Système immunitaire

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, des prélèvements sanguins répétés, et selon les groupes une pompe implantée chirurgicalement sous la peau ou des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur indique vouloir moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur, afin d'améliorer les traitements de thérapie génique. Il affirme que le rat Sprague-Dawley est le seul petit modèle reproduisant cette réponse et que le modèle animal reste "incontournable".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAV) constituent des outils de choix. Une seule injection de ces vecteurs permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire semble être dépendante de nombreux facteurs (voie d'administration, dose injectée, tissu cible, transgène thérapeutique...) et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Nous avons récemment développé un modèle animal dans lequel nous observons une réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Ce modèle semble reproduire la réponse immune observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de rats, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser une molécule (l’interleukine 34 (IL-34)) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes T) régulatrices impliquées naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. La seconde stratégie repose sur le constat que les cellules effectrices humaines expriment fortement un marqueur de surface (le CD45RC) à l’inverse des cellules aux propriétés régulatrices Un anticorps ciblant ce marqueur spécifique sera utilisé pour moduler l’action des cellules immunitaires effectrices. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les rats recevront une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral en Intraveineuse. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit 7 pour les suivis 1 mois et 10 pour les suivis 3 mois. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation, des pompes seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des rats permettant de diffuser un immunomodulateur sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge s’effectuera tous les 15 jours à travers la peau et s’effectue en moins de deux minutes sous anesthésie. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation, les anticorps seront injectés en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés, le temps de réaliser l’injection soit environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère douleur au point du prélèvement sanguins et au point d’injection de l’intraveineuse et de l’intrapéritonéales dû à la pénétration de l’aiguille. La répétition des injections intrapéritonéales peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux ressentiront une douleur modérée dû à l’incision de la peau pour la mise en place de la pompe rechargeable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapie géniques développés à l’aide d’AAV consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat Sprague-Dawley, car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti-AAV similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’Homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des animaux injectés développent une réponse immunitaire. De manière à avoir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 10 .

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.). En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Selon le score enregistré et l’arbre décisionnel, certaines actions seront mises en place comme l’utilisation d’analgésique, une surveillance accrue, ou une euthanasie.

