Système immunitaire

1 322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau ou en intraveineuse, des gavages répétés pouvant atteindre 52 séances par animal, des applications cutanées de bactéries et des injections d'immunothérapie, avant d'être mises à mort pour prélever tumeurs et organes lymphoïdes. L'étude cherche à comprendre comment le microbiote influence la réponse au traitement du mélanome. Le porteur affirme que l'interaction entre bactéries intestinales et réponse immunitaire ne peut être étudiée que sur "organisme entier".

Objectifs

Le mélanome est un cancer qui se développe initialement au niveau de la peau (mélanome cutané) ou de l’œil (mélanome uvéal). Le mélanome cutané est le cancer dont le taux d’incidence a le plus augmenté entre 2010 et 2018 (+3,4 %). La mortalité due à ce cancer diminue notamment grâce à des avancées thérapeutiques importantes au cours de la dernière décennie. En effet, les immunothérapies permettant de renforcer l’action anti-tumorale des lymphocytes T constituent la première ligne de traitement du mélanome en France. Cependant 60% des patients résistent à ces traitements. Nous étudions une protéine qui pourrait jouer un rôle majeur dans cette résistance. Notre hypothèse est que cette protéine, surexprimée dans le microenvironnement tumoral, élimine des bactéries indispensables pour la réponse au traitement. Nous proposons d’identifier ces bactéries, puis d’évaluer si ces dernières potentialisent l’efficacité de l'immunothérapie. Alternativement, nous évaluerons l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur de notre protéine d'intérêt. L’objectif fondamental de ce projet est de déterminer l’impact de ces traitements sur les cellules immunitaires au site de la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous avons mis en évidence le rôle d’une protéine dans l’agressivité du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de cette protéine. Compte tenu d’une part de sa capacité à lyser des bactéries in vitro et d’autre part de sa surexpression lors du développement du mélanome, cette protéine pourrait modifier in vivo la composition des bactéries aux niveaux de l’intestin mais aussi de la peau, site du développement tumoral. Nous émettons l’hypothèse que le retard du développement tumoral chez les souris dont l’expression de cette protéine a été inactivée est dû à la présence de bactéries anti-tumorales et que ces bactéries sont spécifiquement éliminées chez des souris exprimant notre protéine d’intérêt. Nous déterminerons quel est l’impact de telles bactéries sur le développement tumoral et la mise en place d’une réponse immunitaire dans un modèle de mélanome induit par transplantation et dans un modèle de mélanome spontané. Nous déterminerons si ces bactéries anti-tumorales ou un inhibiteur de notre protéine d'intérêt augmentent l’efficacité d’un traitement par immunothérapie. Des essais cliniques récents supportent que des patients atteints de mélanome métastatique, initialement réfractaires à une immunothérapie, répondent au traitement après avoir reçu une transplantation des selles de malades répondeurs à ce traitement. A terme, nos travaux pourraient permettre de proposer deux nouvelles stratégies pour traiter le mélanome cutané chez l’homme. Une première stratégie consisterai à modifier la composition des bactéries, non plus de façon systémique, mais au niveau cutané. Alternativement, nous proposer d’associer à l’immunothérapie de référence un inhibiteur de notre protéine d’intérêt.

