Système immunitaire

40 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale un probiotique puis une inoculation de Salmonella, avec prises de sang à la jugulaire et prélèvements de fèces répétés, pour tester une réduction du portage de la bactérie dans la filière porcine. Le porteur indique une légère hyperthermie et une modification des fèces après inoculation, sans autre effet attendu. Il affirme qu'en l'absence de modèle in vitro il est "indispensable" de comprendre le rôle de la flore intestinale du porc, et présente l'objectif comme une réponse aux "attentes de la filière porcine".

Objectifs

La salmonellose représente la deuxième cause d’infection humaine d’origine alimentaire en Europe. Cette infection est une zoonose (maladie pouvant être transmise de l’animal à l’homme et inversement) qui peut être transmise à l’Homme tout au long de la chaine alimentaire, mais plus généralement par le biais d'aliments d'origine animale contaminés. Parmi les viandes, celle de porc a été identifiée comme l’une des principales sources des cas humains de salmonellose. Le porc héberge cette bactérie dans son tractus digestif de manière asymptomatique. L’objectif principal de ce projet est de réduire le portage de Salmonella, pathogène prévalent dans la filière porcine, par l’ajout d’un probiotique, Bacteroides fragilis. Au cours d’un précédent travail, il a été démontré in vitro que Bacteroides fragilis était capable de réduire le passage de la barrière cellulaire par des Salmonella de différentes formules antigéniques. Cet essai in vivo sur porcs permettra de valider les effets bénéfiques obtenus in vitro, en vérifiant en conditions expérimentales contrôlées l’effet inhibiteur de ce Bacteroides fragilis sur le passage trans-intestinal de Salmonella. La réduction du portage de Salmonella et de sa diffusion chez l’animal sera mesurée au niveau intestinal, sanguin et immunitaire. L’impact de B. fragilis sur le microbiote digestif en présence et en absence de Salmonella sera également considéré. Développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage permettra de réduire l’usage des antibiotiques et la charge qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des consommateurs et des acteurs de la filière porcine.

Bénéfices attendus

Dans la première partie du projet, des effets bénéfiques du probiotique Bacteroides fragilis sur la colonisation de Salmonella ont été observés in vitro . L’essai in vivo nous permettra de vérifier ces effets de réduction de la colonisation par Salmonella. Ces données sont nécessaires pour l’acquisition de connaissances, et pour le développement d’une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage. Cela permettrait de limiter à terme, l’usage d’antibiotiques en cas de salmonelloses animales, de réduire la charge bactérienne qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des professionnels de la production porcine. Par ailleurs, cette étude nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo dans l'objectif de réduire le recours à l’expérimentation animale lors de futures études.

Procédures

- Administration par voie orale de Bacteroides fragilis à 8 temps donnés (J-4, J0, J1, J3, J7, J10, J14, J17) - Inoculation par voie orale de Salmonella ou d’une solution placebo à 1 temps donné (J0). - Prise de sang (10mL) au niveau de la veine jugulaire à 7 temps donnés (J-7, J-3, J1, J3, J7, J10, J14, J17, J21). - Prélèvement de fèces sur animaux vigiles lors de défécation naturelle à 8 temps donnés (J-7, J-3, J1, J2, J3, J7, J10, J14, J17).

Impact sur les animaux

Chez le porc, Salmonella est susceptible d’induire une légère hyperthermie dans les deux jours suivant l’inoculation. C’est pourquoi un suivi de la température rectale sera réalisé quotidiennement. De même, une modification de la texture des fèces peut être attendu. Pour surveiller ce paramètre, un scoring des fèces (échelle de 0 à 5) sera réalisé quotidiennement. B. fragilis, non toxigène, est considéré comme un probiotique prometteur de nouvelle génération en raison de ses capacités à atténuer l’inflammation. Il n’est donc pas attendu d’effet indésirable du au probiotique tout au long de cet essai.

Devenir

Des prélèvements d’organes et de différents contenus et tissus intestinaux sont nécessaires pour évaluer la diffusion de salmonella et l’impact du probiotique. Ces prélèvements nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Le porc représente l’une des sources majeures de salmonellose pour l’homme. Afin de pouvoir identifier des moyens de lutter au mieux contre cette zoonose, il est indispensable de comprendre le rôle de la flore commensale dans le développement de Salmonella dans le système digestif du porc et sa capacité à passer dans d’autres tissus/organes. Dans ce contexte, et en en l’absence de modèle in vitro ou in silico intégré, permettant de mimer l’interaction de la flore commensale porcine avec Salmonella, seul le modèle in vivo permet aujourd’hui de travailler sur un tel niveau global. C’est pourquoi il convient de réaliser cette étude sur cette espèce cible.

