l’obésité, maladies chroniques mettant en jeu plusieurs organes. Nous voulons par conséquent utiliser des modèles animaux dont les gènes d’intérêt auront été invalidés génétiquement, et soumettre ces modèles à des régimes particuliers afin de développer un diabète, et d’étudier le phénotype métabolique de ces modèles.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux, une étude de "power analysis" (utilisation du logitiel gpower pour definir le nombre d'animaux necessaires) est utilisée pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de générer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés (glycémie, poids, ...).
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidiennes et pesées hebdomadaires. Tous les animaux beneficient d'un hébergement, d'un environnement, d'une alimentation, d'un apport en eau et de soins appropries a leur sante et a leur bien-être (structure en charge du bien-être des animaux (sbea)). Un enrichissement de la cage d'hébergement sera effectué par l'ajout de frisettes de papier et/ou de nids végétaux. Les souris seront au maximum 6 par cage. Le personnel qui participe au projet est dote d’une qualification appropriée (article r.214-114 du code rural et de la pêche maritime). Ces qualifications sont vérifiées par le responsable du suivi de la compétence du personnel en relation avec les animaux de l’établissement, conformément a l’annexe i de l’arrêté relatif à l’agrément des établissements (livret de compétences). Nos lignées de souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Les souris sont habituées aux manipulations afin de réduire le stress. Lors du change, l’ancien nid des animaux est transfère dans la nouvelle cage pour réduire le stress. Entre chaque tests métaboliques (contraintes de stress), un temps de récupération d’une semaine minimum est observé et le maintien de l’enrichissement, de la socialisation est respecté. L’état général des animaux sera évalué par les utilisateurs ainsi le personnel animalier. Les points limites déterminés pour nos protocoles sont : le dos vouté, le poil hérissé, une perte de poids de 20% et la prostration ou l’absence de réaction des animaux. Dans ce cas l’animal sera enregistré au SBEA. Un traitement visant à soulager l’animal pourra être mis en place, le cas échant sans amélioration, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Nos objectifs sont de mieux comprendre la physiopathologie du diabète et de l'obésité. Pour cela, la validation chez l'animal est une obligation pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et physiopathologiques à l'origine de la maladie. Nous devons donc utiliser des souris génétiquement modifiées pour identifier certains gènes comme étant à l'origine de certaines maladies métaboliques.
Ischémie-reperfusion hépatique : mécanismes et approches thérapeutiques.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du modéré au sévère, 284 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées sans réveil. Une partie subit une ischémie du foie provoquée en ligaturant l'apport sanguin pendant soixante minutes après ouverture de l'abdomen, avant reperfusion puis mise à mort, d'autres une perfusion hépatique menée jusqu'au décès ou une péritonite provoquée. Le porteur ne mentionne comme atteinte qu'une douleur post-opératoire prise en charge, alors que 376 souris sont classées en gravité sévère. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro ce phénomène complexe et revendique le caractère "indispensable" du modèle murin pour les validations précliniques.
Objectifs
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appeler ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Sur le plan physiopathologique, les lésions hépatiques d’IR sont caractérisées par un important infiltrat à polynucléaires neutrophiles (PNN) dans les zones de nécrose hépatocytaire. Ces neutrophiles migrent dans le foie sous l’effet de facteurs chimioattractants afin d’exercer sur le site de l’agression leurs fonctions de phagocytose et de défense antibactérienne. Dans le cas de l’IR, les neutrophiles vont avoir un effet délétère en étant responsables des lésions hépatiques. Notre équipe a récemment montré que NOD1, un récepteur des composés bactériens, était un régulateur intrinsèque indispensable aux fonctions de migration et de phagocytose du PNN. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR.
