Système immunitaire
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Superovulation pour collecte d’embryons chez la truie à des fins de conservation de la ressource génétique d’une lignée de porcs développant des mélanomes qui régressent
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 truies vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections hormonales de superovulation puis une insémination, avant d'être transportées à l'abattoir pour collecter leurs embryons, la lignée de porcs devant disparaître avec la fermeture de l'installation. Le porteur indique un stress et une douleur possibles liés aux injections et au transport en fin de gestation. Il présente la congélation d'embryons comme la seule méthode permettant de régénérer en une génération cette lignée développant des mélanomes, décrite comme une "ressource génétique" à sauvegarder.
Objectifs
L’objectif du projet est de conserver une lignée de porcs développant des mélanomes (cancer de la peau) en congelant des embryons. En effet, cette lignée ne pourra plus être maintenue sur pieds après la fermeture de l’installation expérimentale porcine dans laquelle les animaux sont actuellement hébergés. Cette lignée pigmentée développe spontanément des mélanomes cutanés autour de la naissance. Les mélanomes sont des tumeurs malignes qui se développent à partir d’un type de cellules de la peau et qui correspondent à la forme la plus agressive des cancers cutanés chez l’humain. Dans ce modèle animal, les tumeurs régressent à partir du 2ème ou 3ème mois avec une dépigmentation variable et progressive. A partir de 3 mois, les tumeurs ont régressé, et la croissance des animaux va se poursuivre, en bonne santé et ils pourront se reproduire normalement. La régression tumorale, suivie souvent par la dépigmentation de la robe et des yeux, indique le rôle de la réaction immunitaire contre les cellules mélanocytaires, à l’origine de la pigmentation de la peau mais aussi des mélanomes. Le système immunitaire de cette lignée est donc très performant dans le combat contre le cancer cutané et les métastases. Des études génétiques, cliniques et histologiques ont montré que ces mélanomes présentent des caractéristiques très similaires aux mélanomes humains faisant de ces animaux un modèle translationnel d’intérêt pour la médecine humaine. Ainsi cette lignée est un modèle original très intéressant pour la recherche contre le cancer. Afin de sauvegarder cette ressource génétique originale pour des travaux qui pourraient être entrepris à l’avenir, l’utilisation de la technique de production d’embryons à partir de truies donneuses et leur conservation par la technique de congélation rapide a été retenue. Cette lignée de porcs est une lignée peu prolifique avec une taille variable des portées. Un traitement hormonal sera administré aux truies donneuses avant l’insémination artificielle afin de produire un maximum d’embryons.
Bénéfices attendus
L’installation expérimentale qui héberge ce modèle biomédical porcin va fermer définitivement. La sauvegarde de cette lignée est fondamentale car c’est une ressource génétique originale qui permet de comprendre les mécanismes impliqués lors de la régression spontanée des mélanomes par le système immunitaire. Ainsi, cette régression complète des mélanomes permet aux animaux de continuer à vivre en bonne santé. En médecine humaine, les immunothérapies ne sauvent que 20% des personnes traitées pour des cancers de la peau, et induisent des effets secondaires sévères. Ce modèle animal reste donc d’un intérêt majeur pour élucider les mécanismes immunitaires permettant la régression complète des mélanomes. Sauvegarder les embryons de cette lignée est en effet nécessaire pour conserver le patrimoine génétique et permettre de futurs projets scientifiques. La congélation d’embryons présente plusieurs avantages par rapport à la conservation de sperme. En effet, chez le porc la congélation de semence n’est pas une procédure aussi efficace que chez les autres espèces. Le taux de succès de l’insémination artificielle à partir de semence congelée est inférieur à 50%. De plus, la qualité de la semence des reproducteurs de cette lignée n’est pas très bonne ce qui diminue encore le succès de l’insémination. L’inconvénient majeur de la conservation de semence uniquement est que cette semence devra être utilisée pour inséminer des truies d’une autre race porcine. Ainsi, les caractéristiques génétiques de cette lignée ne seront retrouvées qu’après plusieurs générations de croisements consanguins (au moins 3 générations, soit 3 ans). La congélation rapide d’embryons et leur réimplantation chez des truies receveuses permettra d’obtenir des porcelets portant 100% des caractéristiques génétiques attendues. C’est la seule méthode qui permettra de produire à nouveau des porcs développant des mélanomes en une génération et avec le maximum de diversité génétique.
Procédures
Dans ce projet, après synchronisation du cycle ovarien par la ration alimentaire du matin sur 18 jours, cinq truies vigiles seront traitées avec deux injections de superovulation (à jour 1 et jour 4 de la procédure) puis inséminées à jour 5.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être le stress et la douleur liées aux injections. Le fournisseur des médicaments indique que comme avec toutes les spécialités contenant des protéines, des réactions de type allergiques peuvent se produire. Un traitement serait instauré rapidement dans ce cas. En termes de bien-être, et spécifiquement de risque d’avortement, le transport est considéré comme à risque en fin de gestation mais pas avant l’implantation des embryons. Un stress des truies lié au transport est aussi possible.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés à cause de la fermeture de l’installation expérimentale qui les héberge et les embryons seront collectés pour conservation.
Remplacement
L’obtention et la conservation d’embryons réalisées dans ce projet est une alternative à la conservation sur pieds dans une installation expérimentale. Après ce projet, l’installation expérimentale sera fermée. Il n’y a pas de méthode alternative de remplacement pour produire des embryons en nombre suffisant pour pouvoir régénérer la lignée dans le futur après décongélation et réimplantation dans une truie porteuse.
Réduction
L’utilisation de la procédure de superovulation permet de maximiser le nombre d’embryons par truie. Chez la truie de production, plus de 30 embryons sont collectés par donneuse. La fertilité (taux de gestation après transfert) oscillant entre 40 et 70%, ce dispositif permet de produire une portée par truie prélevée. Ces données ne sont pas connues dans la lignée de porc utilisée qui fait des portées de 5-6 porcelets en moyenne. La congélation rapide d’embryons permettra d’obtenir en une génération des porcs avec toutes les caractéristiques génétiques recherchées. Cette méthode permettra aussi surtout d’utiliser moins d’animaux par la suite pour retrouver la lignée par rapport à la congélation de sperme. Nous utiliserons les 5 truies qui restent dans l’élevage avant euthanasie pour cause de fermeture de l’installation.
Raffinement
Les truies ont été entraînées à la présence des soigneurs et interagissent régulièrement aux simples contacts ou caresses. Ces interactions de nature positive favorisent la relation par une absence de peur et une forte confiance en l’humain, caractéristiques du bien-être animal. Les soigneurs, qui connaissent très bien leurs animaux, sont très réactifs si un animal montre des signes de gêne quelconque. Les animaux sont élevés dans des loges aux surfaces réglementaires, sur sciure et avec des enrichissements comme des chaînes, des cordages, et autres jouets en plastique ou caoutchouc à mâchouiller qui sont renouvelés régulièrement. Les cinq truies utilisées dans ce projet n’ont pas eu de complication ni lors du développement des mélanomes ni lors des précédentes gestations et mise-bas. Les injections seront réalisées par des agents formés et habitués à réaliser ce type de manipulation. Au jour 11 de la procédure, le transport à l’abattoir d’une durée de 1.5-2h sera effectué par un transporteur agréé. De la paille sera déposée sur le sol de de la bétaillère pour stimuler le fouissage des animaux et limiter leur stress pendant le transport.
Choix des espèces
L’objectif du projet étant la conservation d’une lignée de porcs, le projet concerne spécifiquement l’espèce porcine. Les animaux utilisés sont adultes, donc en âge d’ovuler.
Validation de la chimio-attraction des lymphocytes T CD8 déficients pour NLRP3 dans un modèle de tumeurs pulmonaires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de cellules qui induisent des tumeurs pulmonaires, puis des chimiothérapies, avant d'être tuées à J13 ou J17 pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que l'injection provoque un stress lié à la contention et une douleur de faible intensité, et affirme s'appuyer sur plus de dix ans d'expérience du modèle. Il conclut que le recrutement des globules blancs au site tumoral ne peut s'appréhender in vitro et doit être confirmé dans un "organisme entier".