Réduction

L’étude est réduite au nombre minimum de lots nécessaires, un lot témoin négatif, un lot témoin « probiotique », un lot témoin « Salmonella » et le lot ou le probiotique et Salmonella seront administrés. Pour chaque lot, un effectif de 10 animaux sera utilisé (2 parcs de 5 animaux dans une même animalerie). Cet effectif de 10 sera suffisant pour reproduire les effets et effectuer des analyses de variance les plus robustes possibles Les tests statistiques utilisés seront, pour une distribution normale, les tests ANOVA et pour une distribution ne suivant pas la loi normale, les tests de Kruskall-Wallis.

Raffinement

L’inoculation de Salmonella et du probiotique sera réalisée à la pipette par voie orale par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Dans nos précédentes expériences, suite à l’inoculation de porcs avec la souche de Salmonella, seule de légères hypertermies dans les 24h après l’inoculation ainsi qu’une modification de la texture des fèces 48h après l’inoculation ont pu être obervées chez certains animaux. Pour surveiller ces paramètres, il est donc prévu un suivi quotidien de la température rectale ainsi qu’un scoring des fèces (échelle de 0 à 5). Dans l’ensemble de notre essai, nous confirmerons l’état de santé des animaux dans nos conditions expérimentales. Pour cela un relevé de symptômes et de manifestations cliniques visuelles sera réalisé quotidiennement. Dans l’ensemble de notre essai, nous confirmerons l’état de santé et de bien-être des animaux dans nos conditions expérimentales comme indiqué au point 5.6.2. Enfin les prises de sang seront réalisées de sorte à prélever 10 mL de sang total au niveau de la veine jugulaire. Ce qui correspond à un prélèvement inférieur à 1% du volume sanguin (soit en moyenne 19mL). Ces prises de sang seront exclusivement réalisées par le personnel expérimenté de sorte à rendre le geste rapide et le plus confortable possible pour les animaux.

Choix des espèces

Le porc représente l’une des sources majeures de salmonellose pour l’homme. Afin de pouvoir identifier des moyens de lutter au mieux contre cette zoonose, il est indispensable de mieux comprendre le rôle de la flore commensale dans le développement de Salmonella dans le système digestif du porc et sa capacité à passer dans d’autres tissus/organes. Le but final étant de trouver des moyens pour réduire le portage des salmonelles par les porcs, tout en réduisant l’utilisation des antibiotiques et ainsi, de protéger la santé humaine, tout en répondant aux attentes de la filière porcine. Les porcs seront sevrés et mis en lot à partir de 4 semaines. A la fin de la 6ème semaine, les lots 2 et 3 recevront le probiotique. L’inoculation des animaux par Salmonella interviendra 4 jours après pour les lots 3 et 4, à 7 semaines d’âge. A cet âge les porcs ont atteint une maturité intestinale avec une flore stable et un système immunitaire performant. Ces conditions permettront donc d’étudier de manière optimale la modulation du microbiote et l’implantation de Salmonella en présence ou non du probiotique. Le probiotique continuera d’être administré deux fois par semaine durant 3 semaines.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles développent spontanément des cancers lymphoïdes, avec biopsie de la queue pour le génotypage et mise à mort à l'apparition de symptômes ou au plus tard à douze mois, pour étudier les voies de réparation de l'ADN. Le porteur indique une dégradation de l'état général et des difficultés à respirer, et surveille l'apparition de grosseurs ganglionnaires. Il affirme que les études in vitro ont "montré leurs limites" et que la souris est l'"organisme approprié" pour ce projet.