Bénéfices attendus
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appelé ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Pour faire face à ce problème majeur de santé publique, il est indispensable de mieux le comprendre. Cela nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme et donc l’usage des modèles animaux. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR. Cette étude nécessite des approches in vivo et ex vivo chez la souris. Elle nécessitera également des souris invalidées pour le gène NOD1. Des tests de puissance ont permis de calculer au plus juste le nombre d’animaux indispensable. Les cellules isolées de souris seront utilisées dans plusieurs expérimentations ex vivo afin d’optimiser leur utilisation. Si de nouveaux outils in vitro apparaissent, ils seront utilisés en remplacement des animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : 1-une perfusion hépatique : après anesthésie profonde, le foie est perfusé jusqu’à ce qu’il blanchisse (quelques minutes), puis les veines sus hépatiques, caves et l'aorte sont sectionnées pour permettre l’évacuation des effluents (Cela induit alors la mort de l’animal). A la fin de la perfusion, le foie est prélevé afin d'isoler les hépatocytes. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection de modulateurs de NOD1 ou d’un excipient. 2-une péritonite stérile est induite chez les animaux afin d’isoler les neutrophiles péritonéaux qui seront ensuite utilisés dans des expériences ex vivo. Les animaux sont mis à mort 18h après l’induction de la péritonite stérile. 3-une ischémie-reperfusion du foie. Après anesthésie, la peau de l'abdomen et le péritoine des animaux seront incisés sur 1 cm, le foie externalisé, les lobes médians et latéral gauche seront ligaturés afin d’arrêter l’apport sanguin. Au bout de 60 minutes, la ligature sera retirée puis le foie reperfusé sera replacé dans l'abdomen. 8h ou 18h après levée de la ligature, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour réaliser un prélèvement sanguin, puis directement mises à mort afin de prélever le foie pour analyses ultérieures. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection d’un activateur de la voie NOD1 ou d’un excipient.
Impact sur les animaux
La chirurgie est par essence à l’origine de douleurs post-opératoires qui seront prise en charge par un protocole de traitement anti-douleur adapté.
Devenir
Dans les 3 procédures décrites, tous les animaux seront mis à mort, et leurs organes seront prélevés en vue d'effectuer des analyses histoloiques, de biologie cellulaire et moléculaire.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion est un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires à l’échelle du tissu. Il n’existe pas de méthode capable de reproduire in vitro ce processus physiologique. Par ailleurs, les molécules qui seront injectées aux souris auront été préalablement testées in silico et in vitro. Seules les molécules les plus efficaces seront testées chez les animaux.
Réduction
Les effectifs sont calculés à partir de données de la littérature et de données personnelles.
Raffinement
Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance animale (Raffiner). Lors de la chirurgie, les animaux recevront une anesthésie/analgésie avant le début de la chirurgie. Un anesthésique sera appliqué localement. Les animaux recevront, après la chirurgie, une injection d’antalgique toutes les 12h. Les animaux seront par ailleurs observés durant 15 à 30 min après la chirurgie, puis au bout de 2h jusqu’au réveil complet. Dans tous les cas, les animaux ne sont pas maintenus en vie plus de 24h après chirurgie. En cas de signes de douleurs : poil hérissé, absence de mouvement, baisse significative de l'activité motrice et/ou une perte de poids supérieure ou égale à 15% de la masse corporelle, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle d’ischémie hépatique chez les souris est très bien décrit dans la littérature et est indispensable aux validations pré cliniques de candidats médicaments. De plus, pour décortiquer les mécanismes à l’origine de ce phénomène nous aurons besoin de modèles génétiquement modifiés uniquement disponible chez la souris. Enfin, la souris est le plus petit mammifère dans l’échelle de l’évolution parmi les modèles animaux. Les animaux utilisés auront entre 7 et 14 semaines car c’est l’âge optimal pour un développement reproductible des phénomènes d’ischémie-reperfusion.
Impact des acides biliaires sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, le métabolisme, l’immunité anti-tumorale et la réponse aux immunothérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de la tumeur, du foie, de l'intestin, des ganglions et de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les procédures, elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries et quatre d'acides biliaires, une injection d'un traceur dans un ganglion et une prise de sang finale. L'équipe veut savoir si des acides biliaires déjà présents dans la pharmacopée humaine pourraient restaurer l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez les patients traités par antibiotiques, un bénéfice que le porteur formule au conditionnel. Il dit avoir défini un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe", sans en donner la valeur ni le nombre de groupes qui mène à 8 256 souris.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur.
