Système immunitaire
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Nouvelle thérapie pro-résolutive dans le contrôle de l’inflammation responsable du développement tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
7 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une inoculation de tumeur par injection sous-cutanée ou par chirurgie, puis des traitements intrapéritonéaux répétés pendant deux à quatre semaines, pour tester une thérapie contre l'inflammation liée au développement tumoral. Le porteur indique que les modèles orthotopiques du poumon et du mésothéliome altèrent la respiration, atteinte servant de point limite, et que ces modèles peuvent provoquer douleur, perte de poids et baisse de mobilité. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et rend donc l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d'une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d'auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Les essais d'immunothérapie dans le cancer ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques murins. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires et pour cela les approches sont plus spécifiques de populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. Une nouvelle approche consiste à cibler une étape de l’inflammation récemment décrite et nommée la résolution de l’inflammation. En effet, cette étape fait suite à la réponse inflammatoire et permet d’éteindre de manière active la réponse immunitaire tout en permettant la mémoire de celle-ci. Il a été identifié des récepteurs spécifiques de cette étape qui jouent un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie mais aussi dans le contrôle de l’inflammation qui pourrait alors devenir chronique. Celle-ci étant responsable des maladies inflammatoires, d’une mauvaise réponse immunitaire contre les pathogènes, voire du développement tumoral. Nous aimerions donc tester différentes molécules capables d’activer un ou plusieurs de ces récepteurs et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer induit par l’inflammation et/ou ayant des microenvironnements inflammatoires différents. En effet, nous aimerions évaluer le potentiel thérapeutique d’une telle stratégie encore inexplorée avec des traitements de type anticorps monoclonaux, traitement de référence aujourd’hui en immunothérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelle stratégie thérapeutique contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Les injections cutanées se font sous anesthésie générale sur un temps maximum de 10min d'anesthésie. Les injections nécessitant une intervention chirurgicale se font quant à elles sous anesthésie générale et sous analgésie sur une durée maximale de 15min par animal. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal (environ 1min par animal) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L'induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques du cancer du poumon et du mésothéliome : altération de la respiration (point-limite) Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique de ce genre nouveau de médicaments et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.
Réduction
L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces en étape 1 et 5 se verront évalués lors des étapes suivantes limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 à 10 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur une analyse de données dites non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour-nuit de 12h-12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique supérieur à 7 sur deux jours consécutifs ou un score de colite supérieur à 4 sur deux mesures consécutives, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg-kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones du sexe féminin peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Mécanismes de différenciation et du recrutement des cellules myéloïdes dans des conditions de développement tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des implantations de tumeurs, des injections d'induction de délétion génétique, des immunothérapies intrapéritonéales répétées et parfois une omentectomie ou une splénectomie, pour étudier le recrutement des cellules myéloïdes dans le développement tumoral. Le porteur indique que chaque modèle de cancer fait l'objet d'une grille d'évaluation de la douleur et d'un point limite, la mise à mort intervenant dans le respect de ces seuils. Il affirme que les cultures d'organoïdes 3D ne permettent pas d'analyser l'ensemble des populations cellulaires du microenvironnement tumoral.
Objectifs
Les macrophages ont une grande plasticité et leur état d’activation est régulé par l’intégration de signaux de l’environnement tissulaire dont ceux induits dans des situations d’infection, d’inflammation chronique ou de progression tumorale. Les cytokines sont des médiateurs clés de l’activation des macrophages : les interférons induisant des macrophages de type M1 pro-inflammatoires cytotoxiques; les cytokines IL-4 / IL-13 induisant des macrophages de type M2 immunorégulateurs. Récemment, de nombreux états intermédiaires à ces stades M1 et M2 ont été phénotypiquement caractérisés mais leur fonction dans des situations pathologiques reste à déterminer. De plus, les macrophages peuvent être d'origine embryonnaires et résidents dans les tissus, ou se différencier à partir des monocytes circulants et être recrutés sur un site inflamatoire. Nous réaliserons des analyses du recrutement et de l’orientation de la différenciation des macrophages au cours de la réponse immune contre des mélanomes ou des tumeurs du sein ou ovariennes ou pancréatiques. Ces analyses visent à comprendre comment les réponses immunitaires sont détournées par les cellules tumorales afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la progression tumorale et de mettre au point de nouvelles immunothérapies
Bénéfices attendus
Ces analyses visent à (i) comprendre comment les réponses immunitaires sont détournées par les cellules tumorales; (ii) identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la progression tumorale; (iii) mettre au point de nouvelles immunothérapies pour le traitement de cancer résistants aux traitement actuellement proposés.
Procédures
Certaines souris seront directement enrôlées dans des protocoles d'implantation de tumeurs. Le suivi de la pousse tumorale est régulier: une grille d'évaluation de la douleur et un point limite sont établis pour chaque modèle de cancer étudié. Certaines lots d'animauxt recevront un traitement (1 injection intra-péritonéale) d'induction de délétion génétique qui n'induit pas de phénotype dommageable, puis seront enrolés dans des protocoles d'implantation de tumeurs (1 injection sous-cutanée ou intra-péritonéale ou orthtopique, selon le type de cancer). Certaines lots d'animaux pourront recevoir des immunothérapies (1 injection intra-péritonéale tous les 3 jours pendant 2 semaines) visant à réduire la charge tumorale. Enfin, d'autres souris pourront subir un acte de petite chirurgie (omentectomie ou splénectomie) avant implantation ou induction de tumeurs. Dans tous les cas, le schéma expérimental s'étend au maximum sur 4 mois dont 1 mois pour induire la délétion génétique d'intérêt et 1 à 3 mois pour le développement tumoral (4 à 6 semaines pour le mélanome, le cancer du sein ou du pancréas; 10 semaines pour le cancer de l'ovaire). Les animaux subissent au maximum 6 interventions (1 implantation de tumeur - 10 minutes sous anesthésie pour transplantation orthotopique- et 5 injections intrapéritonéales-30 secondes chacune).
Impact sur les animaux
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaire pour nos expérimentations. Typiquement, 3 expériences indépendantes conduites selon le planning joint en annexe 3 (7 animaux non traités/ 7 animaux traités). Nous conduirons des analyses longitudinales afin de réduire le nombre d’animaux enrôlés. Les procédures de transplantation orthotopique des tumeurs permettent de limiter le développement tumoral au tissu cible (pancréas ou glande mammaire). Elles impliquent des actes de petite chirurgie pratiqués par une scientifique ayant suivi la formation appropriée. Les protocoles d’immunothérapie testés visent à réduire la pousse tumorale.
Devenir
Mise à mort dans le respect des points limites définis pour analyse du microenvironnement tumoral et des organes lymphoides drainant le site tumoral.
