Système immunitaire

1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des administrations orales de bactéries et d'acide rétinoïque, une injection dans un ganglion et un prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever tumeur, foie, intestins, ganglions et rate. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et un inconfort lors des administrations, l'objectif étant de restaurer l'efficacité des immunothérapies en cas de déséquilibre du microbiote. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et "entier" permet d'étudier l'immunité antitumorale, impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant un déséquilibre de la flore intestinale ou dysbiose. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin (MAdCAM-1). L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. De plus, il a été montré que l’acide tout trans rétinoïque (ATRA, all tran retinoic acid) (dérivé de la vitamine A utilisé pour traiter des leucémies) augmente l’expression du ligand de MAdCAM-1 sur les lymphocytes et réprime l’induction de certaines cellules néfastes. Cette surexpression de ce ligand permettrait une meilleure captation des cellules immunitaires intestinales vers l’intestin en cas de dysbiose. Pour comprendre ce lien entre l’ATRA et la réponse anti-tumorale, nous souhaitons dans un contexte de dysbiose supplémenter nos souris en ATRA pour comprendre son effet sur le MI, sur l’effet des immunothérapies, sur l’expression de MAdCAM-1 et de son ligand et sur la migration des cellules immunitaires entre l’intestin et la tumeur. Pour cela, nous voulons administrer l’ATRA par voie orale. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet bénéfique de la supplémentation en ATRA sur la réponse anti-tumorale aux immunothérapies en cas de dysbiose en capturant les cellules néfastes au niveau de l’intestin permettant ainsi la recirculation des cellules immunitaire bénéfiques vers la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous voulons ainsi montrer la restauration de l’efficacité des immunothérapies post traitement par l’ATRA (all trans retinoic acid) malgré le contexte de dysbiose intestinale. (dérégulation de la flore) Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunitaires néfastes de l'intestin vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, l’ATRA, déjà disponible dans la pharmacopée humaine semble être une bonne molécule pour atteindre cet objectif.

Procédures

Les interventions seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute) sous anesthésie locale, l’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’ATRA (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) sous anesthésie locale, et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 1min) sous anesthésie locale ou générale suivant les prélvèement..

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acide tout-trans-rétinoïque (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Ce résultat statistique sera basé sur l'expression tissulaire de MAdCAM-1 ou sur la différence de taille tumorale entre les groupes. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les souris seront donc adultes ce qui permettra un passage plus aisé à l'Homme dans la suite de l'étude.

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris génétiquement modifiées pour porter une mutation de la fièvre méditerranéenne familiale présentent un poids inférieur de 30 à 40 % et une perte de poils, et subissent des prises de température rectales répétées, des prélèvements sanguins et des injections quotidiennes pendant deux semaines. Le porteur ajoute des situations de stress pour amplifier la réponse inflammatoire et prévoit la mise à mort pour analyses immunologiques et histologiques. Il affirme que la réponse au stress n'est pas modélisable hors d'un "organisme entier" et présente les retombées thérapeutiques au conditionnel.