Procédures

Prélèvement sur souris vigiles de 15-20 jours de bactéries cutanées par écouvillon et de fèces. Rasage des souris (5 minutes par souris), un jour avant l'injection en sous-cutanée des cellules de mélanome. Injection en sous-cutanée (estimation 5 minutes) ou en intra-veineuse (estimation 6 minutes) de cellules de mélanome. Ceci n'est réalisé qu'une fois par souris. Cinq mesures des tumeurs avec un pied à coulisse suite à la transplantation de cellules de mélanome en sous-cutanée. Cela prend environ 5 minutes par souris maintenues en contention. Gavage oral (5 minutes par souris) tous les 3 jours avec des fèces chez des souris avec un mélanome transplanté. Le gavage sera réalisé maximum 6 fois par souris. Application topique avec une pipette de bactéries sur la peau rasée de souris sous anesthésie. 5 dépots de bactéries sont prévus par souris. L'intervention durera le temps de pénétration des bactéries dans la peau puis le temps de réveil. Cela est estimé à 30 minutes par souris. Plusieurs souris seront traitées simultanément. Administration intra-péritonéale (estimation 3 minutes par souris) d'une immunothérapie tous les 5 jours à partir de J14 et gavage oral (estimation 5 minutes par souris) avec des bactéries tous les 4 jours à partir de J15 dans le modèle de mélanome spontané. Au total 10 injections de l'immunothérapie et 11 gavages par des bactéries sont prévus par souris. Gavage oral bi-quotidien (5 minutes par souris) avec un inhibiteur de notre protéine d’intérêt (100µl) pendant 26 jours. Au total 52 gavages par souris.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées, intra-veineuses, intra-péritonéales et par gavage oral peuvent occasionner stress et douleurs lorsque celles-ci sont pratiquées aux animaux. Le dépôt de bactéries sur la peau n'engendre pas de douleur. La croissance tumorale, spontanée ou induite par la transplantation des cellules de mélanome, peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs. Enfin la manipulation pour collecter les fèces chez des souris avant sevrage ou encore mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. La transplantation de cellules tumorales en intra-veineuse peut induire une perte de poids des animaux.

Devenir

Les males reproducteurs seront tous mis à mort à l’atteinte des points limites. Tous les autres animaux seront mis à mort pour prélever des organes lymphoides secondaires (rate et ganglions) et des tumeurs primaires et des métastases.

Remplacement

Des expériences in vitro suggèrent que la protéine que nous étudions empêche la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales. Des expériences sont actuellement réalisées in vitro pour évaluer si cette protéine est également capable de lyser spécifiquement des bactéries fécales cultivées dans des conditions qui miment le flux intestinal. L’objectif est d’identifier des bactéries sensibles à cette protéine. Cela sera complémentaire de la caractérisation des bactéries fécales et cutanées présentes chez les souris exprimant ou non notre protéine d’intérêt. Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre les bactéries intestinales et les cellules immunitaires associés au mélanome primaire ou aux métastases cutanées. En effet, la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives. Le bénéfice d’une réponse à un traitement (réorientation du microbiote ou inhibiteur de la protéine d’intérêt) sur le développement tumoral ne peut être étudié que sur organisme entier en raison de l’organisation et de la coopération des tissus.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, la durée du traitement par l’inhibiteur de la protéine que nous étudions a déjà été optimisée par notre collaborateur qui a développé cette molécule. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant. L’expérience des manipulateurs permettra d’assurer la reproductibilité de la procédure et d’appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi les groupes reposant sur le modèle de mélanome spontané nécessitent 40 souris, alors que les procédures de transplantation tumorale requièrent des groupes de 16 souris. Les élevages permettent de générer non seulement des souris transgéniques pour un oncogène développant spontanément un mélanome, mais aussi des souris contrôles non transgéniques de la même portée.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les souris disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de “maison-abri” en carton. Nous nous efforcerons à chaque instant de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi par le personnel qualifié de l’animalerie lors des changes. A partir des traitements, les animaux seront suivis 3 à 5 fois par semaine par le responsable du projet pour suivre le comportement des animaux et la progression tumorale. Les animaux injectés par des cellules tumorales en intra-veineuse seront pesés à J0 et à J7 et J12. Tout état anormal sera transmis au responsable de projet et les mesures pour remédier à la douleur animale seront mises en place (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. En particulier, le modèle de mélanome spontané est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine. Nos données préliminaires de co-hébergement de souris,contrôles ou déficientes pour la protéine qui nous intéresse, montrent le rôle du microbiote sur la progression tumorale ce qui justifie d’identifier des bactéries pro- et anti-tumorales chez ces souris. Dans notre modèle comme chez l’homme, le traitement de référence utilisé en clinique pour traiter le mélanome cutané métastatique n’est que partiellement efficace. Nous espérons améliorer son efficacité soit en modifiant simultanément les bactéries présentes aux niveaux intestinal ou cutané, soit en l’associant un inhibiteur de notre protéine d’intérêt. Les souris contrôles et déficientes pour la portéine qui nous intéresse auront entre 6 et 10 semaines au moment de la transplantation tumorale car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet de la modulation du microbiote sur celui-ci. Les souris transgéniques que nous utilisons développent un mélanome primaire vers l’âge de 3 semaines qui métastase au niveau cutané vers 4 à 5 semaines. Les fèces seront donc prélevés sur des animaux de 15 à 20 jours, un peu avant la détection macroscopique de la tumeur primaire, dans la mesure où le microbiote influence très tôt le développement tumoral. Ces souris seront également traitées dès J14 pour étudier l’effet de la modulation du microbiote et de l’immunothérapie sur le développement tumoral. Finalement, elles seront traitées avec l’inhibiteur de notre enzyme associé ou non à l’immunothérapie soit à J14 soit à J60 pour étudier l’effet sur le développement tumoral dans des conditions prophylactique et thérapeutique.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès leur première semaine de vie elles subissent un tatouage des doigts et un prélèvement de queue, puis une injection intrapéritonéale quotidienne pendant six semaines, susceptible de provoquer une inflammation douloureuse au point d'injection. Le porteur cherche à savoir si un inhibiteur peut empêcher la disparition de cellules immunitaires de la peau privées d'autophagie. Il affirme que ces cellules changent de phénotype hors de leur tissu et qu'un animal adulte vivant est donc nécessaire, avant prélèvement de la peau et des ganglions.