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation du rat est justifiée à la fois par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. De plus, des études fonctionnelles réalisées in vivo dans un contexte de transplantation d’organes chez le rat mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’anti-CD45RC et de l’IL34. Le but de cette étude est d’apporter une preuve de concept de l’effet de ces molécules sur la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur dans un contexte de transfert de gène. Les rats seront injectés entre 6 et 10 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation menée pour des laboratoires partenaires utilise des souris porteuses d'une mutation reproduisant une maladie liée aux immunoglobulines G4, avec injections de composés et prélèvements de sang et d'urine sur des animaux dès l'âge de deux semaines maintenus avec leur mère. Le porteur indique n'administrer aucun analgésique, au motif qu'il fausserait la réponse immunitaire observée. Il affirme que le modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier" et qu'aucune méthode alternative ne le permet.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies associées aux immunoglobulines G4 (IgG4-RD). Ces maladies sont des troubles fibro-inflammatoires chroniques graves à médiation immune qui se traduisent souvent par des niveaux élevés de protéines dans le sang (IgG4), dans les urines et par le développement de masses semblables à des tumeurs touchant plusieurs organes chez l’homme. Ses différentes manifestations cliniques rendent son diagnostic difficile. Les traitements conventionnels visent à atténuer l'inflammation par l'utilisation anti-inflammatoires mais le taux de rechute (40%) et les conséquences de leur prise sur le long terme sont importants. Le présent projet propose d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les IgG4-RD afin d’augmenter les chances de rémission. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin très bien caractérisé nommé LATY136F qui développe spontanément un syndrome lymphoprolifératif ayant des caractéristiques immunopathologiques semblables aux IgG4-RD chez l’homme. Ce modèle nous permet d’envisager l’étude de composés à visée thérapeutique afin d’évaluer leur efficacité sur la mise en place et l’évolution des IgG4-RD. Pour cela, nous évaluerons les différentes populations cellulaires du système immunitaire de ces souris après injection de composés thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité des composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques graves associées aux IgG4. La prévalence exacte de ces maladies n’est pas connue en partie à cause de son diagnostic difficile à établir et à les dissocier des maladies chroniques connues. Actuellement, les traitements reposent sur l’utilisation d’agents anti-inflammatoires et 40% des patients sont en rechutes. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques est nécessaire afin d’augmenter les chances de rémission des patients. Ce projet permettra d’évaluer à la fois l’effet des composés thérapeutiques sur l’initiation et le développement des IgG4-RD.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection intra-péritonéale (i.p) ou sous-cutanée (s.c) de composés thérapeutiques visant à diminuer ou empêcher le développement spontané du syndrome lymphoprolifératif chez les souris LatY136F, modèle qui reflète les maladies associées aux IgG4 chez l’homme. Chaque individu sera manipulé pour : - les collectes de sang et d’urine à J0 et en fin d'expérimentation (=10 semaines) pour déterminer l'évolution des protéines dans le sang et les urines et d'en conclure sur l’efficacité du traitement. Cette intervention est rapide et dure environ 2 minutes par souris pour la récolte du sang et de l'urine. - les pesées hebdomadaire (30 secondes par souris) - les injections des composés thérapeutiques par voie i.p ou s.c en fonction du type de molécule et de la demande des partenaires. La durée d’injection par voie i.p est de 30 secondes par souris. La durée d’injection par voie s.c est de 3 min et 30 secondes temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection. -les anesthésies générales gazeuses à l’isoflurane dans le cas d’injection des composés thérapeutiques en s.c d'une durée de 3 minutes. L’expérimentation se terminera lorsque les souris auront 12 semaines. Le jour de l’arrêt expérimental, les souris seront mises à mort pour le prélèvement des organes lymphoïdes et non lymphoïdes en vue de l’immunophénotypage et des études histologiques.

Impact sur les animaux

Les tests d’efficacité de composés thérapeutiques sur les maladies liées aux-IgG4 n’entraineront pas d’effet indésirable chez les animaux dans la mesure où les doses injectées sont préalablement testées pour leur toxicité chez nos laboratoires partenaires. Toutefois, lors de l’expérimentation les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques pouvant engendrer du stress notamment lors des contentions, des collectes de sang et d’urine, des pesées hebdomadaires et des injections de composés thérapeutiques pendant 10 semaines. Les injections n’entraineront pas de douleur. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel expérimenté et expert afin de limiter les contraintes subies par l’animal. Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des organes dans le but d’analyser la réponse immunitaire suite aux traitements

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules, doses ou durées de traitement sont à tester. Dans la mesure du possible, les expériences sont multiplexées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Ce protocole demande également l’utilisation d’animaux jeunes de 2 semaines nés au sein de notre animalerie. Les animaux seront maintenus avec leur mère pour la première injection et sevrés ensuite vers 21 jours. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. Toutefois, nous veillerons au bien être animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des animaux à des âges différents dans la mesure où le développement de la pathologie observé est progressif. Afin de vérifier l’effet des composés thérapeutiques, nous traiterons des souris âgées de 2 semaines avant l’apparition des premiers symptômes pour vérifier si le traitement empêche ou retarde la maladie ; puis sur des souris âgées de plus de 3 semaines lorsque la pathologie est mise en place pour vérifier l’effet du traitement sur les symptômes.