Remplacement
Les interactions macrophages/tumeurs seront également analysées dans des cultures d’organoïdes 3D in vitro. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’analyser les interactions impliquant l’ensemble des sous-populations de cellules immunes et non immunes retrouvées dans le micrenvironnement tumoral. Les données bibliographiques montrent que les dialogues entre cellules cancéreuses, cellules immunitaires et cellules du stroma tumoral jouent un rôle important dans l'éradication ou l'échappement des cancers et la résistance aux thérapies. Il est donc capiltal d'analyser des modèles murins pré-cliniques in vivo qui récapitulent tant sur le plan génétique que cellulaire la physiologie des pathologies cancéreuses humaines.
Réduction
Typiquement, 3 expériences indépendantes ; analyses longitudinales afin de réduire le nombre d’animaux enrôlés. Les protocoles d’immunothérapie testés visent à réduire la pousse tumorale. Nous appliquerons des tests statistiques permettant de comparer les groupes traités (n=7) /non traités (n=7) par immunothérapie. En effet, nos expériences antérieures (Etzerodt, J Exp Med 2019 ; doi.org/10.1084/jem.20182124) incluaient 6 animaux par groupe. Cependant, la pousse tumorale étant parfois hétérogène, nous préférons dans ce projet inclure 7 animaux par groupe afin d’augmenter la puissance du test statistique.
Raffinement
Notre projet propose (i) des injections orthotopiques afin de réduire l’invasion tumorale, suivant des protocoles d’implantation en accord avec les recommandations en terme d’anesthésie et d’antalgie ; (ii) un suivi longitudinal de la pousse tumorale par imagerie in vivo. Dans chaque modèle tumoral, des points limites spécifiques seront appliqués. Les conditions d'hébergement des souris au CIML respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE : surface des cages; matériel pour confectionner des nids; Température/Hygrométrie/Photopériode contrôlées.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus adaptée pour étudier les réponses immunitaires et l’immunopathologie car les systèmes immunitaires murins et humains sont très proches. Par ailleurs, l'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés [souris transgéniques; souris "knock-in"; souris "knock-out" dans la lignée germinale ou conditionnel] que nous utiliserons dans ce projet.
Étude de la fonction des DNASEs extracellulaires dans l’immunosurveillance des cancers.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-mammaire de cellules tumorales, des chimiothérapies et immunothérapies répétées par voie intrapéritonéale sur deux semaines, des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux jours et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'enzymes dégradant l'ADN tumoral dans l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort après avoir atteint les points limites ou pour prélever leurs tissus. Il décrit cette question comme "fondamentale" et affirme qu'une étude sur échantillons humains ne peut remplacer des souris génétiquement modifiées développant des tumeurs mammaires.
Objectifs
Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité anti-tumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par l’ADN tumoral. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération de l’ADN tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et « booste » l’immunité anti-tumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité de l’ADN dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité anti-tumorale. Nous avons caractérisé récemment des enzymes dont la fonction principale est de couper/digérer l’ADN libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience d’une de ces enzymes limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire anti-tumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de ces enzymes, ciblant l’ADN tumoral, dans la régulation de l’immunité anti-tumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de ces enzymes dans la régulation de l’immunité anti-tumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser le rôle d'enzymes ciblant l’ADN tumoral dans la régulation de l’immunité anti-tumorale induite par différents traitements couramment utilisés en thérapie des cancers. C’est une question fondamentale car l’ADN libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Il semble que ces enzymes soient requises pour l’induction de l’immunité anti-tumorale induite par certaines chimiothérapies selon nos résultats préliminaires. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancer.
Procédures
1. L’injection intra-mammaire des cellules tumorales est effectuée sur des animaux anesthésiées en moins d’une minute. 2. Injection intrapéritonéale avec des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie (5 injections tous les 2 jours) et immunothérapies (3 injections tous les 4 jours) est effectué durant 2 semaines sur des animaux vigiles. Cette injection est très rapide et dure moins de 30 secondes par souris. 3. La mesure de la taille tumorale est effectuée tous les deux jours avec un pied à coulisse sur des animaux anesthésiées. Cette procédure dure moins d’une minute par souris. 4. Les prélèvements sanguins sont effectués sur des animaux anesthésiés à deux reprises espacées de deux semaines. Cette procédure est très rapide et dure moins d’une minute par souris. 5. La vaccination par les cellules tumorales morte en sous-cutanée sur des souris anesthésiées s’effectue à 3 reprises espacées d’une semaine. L’injection dure environ une minute par souris.
Impact sur les animaux
1. La présence de tumeur du sein chez la souris peut impacter le bien-être des animaux. 2. Le traitement des souris par des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies) peut induire des effets secondaires (dans notre cas mineurs) qui peuvent impacter le bien-être des animaux. 3. Les prises de sang chez les animaux peuvent conduire à un affaiblissement transitoire. 4. Les injection sous-cutanées et intrapéritonéales peuvent induire un inconfort transitoire des animaux
Devenir
Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront mis à mort à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.
Remplacement
Afin d’étudier la fonction des enzymes coupant/digérant l'ADN des cellules tumorales dans l’immunité anti-tumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitement anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés qui à la fois ont des déficiences en ces enzymes digérant l’ADN et développent spontanément des tumeurs mammaires. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet car nous travaillons sur le cancer du sein. Cependant, les souris mâles issues de nos croisements ne seront pas mises à morts mais utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité et pour le maintien de nos colonies.
Raffinement
1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maîtrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections s.c, ainsi que la mesure des volume tumoraux sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort et la douleur incombé par ces procédures.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car des souches génétiquement modifiées déficientes pour les enzymes qui digèrent l’ADN que nous étudions sont disponibles et permettent de répondre au mieux à nos objectifs. Des souris génétiquement modifiées qui développent des tumeurs mammaires seront aussi utilisées dans notre projet. Celles-ci sont idéales pour notre étude car elles récapitulent très bien le processus de développement des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un excellent modèle d’étude et facilite l’applicabilité des résultats à l’Homme. Nous utiliserons les souris adultes entre 8 et 14 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle de nos enzymes digérant l’ADN dans l’induction de l’immunité anti-tumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein, une pathologie qui affecte presque exclusivement l’adulte.
Choc septique et traitements innovants (B1-bloquants)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 120
1 260 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur provoque un choc septique, avec pour certains une chirurgie avec réveil, puis des enregistrements cardiaques sous anesthésie, les animaux du modèle présentant isolement, faiblesse, perte de poids et baisse de température. Le porteur évalue l'effet de médicaments B1-bloquants sur les fonctions d'organes et la réponse immunitaire pendant le sepsis. Il justifie le recours aux animaux par la complexité d'une pathologie touchant plusieurs organes simultanément.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer les effets des B1-bloquants sur les fonctions d'organes et la réponse immunitaire au cours du sepsis à travers l'étude de voies de signalisation ou de mécanismes potentiellement impliqués.
