Système immunitaire

2 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un infarctus provoqué par ligature définitive d'une artère coronaire au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis des échocardiographies sous anesthésie, avant d'être tué par surdose d'anesthésique. Le porteur mentionne une douleur postopératoire soulagée par analgésiques et une mortalité liée à la procédure. Il affirme que ces modèles murins sont un préalable "absolument nécessaire et indispensable" à la validation de traitements de l'infarctus chez l'humain.

Objectifs

Le nombre de patient atteints par un infarctus du myocarde et la mortalité associée par insuffisance cardiaque restent élevés malgré l’amélioration de la prise en charge des patients en aigu ou en chronique La compréhension des mécanismes impliqués dans cette pathologie est indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Notre projet a pour but de comprendre finement les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction réparatrice de certaines cellules de l’immunité, après un infarctus du myocarde, chez la souris. Divers modèles de souris génétiquement modifiées nous permettront d’analyser spécifiquement le rôle de ces cellules. Ces animaux subiront un infarctus du myocarde. L’analyse consistera à étudier la fonction cardiaque, le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment des cellules de l’immunité telles que les macrophages, participent à la réparation du cœur après infarctus du myocarde. L’identification des mécanismes mis en jeu dans les macrophages est un prérequis indispensable au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à réduire la mortalité chez les patients souffrants de pathologies cardiaques ischémiques en stimulant la réparation cardiaque après un infarctus.

Procédures

Chaque animal va subir une procédure chirurgicale de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde expérimental est réalisé par ligature permanente de l’artère coronaire antérieure gauche. Trois injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents jours après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection. Douleur post-opératoire soulagée par des analgésiques.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale toutes les souris sont mises à mort par par surdosage d’anesthésiques.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses in vitro avec des cultures de macrophages autant que possible avant de l’étudier dans un modèle murin. Cependant, ces modèles murins sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes, que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires et tissulaires qui sont mises en jeu lors de la réparation cardiaque apres un infarctus. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à ce projet a été ajusté grace à l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait pour détecter un changement de 20% de la fonction cardiaque par échocardiographie. Ces tests indiquent un nombre de 15 souris par groupe. Pour deux groupes, en supposant quelques problèmes de traitement des tissus et la mortalité inhérente à la procédure, nous estimons une taille de groupe de 20 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses échocardiographiques, anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et cellules cardiaques.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris: - température contrôlée à 22°C - cycle de jour/nuit de 12 heures - nourriture et eau ad-libitum - hébergement dans des cages de 2 à 5 souris maximum - enrichissement des cages avec maisonnettes, bâtonnets en bois et coton Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 48 heures, avec administration sous-cutanée de buprénorphine toutes les 12 heures, pendant 48 heures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 5 premiers jours post-opératoires, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Pour l’infarctus du myocarde et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C dès l’induction de l’anesthésie.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce murine nous permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Nous utiliserons des souris adultes non sénescentes, âgées de 10 semaines minimum chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes reçoivent des injections intrapéritonéales puis sont tuées par césarienne pour récupérer les nouveau-nés, confiés à des mères adoptantes et analysés à huit semaines. Le porteur décrit comme nuisances l'isolement des mâles, les injections et les césariennes, sans autre détail sur les atteintes. Il affirme que le développement du système immunitaire embryonnaire ne peut être étudié in vitro et que le modèle murin est "essentiel" du fait de sa proximité avec l'humain.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques se forment au cours du développement embryonnaire. Ceux sont de petits organes arrondis, aussi appelés organes lymphoïdes secondaires ou périphériques. Ils sont chargés de la régulation des interactions des antigènes avec les cellules du système immunitaire. Ces ganglions lymphatiques sont disséminés partout dans l'organisme sur le trajet de la circulation de la lymphe. Les premières étapes de mise en place dans l'embryon sont encore méconnues. Ces étapes impliquent l'interaction de différents types cellulaires et de différents signaux chimiques dans des régions spécifiques de l'embryon. Notre objectif est de caractériser tous les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement du système immunitaire et de définir l'origine hématopoïétique de ces cellules en particulier en ce qui concerne la formation des ganglions lymphatiques et des vaisseaux lymphatiques. Le projet visera également à identifier quels sont les facteurs qui déterminent l'emplacement de l’initiation du développement de ces structures et quels sont les évènements qui se déroulent à ces sites spécifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet attendus sont une meilleure connaissance des différents acteurs de la mise en place, à des coordonnées spécifiques dans l'embryon, des ganglions lymphatiques. En effet, de précédentes études ont montré que l'alimentation de la mère était très importante et pouvait être un facteur déterminant concernant la taille des ganglions lymphatiques par exemple. La vitamine A a été montrée comme un facteur essentiel au bon développement et fonctionnement du système immunitaire. Il existe un lien moléculaire entre les nutriments maternels (Vit A mais aussi certains métabolites intermédiaires du cholestérol) et la formation des structures immunitaires nécessaires à la résistance aux infections chez la progéniture. Ces études permettront donc de mieux comprendre quelles sont les conditions requises pour le bon développement du système immunitaire au stade embryonnaire. Ces conditions sont critiques car elles affecteront la fonction du système immunitaire adulte.