Bénéfices attendus
Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min).
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.
Rôle du microbiote intestinal sur le phénotype mastocytaire des souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans le développement de certaines cellules immunitaires. Elles reçoivent des gavages quotidiens d'antibiotiques et de laxatif pendant une semaine pour supprimer leur microbiote, puis une partie subit des gavages de bactéries, avant mise à mort pour prélever les intestins. Le porteur qualifie le gavage répété de source de stress et l'antibiothérapie de sans effet comportemental majeur. Il présente les souris comme des modèles "incontournables" faute de modèle cellulaire satisfaisant.
Objectifs
Au sein du laboratoire, des données préliminaires d'analyses génétiques décèlent deux populations de mastocytes au sein de l'organisme : les mastocytes muqueux et les mastocytes connectifs. Les mastocytes connectifs se développent en période prénatale (dans le fœtus), indépendamment du microbiote tandis que les mastocytes muqueux n'apparaissent que plus tardivement (après la naissance) et colonisent des endroits particulièrement riches en microbiote ; à savoir le tractus digestif et les poumons. De plus, notre étude sur des souris Germ-Free (nées exemptes de microbiote) montre une baisse du nombre de mastocytes muqueux par rapport à des souris contrôles avec microbiote. Nous émettons donc l'hypothèse que le microbiote joue un rôle dans le développement et le maintien de cette population de mastocytes muqueux au sein de l'organisme. Les objectifs de ce projet sont donc de 1) déterminer si la perte du microbiote intestinal, à l'âge adulte, altère le nombre/phénotype/localisation des mastocytes muqueux, 2) savoir s'il existe une fenêtre temporelle critique en post-natal durant laquelle le microbiote jouerait un rôle crucial dans le développement des mastocytes muqueux et leur survie au sein de l'intestin et à terme 3) définir les voies de signalisation entre le microbiote et les mastocytes, si elles existent, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mettre en évidence, s'il existe, un rôle du microbiote dans le développement des mastocytes, plus précisément les mastocytes muqueux et/ou un rôle de celui-ci dans le maintien de cette population au sein de leur niche intestinale. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de mettre en lumière une potentielle fenêtre temporelle durant laquelle le microbiote exerce son rôle. Pour finir, si une interaction microbiote - mastocyte existe, ce projet permettra aussi de décrire les voies de signalisation sous-jacentes.
Procédures
Les animaux seront soumis uniquement à des gavages d'antibiotiques et de polyéthylène glycol à hauteur de 7 fois par semaine (5 jours d'antibiotiques + 1 jour de polyéthylène glycol deux fois) pendant une semaine seulement dans le but de dépléter leur microbiote intestinal. Par la suite, 1500 d'entre eux seront soumis à un deuxième protocole de gavage par des souches bactériennes, 3 fois par semaine pendant une semaine. Chaque gavage représente une manipulation brève, d'environ 10 secondes afin de limiter le stress de l'animal. Entre les deux procédures, les souris ne subiront aucune autre intervention pour une durée de deux semaines.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de nos expériences, les manipulations ainsi que le gavage a répétition peuvent entrainer un stress chez les animaux. L'antibiothérapie en elle-même n'induit en revanche aucun changement comportemental majeur connu à ce jour dans la littérature.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes, majoritairement les intestins et évaluer leur phénotype mastocytaire par FACS et imagerie confocale.
Remplacement
Ce projet vise à étudier le rôle du microbiote dans le maintien des différentes populations de mastocytes présentes au niveau intestinal. Il n’existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de ce phénomène. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact du microbiote sur les phénotype mastocytaire, in vivo.