Bénéfices attendus
La septicémie, principale cause d'admission dans les unités de soins intensifs, est caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée résultant d’une infection non contrôlée. En dépit de la mise en œuvre des directives internationales, des progrès médicaux constants et des milliards dépensés chaque année, le traitement du sepsis est principalement symptomatique. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d'un traitement curatif, les B1-bloquants.
Procédures
Tout animaux seront soumis à au moins une injection (Induction du modèle, administration du traitement, ...) ou un prélèvement sanguin. Il est prévu de réaliser une procédure chirurgicale avec réveil sur environ 70 animaux (30 minutes). Les animaux pourront aussi subir des procédures d’enregistrement de paramètres physiologiques sous anesthésie : échocardiographies, électrocardiogrammes et enregistrement de potentiels évoquées moteurs. Tous les prélèvements de tissus seront réalisé sur des animaux préalablement euthanasiés
Impact sur les animaux
Les animaux représentatifs du modèle présentent un changement de comportement (comme l’isolement), un état physique altéré (comme des faiblesses au cours de la marche), des sécrétions (rhinites), ainsi qu’une perte de poids et une diminution de la température.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés dans les 24 heures suivant la création du modèle de sepsis ou son placébo.
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans cette étude, est dictée par la complexité de cette pathologie touchant plusieurs organes simultanément. L’effet ne peut donc être considéré qu’à l’échelle d’un organisme. De plus, il existe une bonne corrélation entre les données obtenues chez les rongeurs (en cas de synergie des résultats des deux modèles étudiés) et l’Homme au cours du sepsis
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous nous sommes appuyés sur les travaux antérieurs réalisés au sein du laboratoire, sur une analyse bibliographique poussée de cette pathologie et une optimisation des prélèvements sanguins et des prélèvements tissulaires effectués après euthanasie sur chaque animal
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des rongeurs et ce afin de déceler tout excès de douleurs. Le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres suivants : i. Comportement; ii. Etat physique; iii. Sécrétions; iv. Poids; v. Température. Tous ces critères sont évalués fréquemment. Si le score dépasse le seuil fixé, les animaux seront euthanasiés. l'admnistration d'analgesique est également prévu.
Choix des espèces
- L’étude du choc septique, à travers l’utilisation de souris comme espèce animale, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Une mise en perspective de nos résultats sera donc plus aisée, même si les effets des B1-bloquants, au cours du sepsis, restent, eux, très peu étudiés à ce jour. - Ce modèle a fait l'objet de recherches exhaustives, de sorte que tous les aspects du cycle de vie de l'animal et leurs incidences potentielles sur l'expérimentation sont relativement bien connus. - Un large éventail de techniques sont adaptées aux souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. - Une étude analysant les mécanismes physiopathologiques impliqués suite à l’administration de B1 bloquants sera entreprise dans un avenir proche. Cette étude utilisera des souris transgéniques. Une recherche de synergie avec ce projet pourra alors être entreprise. Les souris mâles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront agés de 6-8 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois pré pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 300g lors de leur utilisation. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois pré pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. La grande majorité des animaux (80-90 pourcent) seront des souris. Les rats (10-20 pourcent) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang et ce afin de réduire le nombre d'animaux total.
Conséquences des défauts de réparation de l’ADN sur le développement du système immunitaire et système nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
911 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations dans les voies de réparation de l'ADN, elles subissent des prélèvements sanguins tous les quatre mois pendant un an et développent pour certaines des syndromes tumoraux, celles-ci étant tuées dès l'apparition des tumeurs. Le porteur étudie le rôle de la réparation de l'ADN dans le développement des systèmes immunitaire et nerveux et dans la genèse de cancers comme la leucémie lymphoïde chronique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro" pour ces processus de développement.
Objectifs
Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont les lésions génomiques les plus toxiques et font pourtant partie intégrante de processus biologiques au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions ont été conservés au cours de l’évolution afin d’éviter l’instabilité génétique qu’elles peuvent engendrer. La mauvaise réparation des CDB est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme allant de certaines maladies neurodégénératives (Ataxie télangiectasie), aux déficits immunitaires sévères en passant par le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des CDB se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort massive des neurones. Néanmoins, les voies de réparation de l’ADN constituent des cibles thérapeutiques privilégiées pour le développement des traitements anticancer. Notre laboratoire a identifié plusieurs gènes impliqués dans diverses voies de réparation des CDB à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme. Depuis de nombreuses années nous associons ces études issues du patient au développement de modèles animaux d’invalidation génique afin de mieux comprendre la physiopathologie des facteurs identifiés.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet une meilleur compréhension du rôle des mécanismes de réparation de l'ADN au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux central. Ce projet nous aidera également à mieux comprendre comment les défauts de ces mécanismes de réparation participent à la genèse de syndromes tumoraux que l'on rencontre en pathologie humaine, notamment la leucémie lymphoïde chronique.
Procédures
sacrPour évaluer la survenue de leucémie chez les animaux porteurs de mutation dans les voies de réparation de l'ADN, des prélèvements sanguins (une minute sous anesthesie) seront réalisés tous les 4 mois sur une période de 1 an (soit 3 prélèvement par animal) pour l'analyse de l'apparition de cellules pré-leucémiques.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables que nous anticipons sont le développement de syndromes tumoraux dans certaines situations. Les animaux seront particulièrement suivis pour l'existence de ces tumeurs et euthanasiés dès leur apparition.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélèvements d'organe et analyse phénotypique
Remplacement
Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont des processus très complexes pour lesquels il n’existe malheureusement pas d’alternative in vitro aux analyses sur animaux entiers pour avoir une vision d’ensemble. Pour certaines études mécanistiques il existe néanmoins la possibilité d’utiliser des lignées cellulaires après immortalisation in vitro des lymphocytes. Nous utiliserons cette approche afin de diminuer le nombre d’animaux dans la mesure du possible.
Réduction
Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement sacrifiés. Les animaux sont par ailleurs maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social.
