Système immunitaire

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris est anesthésiée et intubée pour recevoir dans les poumons une injection unique d'un composé induisant une inflammation de type BPCO. Le porteur indique une possible blessure de la trachée et des difficultés respiratoires liées au développement de l'emphysème. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la complexité de la maladie et de la circulation des cellules immunitaires, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie chronique respiratoire. Chez les personnes atteintes, une inflammation des voies aériennes entraîne des perturbations dans le fonctionnement normal des poumons. Les alvéoles pulmonaires qui permettent les échanges gazeux lors de la respiration sont progressivement détruites, conduisant à un emphysème. On estime que la BPCO atteint 3,5 millions de personnes en France, soit 7,5% de la population. La maladie est plus fréquente chez les fumeurs, le tabac étant le principal facteur de risque. Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituter une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la BPCO.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques concernant la circulation et la prolifération des cellules immunitaires. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer la contribution des cellules immunitaires dans la BPCO. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans cette pathologie.

Procédures

La BPCO est induite chez les souris par une injection unique, directement dans les poumons, d'un composé provoquant une inflammation. Pour cela les souris sont anesthésiés (environ 20 minutes) et intubées le temps de l'injection (environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

En de rares occasions, une blessure de la trachée pourra être observée . Le développement de l’emphysème pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Une évaluation exhaustive de la bibliographie nous a confirmé qu'il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre au cours de la BPCO et de la circulation des cellules immunitaires entre les organes. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons utilisé une analyse statistique a priori afin de limiter le nombre d’animaux au strict minimum.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. Avant la procédure expérimentale, les souris seront anesthésiées afin d’éliminer la souffrance potentielle due à la procédure. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'Homme pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait impacter sur les résultats.

4 932 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de fluides, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par injection ou inhalation des molécules pharmacologiques pendant quelques jours, avec deux prélèvements sanguins, pour étudier la régulation de l'interleukine-33 dans l'inflammation allergique. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer une inflammation des bronches et une gêne respiratoire, outre un stress modéré et une irritation. Il affirme devoir travailler sur un organisme intégré tout en revendiquant un criblage in vitro pour limiter le nombre d'animaux, les bénéfices restant des avancées de connaissance sur l'asthme.

Objectifs

L'inflammation allergique joue un rôle crucial dans les maladies allergiques telles que l'asthme qui touche 30 millions d'Européens. Ce nombre a doublé au cours des dix dernières années et continue d'augmenter. De nombreuses études sur des modèles animaux et des données cliniques ont démontré de manière concluante le rôle critique de l’interleukine-33 (IL-33) dans l'inflammation allergique. L’IL-33 est une protéine présente au niveau des cellules des vaisseaux sanguins et des tissus en contact avec l’extérieur, comme l’appareil respiratoire. L’IL-33 ne joue pas véritablement de rôle à l’intérieur des cellules ; sa quantité est variable et dépend de nombreux facteurs. Elle est libérée en dehors des cellules suite à divers stimuli, notamment après exposition à des allergènes comme Alternaria alternata, un allergène clinique majeur chez les patients asthmatiques. Une fois libérée dans l'espace extracellulaire, l'IL-33 va jouer le rôle de messager et alerter le système immunitaire d’un danger, comme la présence d’un champignon, en activant rapidement les cellules immunitaires qui sont impliquées dans l'inflammation allergique. Bien que l'IL-33 constitue une cible thérapeutique prometteuse pour l'asthme et d'autres maladies humaines importantes, il existe encore plusieurs questions non résolues concernant la biologie et la biochimie de la protéine. Par exemple, on ne sait pas quels sont les facteurs importants qui régulent la présence de l’IL-33 dans les cellules et sa quantité. Ou bien, comment l’IL-33 est libérée dans le milieu extracellulaire, après exposition à des allergènes comme Alternaria alternata ? L'objectif principal du projet est de fournir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression de la protéine IL-33 et sa libération à l’extérieur de la cellule, conduisant à l'inflammation allergique.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression et de la libération de la protéine IL-33 est essentielle étant donné ses rôles critiques dans l'immunité, l'allergie, l'inflammation et d'importantes maladies humaines, comme l'asthme. Nous pensons que ce projet permettra de mieux comprendre ces questions non résolues dans la biologie de l'IL-33, et conduira à des avancées scientifiques importantes. Nos résultats préliminaires effectués in vitro, dans des cellules en culture, indiquent qu’il est possible de moduler les niveaux d’expression de la protéine IL-33 dans les cellules productrices. Les expériences proposées ont pour but de démontrer que si l’on arrivait à diminuer l’expression de l’IL-33 in vivo, on pourrait limiter l'inflammation allergique. En outre, nous pensons que le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biochimiques et moléculaires impliqués dans l’expression et/ou la libération rapide de l'IL-33 lors d’un stress, comme l'exposition à des allergènes environnementaux. Enfin, de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de l’expression/libération de l'IL-33 devraient être identifiés et pourraient également contribuer au développement d'applications industrielles et thérapeutiques.