Réduction
L’expérience du porteur du projet sur les mastocytes et des collaborateurs sur le microbiote nous permet d’anticiper et optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous effectuerons l’analyse sur un nombre total de 1560 souris sur une période de 3 ans avec 10 souris par groupe et par condition. Les expériences qui seront réalisées ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombres déterminés sur la base de la littérature et de l’expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, pour des tests statistiques de type Mann Whitney ou test-t non appariés pour la comparaison de deux moyennes, ou de type ANOVA à deux facteurs avec post test de type Bonferoni pour l’analyse de données à deux variables.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons divers paramètres de manière quotidienne (1 fois par jour) : poids, température et signes extérieurs de stress afin de s'assurer du bien-être des animaux. La surveillance des fèces sera notamment mise en place lors de l'administration du polyéthylène glycol pendant les 48 heures suivant l'administration.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains. L’organisation du microbiote intestinal de la souris, qui nous intéresse dans le cadre de ce projet, est similaire à celle chez l’Homme avec une forte concentration au niveau des parties intestinales basses. Tout comme chez l’Homme, l’antibiothérapie a été largement démontrée comme impactant la flore intestinale de ces animaux et est largement utilisée par la communauté scientifique comme outil de déplétion du microbiote. La moitié des animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les souris restantes seront, elles, utilisées entre 2 et 8 semaines post-naissance afin d'évaluer la fenêtre temporelle durant laquelle le microbiote jouerait un rôle dans le développement des mastocytes muqueux.
Étude de l’impact du biallélisme Tlr7 sur l’immunité humorale protectrice lors de la vaccination contre la grippe H1N1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.
Objectifs
La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.
Bénéfices attendus
Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.
Procédures
prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure
Impact sur les animaux
Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure
Remplacement
Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)
Réduction
Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).
Raffinement
Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).
Choix des espèces
Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance
Etude de l’environnement inflammatoire cérébral post-radiothérapie : suivi par microdialyse sur rat porteur de glioblastome (EU porteur; EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine est implantée dans leur cerveau, puis une sonde de microdialyse qui ressort du crâne et y reste jusqu'à la mise à mort, des prélèvements de liquide cérébral étant réalisés sur l'animal conscient et maintenu en contention entre le 11e et le 17e jour. Ils subissent aussi radiothérapie et imagerie sous anesthésie, la mise à mort survenant dès un point limite ou au plus tard à 90 jours. Le porteur présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible".
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.
Procédures
Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.
Raffinement
Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Etude des mécanismes d’infections à Escherichia coli productrices de shigatoxines chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le pouvoir pathogène de bactéries E. coli productrices de shigatoxines. Après un jeûne hydrique, elles reçoivent une à deux inoculations orales de bactéries puis subissent prélèvements de fèces, prises de sang et injections, le groupe infecté par des bactéries pathogènes développant faiblesse, diarrhée et déshydratation. Le porteur décrit des points limites et une mise à mort pour prélever les organes, et indique que le projet est financé par l'Argentine, où le syndrome hémolytique et urémique est le plus fréquent. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est "suffisamment sophistiquée" pour simuler un organisme à plusieurs organes.
Objectifs
Certaines bactéries, appelées STEC, produisent des toxines particulières, qui leur confèrent la capacité à provoquer des infections chez l’homme. Les symptômes liés à ces infections vont de la diarrhée bénigne à des symptômes très graves : hémorragie intestinale, syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3-5% et plus d’un tiers des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La toxine produite par les STEC est une protéine formée non par la bactérie mais par un virus qui infecte cette bactérie (phage). Expérimentalement, chez la souris, une STEC infectée par le phage est pathogène. A l’inverse, les STEC chez lesquelles le phage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Lorsque les bactéries infectées par le phage se trouvent dans un organisme de mammifère et qu’un stress est induit, les phages sont libérés par la bactérie, peuvent atteindre les organes-cibles (ex : le rein), et produire la toxine qui induit des dommages. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans les infections causées par les bactéries STEC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans la production de la toxine dans l’organisme. L’utilisation de souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) permettra de s’affranchir des interférences avec les bactéries de ce microbiote à deux niveaux : en évitant la transmission possible du phage à des bactéries du microbiote intestinal ; en évitant un « effet barrière » du microbiote intestinal à l’égard des STEC, qui affaiblirait leur pouvoir pathogène. Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certains symptômes. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5%) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique, en particulier lors d’infection par des denrées alimentaires contaminées. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant, ce qui explique que le présent projet soit financé par ce pays.