Choix des espèces
Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont particulièrement bien étudiés depuis de nombreuses années chez la souris. De nombreuses lignées mutantes existent déjà et peuvent être croisées sur de nouveaux modèles. Le développement de nouvelles technologies permet l’ingénierie de mutations « fines » calquées sur les mutations observées en pathologie humaine. De nombreux réactifs existent pour l’analyse phénotypique des modèles murins. - Pour évaluer le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines) - Pour confirmer un éventuel phénotype dommageable embryonnaire, les embryons seront récupérés à E18, date à partir de laquelle il est possible de réaliser un immunophénotypage - Pour évaluer le phénotype dommageable sur le système immunitaire, les animaux seront sacrifiés à 6-8 semaines, période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel
Etude d’effets physiologiques de l’administration d’une solution probiotique lactofermentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Maintenues à la main, des souris reçoivent à la pipette, de façon répétée, un jus de fruit probiotique lactofermenté, après dix jours d'habituation à la même manœuvre avec de l'eau. 100 souris, jeunes adultes de huit semaines et souris âgées de 48 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec trois séries de prélèvements de sang, de selles et d'urine et 40 minutes de tests d'anxiété : boîte blanche, labyrinthe en croix dont deux bras donnent sur le vide, boîte à zone d'ombre et zone fortement éclairée. Le porteur écrit que l'administration manuelle "peut entrainer un stress chronique car répété", et promet dans le même résumé des soins "afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude". À la fin, toutes sont tuées pour recueillir leur matériel biologique, dont du tissu intestinal et cérébral, des prélèvements qu'il dit impossibles chez l'humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de l’administration d’un jus de fruit probiotique lactofermenté sur la physiologie du microbiote et de l’intestin. Le projet a recours à un modèle de souris afin de permettre l’étude de la physiologie de l'intestin et du comportement. La physiologie des animaux sera étudiée à partir d’analyse des selles, des urines, du sang, et de prélèvements intestinaux, ainsi que sur un plan comportemental avec une batterie de tests pour évaluer leur état d’anxiété. Un maximum de 100 souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’améliorer la connaissance sur l’impact de produits probiotiques alimentaires vivants sur la physiologie de la muqueuse intestinale. Les bénéfices seront à destination des humains, pour valider l’effet sur la santé d’une administration de probiotiques vivants. Les bénéfices à long terme consistent à développer des aliments probiotiques vivants à effets dirigés et connus dans un but de personnalisation.
Procédures
Des prélèvements de sang, de selles et d'urine seront réalisées au moment des manipulations des animaux (3 fois pendant la durée du protocole et espacés de 14 jours). Les tests comportementaux consistent a l'étude de l'anxiété d'exploration. L'ensemble des tests dure 40 minutes. L'animal dans une boite blanche pour étudier son déplacement, dans un labyrinthe en forme de croix, avec deux bras donnant sur le vide et deux bras protégés, et enfin dans une boite présentant une zone d'ombre et une zone fortement éclairée.
Impact sur les animaux
L’administration manuelle de la solution peut entrainer un stress chronique car répété. Cependant, la qualité sucrée de la solution peut aussi induire un conditionnement de l’animal, de plus une période d'habituation de 10 jours d'administration d'eau à la pipette sera réalisée avant le début de l'étude. Les tests comportementaux peuvent induire un stress temporaire le temps de la passation.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir recueillir le matériel biologique pour les études au laboratoire.
Remplacement
Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes pour étudier le retentissement à un niveau physiologique de l'administration de probiotiques (actuellement recours à des organoïdes permet seulement l'étude au niveau cellulaire voir tissulaire). L'étude nécessite des investigations sur des prélèvements non possible chez l’homme (tissu intestinal total, tissu cérébral). L'utilisation d'animaux permet de garantir une qualité scientifique optimale, en contrôlant a maxima les influences du milieu extérieur, ce qui est impossible chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour le protocole a été réduit au minimum mais reste élevé du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition à la solution sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter la souffrance lors de l’administration de la solution, celle-ci n’est pas faite par gavage mais par délivrance orale à la pipette lors d’une manœuvre de contention manuelle. Pour limiter le stress engendré par la contention manuelle et l'administratin à la pipette, une période d'habituation de 10 jours d'administration de 20µL d'eau à la pipette lors d'une manoeuvre de contention manuelle sera réalisée, de plus l'habituation permettra de prévenir un biasi d'administration du volume par salivation ou régurgitation. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger). Dans le cas où les souris mâles viendraient à se battre, il est prévu de les isoler en cages individuelles.
Choix des espèces
La connaissance de la physiologie intestinale et immunologique de la souris est avancée. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. 1 lot d'animaux sera acheté à l’âge de 6 semaines, et sera utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines, ce lot correspond à l'âge adulte jeune, et permet d'étudier le retentissement physiologique sur un organisme pleinement fonctionnel. 1 lot d'animaux « âgés » de 48 semaines sera utilisé pour l’étude afin d’étudier l’impact des produits sur la physiologie des sujets âgés.
Développement et validation par des composés modèles d’une procédure expérimentale pour évaluer des effets de perturbateurs endocriniens suspectés sur le système thyroïdien et l’immunité de la truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
3 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 400 un niveau léger. Dès la fécondation et pendant six mois, elles sont exposées à deux perturbateurs de la thyroïde, puis infectées par un virus, l'infection pouvant provoquer une exophtalmie, une perte d'équilibre et la mort. Le projet vise à valider un protocole d'évaluation des perturbateurs endocriniens sur la thyroïde et l'immunité du poisson. Le porteur affirme que les tests in vitro ou sur embryons ne peuvent se substituer à l'étude sur un organisme complet.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer et valider un protocole d’évaluation des effets potentiels de différentes substances perturbatrices endocriniennes chez un poisson d’eau douce modèle, la truite arc en ciel (TAC), en utilisant 2 composés modèles, le propylthiouracile (PTU) et la triiodothyronine (T3) dont les effets perturbateurs ont été décrits. Ce protocole sera mis en œuvre sur les premiers stades de développement de la TAC, en ciblant de manière originale et novatrice les effets sur le Système Hormonal Thyroïdien (SHT) et le Système Immunitaire (SI) ainsi que les interactions entre ces deux systèmes. Les essais intègreront un suivi de différents paramètres (morbidité/mortalité, suivi des modifications morphologiques, modification du comportement, taux d’hormones thyroïdiennes, réponse immunitaire, histopathologie) et de la résistance à une épreuve infectieuse au virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (vNHI) après une exposition chronique aux composés modèles de plusieurs mois.
Bénéfices attendus
Afin d’évaluer le danger de composés suspectés d’avoir des effets perturbateurs endocriniens, il est nécessaire de disposer d’un système expérimental in vivo validé avec des composés modèles connus pour leurs effets positifs ou négatifs sur le système thyroïdien (hyper- et hypo-thyroïdie). En plus d’apporter des informations sur le lien entre le système immunitaire et le système thyroïdien, ce projet apportera des données de toxicité du PTU qui permettront d’approfondir l’évaluation de sa dangerosité comme perturbateurs endocriniens (PE).
Procédures
Pour chacune des deux procédures, les poissons seront exposés partir de la fécondation et pendant les 6 premiers mois de vie à différentes concentrations de deux substances perturbatrices du système thyroïdien : le PTU (procédure 1) et T3 (Procédure 2). A la fin de cette exposition chimique les poissons seront soumit à une épreuve infectieuse via une infection au vNHI (viruse de la Nécrose Hématopoïétique Infectieuse) par balnéation puis observé pendant 6 a 8 semaines. Au cours de ces expositions et infections 5 prélèvements (P) seront faits post-mortem aprés 1 mois (P0), 3 mois (P1), 6 mois (P2) d’expositions chimique, 96h post infection (P3) et au termes de l'expérimentation (P4) afin d’obtenir des données de morphométrie, d’histologie, de dosage d’hormones thyroïdiennes, d'immunologie et de comportement.