Procédures

Des injections intra-péritonéales (2 injections par souris, pour induire nos systèmes transgéniques) et des procédures de césariennes seront pratiquées sur nos souris gestantes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont l'isolement des mâles, les injections intra-péritonéales, les procédures de césariennes et de mise à mort.

Devenir

A l'issu de la procédure, les femelles gestantes sont mises à mort afin de récupérer les nouveau-nés qui sont confiés à des mères adoptantes et qui seront analysés à l'âge de 8 semaines.

Remplacement

Le modèle animal est ici essentiel car il permet d'étudier un système immunitaire proche de celui de l'homme. Les nombreux modèles de souris transgéniques disponibles nous permettent d'étudier des facteurs spécifiques, comme par exemple les chimiokines impliquées dans ces processus de développement. Le projet concerne l’étude de mécanismes in vivo qui ne peuvent être abordés par des techniques alternatives de culture in vitro dans lesquelles les notions d’interactions cellulaires ne peuvent se faire. De plus, au cours du développement, de nombreux facteurs liés aux contraintes physiques influencent la morphogenèse et ces contraintes ne peuvent être reproduites in vitro. Les intéraction entre les différents types cellulaires impliqués dans le développement du système immunitaire ne peuvent être observées que sur modèle animal. Les études in silico ou in vitro ne permettent pas d'étudier ces différentes intéractions. De plus, nous souhaitons étudier l'embryon en 3D et seul le modèle animal le permet.

Réduction

Nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour nos expérimentations. Pour cela, nous validerons le nombre de souris nécessaire à nos expérimentations par les calculs de puissance statistiques.

Raffinement

Pour limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées, les souris seront hébergées en accord avec la loi européenne dans une enceinte dédiée, dans des cages de dimension suffisante, avec un enrichissement comprenant des nids en carton et du coton. Une grille d'évalutation des points limites permettra d'effectuer un suivi du bien-être des animaux. Si les critères sévères sont atteints, telle qu'une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi car le système immunitaire de la souris présente de grandes similitudes avec le système immunitaire humain. De plus, il existe de nombreux modèles de souris transgéniques disponibles et éprouvés permettant d'étudier les différents acteurs de la mise en place du système immunitaire. Les animaux seront utilisés aux stades embryonnaires E10.5, E12.5, E14.5, E16.5 et E18.5, soit 5 stades embryonnaires distincts afin de couvrir tout le développement embryonnaire du système immunitaire jusqu'à la naissance.

441 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des mâles subit une ablation des testicules sous anesthésie, toutes sont infectées par un ver intestinal avec prélèvements sanguins répétés, puis euthanasiées quatorze jours après l'infection pour analyser la charge parasitaire et la réponse immunitaire. Le porteur indique que la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales et affirme que le parasite, éliminé naturellement par les animaux, ne s'accompagne pas de douleur. Il conclut que la coordination des cellules immunitaires dans plusieurs organes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Comme c'est le cas pour la plupart des infections microbiennes, les individus mâles éliminent plus difficilement les parasites que les femelles. Les objectifs de notre projet seront d'identifier les mécanismes biologiques à l'origine de la plus grande susceptibilité des mâles à des infections par des parasites intestinaux. Nous évaluerons si la réponse immunitaire anti-parasitaire est différente entre les souris mâles et les femelles lorsqu'ils sont infectés avec le ver intestinal Strongyloïdes Ratti. Nous étudierons si les hormones sexuelles mâles, les androgènes, influencent la réponse immunitaire anti-parasitaire en particulier en régulant une population immune clé dans l'élimination des parasites, les cellules lymphoïdes innées de type 2.

Bénéfices attendus

La prise en compte des différences liées les sexes dans la santé et la maladie a toujours été négligée, voire intentionnellement mise de côté. Cependant, à l'ère du développement d'approches thérapeutiques personnalisées, il est essentiel de considérer le sexe comme une variable critique pour les maladies infectieuses. Connaître les mécanismes à l'origine des biais de sexe dans l'immunité permettra non seulement une meilleure connaissance physiopathologique des maladies chez les hommes et les femmes mais aussi le développement de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes à l'origine de la plus grande susceptibilité des individus mâles aux maladies parasitaires.

Procédures

Une partie des animaux sera orchidectomisée (ablation des testicules) afin d'éliminer la source principale de production des androgènes (durée de l'opération = 5 min/souris). L'opération aura lieu sous anesthésie générale (l'animal est anesthésié pendant 60 min environ par une injection qui dure moins de 10 secondes). Toutes les souris seront infectées avec le parasite S. ratti (durée de l'infection = 1 min). Leur sang sera aussi prélevé à jour 0, 6 et 12 post-infection (durée de la prise de sang = moins d'1 min). L'infection et le prélèvement de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux non castrés = 4. Nombre total d'interventions chez les animaux castrés = 6

Impact sur les animaux

Les animaux récupèrent parfaitement d'une orchidectomie. Cependant, la chirurgie peut induire de faibles douleurs abdominales post-opératoires. Le parasite qui sera administré est naturellement éliminé par les animaux immuno-compétents qui seront utilisés dans ce projet. Son administration ne s'accompagne pas de douleurs chez les animaux.

Devenir

A l'issue de l'orchidectomie, les souris mâles castrés ainsi que d'autres lots d'animaux seront infectés par le parasite s.ratti. 14 jours après l'infection, toutes les souris seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus (intestin, poumons) la charge parasitaire ainsi que le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire induite par le parasite.

Remplacement

Les mécanismes de défense mis en place pour éliminer les parasites sont complexes. Ils nécessitent l'implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée et séquentielle avec des cinétiques précises dans différents organes (Intestins, poumons). Ces différentes étapes ne peuvent donc pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les calculs de puissance statistique pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles ont mis en évidence qu'un nombre de 7 animaux par groupe est requis. Nous répéterons les expériences 3 fois. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires infiltrant les tissus post-mortem et prélevements sanguins et de fèces au cours du temps pour évaluer l'inflammation et la charge parasitaire sur animal vivant.

Raffinement

Ce modèle n'induit généralement pas de dommages chez la souris qui, lorqu'elle est immuno-compétente comme c'est le cas avec les animaux ici utilisés, est capable d'éliminer complètement le ver. Les souris infectées ne perdent généralement pas de poids et n'ont pas de signes de douleurs apparentes. Cependant, les animaux seront attentivement observés après l'infection. Le poids des animaux sera mesuré et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes (isolement, baisse importante de l'activité, posture voûtée ou prostrée, pilo-érection, absence de toilettage), l'animal sera mis à mort. Le même soin sera apporté aux animaux ayant subi une orchidectomie qui est cependant une procédure dont les animaux se remettent parfaitement mais qui recevront en complément un bolus d'antalgique en post-opératoire. Les animaux seront placés dans des cages avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification.

Choix des espèces

Tout comme chez l'Homme, il existe des biais de sexe dans les infections parasitaires chez la souris, les souris mâles étant plus sensibles aux infections. Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons aussi de modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer de manière directe si la plus grande susceptibilité des mâles à être infectés par un parasite est en partie expliquer par l'inhibition de la réponse immunitaire par les androgènes. Une partie des animaux mâles sera orchidectomisée autour de 4-5 semaines de vie, avant maturité sexuelle. Tous les animaux seront ensuite infectés à l'âge adulte avec les parasites (9-15 semaines).

270 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées pendant une à six semaines, subissent des tests moteurs répétés et un électromyogramme sous anesthésie, pour tester l'hypothèse d'un lien entre déficit en macrophages thymiques et myasthénie. Le porteur indique que les molécules injectées peuvent provoquer une fébrilité transitoire. Il justifie le recours à l'animal par un "besoin" de valider chez la souris des observations faites chez des patients et in vitro.

Objectifs

La myasthénie grave est une maladie auto-immune rare. Elle est liée à la production d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur à l’acétylcholine (RACh), situé à la jonction entre le nerf et le muscle. Ces auto-anticorps altèrent la transmission du message nerveux entre le nerf et le muscle conduisant à des faiblesses musculaires plus ou moins invalidantes. Il n’existe actuellement aucun traitement pour guérir de la myasthénie. Les traitements actuels proposés aux patients sont essentiellement pour limiter les symptômes ou non-spécifiques, et doivent être pris à vie. Dans la myasthénie, si le muscle est l’organe cible, l’organe effecteur est le thymus. Une diminution du nombre des macrophages dans le thymus des patients myasthéniques a été récemment mise en évidence. Notre hypothèse est que ce défaut en macrophages de l’inflammation du thymus à l’origine de la myasthénie. Ce projet de recherche a pour but de démontrer chez la souris qu’une diminution du nombre de macrophages thymiques induit des changements thymiques comme ceux observés chez les patients, et à long terme une myasthénie.

Bénéfices attendus

La myasthénie autoimmune est une maladie chronique invalidante. On ne sait pas exactement encore pourquoi des personnes développent cette maladie. La compréhension des mécanismes étiologiques est donc très importante pour proposer de nouveaux traitements plus adaptés aux patients. En effet, à l’heure actuelle, les traitements proposés sont souvent des immunosuppresseurs à vie et/ou une ablation radicale du thymus. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un défaut en macrophages thymiques serait à l’origine de l’inflammation thymique conduisant à la myasthénie. Il n’y a pas de modèle spontané connu de cette pathologie chez la souris. Nous souhaitons utiliser une combinaison de molécules pour : 1) Démontrer que l’injection intrapéritonéale de ces molécules peut induire au bout d’une semaine, une inflammation dans le thymus. 2) Démontrer que les effets ces molécules sont exacerbés chez des souris transgénique qui ont moins de macrophages. 3) Sur des manipes plus longues (6 semaines), rechercher chez des souris ayant moins de macrophages thymiques, l’apparition de symptômes myasthéniques. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment la myasthénie se met en place afin de proposer ensuite de nouvelles approches thérapeutiques aux patients.

Procédures

1) L’injection intra péritonéale consiste à injecter un produit directement dans le péritoine, en bas de l’abdomen, afin d’induire une réponse systémique rapide. Cette manipulation se fait sur souris vigiles et dure quelques secondes. Geste réalisé sur chaque souris et selon les procédures: - 3/sem pendant 1 semaine pour 90 souris – 3/sem pendant 4 semaines pour 36 souris – tous les jours pendant 1 semaine 36 souris – 2/sem pendant 6 semaines pour 108 souris. 2) Les tests cliniques visent à étudier l’activité motrice des différents animaux afin d'évaluer l'apparition de la pathologie et les effets du traitement. L’évaluation comportementale de l’activité motrice des souris est pratiquée à l’aide de tests usuels, basés sur le comportement spontané des rongeurs (Grip test après une course sur tapis de 5 minutes et grille retournée) et la mesure du poids. 5 mesures sont faites par souris pour le grip test et un test de la grille retournée; chaque test durant 1 minute maximum. Ces tests concernent 108 souris et sont menés tout au long du protocole expérimental : une séance d’habituation (pour minimiser le stress associé aux manipulations répétées) est effectuée quelques jours avant la première injection et ensuite des séances régulières sont espacées de 8 à 12 jours. 3) L’electromyogramme permet de suivre le statut myasthénique suite à une stimulation du muscle squelettique. Pour ce protocole les souris sont anesthésiées. Après l’examen, les souris sont ensuite replacées dans leur cage initiale. L’examen, qui dure en totalité de 10 à 15 minutes par animal, sera pratiqué quelques heures avant l’euthanasie de la souris à la fin du protocole expérimentale et ne sera donc réalisé qu’une seule fois par animal. Cette procédure concerne 108 souris dans ce projet.

Impact sur les animaux

Les molécules injectées peuvent entrainer une fébrilité transitoire due à l’activation du système immunitaire. Les injections intrapéritonéales ne sont pas invasives pour les souris, le geste étant rapide et n’entrainant pas de blessure chez l’animal ou de gêne pour le déplacement. Les tests cliniques n’entrainent pas de stress particulier chez la souris. L’électromyogramme sera effectué sur les souris anesthésiées et elles ne ressentiront pas la douleur dût au test. Dès la fin de la manipulation, l’animal est euthanasié et n’est donc pas impacté pour la suite par cette procédure.

Devenir

Tous les animaux à la fin de ce projet sont euthanasiés. Effectivement à la fin de chaque protocole, il est nécessaire de prélever différents organes et tissus pour pouvoir étudier l’impact physiologique et moléculaire des différents traitements utilisés. Ceci a pour but d’optimiser l’utilisation des souris de ce projet.

Remplacement

A ce jour notre projet découle d’observations faites chez des patients myasthéniques et d’expériences in vitro. Maintenant, nous avons besoin de valider nos observations avec des modèles animaux, afin de démontrer que la myasthénie pourrait être due à une diminution des macrophages thymiques

Réduction

Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données et par un test de puissance, pour obtenir des résultats fiables à la suite de nos expériences, tout en utilisant le minimum d'animaux. En tout 270 souris sont nécessaires à la réalisation de ce projet expérimentale

Raffinement

Lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant au moins 1 semaine. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). L'utilisation de "Sizzlenests" (bandes de papier Kraft autoclavées) permet aux rongeurs de faire rapidement des nids. Le nid leur permet d’être moins dérangés par le bruit, la lumière, le mouvement et les changements de température. Il donne un sentiment de sécurité, ce qui réduit le stress des animaux et donc leur agressivité. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles d'aller chercher la nourriture en hauteur. Afin de limiter au maximum la douleur et le stress chez les animaux lors des injections intrapéritonéales, elles seront effectuées alternativement à gauche et à droite dans la partie basse de l’abdomen. Une séance d’habituation aux tests cliniques est effectuée quelques jours avant la première injection pour minimiser le stress associé aux manipulations. Le score clinique complet est évalué tous les 8-12 jours. Lors de l’électromyographie, la souris est anesthésié afin qu’elle ne ressente pas la douleur. La souris est ensuite euthanasiée juste après les mesures et ne ressent pas les conséquences de ce protocole. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers pour repérer d’éventuels signes de mal-être, de blessures ou si elles atteignent des points limites. Dans ces cas la souris est euthanasiée.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour la mise en place de modèles pour des maladies autoimmunes, dont la myasthénie. L’avantage de la souris est que le système immunitaire est bien mieux connu et que des souris transgéniques, déficientes pour des gènes précis, peuvent être utilisées. Des souris femelles seront utilisées car la myasthénie est une maladie qui touche majoritairement les femmes. Les expériences seront effectuées sur des souris de 6 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence, période d’apparition de la maladie chez l’humain.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées puis enduites d'une crème à l'imiquimod provoquant des lésions cutanées, elles reçoivent des injections sous-cutanées et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale, avant la mise à mort pour prélever la peau et divers organes. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 %, une peau rouge, squameuse et lésée après 48 heures, et un stress lié à la contention quotidienne. Il vise à comprendre le rôle d'une hormone du fer dans le psoriasis et à tester des pistes thérapeutiques.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement la peau et est associée à des comorbidités importantes. C'est une maladie courante qui touche 2 à 3 % de la population mondiale, sans distinction d'âge, de sexe ou d'ethnie. Les différents types comprennent notamment le psoriasis en plaques (ou psoriasis vulgaire), le plus répandu et le psoriasis pustuleux (PP), considéré comme plus résistant. Le PP, caractérisé par des pustules riches en cellules immunitaires, ne représente qu'une petite fraction des cas, mais peut mettre la vie des patients en danger lorsqu'il est étendu. Malgré des avancées majeures dans la compréhension de sa pathogenèse et dans son traitement, le psoriasis reste une maladie chronique courante dont les causes ne sont pas encore totalement élucidées. Le PP est particulièrement difficile à traiter. Des études ont montré une augmentation des niveaux de fer dans la peau de patients atteints de psoriasis. Le fer est indispensable au niveau cellulaire mais peut être toxique lorsqu’il est en excès. Il existe une hormone, principalement produite par le foie, qui régule les niveaux de fer dans l’organisme. Ce petit peptide est, de manière inattendue, exprimé dans la peau de patients atteints de psoriasis. Des données montrent que l'accumulation du fer et de "l'hormone du fer" dans la peau de patients souffrant de psoriasis est néfaste. Le projet visera à comprendre les mécanismes par lesquels cette hormone induit des effets délétères chez ces patients, mais également visera à tester différents agents thérapeutiques (médicaments ciblant le fer ou l'hormone) dans un modèle murin de psoriasis.