Procédures
En début de procédure, les souris sont soumises à un jeûne hydrique de 4 heures, suivi d’une inoculation par voie orale. Les souris ont au maximum 2 inoculations orales à 30 min ou 24 heures d’intervalle. Puis des prélèvements de fèces sont effectués quotidiennement pendant 7 jours. Les animaux auront un prélèvement de sang qui dure 30 secondes environ. Les animaux recevront deux injections qui dureront moins de 30 secondes. Des organes et du sang seront prélevés après analgésie et anesthésie profonde (sans réveil).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues chez les groupes recevant les bactéries sans phage sont réduites. L’inoculation par voie orale sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les injections seront également réalisées par du personnel très expérimenté. Les nuisances attendues dans le groupe recevant les bactéries avec phage, donc pathogènes, sont : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures seront mises en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition de symptômes. Des points limites ont été identifiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Ceci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus sur lesquels seront pratiquées différentes analyses.
Remplacement
L’analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.
Réduction
L’expérience argentine dans le domaine étudié permet de considérer que 10 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe dans tous les groupes. Dans les groupes inoculés avec la bactérie pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si l’euthanasie est trop précoce, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 30 souris supplémentaires, qui seront utilisées si nécessaires. Au total, nous prévoyons d’utiliser 110+30=140 souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus par cages, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, buchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher et hamac dans lequel se percher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement bénéficié les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue. De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté aux souris si elles montrent des signes de déshydratation. Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite de possibles symptômes et décider d’une euthanasie anticipée si les points limites sont atteints. Les bactéries seront administrées par voie orale à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Toutes les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Préalablement à l’euthanasie des souris, de puissants antalgiques et analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris de 3 semaines (semaine suivant le sevrage). Chez l’être humain, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants. Nous utilisons en part égale des souris mâles et femelles car la maladie touche indifféremment les deux sexes.
Etude de l’impact de l’exposition séquentielle à différents pathogènes sur les capacités fonctionnelles du système immunitaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à quatre immunisations par injection sous anesthésie et autant de prélèvements de sang, pour recréer des expositions successives à des pathogènes et étudier la maturation du système immunitaire. Le porteur annonce peu de douleur, avec une perte de poids transitoire et parfois du sang dans les fèces, puis une mise à mort pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce qui se passe dans un "organisme entier" et conclut au caractère "obligatoire" du recours à la souris.
Objectifs
Au cours de sa vie, l’Homme est infecté par une quantité d'agents pathogènes (bactéries, virus, etc…). Cette exposition aux microbes de l’environnement, façonne notre système immunitaire au cours du temps et modifie probablement ces propriétés. Cependant, de façon surprenante, la majorité des études sur le système immunitaire sont basés sur des souris élevées dans des conditions d’hygiène très strictes et très contrôlées. Ces animaux exemptes de pathogènes sont actuellement la référence pour les études scientifiques et pour les tests précliniques. Récemment, plusieurs travaux suggèrent que l'élevage de souris dans un environnement sans agents pathogènes a des effets importants sur l’état de maturation du système immunitaire. En effet, il a été montré que le système immunitaire des souris de laboratoire est proche de celui d’un nouveau-né, alors que le système immunitaire de souris vivants dans la nature est lui, proche et représentatif d’un humain adulte. Dans ce contexte, les différences observées entre souris de laboratoire et souris issues de milieu sauvage, font des souris de laboratoire un modèle inadapté pour les études précliniques et soulignent la nécessité de nouveaux modèles murins qui intègrent des variables environnementales. Ainsi, ce projet vise à tout d’abord à comprendre l’impact, sur le système immunitaire, d’une exposition successive à différents pathogènes qui mimerait ce que l’Homme subit au cours de sa vie. Puis, dans un second temps, ce projet permettra également mieux comprendre les maladies liées à un dérèglement du système immunitaire comme les maladies auto-immunes et le lupus en particulier.