Objectifs

Les cellules dendritiques (DCs) sont les sentinelles du système immunitaire, elles détectent les signaux de leur environnement et migrent jusqu’aux ganglions lymphatiques pour activer les lymphocytes T et déclencher les réponses immunitaires. Chaque organe contient des DCs, les cellules de Langerhans (LCs) étant les seules DCs de l’épiderme, la couche externe de la peau. L’autophagie est un processus de dégradation de composants du cytoplasme (réserves lipidiques, organelles endommagées…) qui permet aux cellules de mieux résister à un stress énergétique ou à une irradiation. Une activité autophagique basale est également indispensable aux cellules à durée de vie longue, capables d’auto-renouvellement. Nous avons obtenu des souris dans lesquelles une déficience en autophagie est restreinte aux LCs. Nous avons analysé la peau et les ganglions lymphatiques de souris déficientes ou non à 2 et 8 semaines. En l’absence d’autophagie, les LCs ne semblent pas affectées à 2 semaines de vie. En revanche, nous avons constaté à 8 semaines une réduction significative et pérenne de leur population, liée à l’induction de ferroptose, un processus de mort cellulaire liée à l’oxydation des réserves lipidiques dans les LCs. A présent, nous souhaitons déterminer s’il est possible de pallier les effets de l’absence d’autophagie par un inhibiteur de la ferroptose et ainsi éviter la disparition des LCs.

Bénéfices attendus

Les cellules de Langerhans (LCs), présentes dans les couches supérieures de la peau, ont un rôle essentiel dans le maintien de son intégrité et de sa fonction barrière, ainsi que dans l’initiation et le contrôle des réponses immunitaires cutanées. L’autophagie confère en outre aux LCs une capacité antivirale, en permettant l’élimination du VIH. La présence de LCs représente donc un moyen de maintenir une immunosurveillance de la peau, par exemple dans le cadre d’une radiothérapie, à laquelle les LCs sont capables de résister. Pour toutes ces raisons, le projet de recherche décrit ici apportera des connaissances nouvelles sur les LCs. Des applications thérapeutiques sont envisageables dans le traitement du cancer et des infections virales, à travers l’utilisation de modulateurs de l’autophagie ou de la ferroptose.

Procédures

Un tatouage des doigts à l’encre et un prélèvement de queue (< 1mm) pour le génotypage sont effectués sur chaque animal dans sa première semaine de vie. Le souriceau vigile sera rendu à sa mère dès la fin du prélèvement pour limiter au maximum le temps de séparation maternelle. Aucun autre prélèvement ne sera effectué. Une injection i.p. sera réalisée chaque jour pendant 6 semaines sur l’animal vigile, en alternant le côté d’injection. Ces manipulations n'exigent pas plus de quelques minutes.