Objectifs
NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie
Procédures
Les injections de cellules seront réalisées en iv sur souris vigiles (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en ip sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Impact sur les animaux
Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).
Devenir
Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons
Remplacement
Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.
Réduction
Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.
Caractérisation du mécanisme et du rôle de la fixation dans le cycle de vie d’une bactérie commensale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 432
1 344 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par gavage une bactérie commensale de l'intestin, puis des prélèvements de fèces, avant une mise à mort pour prélever leurs tissus intestinaux, aucun ne pouvant être réutilisé en raison du risque de contamination. Le porteur étudie comment cette bactérie s'attache à l'intestin et stimule l'immunité, en vue d'une plateforme de vaccins et d'un probiotique, des applications renvoyées au long terme. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas les interactions d'un organisme complexe et retient le modèle murin.
Objectifs
La Bactérie Filamenteuse Segmentée (SFB, segmented filamentous bacteria) est une bactérie commensale commune de l'intestin. Contrairement à la plupart des autres commensaux, qui résident généralement dans la lumière intestinale, SFB se fixe intimement aux cellules de l’intestin d'une manière spécifique de l'espèce. En raison de cet attachement, SFB stimule puissamment le système immunitaire de l'hôte. Comme l'attachement à l’intestin est une étape clé de son potentiel de stimulation immunitaire, nous visons à mieux comprendre cette partie du cycle de vie en analysant les détails structurels et moléculaires de SFB lorsqu'il est cultivé dans un hôte où il peut se fixer et dans un hôte où il lui est impossible de s'attacher. Il y a deux objectifs principaux à ce projet : 1. Mise en évidence des caractéristiques structurelles de SFB dans des conditions d'attachement et de non-attachement. Les différences structurelles fourniront des informations importantes sur la manière dont SFB peut interagir avec son hôte. 2. Comprendre comment la motilité et la reconnaissance de ses composants par le système immunitaire inné peuvent impacter le potentiel immunostimulateur de SFB.
Bénéfices attendus
La compréhension de l’attachement de SFB à son hôte aura des conséquences translationnelles directes. En effet, ces connaissances nous permettrons de modifier la spécificité d’hôte et d’utiliser SFB de souris chez l’homme pour concevoir une nouvelle plate-forme d'administration de vaccins. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre l'impact de la colonisation du SFB sur d'autres commensaux et pathogènes intestinaux. En effet, nous pensons que SFB a co-évolué avec son hôte afin d’obtenir de l'énergie en échange d'une résistance à la colonisation : SFB façonne la composition du microbiote et en même temps renforce la barrière intestinale et les défenses immunitaires. Ces connaissances constituent la base d'une application translationnelle de SFB pour à la fois améliorer la santé intestinale à l'avenir en tant que probiotique et comme outil de vaccination. Il est important de savoir comment des facteurs bactériens et des facteurs de l'hôte sont impliqués dans le puissant potentiel immunostimulant de SFB. Ces données nous amènerons à comprendre comment SFB est capable de modifier l'environnement immunitaire homéostatique chez l'hôte pour à la fois le protéger mais aussi exacerber des phénotypes pathogéniques. Ce n'est qu'avec une meilleure idée des détails moléculaires de ces mécanismes que des études thérapeutiques pourrons être conçues pour stimuler ou entraver les effets immunologiques de SFB sur l'hôte.
Procédures
Lors de la première procédure, les animaux subiront une inoculation de SFB par gavage (introduction d’une suspension bactérienne concentrée dans l'estomac à l'aide d'une sonde gastrique) au jour 0, ce qui prend environ 1 minute. Au début et au fin de l’expérience (8, 14 ou 21 jours) des prélèvements de fèces seront réalisés sur animaux vigiles, ce qui prend environ 5 minutes. Lors de la deuxième procédure, les mères souris subiront une inoculation de SFB par gavage et sur leur ventre avec une solution bactérienne concentrée au jour 0 (2 semaines après la naissance de ses petits). Des fèces seront prélevés sur les souris mères vigiles à J0 (semaine 2 des nouveau-nés) de la procédure et une ou deux semaines après en fonction du point final. Un prélèvement de fèces prend environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La colonisation par les SFB est sans complication chez l’animal. Le seul risque est lié au gavage qui peut provoquer l’introduction de liquide dans les poumons de l'animal. Pour s'assurer du bien-être des animaux, ils seront surveillés pendant 10 minutes après la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car le risque de contamination par transferts répétés de souris est trop important. A l’issue de la première procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les SFB intestinaux pour analyse. A l’issue de la deuxième procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les tissus intestinaux pour analyse.
Remplacement
SFB est une espèce commensale spécifique qui se cultive très difficilement, ce qui limite l’utilisation de système in vitro. Notre laboratoire a réussi à mettre au point un protocole de culture in vitro pour les SFB. Cependant cette technique est difficile et limitée dans le temps, et ne nous permet pas de modéliser fidèlement les interactions microbiennes pouvant avoir lieu dans un organisme complexe tel que l’Homme. Afin de pouvoir atteindre nos différents objectifs, nous devons donc utiliser des organismes tels que le rongeur pour reproduire le plus fidèlement possible les interactions multiples observés chez l’Homme. Par ailleurs, pour comprendre l’interaction complexe entre l'hôte et les SFB, des modèles de souris in vivo génétiquement modifiés sont nécessaires pour l’étude tissulaire du système immunitaire. L'utilisation de rats est nécessaire pour pouvoir étudier SFB dans des conditions in vivo où il s'attache et ne s'attache pas afin de décrypter les facteurs impliqués dans l'attachement Lors de nos différentes procédures expérimentales nous utiliserons un modèle animal qui nous permettra d’observer et d’étudier les différentes réactions immunitaires induites par les SFB dans un organisme ayant un système immunitaire mature et pouvant être contrôlé. Ce modèle animal nous permettra également d’étudier et de caractériser les interactions physiques et moléculaires des SFB avec leur hôte, notamment au niveau de l’épithélium intestinal. Ce modèle nous permettra également d’étudier la réponse immunitaire induite par les SFB chez des hôtes ayant des caractéristiques immunitaires et tissulaires différentes. Cela nous permettra d’étudier plus précisément les différents mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une colonisation bactérienne.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction dans la conception de nos expérimentations, limité au maximum le nombre de procédure expérimentale tout en permettant d’atteindre nos objectifs, chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre un des objectifs spécifiques précédemment cités. Nous nous sommes assurés de la non redondance de nos expérimentations afin d’exclure toute répétition d’étude antérieures. Ainsi nous garantissons lors de notre projet l’obtention de résultats originaux. Nous nous attachons à partager et réutiliser les tissus et prélèvements pour des analyses multiples. Afin de garantir l’obtention de résultat concluant tout en utilisant le moins d’animaux possible, chaque expérimentation a fait l’objet d’une réflexion approfondie en amont. Nous avons fait appel à un biostatisticien afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire tout en nous permettant d’atteindre nos objectifs scientifiques. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu. Nos protocoles expérimentaux sont parfaitement au point pour limiter au maximum la variabilité technique.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les souris et les rats seront hébergées dans des cages correctement alimentées en nourriture et en eau pour garantir leurs besoins physiologiques. Pour garantir les besoins comportementaux de base des souris, les cages seront enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les souris et les rats seront hébergées en groupe. Si cela est justifié par le comportement agressif ou pour permettre la récupération d’une souris après une manipulation technique, une souris pourra être isolée pour une durée ne dépassant pas 3 semaines. Un complément alimentaire pourra être rajouté pour accélérer la récupération de la souris. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par des personnels compétents et limité au maximum dans le temps. Dans ce projet, nous ne nous attendons pas à avoir d’altération du bien-être des animaux. Toutefois, le bien-être des animaux sera évalué avec une grille de score et si à un moment quelconque de l'expérience, nous observons que l'animal a un score clinique de 2 ou plus, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser nos expérimentations sur des modèles murins. Ces modèles présentent plusieurs avantages. D’un point de vue technique l’utilisation d’un modèle murin nous permet d’utiliser des infrastructures déjà existantes et respectant la législation en termes d’expérimentation animale. La reproduction et la maturation rapide du modèle murin nous permettra de rapidement obtenir des individus pour nos expérimentations. De plus, le modèle murin nous permet de bénéficier d’un nombre important de modèle génétiquement modifié et humanisé nous permettant de mener à bien nos investigations scientifiques. D’un point de vue anatomique le modèle murin présente de grandes similitudes avec l’Homme. Ces similitudes nous permettrons de modéliser le plus fidèlement les mécanismes observer chez l’Homme et fond du modèle murins un modèle idéal pour l’étude des interactions hôte-microbiote. L'utilisation de rats est nécessaire dans un contexte très limité pour pouvoir traiter l'adhérence spécifique à l'espèce de SFB, ce qui n'est pas possible en utilisant un autre système modèle. Pour la première et deuxième procédure, des souris et des rats mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisés. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris et des rats adultes dont le système immunitaire est pleinement développé. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage sont plus faciles à réaliser chez les souris et les rats adultes. Pour la troisième procédure, nous visons à déterminer l'activation immunitaire induite par SFB chez les jeunes souris avant et après le sevrage. Pour cela, nous avons conçu notre procédure pour minimiser la détresse des animaux. Nous ne ferons donc un gavage à la mère que la deuxième semaine après la mise bas et répandrons également la bactérie sur le ventre de la mère souris pour faciliter la transmission aux petits. Nous avons choisi de ne pas nourrir de force les jeunes souris (dans leur deuxième semaine d'âge) mais plutôt de les nourrir d'une petite quantité de solution bactérienne sans aucune procédure invasive pour maximiser le succès de la colonisation et de la reproductibilité.