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales à la patte, jusqu'à treize séances d'imagerie sous anesthésie et des injections répétées de molécules, pour tester des candidats médicaments contre l'ostéosarcome de l'enfant. Le porteur affirme que le développement tumoral ne génère pas de douleur apparente, tout en prévoyant une surveillance trois fois par semaine et des points limites précoces. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées à un futur transfert vers la clinique, l'objectif immédiat étant de valider l'effet antitumoral chez la souris.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os long (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant les cellules immunitaires ont été identifiées, dont leur rôle va être de rétablir le système immunitaire afin de combattre la tumeur. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte gauche avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) 13x max (entre 5 et 13 selon la procédure) pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 2 jours/7 pendant 5 semaines maximum ou 3jours/7 injection des molécules pendant 3 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (2x/semaine) pendant 90 jours maximum (de 35 à 90 jours selon les procédures)

Impact sur les animaux

La toxicité des molécules a été évaluée précédemment et n’a pas montré de toxicité aux doses que nous allons utiliser. La greffe de cellules tumorales ne génère pas de douleur, de plus quand cela est compatible l'animal est anesthésié et reçoit un antalgique. Le développement tumoral ne génère pas de signes de douleur apparente, ni de problème de locomotion. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Toutefois les animaux sont surveillés 3x/semaine pour prévenir et détecter tout mal être animal. Lors du traitement pharmacologique, un cadran sera défini et les zones d'injection seront alternées (gauche-droite-haut-bas) pour le bien-être animal. Ce protocole d'administration a déjà été mis en œuvre et il n'a pas été observé de souffrance particulière. Le développement de métastases pourrait entrainer une difficulté respiratoire, des douleurs abdominales à la palpation (foie), un envahissement de plusieurs organes altérant leur fonction qui seront détectés par imagerie (1x/semaine).

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de cellules de sang humain frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. De plus, pour chaque modèle tumoral orthotopique, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie par bioluminescence. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie et de décider de la mise à mort des souris avant même l’apparition de symptôme critique. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Nous avons généré une lignée cellulaire qui émet de la lumière afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation des souris a un âge un peu plus précoce, nous permettra d’avoir une meilleure reproduction du système immunitaire et des hormones retrouvés chez les patients pédiatriques. Nous avons déjà démontré qu’à des âges plus précoce la prise de greffe reste fiable et donne de résultats clairs afin d’analyser l’efficacité de nouveaux traitements. De plus l’utilisation de souris nous permettra de réellement étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement tumoral. Nous avons également l’avantage de posséder des souris génétiquement modifiées rendant possible l’utilisation d’un anticorps humain permettant alors un rapprochement entre le pré-clinique et clinique plus robuste.

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules de lymphome ou de cancer du côlon, laissées croître jusqu'à un volume de deux mille millimètres cubes, avec des prélèvements sanguins par la queue, pour identifier le mécanisme d'un vaccin antitumoral déjà commercialisé en médecine vétérinaire. Le porteur écrit qu'un anti-inflammatoire "introduirait des biais" en défaveur de l'étude et ne sera donc pas administré, et annonce une efficacité qui "devrait" reproduire celle observée chez le chien. Sur le remplacement, il indique avoir mené des travaux in vitro et ex vivo mais juge la vérification in vivo "primordiale".

Objectifs

Le lymphome B diffus à grandes cellules est le lymphome le plus fréquent. La prise en charge thérapeutique est basée sur une immunochimiothérapie couplant le rituximab à la polychimiothérapie. Pour le patient âgé, cette thérapie n’est pas toujours applicable en particulier en raison de comorbidités notamment cardiaque. Pour pallier ce problème et envisager des traitements pouvant stimuler le système immunitaire, nous avons développé une thérapeutique basée sur l’utilisation de protéines autologues actives sur le système immunitaire. La procédure de préparation de ce vaccin est basée sur la purification de protéines tumorales sur des particules de phosphate de calcium d’hydroxyapatite. Ces particules devront être réinjectés au patient pour une réactivation spécifique de son système immunitaire contre les cellules tumorales. Cette préparation vaccinale est utilisée depuis 2013 en médecine vétérinaire dans le modèle canin. Une étude récente a mis en évidence un doublement de la survie des chiens après traitement par le vaccin. Etant donné Les résultats spectaculaires ont, la mise en place d’un essai clinique est envisagée chez l’homme. Cependant les équipes cliniques requièrent une analyse mécanistique de l’efficacité vaccinale dans un modèle pré-clinique murin. Il est envisagé d’inclure dans le protocole clinique d’autres types de cancers qui font également face à des obstacles thérapeutiques, tel que le cancer colorectal dans le projet. Enfin nos données préliminaires sur la composition du vaccin indiquent la présence de différentes protéines de choc thermique. Il est donc pertinent d’étudier leurs effets dans l’efficacité du vaccin. Nos objectifs sont donc dans ce projet, (1) de mettre au point la préparation vaccinale à partir de tumeur de lymphome B murin et de côlon, (2) de mettre au point la condition de traitement la plus efficace dans le modèle murin, (3) d’identifier les cellules immunitaires anti-tumorale et les protéines de choc thermique impliquées. L’utilisation de ce modèle dans des souris possédant un système immunitaire fonctionnel (Balb/c) a montré, dans plusieurs études, une pertinence pour identifier les cellules contrôlant le développement du lymphome et du cancer du côlon.