Impact sur les animaux
- Induction possible d’un léger stress des animaux du fait des conditions expérimentales. - Peu d’effets indésirables visibles attendus sur les animaux qui seront exposés à de faibles concentrations de contaminants (doses dites sublétales). - Comportements et symptômes caractéristiques de l’infection virale (exophtalmie importante, perte d’équilibre, …), avec une mortalité débutant en moyenne à 5-7 jours post-infection.
Devenir
Les animaux restants seront mis à mort, pesés et conservés à -80°C pour analyse.
Remplacement
L’étude des perturbations endocriniennes nécessite la mise en place de systèmes biologiques représentatifs de la complexité du fonctionnement d’un organisme. Elle ne peut pas être substituée, notamment pour l’étude des effets sur différents systèmes et des interactions entre ceux-ci, par des méthodes alternatives (tests in vitro ou embryo larvaires).
Réduction
Ces procédures expérimentales seront menées en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique et statistique. Le nombre maximum de poissons a été estimé à 3600, répartit comme suit : - 1800 pour la procédure 1 (150 poissons x 3 réplicats x 4 conditions (Contrôle + 3 concentrations de PTU) ; - 1800 pour la procédure 2 (150 poissons x 3 réplicats x 4 conditions (Contrôle + 3 concentrations de T3). Le nombre d’individus a été déterminé statistiquement.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - à réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle des animaux présentant un comportement de nage anormal et/ou des signes de cannibalisme (œil en moins, nageoires abîmées, blessures sur le dos, ...) et/ou de détresse respiratoire.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce idéale : (1) elle est d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes, (2) les caractéristiques spécifiques de cette espèce, notamment la présence de follicules thyroïdiens dans les tissus rénaux, un organe hématopoïétique-lymphoïde important chez les poissons téléostéens, en font un organisme très intéressant pour les études fonctionnelles, (3) c'est une espèce facile à élever en laboratoire, avec un cycle de développement plus long que le poisson-zèbre, ce qui permettra par la suite des expositions chroniques aux stades embryonnaires, larvaires et juvéniles, et (4) son génome, entièrement séquencé, est disponible, facilitant ainsi les analyses génétiques. Les animaux seront utilisés du stade « embryon » au stade « alevin/juvénile » (de 0 à 8 mois post-éclosion), stades qui sont connus pour leur grande sensibilité aux contaminants chimiques.
Suivi de souris lupique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
25 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues de deux lignées développant spontanément un lupus et une insuffisance rénale progressive, elles font l'objet d'un suivi, jusqu'à onze pesées et mesures d'urine hebdomadaires, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids, présenter des lésions de peau, une prostration ou des difficultés à respirer au fil de la maladie. Il affirme ne pas pouvoir remplacer les souris car les organes sont "nécessaires" aux analyses.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mettre à mort des animaux pour prélever des organes et réaliser des analyses cytométriques et tissulaires sur ces derniers. Deux lignées de souris mutantes développant un lupus érythémateux disséminé spontané semblable à la maladie auto-immune humaine, tant au niveau des signes cliniques que du développement progressif d’une insuffisance rénale, seront utilisées dans ce projet. Comme les animaux utilisés peuvent présenter un phénotype dommageable au cours de leur vieillissement, une demande d'autorisation de projet comportant une procédure de suivi des animaux doit être déposée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production de connaissances dans le but d’élaborer des stratégies permettant de traiter efficacement les symptômes du lupus, et par extension, les symptômes observés dans d’autres pathologies inflammatoires autoimmunes.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à une pesée et une protéinurie hebdomadaire, soit un maximum de 11 pesées et protéinuries par animal d'une durée de 30 secondes. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié.
Impact sur les animaux
Les souris pourront développer des effets indésirables dus au développement du lupus : perte de poids, augmentation de la protéinurie urinaire, modifications de l’état général (absence de toilettage, sécrétions nasales et/ou ophtalmiques, alopécie, lésions de la peau), comportement (prostration, difficultés à respirer, agressivité), présence de ganglions. La durée des symptômes pourra varier de quelques jours à quelques semaines, avec une intensité de gravité légère à sévère. Du stress pourra être généré lors des pesées pour le suivi général des animaux et lors de l'injection intrapéritonéale pour réaliser l'anesthésie chimique pour le prélèvement sanguin terminale (durée de 1 minutes maximum).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'organes pour analyses tissulaires et cytométriques.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer les souris car nous avons besoin des organes pour faire des analyses tissulaires et en cytométrie.
Réduction
Il s'agit d'une étude sur 25 animaux, 5 par groupes. Les groupes sont restreints sans nuire aux analyses statistiques et aux résultats du projet.
Raffinement
Les souris seront réceptionnées à l'animalerie, hébergées et suivies au cours du temps. La procédure est une procédure de gravité sévère en raison du phénotype dommageable des deux lignées de souris. Tout au long de la procédure, les souris seront suivies quotidiennement, le registre de soins sera complété en se rapportant à la grille de suivi. Des analgésies seront mises en place en cas de douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons deux lignées de souris développant un lupus érythémateux disséminé spontané semblable à la forme humaine, tant au niveau des signes cliniques que du développement progressif d’une insuffisance rénale. Ces deux modèles murins ont été validés par de nombreux travaux et ce sont les modèles les plus fréquemment retenus pour étudier de nouveaux médicaments dans le lupus. Les animaux utilisés seront agés entre 8 et 30 semaines afin d'étudier des variations tissulaires et cellulaires au cours du vieillissement des animaux. Pour information, le lupus commence à s'installer chez la première lignée de souris à partir de 10 semaines jusqu'à atteindre sa sévérité maximale à 35 semaines ; chez la seconde lignée à partir de 24 semaines jusqu'à atteindre sa sévérité maximale à 72 semaines.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de la Leriglitazone dans un modèle murin de leucodystrophie métachromatique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer une leucodystrophie métachromatique, elles reçoivent la molécule Leriglitazone dans leur nourriture pendant deux à six mois et donnent jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le projet évalue si ce traitement freine la démyélinisation d'une maladie neurodégénérative mortelle, les bénéfices pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe et que la souris est la seule espèce chez qui un modèle de cette maladie a été créé.
Objectifs
Nous avons pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule, la Leriglitazone, dans le traitement des patients symptomatiques souffrant de leucodystrophie métachromatique (MLD), maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse). L’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu.