Prélèvement de globules blancs circulants canins pour mise au point d’un produit de thérapie cellulaire ciblée
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
15 chiens vont être utilisés, réutilisés dans la suite du projet ou proposés à l'adoption plutôt que tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins et une cytaphérèse de deux à trois heures sous anesthésie générale pour recueillir des globules blancs. Le porteur met au point la production de cellules CAR-T canines en vue de traiter la fibrose de la myopathie de Duchenne chez le chien malade. Il affirme que le prélèvement de lymphocytes T ne peut se faire que chez un individu vivant.
Objectifs
En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T(=sous-population de globule blanc) avec récepteur antigénique chimérique). Les globules blancs du patient sont isolés par cytaphérèse (procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple), puis modifiés en culture pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. Avant d'entamer une étude thérapeutique chez des chiens malades, il est nécessaire de réaliser une phase de mise au point pour maîtriser la production ex vivo des cellules CAR-T canines. Ce projet a donc pour objectif de prélever des globules blancs circulants chez des chiens afin de les mettre en culture et mettre au point la technique permettant de les manipuler génétiquement pour en faire des cellules CAR-T.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point la manipulation ex vivo des globules blancs canins nécessaire à la production de cellules CAR-T dirigées contre la protéine spécifique de la fibrose. Cela permettra de démarrer les études de tolérance et d'efficacité avec une bonne maîtrise et standardisation de ces étapes cruciales.
Procédures
- Prélèvements sanguins 50 mL (3 maximum par chien de plus de 20 kg, espacés d'au moins 3 semaines), sur chien vigile. Durée totale 10 minutes, 1 minute pour le prélèvement proprement dit. - Prélèvement de globules blancs (1 fois) par cytaphérèse, sur chien placé sous anesthésie générale. Durée 2-3 heures.
Impact sur les animaux
Au cours des deux procédures, les animaux pourront subir un stress, lié à la contention et à la ponction sur chien vigile pour la première procédure, et à l'anesthésie générale pour la seconde. Tout sera mis en oeuvre pour réduire ce stress, en travaillant avec douceur, en rassurant les chiens par la voix et les caresses. Les chiens seront manipulés uniquement par des personnes qu'ils connaissent bien. Ils recevront une friandise à la fin du prélèvement réalisé vigile. Par ailleurs, s'agissant dans les deux procédures de ponctions veineuses, la formation d'un hématome pouvant générer une douleur n'est pas exclue. Une vigilance sera portée à la bonne coagulation, mais si un hématome se formait, le chien se verrait prescrire des anti-inflammatoires non stéroïdiens durant 3 jours après le prélèvement. Durant la cytaphérèse, le citrate introduit par la machine comme anticoagulant, et réinjecté au chien après passage du sang dans le circuit, peut avoir un effet hypocalcémiant (chute de la quantité de calcium dans le sang). Ce point sera surveillé attentivement par des dosages à intervalles réguliers. Une perfusion de gluconate de calcium sera systématiquement mise en place, et son débit ajusté à la concentration sanguine en calcium.
Devenir
Les chiens pourront être réutilisés dans la suite du projet. Dans le cas contraire, ils seront proposés à l'adoption.
Remplacement
Afin de travailler in vitro sur des lymphocytes T de chiens, il est nécessaire de pouvoir les prélever chez un individu vivant. L'utilisation d'animaux dans ce contexte ne peut donc être évitée.
Réduction
Le nombre de chiens prélevés, que ce soit par prélèvement de sang classique ou par cytaphérèse sera réduit le plus possible. Pour ce faire, chaque prélèvement réalisé sera exploité le plus possible in vitro afin de limiter le nombre de prélèvements nécessaires pour la mise au point technique prévue. Il est très probable qu'il ne sera pas nécessaire d'utiliser les 15 animaux prévus dans ce projet.
Raffinement
Les prélèvements par cytaphérèse seront réalisés sous anesthésie générale afin de limiter le stress généré par ce prélèvement non douloureux mais long (2-3 heures). Au cours des deux procédures, une attention particulière sera portée à la coagulation correcte après le prélèvement. En cas d'hématome, celui-ci pouvant générer une douleur, une analgésie (anti-inflammatoires non stéroïdiens) sera mise en place après le prélèvement. Au cours des prélèvements par cytaphérèse, l'anticoagulant utilisé pouvant avoir un effet de diminution de la concentration sanguine en calcium, cette concentration (calcémie) sera étroitement surveillée, et le chien sera complémenté par une perfusion continue de calcium, dont le débit sera adapté en fonction de la calcémie. Si un chien avait une valeur de calcémie basse en fin de cytaphérèse, l'anesthésie générale ne serait stoppée qu'après retour à une calcémie normale. Les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.
Choix des espèces
L'étape préclinique de validation de l'efficacité du produit thérapeutique en développement est prévue chez le chien. La mise au point de la production des cellules CAR-T dans ce contexte ne peut donc se faire que dans l'espèce canine. Nous utiliserons des animaux adultes, afin que leur poids corporel soit supérieur à 20 kg, et donc compatible avec un prélèvement sanguin volumineux et une cytaphérèse.
Évaluation de l’efficacité de nouveaux outils thérapeutiques sur le développement de pathologies inflammatoires ostéoarticulaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à induire une arthrite psoriasique, une arthrite rhumatoïde ou une spondylarthrite, avec inflammation des orteils et des pattes suivie par scoring pendant plusieurs semaines, des traitements par gavage ou injection et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque. Le porteur teste de nouveaux traitements anti-inflammatoires, les pathologies induites étant irréversibles. Il indique n'utiliser les animaux qu'après des tests in vitro et ex vivo.
Objectifs
Les maladies inflammatoires ostéo-articulaires sont parmi les pathologies douloureuses et invalidantes les plus courantes et les plus répandues dans le monde, dont la prévalence devrait augmenter principalement en raison de l'augmentation de l'espérance de vie. Ces pathologies sont le plus souvent difficiles à repérer, mais peuvent avoir des répercussions sur l’état psychologique des personnes affectées par les douleurs chroniques qu’elles engendrent, et à plus long terme sur la vie professionnelle. On estime que 25 % des personnes atteintes d’ostéoarthrite sont incapables d'accomplir leurs activités quotidiennes. De plus en plus de preuves indiquent maintenant que l'inflammation, locale et systémique, est à l'origine de dommages aux articulations et aux os. Le projet décrit dans cette demande consiste au développement de modèles pathologiques chez le petit animal de laboratoire (souris) afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’efficacité thérapeutique de cellules médicaments ou de nouvelles molécules (études de PK/PD) dans le domaine des maladies inflammatoires ostéo-articulaires telles que l’arthrite psoriasique, l’arthrite rhumatoïde et la spondylarthrite ankylosantes. L’objectif sera de valider leurs propriétés immunomodulatrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques afin de les proposer comme nouvelles modalités de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.