Procédures

Injection ou inhalation de molécules pharmacologiques 1 fois par jour sur un maximum de 4 jours. 2 prélèvements sanguins à 6 semaines d'intervalle. Prélèvement post-mortem d'organes et de fluides biologiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont un stress modéré lors de la manipulation des animaux, une légère douleur lors de l’inhalation et de l'injection des produits. Ainsi qu'une légère irritation cutanée ou de la mucqueuse nasale suite aux injections ou aux inhalations. De plus, les produits injectés ont pour but d’augmenter (ou diminuer) l’expression et/ou la libération de l’IL-33. Ainsi, les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la quantité d’IL-33 libérée par ces traitements qui peuvent induire une inflammation des bronches et une gêne respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Différents organes et fluides biologiques (lavages broncho-alvéolaires) seront prélevés post-mortem afin de pouvoir réaliser les analyses nécessaires à la compréhension de l'expression et de la libération d'IL-33 sous l'effets des différents inhibiteurs utilisés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet nécessite de mener des expériences chez l’animal, car nous devons travailler dans des conditions intégrées permettant l’interaction de plusieurs systèmes cellulaires complexes dont le système immunitaire et le microenvironnement inflammatoire. Cependant afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des expériences de screening in vitro qui nous permettent de remplacer le screening in vivo afin de sélectionner les meilleures molécules candidates capables de moduler l’expression et /ou la libération de l’IL-33, mais ces expériences in vitro ne peuvent pas à l'heure actuelle intégralement remplacer les expériences in vivo pour les raisons évoquées ci-dessus. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre qu’un mammifère. L’espèce animale choisie est la souris car notre étude nécessite l’utilisation d’animaux modifiés génétiquement et qui sont déficient pour l'IL-33.

Réduction

Le nombre d'animaux, qui sont utilisés pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au strict minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il s’agit d’un nombre maximum d’animaux qui pourra être significativement réduit; Par exemple, nous avons prévu des expériences avec plusieurs sites d'injection mais si le premier site d'injection donne des résultats satisfaisant, nous ne réaliserons pas les expériences pour les autres sites d'injection ce qui réduira automatiquement le nombre d’animaux. De même, nous avons prévu dans certaines expériences plusieurs injections si une seule injection n’était pas suffisante mais si une seule injection suffit, alors les expériences avec plusieurs injections ne seront pas réalisées. De plus, certaines procédures ne seront pas réalisées si les procédures précédentes ne sont pas concluantes. Les expériences menées in vitro avant la réalisation des expériences in vivo nous permettront de sélectionner les meilleures molécules candidates capables de moduler l’expression et /ou la libération de l’IL-33, et ainsi d’éviter de tester directement toute une panoplie de molécules chez l’animal, ce qui permet une réduction certaine du nombre d’animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. L’ensemble de nos procédures fera l’objet d’expériences pilotes avec un nombre très réduit d’animaux (2 maximum) par groupe de traitement. Ces expériences nous permettront de vérifier que les traitements n’entrainent pas de détresse et de douleur majeure chez les animaux pendant tout le temps de la procédure. Les expériences sur des groupes plus importants d’animaux ne seront réalisées que si les expériences pilotes montrent que les points limites adaptés au modèle sont corrects. Les inhalations auront lieu sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress chez l’animal. Les procédures seront courtes puisqu’elles dureront de 1 à 4 jours maximum. De plus, nous procèderons à un nombre d’injections minimum (le plus souvent, une seule injection) qui ne sera augmenté (jusqu’à trois maximum) que si les résultats obtenus avec une seule injection sont insuffisants. Pour chaque procédure, le suivi des animaux sera journalier avec un suivi établi selon une grille de score. Enfin, tous les prélèvements seront effectués post-mortem.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle le plus couramment utilisé dans la littérature scientifique pour étudier la biologie de l’IL-33 et son implication dans le développement de l’inflammation allergique. De plus, il existe des souris déficientes pour l'IL-33 ce qui est capital pour étudier les mécanismes d’expression et de libération de cette cytokine. Nous utiliserons des souris femelles adultes âgées de 6 à 8 semaines car c'est un modéle validé pour l'inflammation allergique et qui est en relation avec le développement d'asthme allergique dont l'incidence est plus importante chez les femmes que chez les hommes.