Bénéfices attendus
Cette étude originale permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires anti-infectieuses et d’améliorer les modèles murins actuels de maladie humaine. En effet, ce projet permettra de développer un modèle murin reflétant plus justement le système immunitaire humain adulte et qui intègre des variables environnementales. De plus, les résultats obtenus permettront de mieux caractériser les dysfonctionnements du système immunitaire liés aux pathologies auto-immunes comme le lupus.
Procédures
Les animaux seront soumis à des immunisations (injections, 10 secondes) 1seule fois/animal, ou 4 fois/animal et seront réalisées sur animaux anesthésiés . Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux anesthésiés (10 secondes - 1 seule fois/animal , ou 4 fois/animal avec un mimimum de 14 jours d'intervalle entre les 2 prélevements).
Impact sur les animaux
Peu de douleur est attendue au cours des procédures réalisées. Peu de douleur également attendue au cours des prélèvements de sang. Cependant, une legere perte de poids transitoire peut etre observé après immunisation. De facon rare, des féces molles ou du sang dans les feces peuvent également être observé au cours de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélèver les organes et d'étudier plusieurs paramètres immunologiques.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre comment une exposition antérieur à des pathogenes peut génerer des cellules spécifiques protectrices qui vont infiltrer les tissus et y résider de facon permanente. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour comprendre ce mécanisme.
Réduction
Un nombre minimum de souris nécessaire à une analyse statistique sera utilisé en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Ainsi, 5 animaux par groupe seront néccessaire. Un test statistique sera réalisé permettant la comparaison de 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Des enrichissements de l’environnement (composants de nidification et igloo) seront apportées. Précautions particulières : - Immunisation par les différents pathogenes : Les immunisations sont réalisées sous brève anesthésie. Aucun signe clinique, n’est attendu suite à l’immunisation. Néanmoins, afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé, les animaux seront pesés quotidiennement les 7 jours suivant l'immunisation et feront l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques. En effet, bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Les souris seront âgées de 6-10 semaines au démarrage de l’expérience car le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Etude des mécanismes de l’inflammation dans le poumon de souris atteintes de vascularite
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
1 497 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier l'inflammation pulmonaire des vascularites auto-immunes. Elles subissent des prises de sang dans le sinus rétro-orbitaire, une instillation intranasale d'un composé pro-inflammatoire et une injection rétro-orbitaire d'anticorps, une partie recevant en plus une chirurgie thoracique de 30 minutes à une heure. Le porteur indique que cette chirurgie engendre des 'douleurs importantes' respiratoires et que les dommages pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et inactivité. Les organes sont prélevés après mise à mort.