Bénéfices attendus
Faire émerger de nouveaux outils de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.
Procédures
L’induction du modèle d’arthrite psoriasique nécessite une injection intrapéritonéale de mannan. Cette induction entrainera une inflammation de la peau et des articulations évaluée quotidiennement par scoring pendant 7 jours. L’induction du modèle d’arthrite rhumatoïde nécessite l’injection intradermique d’une émulsion de collagène. Cette induction entrainera une inflammation des orteils et des pattes entières évaluée tous les 3 à 4 jours par scoring pendant 40 à 50 jours. L’induction du modèle de spondylarthrite ankylosante nécessite 3 injections intrapéritonéale de protéoglycane (la première réalisée sur des animaux de 12 semaines, puis 3 et 6 semaines plus tard. Cette induction entrainera une inflammation des orteils et des pattes entières évaluée deux fois par semaine par scoring de l’œdème et de la douleur pendant 20 jours. Les traitements évalués pour lutter contre l’inflammation seront administrés soit par voie orale (gavage), soit par voie sous cutanée au niveau de la nuque, soit par voie intraveineuse (veine caudale), soit par voie intrapéritonéale, soit par voie topique. Des prélèvements sanguins de 50µl seront également effectués une fois par semaine maximum avant et pendant les phases de traitement. Un dernier prélèvement, terminal, sera réalisé en fin de protocole par ponction cardiaque juste avant mise à mort, sans réveil. Chaque procédure d’administration étant pratiquée par du personnel formé, chaque geste ne prendra que quelques secondes. Pour les protocoles d’imagerie (Tomographie moléculaire de fluorescence, Tomodensitométrie et Tomographie par émission de positons) les animaux subissent une injection intraveineuse (animal vigile pour la fluorescence, anesthésié dans les autres cas) avant imagerie sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Le psoriasis est une maladie auto-immune entraînant une inflammation chronique de la peau qui, lorsqu'elle s'étend dans les articulations, résulte en arthrite psoriasique. Le modèle induit permet de reproduire des lésions semblables à celles observées chez l'Homme (inflammation et hyper prolifération cutanées avec atteintes articulaires). L'inflammation de la peau pourra se traduire par un épaississement des oreilles et de la desquamation. L'inflammation articulaire pourra entrainer un gonflement des orteils, chevilles ou des articulations.
Devenir
Les pathologies induites dans le cadre de cette étude étant irréversibles, les animaux seront tous mis à mort en fin de procédures expérimentales (prélèvement sanguin trans-thoracique terminal).
Remplacement
L’utilisation des animaux ne se fera qu’en dernier recours après des tests préalables de criblage et d’efficacité in vitro et ex vivo.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé en mesures répétées, le nombre d'animaux est réduit à 8 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats des études réalisées. L'utilisation de l'imagerie permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés grâce au suivi longitudinal du même animal.
Raffinement
L’enrichissement du milieu d’hébergement sera contrôlé. Une évaluation quotidienne du bien-être animal sera réalisée selon une grille de scores spécifiques, établie selon des paramètres physiologiques (prise de poids, hydratation par exemple) mais également selon des critères décrivant de façon précise l’apparence physique et le comportement général de chaque animal. Ainsi, l’ensemble de ces observations permet d’intervenir au plus tôt dans la prise de décision de la poursuite du protocole pour un animal donné, cela avant même d’atteindre les points limites pré-établis et fixés par la procédure.
Choix des espèces
La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme un modèle fondamental dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation et les pathologies associées, l’essentiel de la littérature est obtenue chez cette espèce pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~7-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction d’une inflammation menant au développement de maladies ostéo-articulaires chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.
Exploration du rôle du système nerveux périphérique sensitif dans des modèles murins de pathologies inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour que les neurones de la perception de la douleur puissent être supprimés, et d'autres subissent cette suppression par un traitement dès l'âge de trois ou quatre semaines. 1 808 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des pattes, de la moelle épinière et des ganglions rachidiens. Elles développent une arthrite ou une forme de sclérose en plaques provoquée par l'équipe, sans que le résumé décrive comment, et reçoivent jusqu'à 21 injections quotidiennes de TAFA4. La sclérose induite paralyse leurs membres arrière. Le porteur écrit qu'"aucun analgésique ne peut être utilisé" sans compromettre ses résultats, et promet dans le même texte un "soin particulier" pour éviter la souffrance.
Objectifs
De nombreuses études suggèrent que les neurones impliqués dans la perception de la douleur jouent un rôle important dans le développement des maladies inflammatoires. Notre projet a pour objectif de déterminer le rôle de ces neurones sur l’évolution de deux maladies inflammatoires : la polyarthrite rhumatoïde, causant une inflammation des articulations et la sclérose en plaque, causant une inflammation de la moelle épinière. Un objectif secondaire de ce projet sera également d’étudier le potentiel thérapeutique d’une molécule aux propriétés anti-inflammatoires.
Bénéfices attendus
A ce jour, peu d’études décrivent comment les neurones impliqués dans la perception de la douleur influencent l’apparition et l’évolution des maladies inflammatoires. Notre projet permettra donc à la fois de mieux comprendre comment ces neurones influencent ces maladies inflammatoires et permettra également d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques dans ces maladies chroniques, très invalidantes et nécessitantes de nouvelles thérapies.
Procédures
Outre l’induction de l’arthrite et du modèle de sclérose en plaque qui sont l’objet de notre étude, les animaux vont subir des injections quotidiennes de traitement. La durée de l'intervention (contention + injection intra péritonéale) est de moins d'environ 45 secondes par animal. Les injections de TAFA4 pourront durer jusqu'à 21 jours (une injection par jour soit 21 injections).
Impact sur les animaux
Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne peut être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Notre modèle de sclérose en plaque induit une paralysie des membres inférieurs entrainant une difficulté à accéder aux croquettes. Une nourriture gélifiée sera ajoutée systématiquement lors pour prévenir la dénutrition des souris.
Devenir
mise à mort des animaux à la fin des procédure. En effet, pour cette étude nous avons besoin de prélèver différents organes (pattes, moelle épinière, ganglions rachidiens) pour analyser leur composition immunitaire, le score histologique etc.. afin de comprendre les mécanismes de ces pathologies. Les prélèvements nécessitent une euthansie de l'animal.
Remplacement
Nous proposons que les neurones responsables du ressenti de la douleur joue un rôle dans le développement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde et sclérose en plaque. Seuls les modèles animaux mimant la complexité du système nerveux périphérique ainsi que de la réponse inflammatoire permettront de vérifier cette hypothèse. Ces interactions ne peuvent à ce jour pas être modélisées ni in vitro ni in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l’interaction neurone/cellule immunitaire nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques de remplacement.
Réduction
Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d’arthrite a été choisi et optimisé afin d’obtenir une incidence proche de 100% et une variabilité minimale, permettant ainsi de réduire au minimum le nombre de souris nécessaire. Le modèle de sclérose en plaque est quant à lui le seul modèle murin mimant la pathologie humaine. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé nous avons modélisé les tests statistiques en amont de nos expériences pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à chacune de nos hypothèses de travail.
