Système immunitaire

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont tués comme donneurs de peau, les autres reçoivent une greffe cutanée sous anesthésie puis portent un pansement pendant sept jours qui réduit leur mobilité. Tous sont tués pour des prélèvements de tissus. Le projet étudie l'effet d'une déficience en CD45 sur le rejet de greffe, le porteur affirmant qu'aucune expérience in vitro ne rend compte des mécanismes immunitaires en jeu.

Objectifs

La transplantation représente un moyen thérapeutique efficace pour palier au dysfonctionnement de certains organes. Cependant, en l'absence de traitement du receveur, le greffon est rejeté par le système iimunitaire de l'hôte. Aujourd'hui le rejet de greffe est contrôlé par l'utilisation d'immunosuppresseurs pharmacologiques. Cependant, ces drogues ont des effets secondaires importants et ne sont pas toujours suffisantes pour prévenir le rejet. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver des traitements alternatifs à ces immunosuppresseurs. Notre équipe a montré que l'utilisation d'un anticorps ciblant et déplétant la molécule CD45 normalement exprimée à la surface de sous populations de lymphocytes T, permettait d'induire une tolérance d'une greffe cardiaque chez le rat. L'objectif de ce projet est d'analyser plus profondément le rôle intrinsèque de la molécule CD45RC dans la fonction de ces sous-populations de lymphocytes T, dans le contexte de greffe de peau chez le rat. Pour cela, nous avons à disposition un modèle de rat déficient pour la molécule CD45RC qui a été généré par la plateforme Transgenèse rat du CR2TI.

Bénéfices attendus

Prolongation de la survie du greffon chez les rats déficients pour la molécule CD45RC

Procédures

- Prélevement de greffons sur animaux donneurs euthanasiés - Greffe de peau sur animaux receveurs anesthésiés (1/animal) - Retrait des pansements au bout de 7 jours sur animaux receveurs anesthésiés - Suivi du bien etre de l'animal et du greffon quotidiennement - Injection dose analgésique en post-opératoire - Prélevements post-mortem sur animaux receveurs euthanasiés

Impact sur les animaux

Douleur et stress engendré par la chirurgie. Mobilite réduite lié à la pause d'un pansement pendant 7jours.

Devenir

Euthanasie des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélevements de tissus post-mortem.

Remplacement

A ce jour, aucune expérience in vitro ou modélisation informatique ne permet de rendre compte de l'ensemble des mecanismes immunitaires qui rentrent en jeu dans un modèle complexe comme le modèle de greffe de peau. La nature de cette étude ne permet donc pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux et il n'ya pas d'alternatives non animales à la greffe de peau

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Concernant les donneurs de peau, 1 animal est suffisant pour greffer 5 receveurs. Nous estimons que 5 receveurs par groupe est le nombre minimal requis pour obtenir des résultats significatifs. L'approche statistique adoptée est la suivante : Deux expériences indépendantes seront menées comprenant 5 animaux receveurs par groupe. En cas de résultats significatifs, de nouvelles expériences pourront être menées pour confirmer les premieres observations (3 au maximum). Dans le cas contraire, le protocole sera arrêté.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement pour observer leur comportement général (mobilité, prise alimentaire, toilettage, posture, pilo-érection) suite à la chirurgie et pour surveiller le maintien du pansement avant son retrait à J7. Si un signe clinique sévère est observé (amaigrissement important, prostration, posture voutée), l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Pour réduire la douleur et la souffrance animale liées à la chirurgie, les animaux reçoivent au moment de la greffe de la kétamine, nécessaire à l'anesthésie des animaux et qui présente une action analgésique. De même une dose de buprénorphine (0.05mg/kg) pourra être administrée en post-opératoire (injection sous-cutanée) pour soulager la douleur. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi car nous disposons de cette lignée de rats déficients pour la molécule CD45RC. Les rats utilisés auront entre 12 et 16 semaines. Les animaux donneurs ne doivent pas etre trop jeunes pour disposer d'assez de greffons à partir d'un meme animal. Les animaux receveurs seront utilisés dans une tranche d'age relativement proche de celles des animaux donneurs.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'un lymphome que le porteur décrit comme envahissant les tissus et aboutissant à la mort de l'animal, puis des injections de cellules et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le projet évalue des cellules NK humaines produites selon un procédé breveté comme immunothérapie anticancéreuse, en vue d'un dossier réglementaire pour un essai clinique.

Objectifs

Nous produisons des lymphocytes « Natural Killer » humains à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, en passant par un stade de précurseur lymphoïde, selon une technique brevetée, qui permet d’obtenir en 2 à 3 semaines de très grandes quantités de lymphocytes NK immatures, présentant un degré de pureté supérieur à 90. Nous avons également montré que nous pouvions combiner la culture à une modification génétique par transduction lentivirale, qui permet d’apporter des propriétés antitumorales supplémentaires (par exemple un récepteur antigénique chimérique appelé CAR, dirigé contre un antigène tumoral). Les lymphocytes produits sont fonctionnels in vitro. Notre objectif est de caractériser in vivo la biodisponibilité et la fonction de ces cellules lymphocytaires, non modifiées ou modifiées génétiquement pour exprimer un CAR, et à les comparer à des lymphocytes matures du sang et des lymphocytes dérivées de cellules souches hématopoïétiques selon un protocole qui ne passe pas par l’étape précurseur lymphoïde. Ces deux sources de lymphocytes sont utilisées dans le cadre d’essais cliniques, mais présentent un certain nombre des défauts (résistance à la transduction, expansion limitée, apparition précoce de marqueurs d’épuisement). Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéficiente humanisée et suivrons des schémas expérimentaux publiés. Nous répondrons à la question de la biodisponibilité in vivo des lymphocytes après greffe chez la souris. Nous validerons dans une étape pilote le modèle tumoral. Enfin, nous explorerons la capacité des lymphocytes armées avec un CAR à détruire des cellules tumorales par imagerie sur souris anesthésiée. Ce projet nous apportera les réponses scientifiques et les preuves précliniques du potentiel de ces cellules en immunothérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la capacité des cellules NK produites dans nos conditions (brevetées) à persister après greffe. Il permettra également de valider la fonctionnalité des cellules NK. Au terme du projet, s’ils sont positifs, les résultats seront utilisés pour documenter le dossier exigé qui sera soumis aux autorités réglementaires pour la mise en place d’un essai clinique de phase I/II pour le traitement des lymphomes B. Les schémas expérimentaux et les résultats serviront de base à l’exploration de l’efficacité des cellules NK pour traiter des tumeurs solides.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni procédures chirurgicales n'est prévu dans l'étude. Les interventions se limiteront à : 1) Injection d'agent de conditionnement. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. L’ensemble des souris (314) sont injectées 1 fois avec cet agent. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. 2) 3 jours après l’injection de l'agent de conditionnement, injection(s) de l'agent théeapeutique NK et/ou des cellules cancéreuses après anesthésie générale : 172 souris injectées 1 fois; Durée de l’intervention 5 minutes/ souris. 142 souris injectées 2 fois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 3) Injection de molécule pour permettre le suivi par bioluminescence après anesthésie générale. Maintien de l’anesthésie gaseuze durant l’aquisition au lecteur de bioluminescence. 164 souris injectées et anesthésiées 8 fois maximum pendant 1 mois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 4) Prélèvement de sang après anesthésie générale : 150 souris, 1 prélèvement par souris juste avant la mise à mort. Durée de l’intervention : 10 min/souris. 5) Mise à mort par dislocation cervicale immédiatement après le prélèvement de sang. Toutes les souris (314) sont concernées. Durée de l’intervention : 1 minute/souris. Au total, 150 souris subiront 4 injections et 1 prélèvement de sang. Les 22 aurtes souris subiront 12 injections et 8 séances d’imagerie. Les 142 souris restantes subiront 13 injections, 8 séances d’imagerie et 1 prélèvement de sang.

Impact sur les animaux

Le modèle tumoral est un modèle d’un lymphome de Burkitt, une tumeur liquide qui envahit les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate) et aboutit à la mort de l’animal. Les cellules NK ne provoquent pas d'effets indésirables. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée et un stress.

Devenir

Tous les animaux du projet (314) seront mis à mort pour prélèvement de tissus et leurs analyses (à J4 ou J7). Ces dernières nous permetteront d'étudier la biodisponibilté.

Remplacement

Notre protocole de production de cellules NK est, en soit, une méthode de Remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches humaines isolées de sang de cordon ou ou de donneurs adultes pour produire et expandre des cellules NK ex vivo avec un système complètement in vitro, sans nécessité de faire maturer les cellules humaines chez la souris. Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long développement et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique. Les cellules NK produites selon le nouveau procédé ont été complètement caractérisées phénotypiquement et fonctionnellement. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des cellules NK dans les différents organes immunitaires, ou leur capacité à migrer dans les tumeurs, et à les détruire. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Pour répondre à des questions de biologie cellulaire et moléculaire, nous utiliserons des cultures primaires, ce qui réduit fortement l’utilisation d’animaux. Cependant, les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour les réponses physiopathologiques liées à une manipulation génétique ou traitement pharmacologique. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et le stress infligés aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans le modèle tumoral en particulier, dans le cas où l’induction de la tumeur est à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit, perte d'intérêt de l'exploration, perte de poids, comportement stéréotypique lié au stress), l’expérience sera interrompue et l'animal mis à mort. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). D’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvent seuls dans les cages. Si une souffrance est avérée avec un score supérieur à 6 défini dans les procédures, les NSG-IL15 seront mises à mort pour une étude macroscopique des organes et/ou de l’immunohistochimie et/ou une analyse du statut sanitaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. Par ailleurs, il existe de nombreux outils (ex : anticorps) qui sont développés parfois exclusivement chez la souris. Les essais précliniques sur animaux sont exigés par les autorités réglementaires dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés in vitro seront testés chez l’animal. Les animaux utilisés seront au stade adulte, entre 10 et 12 semaines de vie. Ce choix se base sur l’âge auquel les lymphomes B se déclarent chez l’Homme et sur un protocole ayant montré des résultats encourageants.

94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple négatif leur sont greffées dans la glande mammaire sous anesthésie, puis la tumeur est mesurée trois fois par semaine, pour cette étude pilote sur le rôle de l'enzyme IL4I1. Le porteur indique que 20 à 30 % des souris peuvent développer une ulcération ou une nécrose de la tumeur, et fixe un volume de 1 500 mm³ comme point limite. Il justifie la mise à mort par une croissance tumorale "inéluctable" et affirme que le contrôle de la tumeur par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro.

Objectifs

Rationnel : IL4I1 est une enzyme immunosuppressive (elle empêche le système immunitaire de fonctionner). Sa production dans les tumeurs est associée à des paramètres de mauvais pronostic ou une survie diminuée des patients atteints de différents types de cancers. Nos données préliminaires montrent qu’elle est présente dans les cancers du sein dits « triple-négatifs », une forme agressive de cancer mammaire, pour laquelle les traitements actuels sont peu efficaces, y compris les nouvelles immunothérapies. L’inhibition d’IL4I1 (par invalidation du gène qui code l’enzyme ou administration d’un inhibiteur chimique de l’activité enzymatique) réduit la croissance tumorale dans différents modèles murins, en particulier, l’inhibition d’IL4I1 freine la croissance de modèles de cancer du pancréas et de mélanome. Objectif : Dans cette étude pilote, nous souhaitons vérifier la pertinence de l’invalidation d’IL4I1 pour améliorer le contrôle de la croissance tumorale des cancers du sein triple-négatifs, en utilisant une lignée tumorale murine modèle de ces tumeurs (EO771). Stratégie envisagée : Nous allons greffer des cellules tumorales EO771 dans la glande mammaire de souris syngéniques afin de développer un modèle orthotopique immunocompétent. Nous testerons l’effet de l’invalidation d’IL4I1 sur la croissance tumorale en comparant les courbes de croissance des tumeurs développées chez les souris de la souche naturelle (WT) à celles des tumeurs développées chez les souris déficientes en IL4I1 (IL4I1-/-).

Bénéfices attendus

L’étude pilote permettra de valider l’intérêt d’étudier le rôle d’IL4I1 dans le développement du cancer du sein triple négatif. Dans un deuxième temps (saisine future), une fois cette preuve de concept obtenue, le projet permettra de mettre au point chez la souris un modèle de traitement reposant sur l’inhibition d’IL4I1 avec un composé chimique et d’étudier les mécanismes immunitaires sur lesquels repose l’effet thérapeutique.

Procédures

Injection lente et continue d’une suspension cellulaire en tampon salin dans la glande mammaire (volume = 100 microlitres) sous anesthésie à l’isoflurane. L’injection dure moins d’une minute. Mesure de la tumeur (croissance superficielle) avec un pied à coulisse sur animal vigil, 3 fois par semaine pendant 2 semaines. La mesure dure moins d’une minute par animal.

Impact sur les animaux

L’anesthésie limite le stress lié à la contention et améliore la précision de l’injection. Une injection précise permet une croissance harmonieuse et localisée de la tumeur et ainsi limite le risque de souffrance. Malgré ces précautions, dans 20 à 30% des effectifs, il peut apparaitre une ulcération, une nécrose ou un suintement localisé au niveau de la tumeur qui représente un point limite. Un volume tumoral de 1500 mm3 (atteint habituellement 3 semaines après injection) est également considéré comme un point limite.

Devenir

La croissance tumorale est inéluctable, les animaux doivent donc être mis à mort en fin d’expérimentation.

Remplacement

Le contrôle de la croissance tumorale par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro, car il implique de très nombreuses interactions cellulaires et moléculaires coordonnées au cours du temps dans l’organisme entier. Bien qu’imparfait, le modèle murin reste d’utilisation courante pour ce type d’étude.

Réduction

Nous souhaitons observer une réduction d’au moins 20% de la croissance tumorale dans le groupe de souris IL4I1-/- (souche invalidée pour l’expression d’IL4I1) par rapport au groupe contrôle (souche naturelle), de façon à pouvoir considérer cette diminution comme biologiquement significative. Si on considère que cet effet devra être visible lorsque la tumeur du groupe contrôle aura atteint un volume de 500 mm3 (environ 18 jours après injection de 0,25x10E6 cellules), la variance habituelle à cette date étant de 150 mm3, le nombre de souris à tester par groupe est de 36. Les animaux qui seraient mis à mort avant la fin de l’expérimentation ne pourraient pas être pris en compte. Sachant que jusqu’à 30% des animaux auront atteint un point limite avant J18 du fait de lésions au niveau de la tumeur, il faut prévoir 30% d’animaux supplémentaires par groupe, soit 0,3x36 + 36 = 47 animaux par groupe. Des courbes d’incidence de l’apparition des tumeurs et de survie (Kaplan-Meier) seront réalisées en parallèle. L'estimation du nombre d'animaux nécessaires sur la base d'une différence de 30% de la survie est de 45 animaux par groupe en tenant compte des 30% d'animaux non évaluables. Dans le cas où cette différence atteindrait 40%, 28 animaux par groupe seraient suffisants. La totalité de cet effectif ne sera pas inclus dans une seule expérimentation, permettant d'adapter le nombre d'animaux inclus aux résultats obtenus. Habituellement, nous incluons 8 à 12 animaux par groupe et par expérimentation. Ainsi, la procédure sera arrêtée dès qu'une différence statistique entre les deux groupes sera obtenue.

Raffinement

Les animaux bénéficient de mesures d’enrichissement du milieu. L’injection des cellules tumorales sera faite sous anesthésie (isoflurane, 4% pour induction, 2% pour maintien), ce qui limite le stress pour les animaux et augmente la précision de l’injection dans la glande mammaire. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine par le même opérateur, à partir du huitième jour après injection. La taille des tumeurs sera mesurée avec un pied à coulisse. Le comportement et l’aspect général des animaux ainsi que l’aspect de la tumeur seront évalués de façon à détecter précocement des signes de souffrance (tels que ralentissement des mouvements, tremblements, perte de poids) ou un point limite (tel que nécrose de la tumeur) qui nécessiteraient d’interrompre l’expérimentation pour cet animal.

Choix des espèces

Notre projet s’intéresse au contrôle de la croissance du cancer du sein triple négatif par le système immunitaire (précisément par l’enzyme IL4I1 qui joue un rôle de frein de la réponse immunitaire contre le cancer). Seule la souris permettra d’étudier la croissance d’une lignée murine reconnue comme modèle de cancer du sein triple négatif. Souris adultes (plus de 6 semaines). Le cancer du sein est une tumeur de l’adulte.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 grays, greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes T sous anesthésie, puis reçoivent des injections quotidiennes d'anticorps et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur indique que les souris développent perte de poids, poil terne, atteintes cutanées et posture voûtée, qu'aucun antalgique n'est administré car il modifierait le système immunitaire, et que les animaux atteignant un score clinique de 5 sont mis à mort. Sur le remplacement, il affirme que les expériences in vitro ne peuvent pas répondre à son hypothèse in vivo.

Objectifs

Les lymphocytes T régulateurs sont des cellules immunitaires avec un rôle d’inhibition de la réponse immune. Dans le cas de la maladie du greffon contre l’hôte ces cellules peuvent jouer un rôle important en freinant la réponse immune contre le greffon et diminuant le rejet de greffe par conséquence. Ainsi cibler ces cellules est une des stratégies développées par notre équipe dans l’objectif d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte. Dans ce sens l’objectif de ce projet sera de tester l’efficacité clinique d’anticorps thérapeutiques ciblant cette population spécifiquement. Nous utiliserons des anticorps dirigés contre le CD25 et le TNFR2, des molécules exprimées par les lymphocytes T régulateurs et ayant un rôle dans leur fonction. Nous étudions également l’effet de ces anticorps directement sur les cellules responsables de la maladie qui peuvent temporairement et sous certaines conditions d’activation exprimer les mêmes molécules ou d’autres comme le CD38.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider des molécules thérapeutiques pour lesquelles nous avons obtenu des résultats importants.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seul ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses dans un volume total de 100ul par souris. Ces souris seront traitées selon le schéma choisi (traitement curatif ou préventif) avec 5 injections quotidiennes pendant 5 jours suivi de 5 injections répartis sur 10 jours avec des molécules thérapeutiques dans un volume final de 100ul d’anticorps dilués dans une solution saline et administré par injection intrapéritonéale. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois maximum par expérience. Le premier prélèvement sera effectué 14 jours après le début de l’expérience, le deuxième au moment du sacrifice qui tombe en moyenne à 60 jours après le début de l’expérience. Le volume maximale prélevé sera de 100ul.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pellage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5 avec 5 les signes les plus graves. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Si les souris atteignent un score de 5, elles seront euthanasiées. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi euthanasiées. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pour établir le score, mais seront surveillés tous les jours pour vérification de leur état par rapport au jour d’avant. Les souris ayant une aggravation de situation seront alors euthanasiées. Ce score a été évalué par nos pairs spécialiste de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteints 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront euthanasiés ainsi que les animaux qui n'auront pas atteints les points limites deux mois après l'irradiation. Les animaux restant à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d'étudier l'effet de molécule thérapeutique sur le développement de la maladie du greffon contre l'hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l'utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l'hypothèse émise. Toutefois, toutes expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sera réalisée.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupé dans le maximum possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 5 soit une perte de poids de 20% seront sacrifiées. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établit le score clinique associée à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute sorte de souffrance. Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront sacrifiés quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Enfin il existe une surveillance quotidienne des animaux greffés par les zootechniciens de la plateforme, lesquels sont informés de la nécessité d'une surveillance accrue des animaux du fait de leur engagement dans une expérience. Des enrichissements sont placés dans les cages à raison de 3 par cage afin de réduire l’angoisse des animaux. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane réduisant ainsi la douleur.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudié depuis longtemps dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, il possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doese d'irradiations auquelles ils seront soumis.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique de vecteur viral AAV par voie intraveineuse ou intramusculaire sous anesthésie, un prélèvement sanguin et des séances hebdomadaires d'imagerie par bioluminescence, pour tester des capsides modifiées ciblant le foie. Le porteur indique n'attendre qu'une légère douleur au point d'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo, une réduction des doses chez le patient étant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, plusieurs facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène proviennent de la large biodistribution des AVV après injection mais également de la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur pouvant engendrer la destruction des cellules transduites. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Ces limites nécessitent d’injecter de fortes doses chez le patient. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel de la chimie organique pour améliorer « l’activité spécifique » et « l’index thérapeutique » d'une particule AAV recombinante choisie. Ces améliorations, non explorées jusqu'à présent, vont être obtenues par l’emploi de ligands ayant des propriétés de ciblage. Ces modifications chimiques accentueront le ciblage vers un organe ou un tissu spécifique, comme le foie, ce qui en retour permettra une réduction de la quantité d’AAV à administrer au patient. Différents ligands ayant un ciblage spécifique des hépatocytes présents au niveau du foie, seront couplés sur la surface de la capside d’AAV. Au-delà de l’augmentation du tropisme cellulaire, ces capsides modifiées chimiquement pourraient également diminuer l’effet de la réponse immunitaire. Ces mêmes vecteurs chimiquement modifiés seront également injectés en intramusculaire afin d’évaluer le pouvoir de diffusion de ces vecteurs. Cette voie d’injection pourrait permettre le développement de futurs vaccins utilisant ce mode d’administration.

Bénéfices attendus

Les modifications apportées à ces vecteurs pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées par voie chimique pourraient favoriser la transduction spécifique du foie et celle du muscle. Cette dernière propriété, s’il elle était démontrée, ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées.

Procédures

Les souris recevront une injection unique de PBS ou d’AAV en Intra Veineuse ou en Intra musculaire. Les animaux seront anesthésiés. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections. Les animaux seront anesthésiés. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. L’imageur photon utilisé pour réaliser les imageries par bioluminescence nous permettra de réaliser des images sur 5 souris simultanément. Les animaux seront injectés en Intrapéritonéale avec de la luciférine. Au bout de 5 mn, les souris seront anesthésiées. Le temps d’acquisition est de 1 minute. L’imagerie de bioluminescence sera réalisée une fois par semaine sur 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique. Pour les injections en intra veineuse, en intra musculaire et le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressentie après le réveil. L’injection en intra péritonéale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales (point limite) ou la décapitation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer la biodistribution de ces vecteurs une fois injectés ainsi que la possible réponse immunitaire.

Réduction

Des premiers tests d’efficacité seront effectués in vitro sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur, le nombre d’animaux à utiliser en sera donc réduit. La technique de l’imagerie par bioluminescence nous permettra d’avoir rapidement de premiers résultats. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé pourra être réduit si certains résultats se montrent négatifs, notamment dans les groupes avec injections en IM.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).

Choix des espèces

Comme dans la majorité des études portant sur la thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins ainsi que par la possibilité de constituer des groupes d'animaux suffisamment larges (n=5 par groupe) pour pouvoir effectuer des calcul statistiques (test statistique non paramétrique Mann-Whitney). Le modèle murin envisagé (Balb-c) est couramment utilisé dans le domaine de la thérapie génique et plus particulièrement dans celui des AAVr. Il s’agit d’un modèle souvent utilisé pour étudier la biodistribution de différents vecteurs. Ce modèle nous apparaît donc comme étant pertinent pour ce projet. Nous évaluerons nos vecteurs sur des animaux ayant fini leurs croissances. Afin d’être en corrélation avec des études similaires, notre protocole démarrera donc chez des souris adultes âgées de 8 semaines.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.