Objectifs
Les vascularites regroupent un ensemble de maladies auto-immunes qui affectent les vaisseaux sanguins. Il existe un sous-type de vascularite lié à la présence d’auto-anticorps dirigés contres des protéines spécifiques exprimées par les globules blancs. Ces vascularites engendrent des conséquences néfastes au niveau pulmonaire notamment avec une inflammation des vaisseaux menant à de graves atteintes respiratoires. Il n’existe à ce jour aucune donnée sur la physiopathologie des atteintes pulmonaires associées aux vascularites. Il existe un modèle de souris transgénique qui exprime une protéine spécifique d'origine humaine qui permettrait de reproduire la pathologie humaine. Certaines modifications des protéines pourraient participer au developpement de la maladie ainsi que les protéines impliqués dans la production de médiateurs de l'inflammation, qui pourraient également participer aux mécanismes physiopathologiques de la maladie. Ce projet permettrait d’établir un modèle reproduisant la pathologie des vascularites autoimmunes chez la souris et ainsi mieux comprendre quels sont les mécanismes intervenant dans le développement des atteintes respiratoires de la maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet in vivo permettront de comprendre plus précisément le rôle de certains globules blancs dans la réaction inflammatoire des vascularites et d’identifier de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet permettra d’établir comment les cellules sanguines participent aux dommages vasculaires dans les poumons des souris et de developper de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins au début avant induction de la maladie et au jour de la mise à mort des animaux. Ces prélèvements s'effectueront dans le sinus retro-orbital sous anesthésie gazeuse. Chaque prélèvement se fera en moins de 30secondes. Ils recevront une instillation intranasale de composant pro-inflammatoire sous anesthésie gazeuse, l'instillation est une manipulation qui ne prend pas plus d'une minute à réaliser, ainsi qu'une injection rétro-orbital d'anticorps sous anesthésie qui ne prendra pas plus de 30secondes. Certains animaux recevront une chirurgie thoracique qui durera environs 30min-1h sous anesthésie gazeuse et analgésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sur ce projet sont des douleurs respiratoires liées aux dommages pouvant avoir lieu dans les poumons. Cela pourrait entrainer une perte de poids et une inactivité des animaux impactés. De plus les injections en intraveineuse et prélèvements sanguins effectués sous anesthésie pourraient être source de stress pour l’animal. La chirurgie thoracique engendrera également des douleurs importantes respiratoire sur l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer en post-mortem les organes pour des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques ultérieures.
Remplacement
La multiplicité des types cellulaires impliqués dans la réaction inflammatoire nécessite des études sur des animaux vivants qui sont complémentaires des études in vitro portant sur des cellules inflammatoires isolées, des cultures de lignées cellulaires et des cellules humaines isolées du sang de donneurs sains ou de patients. De plus cette étude permet d’intégrer les intéractions des cellules sanguines au sein d’un organe, le poumon au cours du temps. Cela n’est actuellement pas possible même avec l’apport de systeme de culture mimant les fonctions de certains organes. Les renseignements apportés par ces études animales permettant de les valider à l’échelle d’un organisme entier ne peuvent être obtenus par des techniques alternatives qui ne portent que sur un type cellulaire.
Réduction
Une analyse de puissance statistique préalable a été menée afin de determiner le nombre optimal d'animaux requis pour cette étude. La création de deux nouvelles lignées de souris necessitera l'utilisation de 112 souris pour vérifier que celles-ci se developpent correctement et ne présente pas de caractéristiques qui pourraient leur être dommageables. L’usage d’un total de 1260 souris permettra d’avoir des groupes de 10 souris par génotype et par conditions (basal, instillés avec du LPS, injecté ou non avec anticorps de patients ou anticorps controle) pour le modèle de vascularites. Cela nous permettra de pallier à la mortalité eventuelle et d’obtenir des résultats statisitiquement significatifs. L’étude d’imagerie intravital se limitera à des groupes de 6 souris par groupe pour un total de 125 souris utlisées.
Raffinement
Les mesures prises en compte pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux dans le cadre de ces procédures seront notamment l’utilisation d’une anesthésie pour chaque intervention necessitant une injection et/ou un prélèvement afin de minimiser le stress de l’animal. Une échelle de points limites a été mise en place. Un traitement avec un analgésique pourra être administré pour soulager une souffrance identifiée. De plus le modèle de vascularite se limitera à 7jours suivi d’une mise à mort afin de limiter toute souffrance de l’animal. Un traitement préanalgésique sera également administré aux souris soumises à la chirurgie thoracique. La chirurgie thoracique se fera également sous anesthésie et analgésique et les animaux seront mis à mort à la suite de l'acquisition au microscope pour éviter et limiter toute souffrance de l'animal. Les souris seront placées avec leur congénères dans la même cage, afin de respecter les interactions sociales propres à l'espèce, avec nourriture et eau ad libitum en présence de matériel de nidification.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle car elle est aujourd’hui la seule espèce possédant les mutations capables de reproduire la pathologie humaine. Le stade de développement sera adulte car le developpement de la pathologie necessite un système immunitaire et pulmonaire adulte. Des souris agées (>18mois) seront également etudiées afin d’évaluer l’effet du vieillissement sur le developpement de la pathologie.