Objectifs

Les cassures doubles brins de l’ADN (DSBs) sont des lésions cellulaires toxiques qui doivent être réparées efficacement pour maintenir la stabilité du génome et prévenir le cancer. Dans les cellules de mammifères, deux voies principales de réparation existent pour détecter et ligaturer les DSBs : la recombinaison homologue (HR) et le « non-homologous end-joining » classique (NHEJ). Une troisième voie, moins bien définie, porte le nom de NHEJ alternatif (aNHEJ) et a été tout d’abord identifiée comme un système de "secours" capable de réparer les DSBs dans des cellules génétiquement déficientes pour un (ou plusieurs) facteur(s) essentiel(s) pour le NHEJ. Les cellules cancéreuses présentent fréquemment des mutations somatiques entraînant une altération des voies canoniques de réparation de l'ADN, ce qui provoque une instabilité génomique et favorise l'apparition et l'évolution des tumeurs. Dans ce projet, nous avons pour objectif d’étudier les mécanismes impliqués dans la promotion du développement tumoral en l’absence de NHEJ. Pour cela nous utiliserons des modèles murins qui développent spontanément de l’instabilité génomique et des cancers lymphoïdes proches de ceux observés chez l’Homme. Ces modèles présenteront différentes combinaisons de mutations au niveau de gènes impliqués dans la signalisation des dommages de l’ADN, (i.e. p53, ATM) et dans la voie NHEJ (i.e. Xrcc4, Shld1). Nos récents travaux in vitro indiquent que la polymérase Theta (Pol Theta), un facteur du aNHEJ, promeut la survie de lignées cellulaires lymphoïdes tumorales en l’absence de Xrcc4 et p53. Des animaux présentant en plus une déficience en Pol Theta seront donc générés afin de tester son rôle dans la tumorigénèse in vivo. L’analyse du développement tumoral et des échantillons leucémiques obtenus dans ces différents animaux nous permettra de mieux comprendre l’origine des leucémies et lymphomes humains et potentiellement de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre l’implication relative des différentes voies et facteurs de réparation de l’ADN dans l’apparition de l’instabilité génomique et la transformation cellulaire au niveau de l’organisme. A plus long terme, il pourrait nous permettre d’élargir le répertoire des stratégies thérapeutiques et d’améliorer le traitement des cancers.

Procédures

Pour l’ensemble des groupes d’animaux, une biopsie de queue sera parfois effectuée sur animaux vigiles pour vérifier le génotype. Ce geste dure quelques secondes et ne sera effectué qu’une seule fois au cours de la vie de l’animal. Pour l’ensemble des groupes d’animaux, la mise à mort sera effectuée soit par dislocation cervicale soit par exposition croissante à du CO2. Le prélèvement des échantillons leucémiques et des organes lymphoïdes sera effectués sur les animaux après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent conduire à une dégradation de l'état général et de l’état corporel, et des difficultés à respirer.

Devenir

La procédure consiste à prélever des échantillons leucémiques et des organes lymphoïdes nécessitant la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Des analyses expérimentales in vitro (protéines purifiées, extraits cellulaires, etc....) et dans des lignées cellulaires humaines, murines ou de hamster (knock-down, surexpression, transfection de mutants, etc....) ont été bénéfiques à la compréhension des mécanismes de réparation de l‘ADN et de la fonction des protéines impliquées. Cependant, ces études ont montré leurs limites pour comprendre in vivo les conséquences de la dérégulation de ces processus sur l’apparition de l’instabilité génomique et la transformation cellulaire. Pour ce faire, nous avons besoin d’une approche génétique dans un système biologique proche de celui du système immunitaire et lymphoïde humain. De ce fait, la souris est l’organisme approprié pour conduire ce projet.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduction maximale possible en se basant sur des résultats déjà publiés et suivant le test statistique log-rank test.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement protégé pour réduire le risque d’infection. Elles seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Les animaux seront surveillés trois fois par semaines et seront mis à mort dès l’apparition de symptômes indiquant une condition générale de l’animal amoindrie telle que la dégradation de l’état corporel, isolement de l’animal, difficulté à respirer, position courbée, signe de stress, apparition visible d’une grosseur susceptible d’être d’origine tumorale (dans le cas de tumeurs lymphoïdes non solides : gros ganglion(s) au niveau du cou, de l’aisselle ou de l’aine, visible même sans palpation).