Objectifs

La fièvre méditerranéenne familiale (FMF) est une maladie auto-immunitaire héréditaire, assez fréquente dans certaines régions. Elle est caractérisée par des épisodes récurrents et imprévisibles d’inflammation (réaction de défense immunitaire), qui à long terme peuvent entraîner de graves complications et éventuellement la mort. La solution thérapeutique actuelle est basée sur une administration quotidienne et à vie d'un médicament (qui désassemble certains composants intracellulaires), mais 5 à 10% des patients FMF y sont intolérants ou résistants, d’où l’importance de développer de nouveaux traitements. À ce jour, les mécanismes précis responsables de telles crises inflammatoires chez ces patients demeurent inconnus. Néanmoins plusieurs hypothèses, découlant directement d’observations cliniques (dont le rôle de certaines hormones sexuelles et de molécules du stress), sont maintenant validées en culture cellulaire. En particulier, le stress serait capable d’amplifier l’activation de la réponse inflammatoire impliquée dans la FMF. Reste à comprendre comment ce dialogue a lieu, et montrer en quoi il représente une piste thérapeutique prometteuse. La FMF est due dans la plupart des cas à des modifications génétiques touchant une protéine "récepteur" de l'immunité (la pyrine), dérégulée chez les patients. La majorité de ces mutations affectent un domaine particulier de la pyrine. Il existe des modèles cellulaires pour étudier ces modifications pathologiques dans des cellules en culture, mais leur indispensable analyse à l'échelle de l'organisme est rendue difficile par l’absence de ce domaine particulier chez la Souris. Ceci explique l’intérêt de travailler sur un modèle de Souris génétiquement modifiées pour exprimer ce domaine humain portant des modifications typiques de la FMF. L’objectif de ce projet est d’étudier la modulation des symptômes inflammatoires chez ces souris, par des actions stimulatrices ou inhibitrices sur les signaux de stress, afin de mieux comprendre la régulation des crises inflammatoires et d’en proposer d’éventuels leviers de contrôle.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur certaines maladies immunitaires génétiques) et cliniques : 1) À court terme : mise en évidence du rôle des signaux de stress dans la FMF, et de nouvelles voies à cibler pour moduler les symptômes. 2) A plus long terme : mieux comprendre l’origine des crises inflammatoires (dont les facteurs environnementaux par exemple certains stress), et possiblement tester des traitements innovants (plus ciblés et moins toxiques, utilisables à des moments précis de l’évolution de la maladie, potentiellement préventifs aussi).

Procédures

Interventions effectuées: 1) Prise de température rectale (durée

Impact sur les animaux

Les gestes techniques prévus dans les procédures sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. D'autre part les souris "modèles" de la maladie présentent un phénotype susceptible d’affecter leur bien-être (poids final 30 à 40% plus faible que les souris "sauvages", perte locale de poils, organes immunitaires plus volumineux); nous prévoyons donc un contrôle continu de leur élevage (croisement entre parents hétérozygotes, non malades) en fonction du déroulé et des résultats des expériences. Enfin certains traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires, notamment gastriques. D'où les mesures de raffinement, de suivi et de dosage approprié.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux participant aux procédures d'expérimentation, pour analyses immunologiques et histologiques post-mortem en lien avec les objectifs du projet.

Remplacement

L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaires déjà réalisés in vitro), et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. En particulier la réponse au stress n’est pas modélisable en dehors d’un organisme entier, d’où l’intérêt d’y d’étudier la réponse inflammatoire dans différents contextes.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec un premier "essai pilote" déterminant. Les nombres d’animaux sont calculés pour permettre des analyses statistiques robustes, en accord avec les objectifs scientifiques et en limitant autant que possible la taille des effectifs.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Entrainement à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l'expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Anesthésie gazeuse et application locale de collyre lors des prélèvements sanguins rétro-orbitaux. 3) Utilisation de lubrifiant pour les prises de température rectales, et adaptation de la taille de la sonde au gabarit des souris. 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) Mise à disposition de moyens d’hydratation supplémentaires si diarrhées observées en réaction aux inhibiteurs. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et les expériences menées avec des précautions sur l’âge des souris (

Choix des espèces

Il est ici nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, Vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées génétiquement modifiées et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Les animaux transgéniques envisagés pour ce projet permettent une bonne modélisation des réponses observées chez les patients. L’âge des animaux sera de 6 semaines en fin de procédure expérimentale, dont les expériences de stress (durée maximale après l’injection du traitement : 9h). Les expériences d’injection des inhibiteurs débuteront à l’âge de 4 semaines (pour avoir maximum 2 semaines de suivi), car le phénotype est précoce chez les souris modèles de la FMF et l’espérance de vie est plus courte. Cette chronologie permettra aussi d’inclure le délai de génotypage des petits.