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Les patients MLD présentent des troubles sévères cognitifs et moteurs (perte de l’équilibre, trouble de la marche) qui sont un calvaire au quotidien et, dès l’apparition des premiers symptômes, l’état des patients se dégrade de façon fulgurante avec un décès certain dans les 2 ans au maximum. Le traitement à la Leriglitazone dont nous proposons d’évaluer l’efficacité, pourrait au niveau cellulaire diminuer la neuro-inflammations, diminuer les lésions cérébrales et prévenir la démyélinisation. Ces bénéfices pourraient s’accompagner au niveau clinique d’une amélioration des fonctions motrices et cognitives des patients et de ce fait soulager leur lourd quotidien et augmenter leur espérance de vie. Il est à savoir également que contrairement à d’autres traitements en cours d’études (comme la transplantation cellulaire), le traitement à la Leriglitazone est non invasif et facile d’administration car per os.
Procédures
Pour évaluer l’efficacité thérapeutique de l’administration orale de Leriglitazone sur le modèle murin de leucodystrophie métachromatique (MLD), le traitement à la Leriglitazone est administré en continu à partir de l’âge de 6mois (dans les croquettes ad libitum) pendant 2 mois ou 6 mois (2 temps d’analyse) avant l’euthanasie des animaux. Pour suivre en longitudinal les effets du traitement à la Leriglitazone, des prises de sang mensuelles sont effectuées. Le nombre de prise de sang est de 2 à 6 selon le temps d’analyse et groupe étudié (à 6 et 7 mois ; ou à 6,7,8,9,10 et 11 mois). Ces prises de sang sont réalisées sous anesthésie et ne durent que 2 minutes au maximum par animal. Durant toute la durée de l’anesthésie, la souris est placée sur un tapis chauffant afin d’éviter un éventuel début d’hypothermie, dont le risque reste faible aux vues de la durée de l’anesthésie qui est de 2 minutes au maximum.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Le traitement à la Leriglitazone devrait améliorer quant à lui le phénotype des souris.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologiques et biochimiques) sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. La prise par voie orale nécessite aussi de tester la voie digestive comme voie d’administration, il faut donc un organisme pour tester ce type de traitement.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façons à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables et adéquats pour analyser nos résultats. Un nombre total de 144 souris (comprenant 2 répétitions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet. Nous avons décidé également de ne pas ajouter un groupe contrôle supplémentaire à notre étude car ces données ont déjà été publiées.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et d'un enrichissement du milieu à l’aide de carré de coton, lanières de kraft et de maison de type celldom. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD qui est génétiquement modifié, dont le phénotype est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de l’administration de Leriglitazone sur notre modèle murin de MLD lorsque les symptômes sont installés, en vue d’une thérapie pour le traitement de patients MLD symptomatiques. Pour cela, les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (pour une acclimatation et habituation au manipulateur) avant le début du traitement qui sera administré à partir 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris. La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois afin de déterminer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone sur le court et long terme.
Étude de l’induction d’une immunité entrainée chez le souriceau en comparasion de l’adulte.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Injectés par voie intrapéritonéale à une puis deux semaines de vie, éveillés et sous contention, des souriceaux reçoivent des immunostimulants censés installer une mémoire immunitaire innée, comparée à celle de souris adultes traitées de la même manière. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus, et le porteur prévoit 20 à 30 % de mises en reproduction en plus parce que le stress de certaines lignées "favorise le cannibalisme", les surnuméraires pouvant être "introduits dans un autre protocole". Des femelles, gestantes ou non, boivent une eau additionnée d'antibiotiques, et toute médication est proscrite pour ne pas fausser les mesures immunitaires. Sur l'injection, le porteur écrit qu'"aucune nuisances n'est observée", puis que "des douleurs légères peuvent être liées à l'injection intra-péritonéale", et juge "impossible d'anticiper" les effets indésirables des immunostimulants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité de divers immunostimulants à induire une réponse immunitaire innée mémoire lorsqu’ils sont administrés en début de vie de l’animal. L’implication du microbiote intestinal sera également étudiée dans la modulation et la mise en place de l’immunité innée mémoire. La stimulation et la modulation des cellules de l’immunité innée en période néonatale pourraient permettre d’induire une réponse durable, avec une mise en place de la mémoire immunitaire innée pour favoriser le contrôle d’infections futures à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Les stratégies de contrôle pour lutter contre les infections sont parfois limitées et trop spécifiques d’un agent (ex : vaccin). L’idée ici est de proposer une nouvelle stratégie prophylactique qui cible l'hôte lui-même et plus spécifiquement son système immunitaire inné. Il repose sur l'utilisation d’immunostimulant favorisant la stimulation des récepteurs de l’immunité, et ainsi booster la réponse immunitaire innée pour mieux contrôler une infection zoonotique présente ou ultérieure (d’où les essais d’induction de mémoire innée).
Procédures
Les souriceaux seront soumis à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants : une fois à l’âge d’une semaine, puis à l’âge de deux semaines. Les souris adultes seront soumises à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants sur la période de 6-8 semaine à une semaine d’intervalle. Cette administration est réalisée sur animaux vigiles sous contention. Pour évaluer l’implication du microbiote intestinal, les souris adultes gestantes ou non recevront des antibiotiques dans l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Il est impossible d’anticiper, mais il est possible que des effets indésirables altérant l’état général de l‘animal puissent être remarqués avec certains immunostimulants. Concernant l’injection intra-péritonéale aucune nuisances n’est observée, en effet, nous utilisons des seringues adaptées (seringue insuline, 30G pour les souriceaux, et aiguille 29G pour les adultes), neamoins des douleurs légères peuvent être liées à l’injection intra-péritonéale.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …).
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par l’établissement). Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. L’étude de l’immunité innée mémoire s’effectuera dans différents organes. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation, les différents organes prélevés sur un même animal seront utilisés autant que possible pour réaliser différents types d’analyse. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes adaptés qui tiennent compte à la fois des traitements immunostimulants et de la répétition des expériences.
Raffinement
Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis 2 fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas
Choix des espèces
Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra d’étudier et décrire très précisément les mécanismes d’induction des réponses immunitaires innées mémoires après l’administration d’immunostimulants. 1. Des souriceaux entre 0 jours et 3 semaines seront utilisés car c’est la fenêtre que nous souhaitons étudier pour l’induction de l’immunité innée mémoire. Des souris gestantes fourniront les souriceaux 2. Des adultes seront utilisés dans le cadre de l’étude de l’immunité innée mémoire, afin de comparer ces évènements entre la période néonatale (premières semaines de vie) et la période adulte (6-8 semaines).
Evaluation de la combinaison de vaccins ARNm et de molécules renforçant la réponse immunitaire pour induire une forte réponse dirigée contre le virus de l’immunodéficience humaine
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales par voies sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique, un marquage aux oreilles sous anesthésie, puis jusqu'à trente prélèvements sanguins et vaginaux étalés sur douze mois, pour tester vingt-cinq combinaisons d'ARN messager et d'immunostimulants contre le VIH. Le porteur indique que les prélèvements répétés peuvent provoquer des lésions irréversibles, oculaires ou de fibrose tissulaire, et que la mise à mort sert à prélever ganglions et rate. Il présente ce travail comme une étape "préliminaire" avant des modèles "plus pertinents" comme le lapin et le primate non humain, et affirme qu'un "organisme entier" doté d'un système immunitaire complet reste "nécessaire".