Bénéfices attendus

Dans la peau, l’hormone de régulation du fer pourrait avoir un rôle pro-inflammatoire en induisant d’une part la rétention de fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus physiopathologiques du psoriasis) mais également en recherche appliquée en porposant de cibler l’hepcidine ou le fer comme alternative thérapeutique au traitement du psoriasis.

Procédures

Les souris seront rasées au dos avec une tondeuse sous anesthésie (1 minute par souris). Une crème est appliquée (temps d’application : 30 secondes) sur des animaux vigiles suite à une prise en contention 1 fois/jour pendant 1 à 5 jours. Le poids des animaux est pris chaque jour après l’application de la crème. Une injection en sous-cutané (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes) est réalisée 2 fois (Jour 0 et jour 3 suivant l’application de la crème).30 minutes avant le prélèvement de sang, les souris seront injectées avec un analgésique (temps de réalisation impliquant la contention : 30 secondes); 500µl de sang seront prélevé par voie rétro-orbitale. (1 minute par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux perdent du poids jusqu’au 3ème jour (environ 10% de leur poids) puis commencent à récupérer à nouveau. La peau traitée par l’imiquimod devient rouge après 48h avec des lésions et des écailles. Un stress est généré par la contention quotidienne et les injections.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélever la peau et d'autres organes à des fins d'analyse immunohistochimique, d'expression génique, d'expression protéique et de cytométrie en flux.

Remplacement

Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de psoriasis.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Pour respecter le principe des 3R, la durée et la dose de traitements utilisée seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance quotidienne et des soins adaptés. Le raffinement comprend l'utilisation d'anesthésie (pour rasage et avant exsanguination) et d'analgésie (avant exsanguination) et la surveillance quotidienne des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoires et pour évaluer l’infiltrat immunitaire. Seule cette espèce possède des modèles murins génétiquement modifiés permettant l’étude de ce gène au cours de ces pathologies. De plus, la peau murine est similaire à la peau humaine (consituée de 3 parties : épiderme, derme, hypoderme). Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge la repousse du poil est la plus lente, donc adéquate pour le rasage du dos des souris. De plus, à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude du psoriasis.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe tumorale et des traitements par injection, certaines subissant une incision cutanée ou une laparotomie pour exposer un ganglion ou l'intestin à la lumière. Le porteur étudie la migration de lymphocytes régulateurs de l'intestin vers la tumeur pour comprendre la résistance à une immunothérapie. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire ces interactions immunologiques ex vivo, rendant l'animal vivant "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier les mécanismes de résistance à une des pronicipaux types d'immunothérapie. Notre équipe et d’autres également on montré que le microbiote intestinal joue un rôle important dans la réponse du patient au blocage des points de contrôles immunitaires. Dans une étude récente, nous avons trouvé que le microbiote intestinal dicte l’efficacité thérapeutique du blocage des points de contrôles immunitaires en régulant la migration des lymphocytes T régulateurs (Tregs) de l’intestin à la tumeur et dans les ganglions drainant. En raison du rôle pivot du blocage de ce points de contrôle immunitaire dans les Tregs, nous supposons que la migration des Tregs dérivés de l’intestin pourrait dicter l’efficacité thérapeutique du blocage.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait révéler d’importants mécanismes médiant la résistance aux immunothérapies les plus couramment utilisées à l"heure actuelle, et des informations utiles afin de personnaliser les traitements ou encore de nouvelles cibles de traitement pour améliorer la prise en charge du patient.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections de cellules tumorales, pour greffe (une injection, durée 1 minute, anesthésie locale). Les souris auront également des traitements par injection sous anesthésie locale (3 traitements à , Jour 6, 9 et 12, durée 1 minute). Certaines souris subiront des incisions cutanées pour exposition d'un ganglions à la lumière (photoconversion, durée 5 minutes). Certaines subiront une laparotomie pour exposition des instestins à la lumière (photoconversion), durée maximale 15 minutes, sous anesthésie générale, ces souris seront sacrifiés 24h après l'intervention (prélèvements d'organes et de tissus).