Choix des espèces

Mus Musculus est un modèle unique pour les travaux de recherche car il peut être génétiquement modifié, ce qui permet une analyse fonctionnelle in et ex vivo d’un gène ou d’un mécanisme donné dans un environnement génétique stable. Ce modèle permet d’étudier les effets combinés de plusieurs gènes. L’étude de chacune des lignées mutantes établies dans ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de réparation de l’ADN et des anomalies menant à l’instabilité génomique. L’étude des voies et lésions oncogéniques des différents types de cancers lymphoïdes qui apparaitront dans nos modèles murins permettra une meilleure compréhension de l’oncogénèse des cellules lymphoïdes B et T. L’analyse de ces tumeurs et leur comparaison avec les données de séquençage des tumeurs humaines permettra la découverte potentielle de nouveaux gènes et/ou bio-marqueurs des cancers lymphoïdes. Le développement des tumeurs se fait entre 1 mois et 6 mois suivant le génotype des souris. Les tumeurs seront prélevées en respect des points critiques. Si aucune tumeur n’apparaît à 12 mois d’âge, les animaux seront mis à mort et sujets à une analyse phénotypique (autopsie).

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères reçoivent des prébiotiques pendant la gestation, subissent des traites de lait sous anesthésie et des prélèvements, tandis que la descendance femelle est sensibilisée par injections d'allergène puis soumise à un gavage déclenchant une réaction allergique, avec prise de température rectale. Le porteur relie l'étude à un essai clinique en cours chez des femmes enceintes allergiques et cherche des biomarqueurs de tolérance. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro le microbiote et le système immunitaire intestinaux.

Objectifs

Les maladies allergiques affectent 30 à 40% de la population mondiale, et l’augmentation globale de leur prévalence en font à ce jour un enjeu de santé public. Les allergies alimentaires (AA) représentent environ 6% de la population industrialisée et elles sont souvent associées à des allergies cutanées comme la dermatite atopique (DA). Les réactions dues aux AA peuvent être systémiques et engendrer des chocs anaphylactiques. Elles sont détectables dès les premiers mois de vie et peuvent perdurer chez l’adulte. Le rôle précoce d’une anomalie de diversité du microbiote a été récemment mis en évidence ainsi qu’un dysfonctionnement au niveau des barrières épithéliales intestinales et du système immunitaire. L’origine du développement des AA est multifactorielle (facteurs génétiques, mode de vie, environnement extérieur, etc…) et dépend notamment du régime alimentaire. Aujourd’hui, il n’existe aucune stratégie thérapeutique préventive du développement de l’AA chez l’enfant. Or, la grossesse représente une fenêtre d’intervention optimale dans la régulation du processus allergique à travers une modulation des systèmes immunitaire et microbien du fœtus, ce qui en fait une piste prometteuse pour la prévention de l’AA. En effet, notre étude préclinique a montré chez la souris une diminution de l’AA après une exposition aux prébiotiques durant la gestation et l’allaitement. L’objectif de ce projet sur 5 ans est de comprendre les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires de l’effet préventif des prébiotiques sur l’AA dans un modèle murin pour identifier des biomarqueurs précoces de la mise en place de la tolérance induits par les prébiotiques administrés pendant la gestation, qui pourrons être alors investigués chez l’homme dans notre étude clinique PREGRALL. PREGRALL évalue l’effet préventif de la supplémentation en prébiotique chez la femme allergique pendant la grossesse sur l'apparition de l’allergie alimentaire et la dermatite atopique chez des enfants à 1 an. (L’étude PREGRALL est financée par le PHRC-I 2015 et a démarré en février 2018).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet préclinique sont d’identifier chez la souris des biomarqueurs associés à la supplémentation en prébiotiques pendant la gestation chez la mère et d’identifier les biomarqueurs associés à la protection de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Ces biomarqueurs pourraient ainsi être investigués chez l’homme dans notre étude clinique PREGRALL. En effet en 2018, nous avons lancé le premier essai clinique au monde évaluant la supplémentation en prébiotique chez la femme allergique pendant la grossesse sur l’apparition de l’allergie alimentaire et la dermatite atopique chez les enfants à haut risque d’allergie. PREGRALL, financé par le ministère de la Santé, recrute 376 femmes enceintes allergiques. Les participantes sont randomisées pour recevoir une supplémentation en prébiotiques ou en placebo, à partir de 20 semaines d’aménorrhée jusqu’à l’accouchement. Le critère principal est l’apparition de la dermatite atopique associée ou non à l’allergie alimentaire chez les nourrissons à un an. PREGRALL nous permet de mettre en place une étude mécanistique ancillaire grâce à une bio-collection d’échantillons réalisée au cours du protocole clinique (sang, selle, lait, placenta, écouvillons jugaux), CIMMAP. CIMMAP vise à améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’allergie, les mécanismes d’action des prébiotiques et à identifier les biomarqueurs précoces de la pathologie ou de mise en place de la tolérance induits par les prébiotiques.