Raffinement
Stratégie de réduction du stress : Pour réduire l’angoisse des animaux, un temps d’acclimatation d’au moins une semaine sera respecté avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons de souris en dôme de cellulose et fournies pour l'enrichissement environnemental. Les souris sont nourries et boivent ad libitum, et sont libres de leur déplacement. Stratégie de réduction du la souffrance : Une surveillance quotidienne est réalisée par des spécialistes animaliers permettant de subvenir aux besoins nécessaires au bien-être des animaux. Un soin particulier sera apporté pour éviter la souffrance des animaux par la surveillance de signes extérieurs de souffrance. L’atteinte d’un point limite entrainera la décision d’euthanasie de l’animal concerné. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage des animaux souffrant de sclérose en plaque pour assurer une alimentation suffisante.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude dû au haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état des connaissances actuelles, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de reproduction court. En particulier, la génération de souris génétiquement modifiées bien maitrisée dans notre laboratoire dans lesquelles les neurones sujets de notre étude peuvent être déplétés font de la souris un modèle non remplaçable. Des souris d’âge minimum de 6 semaines seront utilisées afin d’avoir un système immunitaire et sensitif mature. Pour les expériences utilisant une déplétion pharmacoloqique de ces neurones, nous utiliserons des souris âgées de 3-4 semaines. En effet, l’injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d’obtenir une déplétion optimale. La sclérose en plaque et l’arthrite seront ensuite induites à partir de 6 et 8 semaines, respectivement.
Cibler le microbiote intestinal pour améliorer les réponses vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime gras et sucré, du dextran sulfate provoquant une inflammation intestinale, huit gavages et des injections d'ovalbumine, avec prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur cherche des probiotiques améliorant la réponse aux vaccins, un bénéfice formulé comme une perspective. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour étudier l'influence du microbiote sur l'immunité.
Objectifs
La récente pandémie a démontré l’importance de l’utilisation de la vaccination lorsqu'elle est disponible. Elle a aussi mis en lumière l’une des problématiques majeures des vaccins qui est celle de leur efficacité. Cette efficacité est moindre chez les sujets âgés, immuno-déprimés, atteints de pathologies chroniques (notamment les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin). Elle peut être évaluée par plusieurs paramètres, en particulier la proportion de sujets répondeurs, l’intensité et la qualité de la réponse chez le sujet vacciné, la durabilité de cette réponse protectrice, et enfin le spectre d’efficacité du vaccin. Les microbiotes au sens large, et notamment le microbiote intestinal sont connu pour jouer un rôle primordial dans la régulation du système immunitaire. Ce microbiote peut être modulé par l’utilisation de probiotiques, de prébiotiques ou de postbiotiques. En comparaison avec les probiotiques que l’on doit administrer vivants, l’option pré- ou postbiotique présente un intérêt pratique en vue d’une utilisation possible chez l’homme. Nous chercherons donc à identifier un ou des candidats probiotiques permettant de renforcer la réponse vaccinale en condition de microbiote altéré. Nous testerons ensuite si ce candidat est également efficace en contexte de microbiote sain. Nous déterminerons si l’utilisation d’un lysat ou d’un surnageant de ce probiotique récapitule les résultats obtenus avec le micro-organisme vivant, dans l’objectif de travailler sur un postbiotique dérivé de ce microorganisme. Les objectifs expérimentaux de cette étude sont les suivants : 1/ Valider notre modèle d’immunisation chez la souris et démontrer l’importance du microbiote intestinal dans ce modèle, choisir un ou plusieurs modèles de microbiote altéré pour la suite de l’étude. 2/ Dans un modèle de microbiote altéré, cribler dix candidats probiotiques susceptibles de renforcer la réponse à la vaccination, sélectionnés d’après la littérature et notre expérience. 3/ Vérifier si le ou les candidat(s) efficace(s) dans un modèle de microbiote altéré le sont aussi lorsque le microbiote est normal. 4/ Comparer l’efficacité du ou des candidat(s) retenu(s) avec celle de leur forme lysée et de leur surnageant de culture en contexte de microbiote sain ou altéré, et déterminer si un apport conjoint de prébiotiques peut optimiser l’efficacité du ou des candidat(s) retenu(s).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des candidats probiotiques permettant d’améliorer la réponse vaccinale et d’envisager déjà l’utilisation de pré ou post-biotiques dérivés de ces candidats.
Procédures
Prise d’alimentation riche en graisse et en sucres (en continu). Administration dans le biberon de dextran sulfate sodium, de bactéries, de fibres fermentescibles (en continu). Administration intragastrique à l'aide d'une sonde adaptée (8 gavages + éventuellement gavage bi-quotidien de paracétamol si un animal est souffrant). Injection intramusculaire d’ovalbumine purifiée ou de sérum physiologique (trois injections). Prélèvement sanguin sous anesthésie (trois prélèvements).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir des contentions (stress), des gavages intragastriques (stress, éventuellement douleur légère), des injections intramusculaires sous anesthésie (douleur légère) et des prélèvements sanguins sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (douleur légère, possibilité d'anémie légère transitoire). Le traitement au dextran sulfate sodium et le traitement antibiotique peuvent provoquer une légère inflammation intestinale associée à une perte de poids n'excédant pas 10% du poids corporel. L’alimentation riche en graisse et en sucres ne nuira pas à leur santé ou à leur bien-être sur la durée courte de l’expérience.
Devenir
La mise à mort de ces animaux est nécessaire pour les prélèvements post-mortem envisagés.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier la réponse immunitaire de l’hôte suite à la vaccination, et encore moins pour étudier l’influence du microbiote intestinal sur ce phénomène : le microbiote influence les réponses immunitaires à distance, par des mécanismes multiples et encore mal caractérisés.
Réduction
La bibliographie montre une hétérogénéité inter-individuelle dans les réponses à l’immunisation. C’est pourquoi nous prévoyons 10 animaux par lot, ce nombre est nécessaire pour garantir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par lot (prévu à 10) sera éventuellement revu à la baisse (6 à 8 par lot), en fonction des données de variabilité inter-individuelles obtenues lors des permiers essais d'immunisation. De plus, en fonction des résultats, le projet peut soit s’arrêter rapidement (si aucun traitement n’impacte la réponse anticorps) soit être poursuivi mais pas forcément avec les trois modèles de déstabilisation du microbiote : il est probable qu'un voir deux de ces traitements ne soient finalement pas utilisables. Enfin, les expériences ne seront répétées que sur les candidats probiotiques donnant des résultats significatifs : nous avons considéré qu’au mieux, trois candidats seraient intéressants, ce qui nous semble déjà optimiste. Chaque fois que possible, le prélèvement sanguin avant immunisation servira de contrôle, évitant ainsi de réaliser un lot d'animaux non-immunisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages ventilées dans le respect de la réglementation et auront libre accès à l’eau et à la nourriture. Une période d’acclimatation de 7 jours sera réalisée avant le début de l’expérimentation. Les conditions d’hébergement sont les conditions standard. Un enrichissement est proposé aux souris : tube/cachette en polycarbonate teinté rouge préalablement lavé et stérilisé. Il est à noter qu’il n’y a aucune raison objective pour laquelle les animaux pourraient se trouver en état de souffrance suite aux procédures proposées dans ce projet. Toutefois, dans la mesure où le modèle d’immunisation n’est pas encore établi au laboratoire, une attention particulière sera apportée à l’évaluation quotidienne du bien-être de chaque animal par des personnels formés, à partir d’une grille d’évaluation pré-établie. En fonction de ce score individuel de bien-être et de son évolution, l’animal sera isolé, la surveillance sera adaptée et le traitement de l’animal par des antalgiques (paracétamol) sera envisagé. Si un animal dépasse ce score limite, il sera alors euthanasié.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est lié à 3 paramètres essentiels : - disponibilité des outils moléculaires et expertise technique du laboratoire pour cette espèce ; - importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire et le lien avec le microbiote sur ce modèle; - utilisation des modèles de déstabilisation du microbiote établis au laboratoire. Les expérimentations débuteront sur des animaux âgés de 5 semaines (4 semaines + 1 semaine d’acclimatation). L’immunisation interviendra à l’âge de 8 semaines. L’expérience prendra fin 5 semaines plus tard.