Impact sur les animaux

Certains de ces protocoles incluent en plus d'une implantation tumorale, des actes chirurgicaux et des traitements à base d'immunothérapie. L'acte chirurgical entraînera soit une incision cutanée (douleur minime), soit une ouverture du péritoine et donc des douleurs abdominales. L'implatation tumorale ainsi que les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de prélver divers organes pour analyses futures (qPCR, Cytométrie en flux, ELISA, Culturomique)

Remplacement

Il n'est pas possible de reproduire ou modéliser toutes les interactions immunologiques de manière ex vivo. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable pour répondre à la question scientifique du projet. En revanche, nous avons utilisé les découvertes faites dans les publications précédentes pour optimiser au maximum le plan expérimental.

Réduction

Le nombre de souris par lot a été précisément déterminé par calcul de puissance et en tenant compte du taux de prise des greffes de tumeurs. Les témoins seront regroupés au maximum pour minimiser le nombre total d'animaux.

Raffinement

Pour toutes les procédures, des mesures spécifiques seront prises en compte pour ajuster les attentions portées aux souris selon leur condition : Les souris qui sont porteuses de tumeur seront suivies quotidiennement avec mesure de la taille tumorale et du poids 2 fois par semaine. Les souris ayant une tumeur et subissant une chirurgie feront l'objet d'une attention plus poussée. Une injection de d'antiinflmmatoire sera réalisée une fois la chirurgie finie et également 12h après. Les souris seront surveillées au réveil,puis quotidiennement pour vérifier l'état général et le bon maintien des clips (servant à fermer l'incision, dans le cas où les souris perdent du poids, nous mettrons du dietgel dans le cage. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Génétique proche de celle de l’Homme Les voies de signalisation immunologique des tumeurs sont comparables chez l’humain et la souris. La souris est le moèle de référence dans le domaine de la cancérologie . Le modèle Kaede proposé permettent le suivi des cellules immunitaires in vivo. Cela n'est pas possible chez l'homme (pour des raisons éthiques et techniques, le marquage in vivo des cellules immunitaires dans l'intestin humain, par exemple par des traceurs radioactifs, n'est pas justifiable sur le plan éthique). Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines développées sur un fond génétique C57BL/6 et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des différents traitements sur la réponse anti-tumorale. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. A cet âge là, le système immunitaire est tout à fait fonctionnel et permet un suivi de plusieurs semaines sans que la souris ne soit trop vieillissante et que son système immunitaire soit en déclin.