3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans

Procédures

Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.

Impact sur les animaux

L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.

Raffinement

Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

2 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées pour d'autres expérimentations ou confiées à une association d'adoption à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à cinq injections intramusculaires et sept prélèvements sanguins à la jugulaire pour produire des anticorps dirigés contre des vésicules bactériennes. Le porteur indique que le protocole peut provoquer fatigue, douleur, hyperthermie et, dans un cas extrême, un choc anaphylactique. Il affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" et qu'il n'existe "aucune alternative" non animale, seul un "organisme intégré et vivant" pouvant synthétiser ces anticorps.

Objectifs

Les vésicules de membranes externes (OMV) sont des vésicules formées à partir de la membrane externe des bactéries Escherichia coli. Ces vésicules font l’objet de nombreux projets de recherche dans des domaines variés (traitement anti-cancéreux, vaccinologie, ...). Le but de ce projet est de produire des anticorps dirigés contre ces vésicules (anticorps non disponibles à ce jour). Les anticorps fixés sur les vésicules pourront être marqués par fluorescence (immunomarquage) afin de pouvoir suivre le trajet des vésicules au niveau cellulaire et ainsi de comprendre le mécanisme d’action des OMV au niveau des cellules.

Bénéfices attendus

Le sérum des chèvres prélevées permettra de récupérer des anticorps dirigés contre les vésicules extra-cellulaires (OMV) de bactéries et de créer un stock d’anticorps pour les expérimentations en laboratoire ultérieurement (exemple : suivi des OMV par marquage fluorescent des anticorps dirigés contre les OMVs (immunomarquage)). Cela permettra de mieux étudier le mécanisme d’action encore méconnu de ces vésicules.

Procédures

5 injections intramusculaires maximum (durée de 5 secondes environ) à 2 semaines d’intervalle entre chaque injection, sur 2 chèvres vigiles. Et 7 prélèvements sanguins à la veine jugulaire (environ 10 secondes par prise de sang) sur 2 chèvres vigiles avec 2 semaines d’intervalle entre chaque prise de sang.

Impact sur les animaux

Le protocole est susceptible de générer un stress chez l'animal au moment des manipulations (injections et prises de sang) et une réaction inflammatoire et immunitaire attendue liée à la production d'anticorps en réponse à l'injection des OMV, qui pourrait entrainer un état de fatigue, de la douleur et de l'hyperthermie de manière transitoire, voire un choc anaphylactique (dans un cas extrême, non attendu). Ce protocole ne doit pas entrainer d'effet délétère à long terme, ni de souffrance et ne nécessite pas la mise à mort des animaux. De nombreuses validations in vitro et in cellulo ont déjà été réalisées de manière à garantir la qualité des vésicules utilisées à des fins vaccinales. De plus, l’innocuité chez l’animal a déjà été établie dans un modèle poussin.

Devenir

Les chèvres seront réformées pour d’autres expérimentations ou alors adoptées par une association spécialisée dans le placement d’animaux anciennement utilisés à des fins scientifiques.

Remplacement

L'absence d'anticorps disponibles nécessite de recourir à une production d'anticorps par immunisation contre les vésicules extracellulaires d'intérêt. Ce projet ne peut pas être réalisé in vitro. En effet, il n'existe aucune alternative non animale disponible permettant de produire des anticorps. A l'heure actuelle, tous les anticorps sont produits dans des organismes modèles (souris, rat, lapin, chèvre, âne ou singe le plus souvent). Le recours a l'animal vivant est ici indispensable car la production d'anticorps étant secondaire à une immunisation (ici consécutive à l'injection d'OMV) et mettant en jeu des mécanismes complexes et séquentiels, seul un organisme intégré et vivant est capable de synthétiser ces anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal nécessaire pour afin de garantir la production d’anticorps est de 2 individus. En effet, une seule chèvre ne serait pas suffisante dans le cas où le système immunitaire de la chèvre ne répondrait pas à l’immunisation (pas de production d’anticorps) car il existe une variabilité de réponse immunitaire entre les animaux d’une même espèce. 2 chèvres est donc le nombre minimal nécessaire afin d’augmenter les chances de récupérer des anticorps par prélèvement sanguin sur les chèvres.

Raffinement

Les chèvres seront logées à côté d’un troupeau de chèvre (afin de répondre aux besoins sociaux intra-espèce des chèvres, car il n’existe pas de risque infectieux), en boxe intérieur sur aire paillée. Les animaux auront des abreuvoirs, du foin à volonté et une distribution de granulés quotidienne. Les densités par animal sont respectées conformément à la réglementation (directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Des brosses sont mises à disposition sur les murs du logement afin que les chèvres puissent se frotter contre celles-ci afin d’enrichir leur environnement. Elles auront la possibilité d’exprimer un comportement propre à leur espèce. Avant le début du protocole expérimental, les chèvres auront une longue période d’acclimatation dans leur nouvel environnement (supérieure à 1 mois).

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle chèvre car il permet de purifier une quantité importante de sérum, ce qui évitera de devoir reproduire la même expérimentation régulièrement. Par ailleurs, le modèle chèvre étant couramment utilisé pour produire des anticorps, de nombreux réactifs dirigés contre cette espèce sont disponibles dans le commerce, ce qui permettra d'utiliser les anticorps produits dans de nombreuses applications. Chèvre adulte (afin de limiter le risque d'apparition de choc anaphylactique).

346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, un suivi de la tumeur trois fois par semaine sous anesthésie et, pour une partie, des injections d'anticorps, afin de tester le blocage d'une réponse immunitaire régulatrice sur la croissance de la tumeur. Le porteur présente cette approche comme une possible alternative ou un complément au traitement anti-PD1. Il conclut que la complexité des réactions immunitaires rend "nécessaire" l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Notre système immunitaire est divisé en deux: une réponse inflammatoire qui protège l'organisme contre les infections et les cancers, et une réponse immunitaire régulatrice (anti-inflammatoire) qui contre-balance la réponse inflammatoire pour éviter des réponses trop fortes ou non nécessaires, et donc l'apparition de maladies autoimmunes ou d'allergies. Cependant, il est suggéré que la réponse immunitaire régulatrice peut également avoir un rôle néfaste, comme dans le cancer où elle pourrait empêcher l'élimination de la tumeur par notre corps. D’un point de vue thérapeutique, il serait donc intéressant de bloquer la réponse immunitaire régulatrice dans le but de stopper la croissance tumorale. Pour imaginer bloquer la réponse régulatrice, il est nécessaire d'en comprendre les mécanismes sous-jacents, en particulier la façon dont elle est régulée. Dans ce projet, nous souhaitons donc déterminer les molécules impliquées dans la mise en place de la réponse régulatrice dans un contexte tumoral. Nous testerons dans une seconde partie le potentiel thérapeutique des molécules identifiées en les bloquant à l'aide d'anticorps pour voir si cela arrête la croissance tumorale. Ceci nous permettra de déterminer si bloquer ces molécules pourraient être utilisé comme traitement en complément des thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes contrôlant la réponse anti-inflammatoire, ainsi que le rôle des cellules régulatrices impliquées dans le cancer. L'étude des mécanismes induisant la réponse T régulatrice dans la tumeur, ainsi que le blocage de cette réponse pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant servir dans le traitement du cancer. De plus, ce projet nous permettra de déterminer si le blocage de ces cibles pourrait se réveler comme une meilleure alternative au traitement actuel anti-PD1 ou alors en améliorer son efficacité.

Procédures

Lors de la première partie du projet, 94 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces 94 animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 50 minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Ces animaux seront également injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée : 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30 secondes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 51 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une tumeur localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur. Tous les animaux seront surveillés se traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser la croissance tumorale et la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la tumeur.

Remplacement

Les cibles (molécules et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. Les phénomènes mis en œuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu plusieurs organes (tumeur et ganglions lymphatiques) et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécéssaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la réponse immunitaire et et son implication dans la croissance tumorale.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 346 souris, permettant de caractériser la réponse T régulatrice dans la croissance tumorale, et son potentiel en tant que cible thérapeutique. Les groupes comporteront 8 souris, ce qui est l'effectif minimal pour avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquence de Tregs et taille de la tumeur) à l'aide d'un t-test. Deux expériences pilotes seront effectuées avec un nombre limité de souris par groupe, ce qui permettra de déterminer 1) la lignée cellulaire la plus appropriée, 2) les doses d'anticorps à injecter. De plus, nous allons tout d'abord étudier une lignée de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite la lignée de souris dans laquelle le gène est absent dans un type cellulaire donné. De la même manière, nous essayerons de bloquer la signalisation de OX40L avec des anticorps, seulement si nous obtenons des résultats prometteurs au cours de la partie 1 concernant le rôle de cette molécule.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un enrichissement. L'injection de cellules tumorales, les prises de photos et les mesures de la taille de la tumeur seront faites sous anesthésie gazeuse légère. Après ces traitements, les animaux seront placés sous une lampe chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Les sites d'injections d'anticorps seront alternés. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle et selon la grille d'évaluation de la douleur établie. Si un animal dépasse le point limite établi, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires mettent en jeu différents organes, ce qui rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour étudier ces mécanismes. Le modèle choisi est la souris car elle présente un système immunitaire similaire à celui de l’Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d’étudier le système immunitaire à l’âge adulte.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des prélèvements de sang à l'oeil et huit injections intrapéritonéales d'immunothérapie, pour tester si la déplétion des macrophages améliore un traitement anticancéreux. Le porteur renvoie les retombées pour les patients au conditionnel et reconnaît que l'objectif immédiat reste de comprendre le comportement des cellules. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des interactions entre tumeur et microenvironnement immunitaire ne peut pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

Le cancer colorectal, est le 3ème cancer le plus fréquent chez l’homme et le 2ème plus mortel, faisant de cette pathologie un enjeu majeur de santé publique. Bien que l’utilisation des immunothérapies, ont montré une efficacité remarquable dans le traitement de plusieurs types de cancers, leur effet reste cependant limité dans le traitement du cancer du côlon. Ceci peut notamment s’expliquer par la mise en place de voies d’immunosuppression alternatives. Il a notamment été montré que les macrophages infiltrant la tumeur peuvent jouer un rôle immunosuppressif (pro-tumorale) dans plusieurs types de cancer, dont le cancer colorectal. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que la déplétion des macrophages intra tumoraux pourrait améliorer l’efficacité des immunothérapie dans le traitement du cancer du côlon. Pour cela, des souris porteuses de tumeurs de côlon seront déplété ou non en macrophages, et traité ou non par immunothérapie . La croissance tumorale ainsi que le phénotype immunitaire seront évalués.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir à la fois le combo immunothérapie et les macrophages comme des cibles potentielles chez les patients atteints de cancer colorectal.

Procédures

-Rasage des souris sur le flanc après désinfection à l’alcool sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (1x2min/souris) - Injection de cellules tumorales en position sous cutané sur le flanc des souris sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (1x30sec/souris) - Prélèvement de 100µl de sang au niveau de l'oeil (2x 1min / souris) - Injection intrapéritonéale de d'immunothérapie (8x20sec / souris).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. Les tumeurs injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Les traitement utilisés dans ce projet ne provoquent pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 8 injections par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse modérée et de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane ; les rates, ganglions lymphatiques et les tumeurs seront prélevées pour peser et analyse du phénotype immunitaire .

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer l’impact de la déplétion en macrophage sur l’efficacité antitumoral dd'une immunothérapie . À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé unetaille d'échantillon de 10 souris par groupe. Cettt procédure sera réalisé en 2 temps, avec 5 souris par groupe. La deuxième expérience sera réalisée si la première expérience est concluante afin de renforcer la signification statistique des données et de pallier à un problème technique éventuel.

Raffinement

Les tumeurs injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. De plusLes traitement utilisés dans ce projet ne provoquent pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé en cas de douleur et angoisse de l'animal.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation in vivo est justifié par l’existence de la lignée tumorale et des réactifs thérapeutiques, qui à notre connaissance n’ont pas été développés dans d’autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire et du cancer chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines en fonction des disponibilité des animeaux chez le fournisseur. En revanche l'age des souris sera homogène entre les différents groupes expérimentaux.

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur transfère des lymphocytes T qui déclenchent un diabète auto-immun, avec injections répétées et jusqu'à dix prélèvements de sang à la queue, l'hyperglycémie entraînant soif, perte de poids et baisse d'activité avant l'euthanasie. Le projet vise de nouvelles immunothérapies ciblant les lymphocytes responsables de la destruction des cellules du pancréas. Le porteur affirme que la validation de ces stratégies passe forcément par des "organismes entiers", les composés étant d'abord testés in vitro.

Objectifs

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune caractérisée par une perte totale ou quasi-totale de la capacité du pancréas à produire de l’insuline, hormone essentielle pour réguler le taux de glucose dans le sang. La perte de la fonction insulinique est due à la destruction des cellules béta du pancréas par son propre système immunitaire. Parmi l’ensemble des cellules immunitaires se sont les lymphocytes T qui sont majoritairement retrouvés au niveau des lésions pancréatiques et qui sont responsables de la destruction des cellules bêta. Les modèles murins ont permis de mettre en évidence que l’apparition de la maladie se fait en deux étapes consécutives dans des tissus anatomiquement distincts. Premièrement, les lymphocytes T sont activés dans les ganglions lymphatiques drainant le pancréas. Puis ils infiltrent le pancréas où ils vont pouvoir aller détruire spécifiquement les cellules bêta. L’Europe et l’Amérique du Nord ont les taux d’incidence les plus élevés, supérieurs à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en des injections régulières d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie ciblant les lymphocytes T impliqués dans la maladie.

Bénéfices attendus

Le diàbète de type 1 est une maladie auto-immune dont l’incidence en Europe et Amérique du Nord est supérieure à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en un apport quotidien d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Nous espérons que nos études contribueront à jeter les bases de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces sur le diabète de type I. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus pour ce projet devraient contribuer au développement de nouvelles stratégies immmunothérapeutiques pour d’autres pathologies auto-immunes.

Procédures

1. Injection dans la cavité abdominale : Pour reduire le nombre de cellules dans le sang, qui est nécessaire pour déclencher la maladie. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 2. Injection intra-veineuse : Pour injecter les lymphocytes tueurs autoréactifs. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 3. Injection intra-veineuse : 1 seule fois pour chaque animal. Pour injecter un traitement à base de cellules. L'injection prend moins de 10 secondes. 4. Injection dans la cavité abdominale : Pour injecter un traitement à base d'anticorps. 6 injections maximum par souris. L'injection prend moins de 10 secondes. 5. Prélèvements sanguins : Les souris seront suivies pour l’apparition du diabète en mesurant le taux de glucose dans le sang. Une goutte de sang obtenue par ponction dans la veine de la queue est suffisante pour relever une mesure. Un maximum de 10 prélèvements par souris. Cela prend moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris seront surveillées pour détecter l'apparition de la maladie en mesurant les niveaux de glucose dans le sang tous les 3 jours. Une goutte de sang sera prélevée dans la veine de la queue à cette fin. Les prélèvements répétés peuvent causer du stress aux animaux. Au cours de nos expériences, certaines souris vont développer un diabète auto-immun constaté par une hyperglycémie, ce qui marquera la fin de nos expériences. Cette condition peut entraîner une douleur légère ou modérée pendant les 1 ou 2 derniers jours de l'expérience avant l’euthanasie des animaux. L'hyperglycémie apparaît vers le 10ème jour après le transfert de cellules T. Après ce point, les souris commencent à uriner plus fréquemment. 3-4 jours après l'apparition de l'hyperglycémie, les souris présenteront des poils dressés, une perte de poids et une mobilité réduite. Les animaux seront euthanasiés après deux mesures consécutives supérieures à 300 mg/dL. Les injections provoquent une gêne de très courte durée chez les souris. Les cellules ou les anticorps injectées ne doivent avoir aucun effet indésirable notable sur les souris.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée à J11 pour prélèvement des organes. L’autre partie sera suivie notamment pour l’apparition du diabète. Les animaux seront euthanasiés au fur et à mesure de l’expérience quand ils présentent des signes de souffrance ou deux valeurs consécutives de glycémie supérieure à 300 mg/dL. Les expériences seront arrêtées au bout de 30 jours et toutes les souris encore en vie à ce moment là seront euthanasiées pour pélèvement d’organes.

Remplacement

Le diabète est une maladie auto-immune qui implique différents acteurs du sytème immunitaire ainsi que différents organes (ganglions lymphatiques, pancréas...). La validation de nouvelles stratégies d’immunothérapie implique donc forcément l’utilisation d’organismes entiers. Cependant, les composés nouvellement développés seront systématiquement testés et validés in vitro et seules les approches ayant données des résultats probants in vitro seront évaluées in vivo chez la souris.

Réduction

La réalisation des expériences in vivo est conditionnée par l’obtention au préalable de résultats probants in vitro. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles, ce qui évite de réaliser un tri lors des naissances des souris. Pour les expériences d'apparition du diabète, 12 souris par groupe seront nécessaires pour avoir des résultats significatifs. D’après notre expérience avec ce modèle, pour des expériences de caractérisation des cellules T ex vivo, 9 souris par groupe devraient être suffisantes pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre d'animaux représente le minimum requis.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des portoirs ventilés dans un milieu enrichi. Nous nous basons sur une grille de score pour évaluer le comportement et l’état des animaux tous les 2 à 3 jours. Si nous constatons un problème (perte de poids excessive, poil hérissé…) les souris seront euthanasiées. L’apparition d’un diabète se traduit par le fait que les souris commencent à uriner plus fréquemment, une perte de poids et une baisse de l’activité. Afin d’améliorer la condition des souris, dès le début de l'hyperglycémie, une observation quotidienne des cages et du niveau des biberons sera effectuée. De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, elle sera directement deposée dans la cage.

Choix des espèces

Le projet proposé ici est basé sur nos résultats précédents obtenus en utilisant notre modèle de souris transgénique de diabète auto-immun. Outre les modèles de diabète auto-immun spontané, plusieurs modèles de maladie induite chez des souris transgéniques ont été générés, qui permettent de suivre facilement et rapidement le devenir des cellules T responsables de la destruction des cellules bêta du pancréas. Les animaux utilisés seront des animaux âgés de 8 à 16 semaines. A cet âge les souris ont un système immunitaire suffisamment développé pour les besoins du projet. Par ailleurs, ceci nous permettra d’être dans la continuité des précédents travaux menés par l’équipe.