Système immunitaire

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un inducteur chimique de tumeurs une fois par semaine pendant six semaines et des inoculations bactériennes par voie oro-gastrique, avec une perte de poids attendue dans les derniers mois. Le porteur étudie comment la co-infection par Helicobacter pylori et Escherichia coli favorise le cancer gastrique et colorectal, et affirme que seul un "organisme entier" permet d'étudier cette réponse. Les souris atteignant 20 % de perte de poids ou des signes de souffrance seront mises à mort avant le terme.

Objectifs

Environ 18% des cancers sont causés par un agent infectieux, dont la bactérie Helicobacter pylori, responsable de l’infection chronique la plus répandue dans la population mondiale. H. pylori est reconnue comme le facteur de risque majeur du cancer gastrique (CG), souvent associé à un mauvais pronostic. H. pylori pourrait aussi être impliquée dans le développement du cancer colorectal (CCR), tout comme des souches pathogènes de la bactérie Escherichia coli. Un évènement important dans la genèse de ces cancers, est la dysbiose du microbiote gastrique et intestinal, respectivement observée chez les patients atteints de CG et de CCR, et confirmée dans le modèle animal murin. Comment la co-habitation de différentes bactéries dans le même hôte peut influencer leur potentiel pathogène respectif, est la question principale à laquelle se propose de répondre ce projet. Notre hypothèse est que H. pylori et E. coli pourraient favoriser des mécanismes oncogènes communs, exacerbés par leur co-habitation dans le même hôte et impactant leur pathogenèse respective. Basé sur le développement du modèle souris de co-infection, H. pylori-E. coli, les objectifs de ce projet sont : - D’analyser si la sévérité des lésions inflammatoires gastriques induites par H. pylori peut être modulée par la présence de E. coli dans le compartiment intestinal et inversement. - De déterminer si ces mécanismes sont associés à des effets locaux ou systémiques. - De définir si les mécanismes impliqués dans les processus de tumorigenèse sont communs aux deux infections. Les évènements d’instabilités génétiques et de régulation épigénétique jouent un rôle essentiel dans la promotion des mécanismes de tumorigenèse. Ainsi, une fois établi le modèle de co-infection chez la souris et combinant différentes approches, les conséquences de la présence de ces deux bactéries seront analysées sur les mécanismes de régulation à l’origine d’un développement tumoral, dont la méthylation de l’ADN et son impact sur la réponse globale de l’hôte à ces conditions d’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine du développement des cancers gastrique et colorectaux induit par H. pylori et E.coli pathogène. D’autre part, peu de chose sont connues sur l’impact réel de la co-infection par ces deux pathogènes dans l’initiation et/ou promotion de la tumorigenèse. De plus ces données peuvent aboutir à des stratégies de dépistage et/ou prévention du développement du cancer gastrique ou colorectal ou nous permettre d’identifier certaines cibles thérapeutiques.

Procédures

- Injections intra-péritonéales (30 secondes) d’inducteur de tumeurs une fois par semaine pendant 6 semaines ou d’inhibiteur pharmacologique trois fois par semaine pendant 1 mois (fréquence sur l’ensemble de la procédure = 1 fois ou 2 fois avec intervalle de 2 mois ou fois avec intervalle de 2 mois). - Inoculations de suspensions bactériennes ou de streptomycine par voie oro-gastrique 2 fois toutes les deux semaines à 2 reprises espacées de 24 heures (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiellement attendus sont modérés. Ils sont attendus durant la période de traitement par l’inducteur de tumeurs pendant 6 semaines sous forme de baisse de mobilité dans les 48h suivant l’injection IP, comme cela a été rapporté pour la lignée murine particulièrement sensible A/J. Nous ne savons pas si ces effets seront observés pour les C57BL/6, ils ne sont pas rapportés dans la littérature. Durant la progression du protocole, il est envisageable que les groupes recevant une double-infection, et pour lesquels nous anticipons une accélération ou aggravation des lésions pré-tumorales, présentent une perte de poids modérée dans la dernière phase de l’essai (6 à 9 mois post-infection).

Devenir

La mise à mort des souris à la fin de l'expérience est indispensable pour nous permettre de prélever l'estomac et donc de quantifier les bactéries H. pylori qui ont colonisé cet organe. D’autres organes seront également prélevés pour analyses histologiques et moléculaires qui sont indispensables pour le but final de l’étude qui est d’évaluer la carcinogenèse.