Impact sur les animaux

L’inhibition de la ferroptose in vivo par la ferrostatine-1 aux doses proposées ici et par différentes voies d’administration n’a pas d’effets secondaires décrits dans la littérature, pour des traitements quotidiens d’une durée allant jusqu’à 3 semaines. Une inflammation et/ou une infection potentiellement douloureuses pourraient se développer au niveau des points d’injection intrapéritonéale de ferrostatine-1.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans les procédures seront mis à mort. Ceci est nécessaire aux analyses de tissus prévues, réalisées par immunohistochimie ou par cytométrie au niveau de suspensions cellulaires obtenues par digestion enzymatique.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant afin d’observer dans la peau et les ganglions lymphatiques les conséquences de l'absence d'autophagie sur le réseau épidermique de LCs. En outre, les LCs extraites de leur tissu d’origine changent rapidement de phénotype et ne peuvent donc être traitées in vitro.

Réduction

Plusieurs analyses pourront être réalisés simultanément à partir d’un même animal. Nos protocoles expérimentaux sont basés sur les paramètres décrits dans la littérature (ex : quantité des produits à administrer), permettant ainsi de réduire le nombre de variables testées, et donc le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux, si possible par fratrie après sevrage, dans un environnement enrichi (tubes en polycarbonate rouge translucides, frisures de carton, barre en bois à ronger, rouleaux de coton). Un relevé des températures est effectué quotidiennement dans les pièces d’élevage. La nourriture, l’eau et l’environnement de la cage sont vérifiés par le personnel compétent. Les animaux adultes sont habitués à la contention ce qui contribue à réduire le stress lié à l’injection par voie intrapéritonéale, réalisée sur animal vigile. Les animaux sont observés tous les jours afin d’évaluer leur bien-être et de détecter tout signe de douleur ou de stress, qui seront quantifiés, le cas échéant, selon le tableau des points limites (Annexe) mis au point d’après les recommandations de la Structure Chargée du Bien-Être Animal. Le score sera défini par l’addition des points attribués en fonction de l’état général de l’animal (perte de poids, comportement, apparence physique, nutrition, locomotion, aspect des fèces) et des dommages éventuels résultant de la procédure expérimentale (état des sites d’injection). Ceci permet de tenir compte d’éventuels effets secondaires directs et indirects du traitement.

Choix des espèces

Le système immunitaire et les modèles inflammatoires de la souris sont proches des pathologies humaines que nous souhaitons étudier. Outre une littérature abondante sur ces modèles, nous disposons de nombreux outils d'analyse et l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, nous permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous avons choisi de traiter les animaux dès l’âge de 2 semaines car nos expériences préliminaires ont montré que la densité du réseau épidermique de cellules de Langerhans déficientes en autophagie diminue lentement à partir de cet âge, la différence avec les animaux contrôles devenant significative à partir de 6 à 8 semaines.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection intraveineuse de cellules tumorales, une autre développe en vieillissant des plaques cutanées inflammatoires qui s'étendent si l'animal n'est pas tué, avant prélèvement d'organes. Le porteur indique étudier le rôle d'une protéine, E-Syt2, dans la surveillance immunitaire des tumeurs et l'inflammation de la peau. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire humain ne convient car les cellules concernées changent de comportement hors de leur tissu, et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

Nous avons récemment montré que la protéine E-Syt2 joue un rôle important au niveau du système immunitaire en permettant l’activation d’un facteur clé de l’inflammation. En particulier, son rôle se situe au niveau de la reconnaissance par les cellules de l’immunité de lipides. Ces lipides, lorsqu’ils sont exprimés par des cellules cancéreuses donnent lieu à leur reconnaissance et à leur destruction par un processus appelé « immunosurveillance tumorale » ayant pour but de détruire les cellules cancéreuses circulantes. Le but de ce projet est donc de déterminer si les souris déficientes pour E-Syt2 peuvent se défendre contre la présence de cellules tumorales. Si le processus d’immunosurveillance tumorale est altéré, ces souris ne pourront plus détecter les cellules cancéreuses qui se multiplieront et donneront des métastases. Par ailleurs, les souris invalidées pour E-Syt2 possèdent un phénotype dommageable au niveau de la peau lorsqu’elles vieillissent (3-6 mois) qui pourrait être du à un défaut d’activation des cellules de l’immunité reconnaissant les lipides (cette fois ci au niveau de la peau). Nous aimerions étudier le mécanisme responsable de cette anomalie.