CREATION DE LIGNEES AVEC VIEILLISSEMENT ACCELEREE DANS LE FOIE
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur crée par croisements quatre lignées porteuses de mutations du vieillissement, avec coupe du bout de la queue puis prélèvement de sang et perfusion du foie sous anesthésie avant mise à mort. Il décrit pourtant des atteintes lourdes attendues des délétions génétiques, réduction de poids, infertilité, atrophie et durée de vie parfois réduite à quelques mois, ce qui contraste avec la gravité légère déclarée. Il affirme "être obligé" de créer ces lignées faute de modèle in vitro du foie vieillissant.
Objectifs
Le vieillissement de la population mondiale est un problème majeur de santé publique. Le vieillissement est associé à un déclin de la fonction d'un certain nombre d’organes, ce qui contribue à un risque accru de développement de maladies liées à l'âge. Il est décrit chez la personne âgée une augmentation du passage des bactéries de l’intestin vers le sang responsable ainsi d’une inflammation générale dans le corps, inflammation qui est impliqué dans de nombreuses pathologies liées à l’âge dont les maladies chroniques du foie et les infections. Le foie reçoit le sang passant par le système digestif, et participe activement au contrôle de l’inflammation et à l’immunité grâce aux cellules immunitaire résidentes mais aussi aux cellules endothéliales du foie (cellules qui bordent les vaisseaux sanguins présents dans le foie), qui ont des fonctions immunitaires et anti-inflammatoires. Le vieillissement hépatique, qui a été montré comme touchant particulièrement les cellules endothéliales du foie, pourrait participer à l’inflammation générale et au développement de maladie liées à l’âge. Afin de diminuer au maximum la durée de l’expérimentation (4 à 6 mois au lieu de 24 mois) et d’étudier l’impact du vieillissement uniquement de certaines cellules du foie sur tout l’organisme, nous souhaitons créer des souris qui aient un vieillissement accéléré seulement dans les cellules endothéliales du foie et dans les hépatocytes. Notre projet est de créer ces lignées et de vérifier qu’elles ne présentent pas de phénotype ayant un impact sur le bien-être des souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont de créer 4 lignées murines qui auront un phénotype de vieillissement accélérée seulement dans le foie et non dans tout l’organisme. Ainsi par la suite, nous pourrons étudier l’effet de ce vieillissement spécifique sur le développement et la lutte aux infections et élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Nous allons créer 4 lignées murines par croisement d’animaux sur plusieurs mois et plusieurs générations. Nous allons suivre la croissance des souris. A la naissance, les animaux seront identifiés par un tatouage ou une puce (durée 2min). Un petit morceau du bout de la queue des souris sera coupé (durée 1 min). Tout au long de la vie de la souris (maximum 6 mois), les animaux seront observés afin de déterminer si elles ont un phénotype qui peut avoir un effet sur le bien-être animal. Aucun geste invasif ne sera réalisé. Au bout de 6 mois, les souris seront anesthésiées et un prélèvement de sang sera effectué avant l’euthanasie de la souris (cela durera 10min). En ce qui concerne la chirurgie afin d’isoler les cellules endothéliales et les hépatocytes, les souris seront anesthésiées et recevront une injection d’analgésique. La souris sera euthanasiée en perfusant son foie à l’aide d’une solution afin de récupérer les cellules pour les étudier (cela durera 20min).
Impact sur les animaux
Les délétions totales des gènes SIRT6 et TERT provoquent des malformations chez les souris. Pour la délétion totale de TERT, les souris semblent en bonne santé pour les premières générations puis montrent une réduction du poids corporal et de la masse graisseuse sans réduction de prise alimentaire, infertile après 4 générations, déclin fonctionnel de certains organes (intestin, système immunitaire) et une atrophie croissante. (Margaret A. Strong – Mol Cell Biol – 2011) Pour la délétion totale de SIRT6, les paramètres différents selon le background (souche) de la souris utilisée : 129/SvJ ou 129/SvJ/BALB/c : les souris vivent en moyenne de 30 à 300 jours à cause : d’une absence de graisse sous-cutanée, d’une mortalité prénatal importante, de problème intestinal, de problème du système immunitaire et d’ostéoporose (Raul Mostoslavsky –Cell – 2006 ; Victoria Peshti – Plos One -2017). Par contre, il est possible que comme la mutation sera restreinte à un seul type cellulaire, aucun effet indésirable ne soit observé.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de vérifier: * le phénotype dommageable (effet sur le bien-être de l'animal) sur les organes; * la délétion des gènes dans les cellules intérêts et leur phénotype vieillissant. Après euthanasie, nous préléverons les organes (foie, rein, coeur, poumon ...) afin de les analyser et de regarder si les organes sont en bonne santé, ou si la mutation les a modifié ce qui peut avoir un effet ou non sur le bien-être de l'animal.
Remplacement
Nous souhaitons étudier l’impact du vieillissement du foie sur l’ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui impactent les personnes agées qui plus sensible que les personnes jeunes (infection à certains virus : COVID; grippe... ou à des bactéries : E. Coli...). Des expériences in vitro seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. Par contre, pour regarder l’effet du foie sur les injections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal, et c’est pourquoi nous devons créer ses 4 lignées murines.
Réduction
Nous avons suivi les recommandations pour le choix du nombre de souris par sexe afin d’étudier le phénotype dommageable (impact sur le bien-être animal). Afin de caractériser et vérifier le phénotype et le génotype du foie des souris crées, nous avons déterminer un nombre de souris selon notre expérience. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum de d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs
Raffinement
Tous les animaux qui seront utilisés dans ce projet seront surveillés de manière visuelle quotidiennement et toutes les mesures nécessaires à leur bien-être seront prises par l’enrichissement des cages (présence de maisons en plastique dans les cages, bâtonnets en bois et cotons). LLe suivi clinique des animaux se fera une fois par semaine afin de vérifier si le phénotype est dommageable ou non (ayant un impact sur le bien-être animal). Une grille de scoring a été réalisé afin de répertorier tous les aspects de l’animal et d’agir en euthanasiant l’animal si celui est en souffrance. Pour les chirurgies sans réveil (perfusion pour prévélement d'organes, du sang et des cellules du foie), nous utiliserons de l'analgésie et de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettront de mettre en évidence le rôle ou l’implication d’un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l’âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps, analyses protéomiques...) nécessaires à cette étude. S’agissant d’un projet sur le vieillissement et de l'utilisation de lignées avec vieillissement accélérée, les souris seront étudiées à 4 et 6 mois.
Evaluation de l’effet de molécules à visées thérapeutiques dans le modèle de souris autoimmune MRL/lpr
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée qui développe spontanément une maladie proche du lupus, elles subissent une lymphoprolifération, une insuffisance rénale et des lésions cutanées, puis reçoivent des prélèvements sanguins et une injection de molécules candidates sous anesthésie. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort à treize semaines au plus tard pour des analyses biochimiques, la souffrance sévère venant de la maladie que la lignée développe d'elle-même. Il affirme qu'étudier un "organisme entier" est "nécessaire", qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale et que la souris est la "meilleure et seule stratégie" disponible.