945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant un mois, un rasage et des injections de cellules tumorales, avec un suivi de la croissance des tumeurs, avant la mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que les lignées transgéniques développent dès trois semaines une tumeur de l'œil qui métastase à la peau, aux poumons et aux ganglions, avec une baisse de l'acuité visuelle. Il présente l'amélioration de la prise en charge des patients comme un bénéfice conditionnel.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau à haute capacité métastatique responsable de nombreux décès chaque année. Ces dernières années, les nouvelles immunothérapies restaurant les fonctions protectrices du système immunitaire ont permis d'améliorer le pronostic vital des patients. Néanmoins 60% d’entre eux résistent à ces nouveaux traitements, d’où la nécessité d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques ou de résistance à l’immunothérapie. Du fait de ses propriétés pro-tumorales, notre protéine d'intérêt a émergé comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Nous nous intéréssons plus particulièrement à son rôle délétère sur le système immunitaire. Sachant qu'elle est principalement exprimée par des cellules immunitaires associées à un mauvais pronostic, nous émettons donc l’hypothèse qu’elle favorise leurs fonctions pro-tumorales. Nous souhaiterions déterminer le rôle spécifique de chacune des cellules exprimant l'enzyme dans le développement du mélanome.

Bénéfices attendus

Nous déterminerons comment notre enzyme affecte la fonction des cellules immunitaires dans le contexte du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d'action de l'enzyme afin, à terme, de mieux la cibler. En combinaison avec les immunothérapies actuelles, la prise en charge des patients atteints de mélanome métastatique sera donc améliorée.

Procédures

Gavage quotidien sur souris vigiles (5 minute/gavage/souris) pendant 1 mois soit 30 gavages/souris au total. Rasage sur souris vigiles (5 minutes/souris). Une injection sous cutanée d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (5 minutes/injection/souris). Une injection par voie intra-veineuse d'1M de cellules tumorales sur souris vigiles (6 minutes/injection/souris). Evaluation de la croissance tumorale 3 fois par semaine par mesure de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Les lignées transgéniques présentent un phénotype dommageable : elles développent une tumeur primaire au niveau de l'oeil dès l'âge de trois semaines qui métastase rapidement au niveau de la peau, puis des poumons et des ganglions. Les principales nuisances attendues sont un trouble du comportement et une diminution de l'acuité visuelle de ces souris due au développpement de la tumeur primaire. Les souris transplantées peuvent présenter une tumeur ulcérée ainsi qu'un trouble du comportement. La transplantation intra-veineuse de cellules tumorales peut exceptionnellement induire une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyse de la composition immunitaire des différents organes prélevés (tumeur primaire, métastases, ganglions drainants et non drainants, rate, péritoine).

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour étudier les conséquences sur les fonctions de différentes cellules immunitaires. Des expériences de stimulation in vitro ont également été réalisées pour déterminer quelles sont les cellules qui expriment l'enzyme. Cependant, le recours à un modèle animal est indispensable car la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives in vitro ou ex vivo.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi, les expériences reposant sur le modèle de souris transgénique de mélanome spontané nécessitent 40 souris par groupe. Le modèle de transplantation de cellules tumorales présente l’avantage d’être fortement reproductible d’une souris à l’autre. Ainsi, les expériences de transplantation de mélanome nécessiteront des groupes de seulement 10 souris.

Raffinement

Nous avons défini des points limites adaptés aux différents modèles utilisés et au delà desquels les animaux seront mis à mort. Ainsi, l’état général des animaux sera suivi lors des changes par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal sera communiqué aux responsables de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie). De plus, les souris RET seront diagnostiquées une fois par semaine par les responsables de projet pour suivre l'évolution du mélanome. La tumeur sous-cutanée des souris transplantées sera mesurée trois fois par semaine afin de surveiller l'aspect et la croissance tumorale. Les animaux injectés par des cellules B16 en IV seront pesés à J0, J7 et J12. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. De plus, les souris transgéniques développant une tumeur spontanée permettent de comparer la réponse immune à différents stades du développement du mélanome (à un stade précoce ou tardif de la maladie). Ce modèle est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine et permettra d’étudier les cellules immunes au sein d’une tumeur qui vient de se développer, ce qui est éthiquement impossible à partir de mélanome primitif chez l’homme. Enfin la disponibilité de modèles transgéniques permet d'étudier finement le rôle de l'enzyme dans le contexte tumoral. Le modèle de transplantation des cellules de mélanome, largement utilisé, présente l’avantage d’être reproductible d’une souris à l’autre et ne requiert pas un grand nombre de souris par groupe. Les données obtenues dans ces trois modèles seront complémentaires. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte (>6 semaines) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.