Bénéfices attendus

Globalement, ce projet nous aidera à mieux comprendre les mécanismes immunitaires responsables de l’immunosurveillance antitumorale et de quantifier la sévérité de l’inflammation de la peau et de proposer des nouvelles thérapeutiques basées sur les connaissances acquises.

Procédures

Injection intraveineuse de cellules issues de lignées tumorales par voie intracaudale . L’injection durera environ 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Apparition d’un phénotype dommageable au niveau de la peau après 3 à 6 mois. Les lésions seront des plaques inflammatoires au niveau du dos des souris qui ne régresseront pas mais au contraire s’étendrait si la souris n’était pas rapidement mise à mort .

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront mis à mort pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Après avoir mis en évidence le fait que certains types cellulaires sont augmentés dans les souris invalidées pour la protéine que nous étudions, nous avons besoin de réaliser des tests in vivo dans notre modèle murin qui reproduit certains aspects de la pathologie humaine. Ce modèle est disponible dans notre laboratoire. Dans ce projet, il n’est pas possible d’avoir recours à un modèle cellulaire humain car nous avons besoin d’étudier les conséquences de l’absence de notre protéine d’intérêt (E-Syt2) in vivo chez la souris en étudiant l’influence des interaction cellulaires entre cellule présentatrice de lipide et cellules de l’immunité, en mesurant la productions cellulaire de médiateurs de l’inflammation (cytokines), et en analysant le phénotype des souris, c’est-à-dire les conséquences visibles de l’absence d’E-Syt2 sur la souris. 1- pour mesurer l’activation des cellules d’intérêt et leur production de cytokines in vivo et notamment, dans un organe, le thymus. 2- Pour mesurer l’activation des cellules d’intérêt par des cellules présentatrices naturelles, les macrophages péritonéaux 3- Pour quantifier la nature des lipides exprimés in vivo à la surface de ces macrophages 4- Pour effectuer des expériences in vivo permettant d’appréhender le rôle d’E-Syt2 dans le devenir de cellules tumorales. Pour étudier le rôle d’Esyt2 dans l’apparition d’un phénotype dommageable au niveau de la peau que nous avons observé chez les souris KO vieillissantes

Réduction

Il s’agit de terminer un projet pour lequel nous avons déjà accumulé beaucoup de résultats. 80 souris seront utilisées. Pour le calcul de puissance des analyses statistiques envisagées, nous avons supposé un effet cage de 15%. Les effectifs proposés devraient permettre d’obtenir des résultats significatifs pour des tailles d’effet supérieur à 0.58 (effets forts à très forts contre 0.44 sans effet cage devraient être suffisant. 2 types de cellules tumorales seront inoculées (expérience), 4 âges ou temps post-inoculation seront utilsiés (« groupe »), 2 cages par groupe (« répétitions ») et 5 souris par cage soit 2x4x2x5= 80.Les souris seront des 2 sexes sans discrimination.

Raffinement

Les prélèvements seront réalisés sur des souris recevant une dose létale d’anesthésique (pour les prélèvements de macrophages péritonéaux) ou euthanasiés par dislocation cervicale pour éviter tout l’inconfort, douleur ou détresse occasionnée par le prélèvement d’organes. A la fin de l’experience, la dislocation cervicale sera réalisée aussi sur le souris qui ont reçu une dose lethale d’anesthesie. Pour les expériences nécessitant l’injection de cellules tumorales, les souris seront surveillées de façon journalière, mises à mort aux dates indiquées sur le schéma ou avant si les points limites précoces (diminution de la prise de nourriture, déshydratation, diminution de la locomotion, respiration laborieuse) que nous avons établi sont atteints. Les souris injectées seront placées dans des cages à part dans l’animalerie d’expérimentation sans aucune restriction. Les souris susceptibles de présenter un phénotype dommageable seront examinées toutes les semaines et euthanasiées dès l’apparition du phénotype dommageable qui se manifeste par des lésions psoriasiformes au niveau de la peau très inflammatoires.