1280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés reçoivent des cellules souches humaines pour reconstituer un système immunitaire humain, puis les souris subissent des greffes de peau avec deux greffons suturés en environ 90 minutes, des greffes d'îlots pancréatiques, l'induction d'un diabète par injection d'alloxan et une imagerie intravitale répétée. Le porteur indique que ces greffes peuvent provoquer des douleurs postopératoires et une perte de poids. Il affirme que l'efficacité de la thérapie cellulaire ne peut être évaluée qu'in vivo et présente les bénéfices pour les patients au conditionnel et à terme.

Objectifs

Aujourd'hui, la greffe d'organe est souvent le dernier recours pour les patients dont les organes vitaux sont défaillants. La greffe permet de retrouver une qualité de vie et d’améliorer la survie des patients. Néanmoins, les traitements anti-rejet ont de nombreux effets secondaires (infections et cancers). Le but de ce projet de recherche, prévu sur une période de 5 ans, est de développer une thérapie cellulaire et génique pour supprimer le besoin en anti-rejets. Il s’agit de modifier génétiquement les cellules régulatrices du système immunitaire du receveur pour qu’elles neutralisent la réaction de rejet. L’efficacité in vitro et in vivo de ces cellules régulatrices modifiées a été établie. Il est désormais indispensable de démontrer et d'optimiser leur efficacité dans des modèles précliniques de greffe pour mieux garantir un effet protecteur à long terme, une étape nécessaire pour son utilisation future chez l'homme. Seul un modèle murin de transplantation est capable de récapituler la complexité des phénomènes de rejet. Quatre types de modèles murins seront utilisés pour tester et optimiser l'utilisation d’immunothérapies dont les CAR-Tregs : 1- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules souches humaines (souris humanisées) 2- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution partielle du système immunitaire par des cellules mature humaines (souris semi-humanisées) 3- un modèle de greffe d’ilots chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules humaines (souris humanisées) et 4-un modèle de maintien de la tolérance immune avec deux greffes de peau successives chez la souris humanisée. Au total, deux lignées immunodéprimées seront utilisées.

Bénéfices attendus

A terme, ces expériences permettront : - de démontrer la synergie d'une immunothérapie ciblant les cellules dirigées contre les greffons et de CAR-Tregs - de montrer la possibilité d’expandre les CAR- Tregs in vivo, - et d'établir l'efficacité des CAR-Tregs à prévenir le rejet aigü et chronique de greffe de peau et d’ilots dans des modèles précliniques de souris humanisées. Cette nouvelle stratégie thérapeutique ambitionne d’améliorer la prévention des rejets en transplantation d’organe, tout en s’affranchissant de la toxicité des drogues immunosuppressives administrées au long cours. La prévention des réactions de rejet dans ces trois modèles complémentaires serait un argument préclinique très robuste et convaincant pour porter cette nouvelle stratégie vers une utilisation clinique.

Procédures

Injection des cellules souches: Des nouveaux nés recevront des cellules souches humaines par voie intrahépatique sans anesthésie. Ce geste est réalisé une fois et dure quelques secondes. Injection et prélèvement sanguin: réalisés dans le sinus rétro-orbitaire en alternance sur chacun des yeux sous une courte anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Les greffes de peau et d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnée d’une perte de poids (>10%) et une perturbation de la mobilité par le bandage. L’injection d’alloxan risque d’induire une hypoglycémie transitoire avec une augmentation du taux d’insuline plasmatique due à la destruction du pancréas.

Devenir

A l’issus de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser la préparation de la thérapie cellulaire. Toutes les étapes visant à améliorer l’efficacité de la modification génétique des cellules régulatrices ont été mises au point in vitro. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des CAR Trégulateurs dans les différents organes, ou leur capacité à migrer dans les greffons, et à induire une tolérance. En effet, lorsque les cellules sont greffées, elles se transforment en réponse à leur environnement, en particulier l’environnement inflammatoire induit pas la réaction de rejet, ce qui peut complètement modifier leur persistance et leur activité tolérogène. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Le suivi par imagerie intravitale permet un suivi longitudinal des animaux et donc une réduction de leur nombre. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront partagés avec la communauté scientifique pour éviter les doublons.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine) sont prévues. Une grille de score permettant d’évaluer objectivement les éventuelles souffrances, douleurs et détresses a été établie pour définir des points limites permettant d’anticiper l’administration d’analgésiques ou la mise à mort de l’animal si nécessaire. Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pour chaque geste invasif (injection iv, prélèvement sanguin, chirurgie). Pour toute anesthésie prolongée, les animaux seront placés sur une plaque thermostatée permettant de maintenir leur température corporelle et du gel oculaire sera appliqué. La contention nécessaire pour l’imagerie in vivo sera accompagnée d’une anesthésie sous forme gazeuse par isoflurane. Dans le cas de l’anesthésie gazeuse, la vigilance de l’animal sera surveillée par pincement de la palme plantaire, mobilité des vibrisses et suivi du mouvement thoracique respiratoire et ce, jusqu’au réveil complet de l’animal. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). Les souris seront élevées en communauté. Cependant si cela n’est pas possible (agressivité entre deux souris par exemple), d’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvant seuls dans les cages. Pour réduire le nombre de manipulations et limiter le stress des animaux, l’imagerie in vivo sera faite en même temps la mesure du score.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. De plus, la souris est un modèle permettant d’effectuer des modifications génétiques relativement facilement. Ces modifications nous permettent d’avoir des modèles immunodéficients nécessaires pour la création de lignée dites humanisées, qui se rapprochent du système immunitaire humain. Pour la constitution des souris humanisé par injection de cellules souche humaines, les animaux seront âgés de 1 à 3 jours car c’est une période durant laquelle la greffe de cellule humaine est la plus efficace. Concernant les greffes de peau/ilots, elles seront réalisées 14 semaines post injection des cellules humaines pour permettre une reconstitution complète du système immunitaire humain. Pour le modèle de greffe d'ilots sur souris partiellement humanisées, les animaux seront greffés à l’âge de 8 à 12 semaines.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.

Bénéfices attendus

Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections abdominales et intraveineuses au niveau de l'œil, des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis sont infectées par un virus provoquant une perte de poids temporaire, avant prélèvement de la rate et du foie. Il s'agit d'étudier le rôle d'une protéine de l'inflammation dans la réponse antivirale des lymphocytes T. Le porteur affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

Les lymphocytes T, qui sont une population de cellules du système immunitaire, jouent un rôle essentiel dans la défense contre les infections virales aigües (telles que la grippe) et chroniques (comme les hépatites B ou C). La compréhension des mécanismes régissant ces fonctions a donc un fort intérêt fondamental et thérapeutique. Des données de la littérature, indiquent qu’une protéine de l’inflammation pourrait jouer un rôle majeur dans l’élimination des virus, via son rôle dans les lymphocytes T. Nous souhaitons ainsi tester sa fonction in vivo, dans un modèle d’infection virale aigüe et un modèle d’infection chronique, qui reflètent fidèlement le déroulement de ces maladies chez l’homme. La charge virale et la réponse immunitaire seront ainsi mesurées après infection de souris témoins et déficientes pour la protéine d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait nous permettre de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la fonction des lymphocytes T dans le contexte des réponses anti-virales, donnant ainsi des indices sur la physiopathologie des infections aigues et chroniques chez l’homme.

Procédures

-Injections dans l’abdomen : 1 injection sur 20 animaux vigiles, 2 à 3 secondes/injection. -Injections intra-veineuses au niveau de l’oeil: 1 injection sur 20 animaux sous anesthésie générale gazeuse, 5 secondes/injection sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ. -Prélèvements sanguins au niveau de l’oeil : 1 prélèvement sur 20 animaux, 10 secondes/prélèvement sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ. 2 prélèvements à 10 jours d’intervalle, sur 20 autre animaux : 10 secondes/prélèvement sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (injections intraveineuses et abdominales, prélèvements sanguins). Le protocole d’injection et de prélèvement que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. L’injection dans l’abdomen peut éventuellement provoquer une inflammation locale temporaire. L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins peuvent éventuellement provoquer une inflammation au niveau de l’oeil. Une perte de poids limitée et temporaire (4 jours) est attendue suite à l’infection virale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever les rates et foies. L’objectif est d’analyser la charge virale et le phénotype immunitaire. Ceci permettra de documenter la fonction de la protéine d’intérêt non seulement dans l’élimination du virus mais également sur le type de réponse immunitaire mis en place.

Remplacement

Un certain nombre d'expériences in vitro, suggérent un rôle d’une protéine de l’inflammation dans la fonction anti-virale des lymphocytes T. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine d’intérêt dans un contexte physiologique pertinent. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la bio-informatique, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Une taille d'échantillon de 10 souris/groupe est calculée. Ces éxpériences n’ont jamais été réalisées, et il n’y a pas de double emploi des animaux.

Raffinement

Le protocole d’injection et de prélèvement que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. Les injections et prélevements par voie intraveineuse seront accompagnées de l’appication d’une goutte d’anesthésique local pour limiter la douleur, et seront effectués en alternance sur chaque oeil. De plus l’utilisation de l’anesthésie générale gazeuse, un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience, et l’altération d’un de ces paramètres entraînera une surveillance accrue. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence d’un modèle transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de la protéine d’intérêt dans les réponses immunitaires, et l’existence de virus modèles, reflétant le déroulement des infections virales comme la grippe ou les hépatites B et C chez l’homme. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 30 semaines.

30 bovins, veaux et génisses, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux vaccinations intramusculaires, sept prises de sang et trois prélèvements par poche, puis des écouvillonnages nasaux, pour tester un candidat vaccin contre le virus respiratoire syncytial bovin. À la fin, tous sont tués pour prélever des tissus lymphoïdes et du sang. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour évaluer la réponse vaccinale et relie l'intérêt du projet à la réduction des antibiotiques en élevage.

Objectifs

La vaccination contre le virus respiratoire syncycial (VRS) bovin a été identifiée comme une priorité en élevage en raison de la prévalence de cette infection virale (qui touche les veaux dans leur première année) et de la morbidité et mortalité qu’elle occasionne. De plus, le VRS bovin peut favoriser la survenue de surinfections bactériennes et pour prévenir ce risque, les éleveurs traitent fréquemment avec des antibiotiques dès l’apparition de troubles respiratoires dans leur troupeau. Un vaccin efficace dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux. Un enjeu majeur de la vaccination contre le VRS chez le veau est d’induire une immunité protectrice dans les premières semaines de vie, en présence des anticorps d’origine maternelle (acquis par la buvée du colostrum). Notre candidat vaccin est une protéine virale, la protéine de fusion F, produite in vitro sous une forme stabilisée dite préfusion (preF). Un candidat vaccin similaire est également en cours de développement pour protéger contre le virus respiratoire syncytial humain responsable des bronchiolites infantiles. Or il a été montré chez l’homme que les déterminants antigéniques portés par cette protéine preF qui sont reconnus par les anticorps neutralisant l’infection virale, diffèrent entre les nouveau-nés (0-2 mois) et les enfants plus âgés (6 mois et au-delà). Pour les bovins, nous avons déjà fait la preuve de l’efficacité du vaccin preF pour protéger contre l’infection virale après une seule administration par voie intramusculaire avec un adjuvant vétérinaire classique. Le projet actuel a pour premier objectif d’identifier les déterminants antigéniques qui sont dominants en réponse au vaccin preF chez les veaux de 2-3 semaines et qui sont mineurs chez les veaux plus âgés (6-9 mois). Notre deuxième objectif est de concevoir un nouveau candidat vaccin ne comportant que ces déterminants antigéniques dominants en période néonatale puis de l’évaluer chez des veaux de 1 mois pour son efficacité meilleure par comparaison avec preF en présence des anticorps d’origine maternelle.

Bénéfices attendus

- Un vaccin efficace contre le VRS dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux qui sont fortement affectés par des infections respiratoires. Un vaccin efficace réduira l’utilisation des traitements antibiotiques par les éleveurs lorsque des troubles respiratoires apparaissent dans leur troupeau et que les éleveurs veulent prévenir le risque de sur-infections bactériennes. - Comprendre comment élaborer des vaccins efficaces dans la période néonatale en présence des anticorps d’origine maternelle est une avancée majeure en vaccination pour les animaux d’élevage, de compagnie et aussi pour le nourrisson.

Procédures

Les 30 animaux du projet seront soumis aux 3 gestes techniques suivants : 1) Vaccination 2 fois en intramusculaire J0 et J30 post-vaccination et moins de 5 minutes par animal. 2) Prise de sang/poche : 7 prises de sang une fois par semaine en moyenne et 3 poches de sang à 20 jours d'intervalle entre 5 à 10 minutes par animal. 3) Ecouvillonage nasal non invasif et moins de 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les vaccins évalués dans ce projet sont de type protéique sous-unitaire (inerte, non réplicatif) et adjuvés avec un adjuvant vétérinaire classiquement utilisé pour les bovins. De ce fait les réactions locale et systémique attendues sont faibles (évenutellement douleur locale et fièvre), et la durée de la phase inflammatoire sera limitée à quelques heures. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. La contention de l’animal pour les prises de sang engendre du stress et que la prise de sang peut également engendrer un hématome.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront mis à mort à la fin de l’étude. Des tissus lymphoides seront prélevés et des poches de sang pour collecter pour récupérer les cellules immunitares.

Remplacement

Il n'a pas de modèles in vitro alternatifs pour évaluer la réponse vaccinale.

Réduction

Des effectifs de 5 génisses de 6-9 mois et 5 veaux mâles ou/et femelles de 3-4 semaines seront suffisants pour isoler des lymphocytes B du sang ou des ganglions en réponse à la vaccination. Des expériences antérieures nous ont en effet permis de valider la quantité d’antigène preF, l’adjuvant et la voie de vaccination pour générer des réponses anticorps robustes. Trois individus dans chaque groupe avec les réponses les plus fortes seront sélectionnées pour l’analyse des répertoires. Ce sont également nos données antérieures qui nous ont permis de déterminer le n=5 par groupe de veaux de 2-3 semaines pour avoir des comparaisons statistiquement significatives. Ce nombre d’animaux permettra de réaliser des tests statistiques non paramétriques. Les bovins pourront recevoir un traitement si nécessaire lors de la vaccination car il y a un risque de réponse inflammatoire locale modérée avec une légère fièvre pendant 24h.

Raffinement

Les bovins sont hébergés en groupe dans une animalerie conventionnelle fermée, avec un environnement enrichi (pierre de sel, brosse, paille, aire d’exercice). Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Les bovins pourront être traités avec des anti-inflammatoires ou des antalgiques en cas de réaction à la vaccination. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire à base de méloxicam (voie sous-cutanée), éventuellement répétée après 48h. Il sera mis en place une récompense positive, type céréales ou boucons de paille, après chaque prise de sang.

Choix des espèces

Le bovin est l'hôte naturel du virus respiratoire syncytial bovin et le veau doit être protégé par la vaccination. Veaux de 2-4 semaines : période néonatale avec présence d’anticorps circulants spécifiques du virus respiratoire syncytial bovin et d’origine maternelle. Génisses de 6-9 mois : stabilisation d’un répertoire B de type adulte

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intramusculaire puis jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant dix jours, et un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie avant leur mise à mort. Le porteur indique un inconfort et un stress liés aux injections répétées, sans attendre d'autre effet des molécules testées. Il affirme que le modèle murin est le seul modèle préclinique adapté pour étudier la réponse immunitaire après une greffe de poumon.

Objectifs

BOB1 est un facteur exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients transplantés le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associé au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de « calmer » les lymphocytes activés qui devraient moins agresser le greffon.. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique (qui se met en place après une greffe). Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune allogénique, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique in vivo chez la souris au préalable. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une greffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 1 minute, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intra-péritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro, et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables, et à l'aide de tests statistiques. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.