Remplacement

Seul un modèle in vivo permet de répondre aux questions complexes soulevées par ce projet, i.e. étudier la réponse d’un organisme entier à une infection ou une co-infection via la mobilisation de son système immunitaire et les conséquences sur les mécanismes de tumorigenèse. Dans le cas de l’infection par H. pylori, le modèle souris permet de récapituler l’ensemble de la cascade d’évènements décrits en pathologie humaine, allant de la gastrite chronique aux lésions pré-cancéreuses que sont les dysplasies gastriques. La réponse immunitaire observée chez la souris reflète parfaitement celle observée chez l’Homme. De même, la souris est une espèce de choix pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive à l’infection par ce pathogène opportuniste sans nécessité de manipulations génétiques ou de modification du statut immunitaire des animaux. De plus la littérature concernant ces infections est abondante et les modèles expérimentaux bien établis, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en limitant le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, l’utilisation du modèle souris se justifie parfaitement car il remplit la condition essentielle de reproduire plusieurs aspects des pathologies observées chez l’Homme. D’autre part, l’utilisation d’un carcinogène est nécessaire pour diminuer les temps d’expérience. Dans ce contexte, le modèle murin de carcinogenèse AOM-induit est parfaitement adapté.

Réduction

Dans nos expériences, le nombre d’animaux par groupe test est calculé au plus juste pour être statistiquement significatif en utilisant des modèles hiérarchiques (ou modèles à effets mixtes). Ce projet comprend trois procédures qui s'articulent sur un nombre de 16 animaux par groupe. Ce nombre est similaire à certaines études du même type et il est proche des estimations que réalisées par notre statisticien (pour des tailles d'effets proches de 1). Les effectifs proposés semblent donc dimensionnés par rapport aux objectifs du projet. Le succès d'infection par animal rentre également en considération. L’ensemble des organes d’intérêt sera prélevé à l’issue des différentes expériences, de fait les animaux ne pourront pas être réutilisés. Les fèces seront prélevées longitudinalement (toutes les deux semaines) et conservés congelés en vue d’étude futures visant à définir les dysbioses associées aux infections et au développement de la pathologie sans avoir à reprogrammer des expériences similaires.

Raffinement

Les faibles doses d’inducteur de tumeurs utilisées engendreront des effets néfastes modérés sur les souris. Nous serons vigilants en particulier au cours des 6 semaines de traitement par l’inducteur de tumeurs afin de prévenir au plus tôt tout signe évident de détérioration de l’état général des animaux. Des hydrogels seront mis à disposition des animaux. Nous utiliserons une feuille d'observation : tout animal présentant des signes de souffrance, tels que l'apparence du poil affectée ou un changement de leur comportement, sera noté selon une grille et mis à mort si son état le nécessite ou en cas de perte de poids >20%. En référence à notre expertise de ces modèles murins d’infection, l’observation des animaux infectés par chaque bactérie en absence d’inducteur de tumeurs ne montre aucune modification de comportement ou physique qui pourrait indiquer une quelconque souffrance. Chacune des bactéries n’induit pas de signes digestifs tels que la diarrhée après administration. Si la procédure 1 indique que la co-infection permet d’observer une synergie dans le développement pathologique sans adjonction d’inducteur de tumeurs, les procédures 2 et 3 seront menées sans inducteur de tumeurs, ce qui réduira les nuisances et améliorera le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nos deux laboratoires ont une longue expérience du modèle souris d’infection par H. pylori ou par E. coli et nous possédons des souches adaptées à la colonisation des souris. De plus, dans le cadre de notre étude, le modèle murin est adapté car il reproduit de nombreux aspects des pathologies humaines étudiées. Nous utilisons des souris C57BL/ 6, mâles, âgées au début de l’expérience de 4 à 6 semaines. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 6 semaines). Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée et leur système immunitaire est mature.

10 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés en vie à l'issue. Huit reçoivent une perfusion intraveineuse de 15 à 30 minutes sous contention manuelle prolongée, suivie de prélèvements de sang répétés pendant 28 jours, deux autres restant en réserve. Le porteur compare deux formulations d'un composé test et affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang "au niveau de l'organisme entier", d'où le recours "indispensable" à l'animal. Les points limites prévoient l'exclusion de tout chat montrant agressivité, troubles de l'équilibre ou douleur aux sites de prélèvement.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont: - de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un élément test mis en solution sous deux formulations différentes aprés une simple administration intraveineuse (perfusion de 15-30 minutes) et de les comparer entre elles. - de vérifier certains paramètres hématologiques pour évaluer la pharmacodynamie de l'élément test.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l'élément test présent dans deux formulations différentes. Et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, impact sur la pharmacodynamie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration des formulation test par voie intraveineuse. 1 seule administration / animal Durée: 15-30 minutes Des prélèvements sanguins seront réalisés: 1 ou 2 prélèvements par jour maximum. Volume de sang prélevé entre 2 et 2.5 mL. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute. prélèvement aura lieu avant administration, 2 prélèvements le jour de l'administration, puis 1 prélèvement par jour pendant 3 jours puis 1 prélèvement par semaine jusqu'à 28 jours aprés administration.