Evaluation de l’efficacité et de l’impact sur la réponse immunitaire de l’association de radiothérapie avec des immunothérapies, des nanoparticules radiosensibilisantes et/ou de chimiothérapies sur plusieurs modèles de tumeurs syngéniques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour optimiser des combinaisons de radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et immunothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et des prises de sang sous anesthésie, les tumeurs pouvant former des nécroses et ulcérations douloureuses. Le porteur indique qu'environ 75 % des souris seront tuées après un point limite ou une progression tumorale dès la première procédure, le reste à l'issue de la seconde. Le modèle de souris immunocompétente est présenté comme 'indispensable' pour reproduire un 'organisme entier'.
Objectifs
Nous proposons d’optimiser les combinaisons à base de Radiothérapie avec des Nanoparticules et/ou des immunothérapies et/ou des chimiothérapies. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par suivi du volume des tumeurs traitées et par étude de la réponse immunitaire à partir d’échantillons sanguins. L’objectif de ces expérimentations est de constituer des bases solides nécessaires aux développements d’essais cliniques en évaluant l’efficacité des combinaisons présentant les meilleurs efficacités en préclinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont cliniques avec l’optimisation et la sélection des meilleurs schémas de combinaison à base de radiothérapie, nanoparticules et ou immunothérapies pour traiter des cancers localisés ou métastatiques.
Procédures
- Injection sous cutanée de cellules tumorales - Prélèvement sanguin sous maxillaire - Ces deux types d’interventions seront réalisés sous AG gazeuse (Isoflurane 2.5%)
Impact sur les animaux
Les tumeurs formées par certains types de cellules peuvent former fréquemment des nécroses/ulcération en surface qui peuvent entrainer une douleur évaluable par palpation de la tumeur Aucun effet secondaire ou nuisance dû aux prélèvements sanguins en sous maxillaire n’est attendu. Ce geste est couramment réalisé par les membres de notre équipe.
Devenir
A l’issue de la procédure N°1 : environ 75% des animaux auront été mis à mort après atteinte d’un point limite ou parce que leur tumeur est en progression. Les 25 autres pourcents des animaux seront pris en charge dans la procédure N°2 A l’issue de la procédure N°2 : tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet de la radiothérapie sur l’activation de cellules immunitaires, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux présentant un système immunitaire actif. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur des cellules en culture nous a permis de nous affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
La formation de tumeur par les types de souris qui seront utilisés dans ce projet, se fait de façon homogène, permettant l’utilisation d’un nombre d’animaux relativement réduit pour répondre aux questions scientifiques posées. Afin de pouvoir traiter dans un même groupe des tumeurs de tailles comparables, il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules de cancer de souris permet de pouvoir travailler avec des souris au système immunitaire actif sans entrainer de rejet des tumeurs. Ainsi, nous pouvons étudier les effets de nos traitements à la fois sur la croissance des tumeurs mais aussi sur les cellules immunitaires. Afin de garantir la fiabilité de nos résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations 3 fois.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe dans des cages de taille adaptées et en présence d’enrichissement (matériel leur permettant de constituer un « nid »). Les combinaisons des traitements par radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et/ou immunothérapie ont déjà été réalisées dans ces conditions dans notre équipe sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle de souris est indispensable car les expérimentations sur cellules en culture ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme entier, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeur par les souris qui seront utilisées dans ce projet est homogène et maitrisé par notre équipe. Ceci permet de limiter la quantité de souris injectées par des cellules tumorales pour constituer des groupes de traitement avec un volume de tumeur comparable. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.