Objectifs
Malgré des années d'études et un large panel de thérapies contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), les scientifiques peinent à contrôler la propagation et l’échappement du virus. De nouvelles stratégies d’immunothérapies actives et passives voient le jour, comme avec l’utilisation d’anticorps ou la vaccination. La crise sanitaire liée au COVID-19 a mis en avant les vaccins à base d’acide ribonucléique messager (ARNm) et a largement démontré son efficacité comparée aux vaccins conventionnels. Sa facilité de production et d’optimisation permet à cette technologie de s’appliquer à diverses pathologies dont le VIH. Notre laboratoire souhaite combiner des ARNm spécifiques avec des médicaments (immunostimulant) capables de renforcer la réponse immunitaire. 5 ARNm et 5 médicaments ont déjà été validés ces dernières années au laboratoire dans des modèles n'utilisant pas d'animaux. Cependant, l'efficacité réelle de ces médicaments / combinaisons ne peut être observé que chez un organisme entier, possédant un système immunitaire complet et mature. Nous souhaitons donc tester nos différentes combinaisons (25 combinaisons au total) dans des modèles souris afin d'évaluer la valeur ajoutée de nos combinaisons sur le développement d'une forte réponse immunitaire et surtout au long terme. Afin d'obtenir des résultats concluants, nous passerons par plusieurs étapes pour évaluer : l'efficacité et la sécurité de nos médicaments et combinaisons, la dose optimale à injecter, la meilleure voie d'administration et le maintien de la réponse à cours, moyen et long terme.
Bénéfices attendus
Le développement d'une nouvelle prophylaxie par combinaison d'un vaccin ARNm avec un médicament immunostimulant permettrait d'améliorer la réponse spécifique dirigée contre le VIH capable : - D'être maintenue au long terme - D'activer les centres germinatifs (essentiels pour l'induction d'une réponse à large spectre et neutralisante) - D'induire une réponse au niveau des muqueuses (essentielles dans la réduction des risques de transmission du VIH).
Procédures
Lors de cette étude, nous injecterons des combinaisons de médicaments par différentes voies d'administration (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Chaque type d'administration dure moins de 30 secondes à 1 minute . Ces médicaments seront injectés à minima 1 fois, et au maximum 3 fois afin d'évaluer la réponse immunitaire à court (3 mois), moyen (6 mois) et long terme (12 mois). Afin d'identifier nos animaux, nous effectuerons des marquages aux oreilles sous anesthésie gazeuse qui est un acte qui dure quelques secondes au début de chaque étape. Nous effectuerons également de multiples prélèvements sanguins et vaginaux. Ces prélèvements seront fait toutes les 2 semaines (3-6 prélèvements à minima pour les études à court terme, jusqu'à 30 prélèvements étalés sur 12 mois pour les études à long terme). Cette acte dure 1 minute maximum par souris.
Impact sur les animaux
Un inconfort léger est attendu lors du marquage au oreille pour une durée de quelques minutes. Un inconfort léger est attendu lors de l'administration des vaccins (pour les 2 voies : intramusculaire, sous-cutanée) pour une durée de quelques minutes. L'administration par voie intradermique est un geste plus douloureux, induisant un inconfort modéré. Un suivi post-injection sera réalisé pour mettre en évidence une fièvre chez l'animal. Les prélèvements peuvent entrainer un inconfort modéré, notamment à cause de la contention qui peut entrainer un stress et les prélèvements répétés pouvant induire des lésions irréversibles (lésions oculaires, fibrose tissulaire, ...). Pour pallier à cet inconfort, nous effectuerons tous nos prélèvements sous anesthésie gazeuse et nous alternerons les sites de prélèvement afin de minimiser le risque de lésion irréversible.
Devenir
A la fin de chaque procédure, nos animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse. Cette mise à mort est nécessaire afin de récupérer des organes clés impliqués dans le développement et le maintien d'une bonne réponse immunitaire (comme l'analyse des cellules retrouvées dans le ganglion lymphatique, la rate, ...). Ces analyses sont primordiales dans la compréhension des voies induites par nos candidats vaccins. Les résultats obtenus nous permettront d'adapter notre stratégie thérapeutique/prophylactique afin d'optimiser nos vaccins eux-mêmes ou encore d'optimiser les schémas d'injection.
Remplacement
Les études vaccinales nécessitent d’effectuer des analyses préliminaires sur le modèle murin avant de passer sur des modèles plus pertinents tels que le lapin et le primate non humain. Des études préliminaires d’efficacité et de toxicité ont été effectuées sur des modèles in vitro pertinent. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité d’une réponse immunitaire humorale et cellulaire, impliquant généralement une multitude de cellules et d’organes. Dans ce sens, un modèle vivant, dynamique et doté d’un système immunitaire complet favorisera la compréhension des mécanismes sous-jacent liés à l’efficacité vaccinale dirigée contre le virus de l’immunodéficience humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux indiqué pour chaque étape représente un essai pour lequel toutes les combinaisons se révèleraient efficaces. Le nombre d’animaux maximum à utiliser dépendra donc du nombre de candidats vaccins ayant été validé lors de la première étape. En fonction de ces succès, nous adapterons nos expériences afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux à utiliser, notamment par les groupes contrôles négatifs, identiques pour chaque candidats vaccins. Le nombre d’animaux choisi par groupe permet de lisser la variabilité entre individu existant dans les études immunologiques et nécessitant a minima 7 souris pour les groupes essais. Nous évaluerons et déterminerons les groupes d'intérêt afin de minimiser au maximum le nombre de souris utilisé au cours de toutes les étapes.
Raffinement
Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement (en collectivité), des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton, dôme de cellulose et/ou tube rouge transparent). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance en cas d’altération du comportement et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. Dans le cas où nous observons une fièvre ou une douleur, nous mettrons en place un traitement par analgésique ou anti-pyrétique et surveillerons l'animal sur les 48h.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris présentant un système immunitaire complet et reflétant au mieux les réponses que nous pouvons retrouver chez d'autres animaux dont l'homme. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin, notamment dirigé contre le VIH qui nécessite une réponse variée afin de contrôler le virus. Les souris seront âgées de plus de 7 semaines pour s’assurer que le système immunitaire est mature. Des souris plus âgées pourraient biaiser nos analyses due au dysfonctionnement causé par la vieillesse des souris.
Facteurs impliqués dans la leucémogenèse B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
585 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules ou sont suivies dix à douze mois pour laisser survenir une leucémie qui se manifeste par des tumeurs palpables, pour analyser quatre facteurs de la leucémogenèse B. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements et prévoit une mise à mort avant que la tumeur ne dépasse une taille définie. Il affirme que ces processus ne peuvent être étudiés dans des lignées cellulaires et conclut que la génétique connue de la souris "impose" son choix.