Impact sur les animaux

L'administration de l'élément test est une administration intraveineuse par perfusion de 15 à 30 min. Cela va necessité une contention longue dans la durée pour l'animal. La contention sera manuelle. Durant la phase d'acclimatation les animaux auront une péride d'entrainement pour s'habituer à cette durée de contention. La manipulation des animaux se fera par un personnel formé.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

10 animaux seront inclus dans ce projet. 8 animaux seront administrés et 2 animaux seront des animaux de réserve si besoin.Si les 2 animaux de réserve ne sont pas utilisés, ils pourront retourner dans le stock. Les 8 animaux administrés seront répartis en 2 groupes de 4 animaux. Chaque groupe recevra une formulation test. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 (2 males et 2 femelles par groupe). De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Les points limites spécifiques de ce projet sont: - Un comportement agressif de l'animal au cours de la perfusion - Problèmes de comportement général (mouvements anormaux, perte d'équilibre, prostration) - Douleurs importantes au niveau des sites de prélèvements. Si un des points limites est atteint l'animal sera exclu du projet. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude. Adulte, age supérieur à 1 an. Poids d'animaux compris entre 2.5 et 6 Kg.

4 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la listériose, par gavage ou injection intraveineuse, puis pesées quotidiennement, certaines recevant du tamoxifène ou des anticorps, et peuvent développer diarrhées et infections d'organes dont le cerveau. Le porteur situe le projet dans la recherche fondamentale sur les interactions entre la bactérie et son hôte, et indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité d'un "organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Listeria monocytogenes (Lm) est la bactérie responsable de la listériose, maladie humaine d'origine alimentaire. Lm peut atteindre le cerveau et induire des méningites et encéphalites, en particulier chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 %. La listériose peut aussi se traduire par une infection materno-fœtale chez les femmes enceintes, provoquant fausses-couches, accouchements prématurés ou infections néonatales. Les objectifs de ce projet sont de déterminer les rôles des facteurs bactériens et de l’hôte, y compris le microbiote intestinal, dans la listériose. L’étude de la listériose est importante pour comprendre cette pathologie, mais également pour mieux appréhender la réponse de l’hôte à un pathogène intracellulaire facultatif.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses et en particulier sur la listériose. Cette maladie tue chaque année plus de 300 personnes en France. Elle constitue donc un problème de santé publique ainsi que pour l’industrie agro-alimentaire. Elle est également un modèle précieux pour la compréhension des interactions entre une bactérie intracellulaire facultative et son hôte. Une meilleure compréhension du mécanisme de dissémination des bactéries dans l'organisme et de la réponse immunitaire mise en place est en soi importante pour l’évolution des connaissances et constitue un prérequis indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques multi-cibles innovantes et efficaces. Même si nos recherches se focalisent sur Lm, une grande partie de nos approches et résultats pourrait être étendu à l’étude d’autres pathogènes..

Procédures

1128 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), avec un ou des composants du microbiote (ou PBS en contrôle) puis, 30 jours après, à un nouveau gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes, pathogène pour l’homme et l’animal. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement, et les fèces prélevés (durée d’environ 2 minutes dans une boîte individuelle). 600 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 240 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 324 souris seront soumises à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces animaux recevront 10 injections de tamoxifène ou de solvant contrôle (huile d’olive) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). 5 injections avant et 5 injections après inoculation de Listeria. L’injection de tamoxifène pourra être remplacée par l’ajout de tamoxifène dans la nourriture, si ce mode de délivrance est efficace pour notre modèle. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 480 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes. Parmi ces souris, 240 recevront 3 injections d’anticorps anti-Il-10 (ou anticorps contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 2 injections avant et une injection le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 60 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 60 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces 120 souris recevront 3 injections d’inhibiteur d’EVH1 (ou contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 1 injection avant et 2 après le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. Les animaux sont susceptibles de développer des diarrhées, des infections de différents organes y compris le cerveau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude de la physiopathologie de la listériose. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité d’un organisme vivant dans son intégralité, y compris les conditions très spécifiques pour maintenir un microbiote sous conditions physiologique. Seul les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus d’infection dans sa globalité et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. Nous utilisons en parallèle des approches in vitro ou ex vivo (organoïdes) pour répondre à des questions plus spécifiques.