Objectifs
Le lupus érythémateux disséminé est une maladie auto-immune. Dans cette maladie, le système immunitaire qui en principe protège contre les microbes ou les substances étrangères à l'organisme, se dérègle et se retourne contre les propres cellules de l'organisme. L'inflammation chronique qui se produit dans le lupus peut virtuellement affecter de nombreux organes (articulations, peau, sang, cœur, vaisseaux sanguins, tractus gastro-intestinal, cerveau, poumons, etc.), ce qui rend ce syndrome parfois difficile à diagnostiquer et surtout à traiter. Il n'existe à ce jour aucun traitement du lupus. Les traitements disponibles ne traitent que les symptômes et pas les causes. En plus, leur administration provoque souvent des effets secondaires indésirables à moyen ou long terme (infections à répétition, troubles cardiaques, cancer). Il y a quelques années, une molécule a été découverte qui se comporte comme un puissant régulateur bénéfique de la réponse auto-immune dans le lupus. Cette molécule présente une activité protectrice chez des souris-modèles qui développent une maladie qui miment la maladie lupique. Ce candidat-médicament a montré des effets bénéfiques dans des essais cliniques chez des patients atteints de lupus. Son mécanisme d’action a été identifié au laboratoire. Ce n’est pas une molécule immunosuppressive qui réduit sans discernement toutes les réponses immunitaires. Il n’empèche pas l’organisme de développer une réponse immunitaire normale contre un pathogène, par exemple un virus. Il réduit seulement et très précisemment la réponse autoimmune. L'objectif de cette étude est d'identifier de nouvelles molécules capables, comme ce premier candidat, de modifier l'évolution de la maladie de manière bénéfique et non immunosuppressive. Ces molécules que l’on espère plus puissantes et administrables par des voies naturelles (peau, muqueuses, voie orale), sont préalablement sélectionnées dans des tests cellulaires. Leur non-toxicité cellulaire est testée avant de les injecter à des souris modèles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact scientifique et clinique pour les patients touchés par le lupus. La découverte de nouveaux moyens d'intervention thérapeutique pour traiter une maladie incurable comme le LED améliorerait considérablement la qualité de vie et la durée de vie des patients en réduisant les effets secondaires causés par les médicaments symptomatiques (non ciblés sur un mécanisme moléculaire comme dans notre cas), les seuls disponibles à l'heure actuelle.
Procédures
Les souris recrutées pour l'étude pharmacologique subiront : - deux prélèvements de sang, avant le traitement et à jour 5, sous anesthésie gazeuse (durée 3 minutes) - une unique injection du traitement contrôle ou des molécules candidates ou de NaCl sous anesthésie gazeuse (durée 3 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle murin MRL/lpr développe une maladie auto-immune ressemblant au LED en raison d'une mutation du gène lpr. Généralement après l'âge de 11-12 semaines, les souris femelles et mâles commencent à développer progressivement une lymphoprolifération, une insuffisance rénale, une lymphadénopathie et des lésions cutanées. Ces effets associés à la maladie du lupus ont un impact sur le bien-être des souris. Les effets secondaires dus au prélèvement sanguin et à l'injection intraveineuse sont exceptionnels (œdème, inflammation, rougeur).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'âge de 13 semaines maximum pour analyse biochimiques et moléculaires.
Remplacement
L'utilisation de modèles de souris dans ce projet est cruciale car l'hypothèse selon laquelle le Lupus Erythémateux Diffus est une maladie multi systémique est plus que bien établie. Afin de comprendre le rôle joué par les différents organes, tissus et compartiments de l'organisme et les mécanismes qui sous-tendent leur communication au cours de la détermination et de la progression de la maladie, il est nécessaire d'étudier un organisme entier, une étude intégrée qu’il n'est évidemment pas possible de réaliser en utilisant des systèmes cellulaires (cellules isolées en culture ou organoïdes). Parmi les modèles animaux de LED disponibles, le modèle spontané de MRL/lpr, représente le modèle le plus utilisé en raison de l'apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de nouvelles thérapies. Il n'y a pas d'alternative disponible à un modèle non-animal qui puisse répondre à nos questions. Le modèle de la souris représente la meilleure et seule stratégie actuellement disponible pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour les humains.
Réduction
Le nombre d'animaux dans le projet est estimé selon les calculs de puissance considérant la nécessité de réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d'animaux est de n=10 souris/groupe et elle a été calculée en utilisant un logiciel. Les triplicats sont envisagés pour assurer la validation statistique des données. Si les résultats sont homogènes, ou tout à fait négatifs après un duplicat, un triplicat ne sera pas effectué, ceci afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un groupe social, pendant l'accouplement (1 mâle et 2 femelles) et pendant le traitement dans un groupe (5 souris/ cage). Les cages seront enrichies avec matériaux de nidation et tubes. Nous avons défini des points critiques de souffrance pour l'animal. Toutes les opérations invasives (injections et saignées) seront réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux de LED disponibles, le modèle spontané MRL/lpr représente le modèle le plus utilisé en raison de l'apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de nouvelles thérapies. D’autres modèles existent mais ils sont beaucoup plus lents à se développer et rendent les études de tests de médicaments très allongées (1 an-1,5 an en moyenne). Les animaux pour la reproduction seront recrutés à l'âge de 6-7 semaines (maturité sexuelle). Les animaux destinés à l'essai du médicament seront recrutés à l'âge de 11-12 semaines (souris adultes). A cet âge, la maladie a débuté mais les souris ne sont pas encore à un stade où leur système immunitaire est gravement altéré.
Traitement des allergies par nébulisation d’acide gras à chaînes courtes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées de façon répétée par injection, gavage et voie nasale pour développer un asthme allergique aux acariens et une allergie alimentaire au blé, puis reçoivent des acides gras à chaînes courtes par nébulisation. Le porteur indique que le déclenchement de l'allergie provoque une chute de la température corporelle et une gêne respiratoire, et que les souris sont mises à mort pour prélever poumons, rate, ganglions et intestins. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro ou in silico, les bénéfices préventifs et thérapeutiques annoncés restant à évaluer.
Objectifs
Des études épidémiologiques ont établi des relations entre le mode de vie /environnement et l’incidence des maladies allergiques. Des données récentes ont montré́ l’association entre la survenue des allergies et la sévérité des symptômes avec des modifications de microbiote. Il est aujourd’hui clairement établi que le microbiote intestinal, contribue au développement du système immunitaire en étant impliqué dans des fonctions digestives, métaboliques et neurologiques. Le déséquilibre de l’écosystème microbien appelé́ « Dysbiose », est associé à des altérations des réponses immunitaires et au développement de maladies et en particulier des allergies ou de l'asthme. Cette dysbiose entraine non seulement un changement dans les espèces bactériennes présentes mais surtout une dérégulation de la production d’acides gras à chaines courtes (AGCC) par le microbiote. Des études ont mis en évidence qu’une concentration élevée en AGCC comme par exemple le propionate ou le butyrate était associée à une protection contre le développement des allergies et de l’asthme. Nous avons montré une diminution des niveaux d’AGCC en lien avec une aggravation des symptômes de l’asthme. De plus, l’augmentation de ce taux d’AGCC est associé à un blocage de la différentiation deslymphocytes B en régulateurs contrôlant la réponse immunitaire durant l'allergie in vitro. L'objectif de ce projet est d’étudier le rôle des AGCC comme moyen de prévention et de thérapies dans un modèle d’asthme allergique aux acariens chez la souris et dans un modèle d'allergie alimentaire au blé.
Bénéfices attendus
Les travaux réalisés antérieurement au laboratoire ont démontré un rôle majeur des AGCC dans la réponse immune et en particulier la réponse lymphocytaire B. Par ailleurs, cette réponse régule en grande partie la réponse allergique. Dans ce contexte, les bénéfices attendus de ce projet préclinique sont d’évaluer l’intérêt préventif et thérapeutique des acides gras a chaines courtes (AGCC) dans l’allergie alimentaire et l’asthme.
Procédures
Sensibilisation par voie intrapéritonéale tous les 7 jours pendant 3 semaines puis un gavage, pour l’induction de l’allergie alimentaire. ce geste dur moins d'une minute. Anesthésie gazeuse tous les 7 jours pour l’induction de l’allergie respiratoire pendant 6 semaines. Ce geste dure quelques miniutes (2 à 5 minutes). Sensibilisation sous anesthésie gazeuse percutanée à l’oreille tous les 7 jours pendant 4 semaines. Ce geste dure quelques miniutes (2 à 5 minutes). Sensibilisation nasale sous anesthésie gazeuse tous les 7 jours pendant 2 semaines. Ce geste dure quelques miniutes (2 à 5 minutes). Nébullisation des AGCC dans une chambre de plethysmographe (Chambre hermétique permettant de mesurer les variations d’air a l’intérieur et d’apprécier la respiration de la souris). Ce geste dur de 30 secondes a une minute.
Impact sur les animaux
Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge) par gavage oral, une baisse de température corporelle d'environ 30 à 45 minutes des animaux est généralement observée. Lors du déclenchement de l’allergie respiratoire (challenge) par dépôt intra-nasal, certaines souris peuvent ressentir une gêne respiratoire suite au deuxième dépôt intra nasal d'une durée de quelques minutes (>10).