Objectifs
Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, de rares cellules B peuvent devenir cancéreuses. Ce processus pathologique peut survenir à différents stades du développement des cellules B. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement, alors que les lymphomes ou myélome ciblent des cellules B plus matures. Malgré d’intenses efforts et d’importantes avancées, les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif d’analyser le rôle de 4 facteurs, connus pour jouer un rôle important dans le développement des cellules B, dans la survenue de la leucémie. Ces 4 facteurs seront étudiés dans un modèle de leucémie chez la souris. Nos travaux relèvent de la recherche publique et sont réalisés au sein d'une unité mixte de recherche.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 4 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, chez qui les conséquences sont souvent fatales. Cette étude devrait donc apporter une contribution originale et importante aux efforts déployés par différentes équipes pour la compréhension des mécanismes de la leucémogenèse en particulier et des différents cancers touchant les cellules B en général (lymphome, myélome, etc). A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques, notamment par des criblages pharmacologiques et des essais d’immunothérapie, ciblant les facteurs qui se révéleront les plus prometteurs.
Procédures
Dans une procédure, les souris subiront une injection de cellules et d’un suivi de la survenue de la leucémie. A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort et certains de leurs organes prélevés pour analyse. Dans une deuxième procédure, aucune intervention n’est prévue. Les souris seront suivies pendant 10-12 mois pour vérifier la survenue de la leucémie, qui se manifeste par l’apparition de tumeurs d’abord palpables à la main lors des examens réguliers, puis visibles à l’œil nu. A la fin de la procédure, les souris seront euthanasiées et certains de leurs organes prélevés pour analyse.
Impact sur les animaux
Deux types de nuisance ou d’effets indésirables sont attendus dans le cas du protocole rapide : l’injection intraveineuse est relativement douloureuse pour les souris. L’injection se fera au niveau des queues des souris. Les souris seront d’abord mises sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). Une anesthésie locale sera en plus réalisée en appliquant une pommade sur la zone de piqure. Par ailleurs, en cas de survenue de leucémie, l’apparition de tumeurs peut gêner le mouvement des souris (voir point 3 : Raffinement). Dans le protocole standard, aucune injection n’est prévue et les nuisances ou effets indésirables sont ceux liés à l’apparition des tumeurs, i.e., mobilité réduite. Dans tous les cas, nous adopterons en plus des critères généraux d’arrêt par rapport à la souffrance (arrêt d’alimentation, amaigrissement, poil hérissé, prostration durable) un critère lié à la taille de la tumeur (< 5 mm). Avant ce point limite, les souris seront mises à mort pour analyse.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse.
Remplacement
La nature des travaux que nous menons, et qui concernent la physio-pathologie du développement des cellules B, impose le choix de la souris dans la mesure où sa génétique est bien connue. En effet, les processus développementaux que nous étudions ne peuvent être abordés dans leur complexité physio-pathologique (développement, interactions avec d’autres molécules et cellules, vieillissement, etc) dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro. Néanmoins, aussi souvent que possible, dans le respect du principe de remplacement, nous utilisons des lignées cellulaires ou d’autres systèmes de culture cellulaire. Enfin, notre démarche inclut également la responsabilisation de tous les membres de l’équipe amenés à faire de l’expérimentation animale grâce notamment à des formations spécifiques et au strict respect des règles en vigueur.
Réduction
Dans toute notre démarche, de l’hébergement des souris à l’expérimentation, nous nous faisons un devoir de respecter la règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement). En étroite interaction avec les animalier(e)s, le nombre des souris est réduit au strict nécessaire permettant de réaliser nos expériences en tenant compte de la reproductibilité et de la significativité statistique. Ci-dessous, nous présentons le nombre de souris prévues dans les 2 cas de figures : 1) succès du protocole rapide, 2) échec du protocole rapide, impliquant le recours au protocole standard. A noter que les nombres totaux de souris sont donnés pour la durée globale du projet. En pratique, les expériences seront échelonnées dans le temps et conditionnées par les résultats de l’étude pilote. 1. Succès du protocole rapide : Dans un premier temps, nous procèderons à une étude pilote dans laquelle nous nous focaliserons sur un seul facteur (sur la base des données de la littérature). Nous utiliserons donc 3 lignées de souris : une pouvant développer à terme la leucémie, une correspond au facteur cible (et contrôle négatif), et une qui permettra l’étude de l’effet du facteur étudié sur la survenue de la leucémie (amplification ou inhibition) (45 souris au total). En cas de succès de l’étude pilote, l’étude défintive, réalisée une fois, sera étendue aux 4 facteurs. Dans ce cas le nombre de souris prévu (incluant tous les contrôles) est de 540 souris. 2. échec du protocole rapide : En cas d’échec de l’étude pilote, nous adopterons une procédure consistant en un suivi à long terme des lignées. Dans ce cas, le nombre total de souris est de 360 souris, dont la moitié sera hébérgée en zone stérile et l’autre moitié en quarantaine.
Raffinement
Le raffinement inclut d’un côté les conditions d’élevage et d’hébergement qui sont optimisées par les animalier(e)s (nombre de souris ne dépassant pas 5/cage, inclusion de différents objets dans les cages, nourriture au sol en cas de mobilité réduite, etc), et d’un autre côté le choix des méthodologies induisant le moins de souffrance. Notre souci premier dans ce contexte est la prévention de souffrances inutiles, incluant notamment l’observation régulière tous les 2 jours, grille de scoring (établie par la SBEA, structure du bien-être animal), respect des nouvelles règlementations mises en place, etc. Pour ce qui est de la grille de scoring, elle est basée sur 3 critères majeurs : I. Aspect (état corporel, état du pelage et de la peau, écoulement, yeux, bouche) II. Fonctions corporelles (surtout respiration) III. Comportement (interaction sociale, posture et mobilité, comportements indésirables) La grille comporte une échelle de 0 à 3 à renseigner pour chaque souris à chaque observation : 0 (normal), 1 (légère altération), 2 (altération forte), 3 (altération très forte). Le score final se décline comme suit : Score total de 0-3: Normal Score total de 4-7: Observer attentivement, envisager l'utilisation d'un antalgique Score total de 8-11: Souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement. Demander un 2ème avis. Considérer l'euthanasie Score total de 12-15: Souffrance sévère. Fin de la procèdure par l'euthanasie de l'animal (sachant que la procédure est impérativement arrêtée lorque le total de point atteint 12).
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle d'étude est justifié à plusieurs titres : 1) sa génétique est bien connue permettant une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu, 4) son ontogénie est bien connue de sorte que les lymphocytes B peuvent être prélevés à des stades précis du développement, 5) il existe une grande panoplie d'anticorps spécifiques et de banques de séquences très utiles à nos travaux et projets.