Bénéfices attendus

La vaccination des animaux devrait permettre une réduction tumorale significative comme celle observée chez le chien. L’identification des mécanismes antitumoraux de la vaccination nous permettra de valider les prérequis nécessaires à la mise en place d’un essai clinique de Phase I/II dans le lymphome B et le cancer du côlon.

Procédures

Il s’agira de prélever une goutte de sang pour déterminer la composition sanguine de l’animal en réponses aux vaccins. Pour dilater la veine de la queue, les souris sont placées sous une lampe d’animalerie chauffante pendant 10 minutes. Elles sont ensuite glissées dans un tube de contention adapté aux souris et acheté chez un fournisseur spécialisé. Le placement des souris ne durera qu’une dizaine de secondes par souris. Le prélèvement de sang est ensuite effectué avec une aiguille (26 Gauge) ou une lame tranchante stérile. Cette opération durera en moyenne 10 secondes par souris. Cette méthode est recommandée pour des prélèvements répétés de moins de 0,1 mL de sang. Les animaux sont maintenus dans le tube de contention pendant toute la durée du prélèvement. Le volume prélevé est au maximum de 100 microlitres (2 à 3 gouttes). Après la prise de sang un point de compression sera réalisé afin d’éviter tout saignement à l’endroit de l’incision. Une prise de sang (100uL) à J-1 avant l’injection des cellules tumorales et le jour de la mise à mort à la fin de la procédure expérimentale seront réalisés. Total de 2 prises de sang par souris. Le nombre de souris concerné par ces prises de sang sera de 532. Les 36 autres souris qui seront employées à la génération des tumeurs nécessaires à la fabrication des vaccins ne seront pas concernées par ces prises de sang. Les injections de cellules tumorales A20 (2x106 cellules) et CT26 (5x105 cellules) seront réalisées en sous-cutanée à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 26 Gauge et concerneront les 568 souris du projet expérimentale. Un maximum de 100 µL de suspension cellulaire seront injectés. Chaque injection de cellules tumorales durera en moyenne une dizaine de seconde. Les injections de préparation vaccinale concerneront ¬532 souris à hauteur de 4 injections vaccinales par souris et seront réalisées à J5, J7, J9 et J14 en post-injection des cellules tumorales. Chaque vaccination durera en moyenne une dizaine de seconde. Au total, pour une souris, deux prises de sang auront lieu, (à J-1 avant injection des cellules tumorales et avant la mise à mort), 5 injections (1 de cellules tumorales A20 ou CT26 et 4 injections de solution vaccinale).

Impact sur les animaux

L’utilisation du vaccin chez le chien depuis 2013 n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection des inhibiteurs d’HSP chez la souris n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection du vaccin peut engendrer de la souffrance et du stress au souris, c’est pour cela que l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. Également, l’injection des cellules cancéreuses A20 et CT26 par voie sous-cutanée se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 2000 mm2.