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude physiologique, immunologique et la sévérité des allergies incluant poumons, rate, ganglions, femurs, intestins.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico. Notamment pour mesurer l'impact de traitement comme la nébulisation de propionate sur la fonction respiratoire, l'inflammation pulmonaire ou encore la réponse humorale. Nos travaux préliminaires ont montré une action du propionate sur la différenciation des lymphocytes B qui doivent etre confirmé et étendu in vivo.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. Ce nombre à été determiné grâce aux études précedentes et aux tests de la variance.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront herbergé dans les cages ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Les souris seront sacrifiées si trois signes cliniques notables ou un signe clinique sévère sont observés.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus nous avons débuté nos modèles sur ces femelles Balb/c. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Les femelles auront entre 6 et 10 semaines de vie, stade auquel le système immunitaire est complètement mature.
Identification du rôle d’une hormone dans la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées par injection, pour étudier le rôle d'une hormone du fer dans la maladie du greffon contre l'hôte, complication fréquente des greffes de moelle. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau, et que les souris sont mises à mort pour prélever peau, intestin et foie. Il affirme qu'il est impossible de reproduire le système immunitaire in vitro et conclut que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet, les retombées thérapeutiques restant formulées au conditionnel.
Objectifs
La greffe de moelle est un traitement majeur de nombreux cancers du sang. Dans certaines formes de leucémies aiguës notamment, il s’agit du seul traitement permettant potentiellement d’obtenir la guérison. L’efficacité de la greffe de moelle est limitée par les complications de ce traitement. En effet, dans près de 50% des cas, la greffe de moelle se complique d’une réaction immunitaire appelée maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte est caractérisée par une toxicité de certains organes : principalement la peau, le tractus gastro-intestinal et le foie. Cette complication est parfois gravissime puisqu’elle entraîne le décès du patient dans environ 15% des cas. Il s’agit de la principale cause de décès après greffe de moelle. De manière intéressante, il a été montré que la surcharge en fer chez les patients exacerbait la maladie du greffon contre l’hôte, suggérant un rôle du fer dans la pathogenèse. L’hormone clé de régulation du fer est principalement secrétée par le foie mais peut être exprimée localement dans la peau et intestin et joue un rôle majeur dans le recrutement de cellules immunitaires. Des données montrent l’expression de cette hormone dans la peau et l’intestin de patients souffrant de la maladie du greffon contre l’hôte. Le projet visera à comprendre le rôle de cette hormone et du fer dans le développement de cette maladie.
Bénéfices attendus
Dans la peau et l’intestin, l’hormone du fer pourrait avoir un rôle inflammatoire en induisant d’une part la surcharge en fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus de la GVH) mais également en recherche appliquée en proposant de cibler l’hepcidine ou le fer en thérapeutique dans cette pathologie.
Procédures
Sur animaux vigiles : - Les souris seront irradiées pendant 3 minutes 30 (quelques secondes de contention pour les placer dans les boites d’irradiation). - 3 heures après irradiation: les souris subiront une injection intraveineuse caudale (100 ul ; temps de contention de 20 secondes). - 14 jours post-greffe : prélèvement sanguin de 50 ul via la veine mandibulaire par simple contention (20 secondes) à l’aide d’une lancette. - 1 mois post-greffe : Injection sous-cutanée (100 ul Buprénorphine à 0,1mg/kg) avec une aiguille de 26G 1⁄2 (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes). 30 minutes après, sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (1 minute par souris) à 4% avec un mélange d’air, 500ul de sang sera prélevé par voie rétro-orbitale à l'aide de capillaires héparinés (Hirschmann TM).
Impact sur les animaux
L’irradiation (sans transplantation) provoque (aux cinétiques étudiées) une rougeur de la peau. La maladie du greffon contre l'hôte va induire une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau (formation « d’écailles »).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever la peau, l’intestin et le foie ainsi que le sang afin de mesurer différents paramètres biologiques.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de la maladie du greffon contre l'hôte. Les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d'obtenir un modèle pathologique proche de celui développé chez l’homme. Au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » de nombreuses cellules immunitaires sont impliquées et leurs interactions ont un rôle fondamental dans le développement de la maladie. De plus, cette réaction du greffon congre l'hôte est caractérisée par le déclenchement de symptômes, uniquement observables in vivo. Il est donc impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des études in vitro. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
La durée et la dose de traitements utilisées seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les souris sont mises sous antibiotique pour éviter tout risque d’infection. Des analgésiques et anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin et en cas de mal être. Les animaux sont en groupes sociaux et disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.
Choix des espèces
Les réactions observées au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris sont les mêmes que celles observées chez l'homme. Des souris adultes de de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude de la « maladie du greffon contre l’hôte ».
Evaluation de l’activité anti-inflammatoire de deux bactéries intestinales dans trois différents modèles murin d’inflammation cutanée
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des bactéries intestinales par gavage cinq jours sur sept pendant plusieurs semaines, et des composés appliqués sous anesthésie sur les oreilles pour provoquer une dermatite, un psoriasis ou un eczéma, avant d'être tué pour prélever les organes. Le porteur indique que le gavage répété peut irriter la trachée et faire perdre du poids, et décrit l'inflammation induite comme légère et sans grattage. Il affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire cutanée dans son ensemble.
Objectifs
Les maladies inflammatoires cutanées type dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique de contact, touche une trés forte proportion de la population (plus de 20%). Il est largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle important dans les maladies allergiques,dont la dermatite atopique et le psoriasis. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement notamment de la dermatite atopique et du psoriasis. Aussi, c'est dans ce contexte que les proprietés anti-inflammatoires de 2 bactéries intestinales seront testée dans trois modèles d'inflammation différentes chez la souris ( dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique)
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer la capacité de deux bactéries, connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires dans des modèles d’inflammation intestinales, à réguler l’inflammation cutanée de type psioriasis, eczema allerrgique de contact et dermatite atopique dans des modèles murins, et à long terme le developpement d'un nouveau traitement chez l'homme pour améliorer ces pathologies.
Procédures
Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile, pour deux tiers des animaux il sera réalisé 5 fois par semaine entre 28 et 56 jours selon la procédure (durée 30sec), le tiers des animaux restants seront gavés pendant 28 jours 5jours / 7 au début puis avec une periode de 12 jours consécutifs (durée 30sec). L'application des composés servant à induire les différentes inflammations, seront appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, un tiers des animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives et une derniere fois aprés resolution de l'inflammation 7 jours plus tard (7 injections =30sec). Un tiers des animaux recevront 1 application par semaine pendant 7 semaine; et 2 applications consécutives à la 4e semaine pour booster la réponse) sous anesthésie pendant 30 min (8 injections =30sec). Le dernier tiers des animaux recevront 2 applications à 9 jours d'intervalle (2 injections =30sec) . Le traitement utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du composé utilisé pour généré l'inflammation, et sur des souris anesthésiés pendant 30secondes. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30secondes. Un tiers des animaux seront egalement rasés sur le ventre à l'aide d'une tondeuse en vigile, durée 30sec.
Impact sur les animaux
Le gavage répétée sur plusieurs semaines pourrais induire une irritation de la trachée et donc une perte de poids. Les modèles d'eczema allergique,de psoriasis ou de dermatite atopique sont bien connus et utilisés dans l'equipe quotidiennement, ces derniers engendrent une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gènent pas la souris et ne gènerent pas de grattage. Les souris seront regulierement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines ce qui peux génerer un stress.
Devenir
Toue les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récuperer les organes ce qui permettra d'analyser les propriétés anti inflammatoires des deux bactéries testées
Remplacement
L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact de candidat médicament sur différentes inflammations cutanées. Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie. Dans le but de diminuer le nombre d'animaux utilisé dans ce projet, un des groupes control sera commun à 2 procédures.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Dans le cas où des nimaux perdrait du poids, des aliments réhydratées seraient disposé dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisés et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autre inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs sont acclimatées au moins une semaine au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.