Procédures

Les souris reproductrices femelles et mâles seront mises en reproduction sur 1 semaine. Deux prélèvements de lait seront réalisés sur les souris reproductrices femelles à 10 jours d’intervalle.Un prélèvement de sang sera réalisé sur les souris reproductrices femelles en fin de protocole. Six prélèvements de fèces seront réalisés sur les souris reproductrices femelles à 10 jours d’intervalle en moyenne entre chaque prélèvement. La descendance femelle sera soumise à 2 injections intrapéritonéales espacées de 10 jours et d’un gavage oral en fin de protocole. Un prélèvement de sang sera réalisé sur la descendance femelle en fin de protocole. Quatre prélèvements de fèces seront réalisés sur la descendance femelle à 10 jours d’intervalle en moyenne entre chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Lors du prélèvement de lait chez les souris reproductrices femelles, la traite au niveau des tétines pourrait induire une irritation. De plus, pour le prélèvement de lait, les souris seront anesthésiées. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), une irritation de la gorge et/ou de l’œsophage peut avoir lieu rendant la déglutition difficile. Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude physiologique, immunologique et du microbiote suite à la supplémentation en prébiotique et à l’induction de l’allergie alimentaire.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des prébiotiques et leur influence au cours de la période prénatale.

Réduction

Le modèle animal utilisé a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Pour évaluer l’impact des prébiotiques sur les nouveaux nés, le projet étudiera 3 conditions, les mères avec une alimentation standard (160) et avec une alimentation supplémentée en prébiotique HMO (160) ou GOS/Inuline (160). A l’issu de la reproduction nous obtiendrons 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime contrôle, 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime HMO et 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime GOS/Inuline. Les 96 souriceaux femelles de chaque groupe seront divisés en 2 : 48 souris sensibilisées par voie intrapéritonéale et 48 souris non sensibilisées considérées comme le contrôle négatif intrapéritonéale. Le nombre de reproducteurs a été sélectionné en fonction de l’efficacité de reproduction, du nombre de petits issus de chaque portée, du rapport mâle/femelle obtenu à l’issu de la gestation. Ces nombres permettront d’être statistiquement significatif pour réaliser des tests quantitatifs de comparaison : Anova, Kriskal-Wallis, Mann & Whitney ou t de Student.

Raffinement

Hébergement adéquate, ajout d’au moins 2 enrichissements (dôme, tuyau, coton), utilisateurs expérimentés et qualifiés, utilisation d'anesthésique et tapis chauffant pour les prélèvements de lait. L’observation quotidienne des souris permet de détecter un changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délais. Si un seul signe clinique sévère ou 2 signes notables sont détectés, alors le responsable de la SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délais. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : -Notables : aspects extérieurs : pelage sale, pâleur (yeux, oreille, peau), position recroquevillée, faciès contracté, yeux larmoyants. A la manipulation : réticence à se déplacer, zone urogénitale souillée. Evolution pondérale : perte de poids à 10%.