Choix des espèces

Les modèles animaux doivent, de manière idéale, refléter tout ou la majorité des caractéristiques de la maladie observée chez l’homme. Dans ce contexte, les souris de laboratoire partagent des nombreuses propriétés avec celles des êtres humains. Plusieurs études utilisant des souris ont déjà permis une nette avancée des connaissances dans le cancer et dans la physiopathologie des maladies inflammatoires cutanées. Les résultats issus de ce projet nous permettront d’obtenir des nouvelles pistes sur les mécanismes humains impliqués dans la sévérité de maladies comme le psoriasis et de proposer des nouvelles approches thérapeutiques. Tous les animaux utilisés seront adultes (3-6 mois) pour les animaux destinés aux biopsies cutanées étant donné que le phénotype cutané se manifeste très tardivement et 6 semaines pour les animaux qui seront mis à mort pour obtenir leur thymus (le thymus involue avec l’âge) ou leurs macrophages péritonéaux. Les souris destinées à l’injection de cellules tumorales auront 6 semaines au moment de l’injection.

2 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vivants vers d'autres laboratoires et les autres tués. Chaque animal subit sous anesthésie une ablation des glandes surrénales de 30 minutes, puis son eau de boisson est remplacée par du sérum physiologique pour compenser la chute de sodium. Le porteur indique une douleur chirurgicale et post-opératoire, une hyponatrémie et une déshydratation. Ce projet prépare à la demande des rongeurs sans glandes surrénales, décrits comme "préparés en vue de leur utilisation", pour d'autres projets de recherche.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but d'avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats et souris (environs 400/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale (hormones de stress, hormones minéralocorticoides, glucocorticoides et androgènes) intervenant dans la régulation du métabolisme, de la pression artérielle ...

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une ablation des glandes surrénales, pour une durée maximale de 30 minutes. Après la chirurgie et durant toute la vie de l'animal, l'eau de boisson sera intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, également l'hyponatrémie (baisse de sodium dans l'organisme) et la deshydratation.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés, les autres seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins adaptés et l'eau de boisson intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie, afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres systèmes métaboliques proches de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connue ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.

390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.

Remplacement

La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie à l'isoflurane, elles reçoivent des injections sous-cutanées dans les flancs ou intradermiques dans les oreilles de fragments de cellules sénescentes, puis sont tuées au dioxyde de carbone à 24, 48, 72 ou 168 heures pour prélever ganglions et sites d'injection. Le porteur n'attend qu'une réaction locale, rougeur ou gonflement, sans réponse systémique. Il affirme que cette réponse impliquant plusieurs organes est impossible à étudier in vitro et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

Dans notre groupe nous étudions la sénescence cellulaire. La sénescence est une destinée cellulaire. Elle se caractérise, entre autres, par la sécrétion de molécules spécifiques et un arrêt permanant du cycle cellulaire en réponse à des stimuli dommageables. De multiples études ont montré que les cellules sénescentes sont à l'origine du vieillissement et des maladies liées à l'âge, mais le mécanisme d’action reste inconnu. Une autre caractéristique observée dans les tissus vieillissants est l'inflammation chronique de bas bruit appelée inlamm’aging, de la contraction d’inflammation et âge. Lors de nos études, nous avons récemment découvert une nouvelle caractéristique de la sénescence que nous avons nommée fragmentation. Les cellules sénescentes génèrent des fragments et comme leur nom l’indique il s’agit de petits bouts qui se détachent des cellules. L’intégrité des fragments est maintenue jusqu’à trois jours après leur formation, après quoi ils se rompent et relarguent leur contenu. Leur rôle est pour le moment inconnu et nous cherchons à le comprendre. L’analyse du contenu des fragments a révélé la présence d’une grande majorité de molécules liées à l’inflammation. Les fragments sont donc potentiellement une source d’inflamm’aging et ils ne sont pas encore décrits dans la littérature scientifique. L’objectif principal de notre projet est de tester la capacité de ces fragments de cellules sénescentes à induire de l’inflammation ou en d’autres termes leur capacité à activer le système immunitaire. Dans cette expérience pilote, nous cherchons à trouver les conditions optimales pour mesurer l'effet des fragments sur l'activation de la réponse immunitaire locale dans un modèle de souris. Pour cela, nous isolerons des fragments et ferons des injections sous-cutanée ou intradermique des fragments et des contrôles appropriés. Nous évaluerons la réponse inflammatoire liée à ces injections à 4 temps différents et en utilisant des techniques communément utilisées en laboratoire telles que l’immunomarquage fluorescent (IF), l’analyse de cytométrie de flux (FACS) et la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). La meilleure méthode sera sélectionnée pour de futures études des mécanismes des effets pro-inflammatoires des fragments sénescents.