Devenir

L’analyse de la réponse des souris à la vaccination nécessite une étude approfondie des tumeurs et des cellules du système immunitaires. Le prélèvement de la tumeur ainsi que des organes lymphoïdes (rate et ganglions) contenant les cellules immunitaires nécessite la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les résultats préliminaires obtenus à partir des nombreuses expériences in-vitro et ex-vivo ont été très encourageants et ont permis de réduire le nombre de souris au regard des différents axes restant à être investigués. Des marqueurs phénotypiques ont été découvert via ces expériences ex-vivo. Toutefois, ce modèle ne nous permet pas de tester notre hypothèse d’une stimulation de certaine populations anti-tumorales du système immunitaire. C’est la raison pour laquelle il est primordial de pouvoir vérifier ces résultats dans un modèle in-vivo. Ces expériences constituent des tests pré-cliniques et ont pour but d’observer l’immunogénicité de notre traitement dans un organisme vivant immuno-compétent. Ces expériences in-vivo sont donc nécessaires afin de mettre en valeur les aspects physiologique résultants de notre thérapie. Mais également de retrouver les marqueurs phénotypiques vérifiés par les expériences ex-vivo.

Réduction

Pour chacune des combinaisons thérapeutiques (vaccination préventive ou curative, effets des inhibiteurs de HSP, ou déplétion des HSP) réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 7 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques et valable avec le test non paramétrique adapté aux petits échantillons (< à 10) de Mann-Whitney. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

Dans le but de préserver le bien-être animal et pour anticiper l’arrivée des signes de souffrance liés à la maladie, nous suivrons l’évolution de la croissance tumorale en mesurant tous les 2 jours par un pied à coulisse le volume des tumeurs, puis tous les jours lorsque la tumeur atteindra un volume égal ou supérieur à 1500 mm3. Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse pour l’ensemble de nos animaux (vaccinés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Les injections des cellules cancéreuses A20 et CT26 pourraient engendrer de la souffrance et du stress au souris, ainsi l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. La croissance tumorale sera monitorée et ne dépassera jamais les 2000 mm2. L’injection du vaccin par voie sous-cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales en sous-cutané (s.c.), et des vaccins (s.c.), pour nous assurer que les souris retournent à une activité normale (confort, vivacité, état sanitaire). L’utilisation d’un anti-inflammatoire introduirait des biais en notre défaveur, car cela irait à l’encontre de l’intérêt de l’étude (l’immunisation via l’utilisation d’un biomédicament). Pour pallier à cela, les animaux seront quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée. De plus, des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…). Les animaux seront mis à mort par les personnes formées. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane. Après la mise à mort, la mort des animaux est constatée par l’absence des signes vitaux : respiration, battements cardiaque, absence des mouvements volontaires et des réflexes.

Choix des espèces

Les souris BALB/c seront utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions de développement tumorale en présence d’un système immunitaire compétent. Cette condition est nécessaire pour tester les effets d’une vaccination anti-tumorale sur le système immunitaire. La souris a pour intérêt d’avoir un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Le modèle de lymphome B murin A20 et le modèle CT26 de cancer du côlon ont été montré comme pertinent comme modèles pré-cliniques or ces modèles se développent dans des souris BALB/c. Nous utiliserons des souris femelles et mâles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras, elles reçoivent des injections répétées induisant fibrose puis cancer du foie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer le rôle de deux protéines dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur résume les retombées en une phrase, la validation des "effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs". Il affirme qu'"il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé" et conserve les organes pour tirer un maximum de données de chaque souris.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs ont été déjà identifiés (diabète, inflammation, modification du microbiote intestinal). Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à 2 acteurs clefs impliqués dans le développement de ces maladies. Ces acteurs peuvent agir de pair favorisant le développement de ces maladies chroniques du foie. Pour une meilleure compréhension de leurs rôles, nous évaluerons sur des animaux, l’impact potentiellement bénéfique de leur absence sur le développement et la progression de ces maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ces études précliniques valideront les effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs dans les maladies chroniques du foie .

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la cicatrisation hépatique. Pour la procédure 2 : les souris recevront une injection 2 fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7-8 semaines d’âge. Pour la procédure 3 : une unique injection sera réalisée sur les souris mâles âgés de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont les contentions, les prises de poids régulières ainsi que les injections en fonction des procédures. Les effets indésirables attendus pourraient être principalement une faible inflammation locale au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, certains aspects du projet seront réalisés sur des cellules. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études précliniques car les études sur cellules ne permettent pas de reproduire la maladie humaine. Ainsi, il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé pour ces études.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et exploitables. Les expériences seront reproduites pour confirmer la significativité statistique. Les organes obtenus à partir des souris seront conservés et stockés pour des analyses ultérieures afin d'enregistrer autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (grille d’observation) nous permettront d'identifier précocément tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée et pertinente pour étudier ces maladies. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La maladie développée par la souris récapitule les symptômes et les caractéristiques de la maladie chez homme. Pour la procédure 1, la mise sous régime riche en graisse débutera lorsque les souris auront 8-10 semaines d’âge. En effet, un tel régime induit une prise de poids importante et peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Cette procédure permet d’analyser la progression des maladies chroniques du foie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline. Pour la procédure 2, le traitement chimique induisant la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge. Cette procedure permettra d’étudier les mécanismes moléculaires associés à la fibrose hépatique. Pour la procédure 3, l’injection du réactif induisant le cancer hépatique sera effectuée à environ 2 semaines d’âge (âge approprié pour cette procédure) et la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge (animaux relativement jeunes). Cette procédure permettra d’étudier les stades le plus avancés de la maladie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Klebsiella pneumoniae, par voie nasale sous anesthésie ou par gavage, reçoivent un inhibiteur de l'inflammasome, puis sont tuées au cinquième jour pour prélever poumons, intestins, foie, rate et sang. Le porteur indique que l'infection pulmonaire peut provoquer sifflements, écoulements nasaux, insuffisance respiratoire et fièvre, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Il reconnaît avoir mené des essais in vitro sur cellules mais les juge insuffisants, et conclut à la nécessité d'un organisme complexe.

Objectifs

L’axe intestin-poumons résulte d’une communication croisée entre le microbiote intestinal et la sphère pulmonaire. La survenue d’une dysbiose intestinale favorise un état d’hyper-inflammation, exacerbe les lésions pulmonaires et aggrave les pathologies respiratoires. Les mécanismes sous-jacents sont méconnus, et notamment les liens entre microbiotes et les complexes protéiques de l’immunité innée que sont les inflammasomes qui ont été identifiés comme de puissants modulateurs de l’inflammation. L’ambition de ce projet est de décrypter le rôle de l'inflammasome en lien avec l’interface hôte/microbiote dans l’axe intestin-poumons via un modèle infectieux impliquant le pathogène respiratoire Klebsiella pneumoniae (bactérie opportuniste commensale de l'intestin). Les objectifs sont d’identifier 1) s'il existe une activation differentielle de l'inflammasome dans le tissu pulmonaire et/ou intestinal chez des souris infectées par K. pneumoniae et 2) les conséquences de son activation (ou inhibition) sur le transfert d’informations immunologiques et bactériennes dans l’axe intestin-poumons. Pour cela, deux modèles murins seront développés: un modèle intestinale (modèle de colonisation intestinale par inoculation intra-gastrique de K.pneumoniae) et un modèle pulmonaire (instillation intra-nasale de K. pneumoniae). Dans les deux modèles, un inhibiteur de l'inflammasome sera administré afin d'étudier l'impact de l'inflammasome dans l'inflammation intestinale, pulmonaire et dans l'axe intestin-poumons. Les connaissances générées permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une approche spécifique du traitement des pathologies pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est clinique, puisque le projet a pour objectif d’identifier le rôle des inflammasomes dans l’axe intestin-poumons et ainsi de générer des nouvelles pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques. L’identification de bactéries commensales immunomodulatrices permettra le développement de bactéries probiotiques ou d’interventions nutritionnelles ciblées chez des patients atteints de pathologies respiratoires infectieuses et/ou inflammatoires. Ce projet vise également à décrire les interactions du microbiote intestinal avec les poumons en réponse à un pathogène. Ce domaine est encore largement méconnu mais il représente un levier majeur pour améliorer les connaissances sur la pathogénie, la persistance et la transmission des pathogènes. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux.

Procédures

Deux modèles d'infection avec le pathogène bactérien seront mis en place pendant 5 jours. Le premier modèle expérimental correspond à la mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire dans lequel le pathogène est introduit dans les voies aériennes par inhalation réalisée sous anesthésie légère (moins de 5 min). Cette première procédure nécessitera 3 lots soit 72 souris. Le deuxième modèle sera un modèle de colonisation intestinale dans lequel les animaux (3 lots soit 72 souris) recevront une unique dose de pathogène par voie orale. Dans chaque modèle, un lot de souris recevra en plus un inhibiteur de l'inflammasome (3 injections tous les 2 jours). Des collectes de fécès quotidienne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle de colonisation intestinale. Aucun prélevement sur animaux vigiles ne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle d'infection pulmonaire. Les animaux seront mis à mort au bout des 5 jours de procédure.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables pourraient etre observés avec les animaux infectés par le pathogène en intra-nasale (modèle d'infection pulmonaire). Ils pourraient montrer des signes respiratoires tels qu'un sifflement pulmonaire, des écoulements nasales ou une insuffisance respiratoire accompagnés de fièvre.

Devenir

Tous les animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin d'effectuer des prélements d'organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d'étudier le rôle du pathogènes sur la réponse inflammatoire intestinale et pulmonaire et plus précisement sur l'inflammasome. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par le dénombrement du pathogène dans les différents organes prélevés ainsi que dans le sang afin de voir l'impact de l'inflammasome sur les processus de colonisation, translocation et dissémination de la bactérie.

Remplacement

Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des cellules eucaryotes en culture, mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’implication de l’inflammasome dans la réponse inflammatoire induite par K. pneumoniae, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe ce qui est observé en clinique lors de d’infections pulmonaires à K. pneumoniae et permettra ainsi de mieux caractériser le rôle de l’inflammasome (au niveau pulmonaire ou par l’intermédiaire de l’axe intestin-poumons) dans le développement des processus hyperinflammatoires lors des infections à K. pneumoniae.

Réduction

Les expérimentations seront organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible, et chaque expérience sera exploitée au maximum (prélèvement d’un maximum d’organes, prélèvement de sang, réalisation de lavages broncho-alvéolaires...). Le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé à partir d’analyses statistiques. Nous utiliserons des lots de 8 souris ; ceci est classiquement utilisé afin de prendre en considération la variabilité/reproductibilité intra-lot. La variabilité inter-lot (entre les différentes conditions) ne peut pas être évaluée. Nous estimons que 3 répétitions par point de mesure pour chaque condition de culture (3 lots de 8 souris) sera suffisant pour prendre en compte la répétabilité inter-lot, et seront suffisantes pour obtenir une puissance statistique recevable. Nos précédentes études nous ont permis de confirmer que l’étude de groupes de 8 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des antalgiques seront administrés aux animaux pour réduire la douleur si nécessaire. Si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.

Raffinement

Des échelles cliniques journalières et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des animaux. Une grille de score et l'utilisation de points limites adaptés à chaque modèle permettra repérer les signes de stress et de douleur des animaux. Si des signes de douleur sont observés, l’animal concerné sera isolé dans une cage individuelle et des analgésiques lui sera administré. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% par rapport à leur poids en début d’expérimentation ou présentant des effets indésirables durant les procédures seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris C57BL/6. Des publications internationales montrent que cette lignée est parfaitement adaptée pour étudier la virulence de K.pneumoniae au niveau pulmonaire et intestinal; le fond génétique C57BL/6 est préférable pour l’étude de l’immunité et des outils moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les animaux seront âgés de 6 semaines, âge où les souris ont un système immunitaire mature et fonctionnel caractérisé par un développement maximal des organes lymphoïdes secondaires et une réponse lymphocytaire complète (présence des différentes populations lymphocytaires matures).