Choix des espèces

D’après la bibliographie, les modèles murins d'allergie alimentaire (Bouchaud & al. 2016 ; Gourbeyre & al. 2011) sont ceux se rapprochant le plus de la pathologie humaine. Ce modèle est bien établi dans la littérature et dans notre laboratoire. Nous avons débuté notre modèle sur les femelles Balb/cj et afin de rester cohérent dans nos études, nous souhaitons continuer à utiliser ce modèle. Les souris reproductrices femelles seront âgées de 4 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Après 2 semaines d’acclimatation, donc à 6 semaines de vie, elles seront mises en reproduction pendant 1 semaine car c'est à 6 semaines que les souris femelles atteignent leur maturité sexuelle. Les souris reproductrices mâles seront âgées de 6 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Après 2 semaines d’acclimatation, donc à 8 semaines, elles seront mises en reproduction pendant 1 semaine car c’est à 8 semaines que les mâles atteignent leur maturité sexuelle. Les souriceaux seront séparés des mères à 3 semaines de vie correspondant au sevrage. Les souriceaux femelles seront acclimatés 1 semaine et le début du protocole de sensibilisation aura lieu à 4 semaines de vie pour la première injection intrapéritonéale puis à 5 semaines de vie pour la 2ème injection intrapéritonéale. Une semaine après, donc à 6 semaines de vie, nous réaliserons le gavage oral pour déclencher les symptômes de l’allergie. Le protocole d'induction d'allergie commence à 4 semaines de vie car c'est l'âge le plus pertinent pour l'induction de l'allergie et ce modèle d'induction à 4 semaines de vie a été décrit comme un bon modèle d'induction d'allergie dans l'article de Selle et al., 2022 : Prebiotic Supplementation During Gestation Induces a Tolerogenic Environment and a Protective Microbiota in Offspring Mitigating Food Allergy. Les souriceaux mâles seront acclimatés 1 semaine et les études comportementales seront réalisées durant les 2 semaines suivantes car c’est à partir de 4 semaines de vie que la mémoire de la souris peut être étudiée.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est inoculée, avec des injections de traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut nécroser ou s'ulcérer, l'animal étant tué si elle dépasse 2 000 mm³. Il affirme que la validation de ces anticorps ne peut s'effectuer que chez l'animal vivant, l'entrée en essai clinique restant une perspective.

Objectifs

L’immunothérapie constitue un véritable espoir dans le traitement de nombreux cancers, notamment dans ceux sans prise en charge efficace actuellement. Ce traitement consiste principalement en l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules tumorales ou leur microenvironnement afin de limiter la croissance tumorale. Plusieurs types d’anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans ce but, sous réserve que le patient présente bien la protéine ciblée au sein de sa tumeur. D’autres anticorps monoclonaux ont une action immunomodulatrice en levant le mécanisme d’inhibition du système immunitaire induit par la tumeur. Ces mécanismes sont communs à plusieurs cancers et ces traitements récents ont des indications dans déjà sept types de cancers : poumon, rein, vessie, tête et cou, mélanome , maladie de Hodgkin et maladie de Merkel et sont actuellement évalués dans de nombreux autres cancers. Bien que des réponses remarquables et prolongées aient pu être observées chez des patients atteints de cancers avancés métastatiques, un nombre important de patients (80 à 60% selon les cancers) restent réfractaires au traitement.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet permettra de compléter la caractérisation de notre produit par confirmation des marqueurs tumoraux identifiés et permettra de de débuter un essai clinique chez l’homme , dans des cancers ou le besoin médical est très important. Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre candidat médicament et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sur animal vigile. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéale la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 2000mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles de lymphomes T périphériques peuvent induire une splénomegalie, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des souris seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.Une contention légère sera fait sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne durera que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères. La manipulation des souris pour mesurer la masse tumorale n’excédera pas 1 min. elle se fera 3 fois par semaine dont 2 fois en même temps que l’injection des traitements afin d’éviter les manipulations intempestives.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Du fait du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire, la validation d’un traitement par anticorps polyclonaux ne peut s’effectuer que dans un modèle in vivo. Il est nécessaire d’utiliser des animaux pour atteindre les objectifs du projet car cette étude a pour objet l'évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs traitements en préclinique. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité du (des) traitement(s), de caractériser le fonctionnement du (des) traitement(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est efficace.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 -15 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ces tests nous permettent d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique > à 7 sur deux jours consécutifs, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg/kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne.

Choix des espèces

La souris NMRI nude est très largement utilisée pour la mise en place de modèle xénogreffe. De plus elle présente une activité résiduelle du complément murin, ce qui la rend pertinente pour l’évaluer l’activité biologique de nos traitements à base de d’anticorps polyclonaux. Tous les modèles xénogreffe décrit dans ce projet ont été validé et caractérisé dans des publications. Adulte-8-10 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

700 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie orale par le parasite Eimeria pour étudier le rôle d'un type de lymphocytes dans l'inflammation intestinale, puis tués pour prélèvement de tissus. Le porteur situe l'enjeu dans les pertes de production de l'aviculture et annonce un bénéfice uniquement scientifique. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier cette infection, et la perte de poids attendue resterait en deçà du point limite.