Réduction

Les moyennes de CFU entre les groupes seront comparées à l'aide de tests de comparaison de moyenne (ANOVA ou test non paramétrique). Les effectifs par groupe (n=5) sont associés à des tailles d'effet de 2, pour un test de comparaison de 2 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Lorsque cela est possible, les animaux sont infectés avec un mélange de souches (index de compétition), afin de comparer leur virulence au sein du même animal, ce qui permet de diminuer le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Des points limites incluant la prostration/faciès de souffrance ou Body score 1, la perte de poids>20% du poids initial, ainsi que les signes d'infection du système nerveux central (paralysie partielle) sont appliqués pour ce projet. Les animaux seront mis à mort dès qu'un de ces points limites est atteint. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).

Choix des espèces

La souris n’est pas permissive à une infection orale par Lm du fait d’une spécificité d’espèce de l’interaction entre InlA et la E-cadhérine. La lignée murine permissive à Lm, qui exprime une E-cadhérine reconnue par InlA, sera dont principalement utilisée. L’interaction InlA-E-cadhérine n’étant pas impliquée après le passage de la barrière intestinale, des souris non permissives pour cette interaction, dont des C57BL/6J, pourront être également utilisées pour des infections intraveineuses afin de tester le rôle de facteurs bactériens ou de l’hôte indépendamment de la traversée de la barrière intestinale. Différentes lignées mutantes pourront ainsi être utilisées. Le recours à ces lignées permettra d’identifier et de caractériser les processus d’interactions hôtes / bactéries de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. Selon les procédures, les animaux suivants seront utilisés : Souris adultes (âge > 7 semaines), pour lesquelles le système immunitaire est mis en place. Souris gestantes pour étudier la listériose materno-fœtale et l’infection des fœtus. Souris âgées (plus de 18 mois) pour caractériser l’augmentation de la susceptibilité à la neuro-listériose liée à l’âge et au changement de microbiote.

221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un produit allergène et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles, ainsi que des injections, pour étudier les cellules mémoires de la peau dans un modèle d'eczéma. Le porteur affirme que l'eczéma "ne génère pas de signe de douleur apparente" chez la souris. Les organes sont prélevés après la mise à mort, et il conclut que le recours à des souris transgéniques est "indispensable".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à étudier l'effet de la persistance de l’allergène sur la maintenance dans la peau d'une population de cellules immunitaire particulière, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans la peau. Les eczémas se développent suite à des contacts répétés avec un allergène de l’environnement, induisant, chez certains individus, la production de cellules spécifiques de cet allergène. Lorsque ces cellules pénètrent dans la peau , elles induisent une poussée d’eczéma et certaines d’entre elles acquièrent alors des propriétés mémoires, c’est à dire une capacité à répondre très rapidement et plus efficacement à des expositions ultérieures au même allergène. Ces cellules mémoires, récemment décrits dans la littérature, ont la capacité de persister pendant de longs mois dans la peau, sans recirculer dans les organes lymphoïdes ou le sang. Pour survivre dans le tissu, ces cellules ont besoin de capter un certain nombre de signaux présents dans leur environnement tissulaire. Toutefois, la nature de ces signaux et leur importance relative reste encore mal caractérisée à ce jour. S'appuyant sur la récente mise en évidence de la capacité des allergènes de nature chimique à persister jusqu’à 1 mois dans la peau, cette étude vise à caractériser l’impact de la persistance de l’allergène sur la biologie des cellules mémoire résidant dans la peau. Ce projet permettra une meilleure connaissance du cycle de vie de ces cellules dans la peau et s’inscrit dans un projet plus global de développement d’une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules mémoires résidant dans la peau.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 30 à 45 minutes. Les animaux pourront également être injectés (5 injections au total) avec un produit permettant d'induire sélectivement la délétion de gènes cibles. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Il est connu que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'induction de l'eczéma peut conduire les souris à se gratter mais aucun signe excessif de grattage n'a jamais été observé. Les souris seront raser sur le ventre en vigile et recevront plusieurs injections au cours de la procèdure ce qui pourra engendrer un leger stress ponctuel.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules étudiées dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisés. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que les expériences de ce projet durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Par ailleurs, la question biologique adressée dans ce projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques qui existent seulement chez la souris. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de l'expérience de l'équipe ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que pour la procédure 1, 3 souris par groupe seront suffisantes pour determiner la bonne dose de tamoxifène à injecter, et qu'afin de minimiser le nombre d'animaux, les doses les plus fortes seront utilisées uniquement si les doses les plus faibles, testées en 1er, n'ont pas été suffisantes pour obtenir l'effet attendu. Les expérimentations décrites ici indiquent donc le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux sera réalisée. Une grande importance sera donnée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Par ailleurs, la question biologique adressée dans ce projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques qui existent seulement chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou l’induction de différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules mémoires résidant dans la peau sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter les résultats de cette étude à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées, au minimum 2 semaines, au sein de l'animalerie avant d'entrer dans les protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-12 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

40 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse, puis une blessure musculaire provoquée par injection d'un agent chimique dans les deux pattes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la régénération du muscle vieillissant. L'irradiation provoque une immunodépression et une fatigue de plusieurs jours. Le tissu musculaire est prélevé après la mise à mort, et le porteur indique avoir mené en amont des essais sur cultures cellulaires.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion. Certaines cellules de l'immunité jouent un rôle important dans ce processus, comme les macrophages. Cependant, au cours du vieillissement, le processus de réparation musculaire se fait mal, en partie car les macrophages fonctionnement moins bien. Une protéine X a été montrée comme régulant l'activité des macrophages dans des modèles mimant la réparation musculaire in vitro. La validation du rôle de cette protéine dans les macrophages au cours de la régénération musculaire in vivo chez la souris âgée nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation du gène à l’origine de cette molécule. Une approche réductrice en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses âgées saines. De cette manière, seuls les macrophages sont inactivés pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire avec un agent chimique est réalisée afin de pouvoir analyser la régénération musculaire de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider le rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire dans la souris âgée.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace est altéré au cours du vieillissement. La connaissance des mécanismes moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus. L'étude permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les macrophages pour la régénération musculaire dans le sujet âgé.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - irradiation (1 fois 10 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - prélèvement sanguin (1 fois 10 minutes sous anesthésie) (pour un seul groupe de souris, 1/3) -traitement antalgique par injection sous cutanée - induction de blessure musculaire : injection dans les deux pattes d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie et analgésie).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (irradiation, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et une perte de mobilité pendant environ 4 jours, et peut entraîner chez certains individus à une perte de poids de corps jusqu'à 5 jours après l'irradiation, et qui est récupérée ensuite. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager (la douleur étant traitée par analgésique).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées en amont de ce projet. Il s'agit d’expériences de culture cellulaire in vitro, qui montrent un rôle de la molécule dans la fonction des macrophages dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. L'étude analysant les effets du vieillissement, des souris agées (24 mois) sont utilisées.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car il permet de répondre à la question et car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux. Les études précédentes ont montré qu’un nombre de 5 individus par point d’analyse est suffisant pour réaliser des statistiques. De plus, l'établissement d'une lésion aux deux pattes de chaque souris permet de réduire par deux le nombre d'animaux, sans impact sur la mobilité des animaux.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie et l'analgésie lors de l'injection de la moelle osseuse, du prélèvement sanguin et de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions prophylactiques strictes et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée trihebdomadaire, la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites ont été établis sur l'observation du comportement des animaux et leurs poids.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme sont observées au cours de la régénération musculaire. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). L'existence de lignées murines génétiquement modifiées et permettant le traçage des populations de macrophages est un argument supplémentaire pour l'utilisation de cette espèce. Les souris sont utilisées à l'âge de 22 mois car le projet concerne la régénération musculaire chez l'individu âgé.

411 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée et suivie jusqu'au développement de lymphomes, une autre reçoit une injection de cellules de lymphome puis des anticorps, avant la mise à mort pour étudier le rôle du gène Jarid2. Le porteur indique que les lymphomes provoquent de gros ganglions et une augmentation de la rate et du foie, la mise à mort intervenant à la palpation d'une hépatosplénomégalie ou à 20 % de perte de poids. Il affirme que ce cancer exige un microenvironnement complet et que les modèles génétiques ne sont disponibles que chez la souris.

Objectifs

Il a été décrit ces dernières années une nouvelle entité de lymphome, à la fois chez la souris et chez l'homme, dont la cellule d'origine est un lymphocyte T non conventionnelle appelé lymphocyte NKT. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ce cancer, des études du génome c'est à dire au niveau de l'ADN, ont été réalisées sur les lymphomes générés chez la souris et ont mis en évidence des altérations du gène Jarid2. Ce gène est particulièrement intéressant car son implication dans la biologie des lymphocytes NKT normaux a déjà été décrit. Ces résultats suggèrent que ce gène pourrait jouer un rôle essentiel dans les mécanismes à l'origine de ce cancer. L'objectif de ce projet est donc d'étudier chez la souris l'impact de l'invalidation du gène Jarid2 sur la survenue de ces cancers et d'identifier de potentielles voies thérapeutiques qui pourront être testées dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires associés à ces lymphomes sont encore mal connus et la mise en évidence d'un gène responsable de ce cancer peut constituer une nouvelle approche thérapeutique pour des patients dont la survie à 5 ans ne dépasse actuellement pas 30% et pour lequel les solutions thérapeutiques sont mimines.

Procédures

Génération d'une nouvelle lignée par croisement de souris avec différentes modifications génétiques puis observation des souris afin de mettre en évidence le dévelopement de rares lymphomes. Injection unique de cellules de lymphome par voie intraveineuse après anesthésie (durée de quelques secondes). Injections répétées d'anticorps 1 jour sur deux pendant 2 semaines par voie intrapéritonéale (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables seront associés au développement de tumeur et en particulier de lymphome qui se caractèrisent par des adénopathies (gros ganglions) ou des hépato-splénomégalie (grosse rate, gros foie). Cependant, les nuisances de ces souris seront modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris dès les premiers signes de souffrance. Suite aux transferts de lymphomes aux souris C57BL/6, celles-ci vont développer assez rapidement (de 30 à 60 jours post-transfert) des lymphomes NKT. Les nuisances seront alors modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris au premier signe de souffrance. L'injection des cellules de lymphomes préalablement congelées dans des souris receveuses syngéniques C57BL/6 n'entrainera qu'une nuisance légère. L'injection des anticorps bloquants anti-ICOS se fera sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale et n'entrainera qu'une nuisance légère.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort soit parce qu'elles développent une pathologie soit en raison d'un vieillissement avancé. Pour les expériences de transfert de lymphome, toutes les souris seront mises à mort car elles auront toutes été transférées avec des cellules de lymphome NKT et développeront donc toutes une lymphome.

Remplacement

Les objectifs du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement des lymphomes NKT nécessite la présence d’un microenvironnement qui joue un rôle clef dans le développement et le maintien du lymphome. Aussi les invalidations génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris, justifiant le développement de ces modèles chez la souris.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : 1- mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem en congelant le maximum de cellules et de morceaux d'organes afin que ceux-ci soient exploités pour diverses études in vitro sur ces lymphomes et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. 2- effectuer une étude statistique descriptive qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur associée aux lymphomes, des points limites prédictifs pour limiter les souffrances seront mise en place. La mise à mort sera pratiquée lorsque l'un des points limites suivants sera atteint : mise en évidence d'une hépatosplénomégalie par palpation de l'abdomen des souris, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Dans le cadre des premiers travaux, la plupart des souris ne développeront pas de lymphome et un grand nombre d'entre elles vont entrer dans un processus de vieillissement avancé. Au delà de 15 mois, ces souris seront donc surveillées 3 fois par semaine avec prise de poids et prise de température. Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, placer les souris dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale de choix pour étudier l'impact de l'invalidation d'un gène sur le développement de lymphome. En effet, nous disposons chez cette espèce des souris pour lesquelles le gène Jarid2 a été invalidé. D'autre part, le modèle de lymphome étudié a été développé chez la souris p53KO et le croisement de ces souris p53KO avec les souris invalidées par Jarid2 permettra de comprendre le rôle de ce gène dans le développement de ce cancer. Les souris seront générées par croisement au sein de notre établissement utilisateur et seront suivis jusqu'à la mise à mort des souris lorsque les points limites seront atteints. Pour les expériences de transfert, les souris receveuses seront commandées à l'âge de 6 à 7 semaines et seront utilisées à l'âge de 8 à 12 semaines correspondant à l'âge adulte de ces souris. L'utilisation de souris adultes est justifiée par le besoin d'avoir des souris receveuses ayant un système immunitaire mature.