Bénéfices attendus

La senescence est, entre autres, liée aux mécanismes de réparation tissulaire, au vieillissement et aux maladies liées à l’âge. Ce projet va nous permettre d’établir un modèle optimal d’étude des effets immunomodulateurs des fragments produits par les cellules sénescentes. En manipulant ce modèle nous pourront évaluer le caractère et l’intensité de la réponse immunitaire aux fragments. Ce modèle nous servira également à caractériser les mécanismes d’action des fragments et leurs interactions avec les cellules immunitaires.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections sous-cutanées ou intradermiques. Elles seront, au préalable, anesthésiées par inhalation d'isoflurane. La moitié d’entre elles sera soumise à une injection sous-cutanée dans chacun des flancs dorsaux (soit deux injections par souris) _ une injection de fragments d’un côté et une injection d’un contrôle de l’autre. L’autre moitié sera soumise à une injection intradermique dans chacune des oreilles (soit deux injections par souris) _ une injection de fragments d’un côté et une injection d’un contrôle de l’autre. La durée totale de la procédure est estimée à 10 minutes par animal. Aux temps suivants : 24h, 48h, 72h et 168h ; des groupes d’animaux de chaque condition expérimentale seront euthanasiés par exposition à des doses croissante de dioxyde de carbone et les tissus d’intérêts (sites d’injection, ganglions lymphatiques adéquats) seront disséqués pour les analyses ultérieures.

Impact sur les animaux

L’injection de fragments ou cellules syngéniques, c’est-à-dire génétiquement identique à la souris injectée, ne devrait pas déclencher de réponse immunitaire systémique. Au pire, il pourrait y avoir une réponse, locale et limitée, caractérisée par de l’infiltration des cellules immunitaires et de l’inflammation locale. Les effets secondaires qui seraient éventuellement liés à la piqure, tels que des rougeurs, gonflements ou automutilations au niveau du site d’injection seront surveillés pendant les trois jours suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à des moments bien précis selon un protocol autorisé, afin d'isoler les ganglions lymphatiques et le site d'injection pour des analyses supplémetaires.

Remplacement

La réponse du système immunitaire à la présence de fragments produits par les cellules sénescentes implique des interactions complexes entre différents organes et différents types cellulaires. Cette réponse complexe est impossible à étudier avec des modèles cellulaires in-vitro. Pour bien comprendre la dynamique de cette réponse immunitaire et les types cellulaires en jeu, l’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable.

Réduction

Du fait de l’activation de la réponse immunitaire au niveau local uniquement, nous pouvons appliquer l’échantillon à tester et l’échantillon contrôle sur une même souris, réduisant ainsi de moitié le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Ainsi l’utilisation de 10 souris par conditions devrait être suffisante pour obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les souris seront regroupées à plusieurs par cage afin de préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement de milieu. Les injections sous-cutanées et intradermiques se feront sous anesthésie gazeuse. Du gel ophtalmique sera appliqué durant tout le temps de l’anesthésie pour prévenir le dessèchement de la cornée. Après l’injection l’animal sera placé dans une cage chauffée à 37°C et surveillé jusqu’au réveil complet. D’une manière générale, l’état de la souris (apparence générale, comportement, posture, mouvements) sera surveillé durant toute la durée du protocole. Si un animal venait à présenter des signes de détresse, il serait soigné et retiré de l’étude. Dans un cas plus sévère, l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

Les systèmes immunitaires humain et murin présentent des similitudes, en termes d’immunité innée et acquise, qui rendent l’utilisation de la souris très appropriée pour cette étude. De plus les molécules des DAMP et leurs récepteurs sont très similaires entre la souris et l’humain. De même, les cellules murines et humaines sénescent de la même manière. Les animaux seront utilisés dès l'âge de 8 -12 semaines pour étudier la réponse immunitaire aux fragments sénescents à l'âge adulte. Nous avons choisi cette tranche d'âge, car à ce stade, le système immunitaire inné et adaptatif est suffisamment mature.