Objectifs

L’amélioration des performances de croissance en production avicole s’est effectuée grâce à la sélection génétique et à une optimisation de l’alimentation, mais elle a été réalisée au détriment de la santé des animaux associée à une augmentation de l’incidence des maladies infectieuses. La coccidiose, causée par des parasites du genre Eimeria, représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture induisant des pertes de production ayant de graves conséquences économiques dues à de la mortalité mais surtout de la morbidité. L’infection par Eimeria conduit à une inflammation intestinale importante. Cependant, la nature des différents acteurs cellulaires et moléculaires ainsi que les mécanismes précis conduisant à cette inflammation nécessitent d’être mieux connus. Des travaux montrent l’importance de l’interleukine 17 (IL-17) sur l’inflammation et l’apparition de lésions. Dans ce contexte, et comme les lymphocytes T gamma delta sont des cellules majeures impliquées dans la production d’IL-17, nous avons pour objectif d’étudier le rôle fonctionnel de ces cellules dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria. Nous testerons plusieurs espèces d’Eimeria indépendamment. Pour ce faire nous utiliserons au maximum 700 poulets au total.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est scientifique et nous permettra de mettre évidence le rôle plus ou moins important des lymphocytes T gamma delta sur la physiopathologie de l’infection par Eimeria lors d’une infection primaire.

Procédures

L’objectif de créer une infection expérimentale per os pour étudier le rôle des lymphocytes T gamma delta sur la physiopathologie de l'infection par E. tenella. L’inoculation est de courte durée (20s maximum) et est effectué par du personnel expérimenté. les animaux sont calmes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. Dans le cas peu probable que l’état des animaux exempts de lymphocytes T gamma delta infectés soit pire que les animaux contrôles wild type, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, refus d’alimentation …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales pour l’étude de la physiopathologie de l’infection, la physiopathologie étant est la résultante, lors de l’infection par E tenella, de l’activation et de l’interaction de différents types cellulaires entre eux et directement ou indirectement avec le parasite ou ses antigènes au sein de la muqueuse intestinale conduisant à l’apparition de signes cliniques (exemple des lésions caecales). Par conséquent, l’étude du rôle des lymphocytes Tγδ dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria ne peut être étudié in vitro et nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot est adapté aux buts de cette expérimentation. Les effectifs sont basés sur le nombre d’oocystes qui est le paramètre le plus variable de cette étude. Ainsi, pour avoir un log de différence d’excrétion d’oocystes entre 2 groupes avec une puissance de 90%, il faut 20 animaux ce qui correspond à 2 réplicats de 10 animaux par groupe. Les effectifs utilisés devraient aboutir à suffisamment d’animaux pour permettre de conclure sur le rôle des lymphocytes Tγδ dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria.

Raffinement

Les poulets seront dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté dans un milieu enrichi social et comportemental (petites plaques en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans). Une visite quotidienne est réalisée dans la salle expérimentale afin de surveiller l’état général des animaux et l’apparition d’éventuelle symptômes liés à la maladie. Même si les doses administrées sont déterminées de manière à éviter toute pathogénicité qui entraverait le développement cette étude, le point limite défini est l’observation d’un état de prostration tel que l’animal ne s’alimente plus. La décision est prise de le mettre à mort. Sur l’ensemble des protocoles de multiplication au cours des 3 dernières années, aucun animal inoculé n’a atteint le point limite nécessitant sa mise à mort.

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria tenella, acervulina et maxima. Les œufs étant éclos et le génotypage ayant lieu à J1-J3 d’âge, les expérimentations commencent dès la sortie de l’éclosoir. Les infections seront réalisées à 2 semaines d’âge et les prélèvements seront réalisés à 7 jours et 9 jours post infection (19-23 jours d'âge).

Des souris sont rendues malades par une injection intradermique cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, soit 20 à 30 injections de bléomycine ou d'acide hypochloreux, qui provoquent une fibrose de la peau et des poumons censée reproduire la sclérodermie systémique. 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection unique de cellules souches issues du tissu adipeux dans la veine de la queue, et le porteur décrit des démangeaisons, de petites plaies au point d'injection et une fibrose pulmonaire qui, selon lui, "n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur sang, leurs poumons, leur rate et leur peau.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines (procédure N°1 et N°2 ) ou pendant 6 semaines (procédure N°3) et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes