Système immunitaire

63 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis douze perfusions intraveineuses d'une heure par un cathéter alors qu'elles sont éveillées, avant un prélèvement de sang cardiaque terminal, pour tester un candidat médicament anticancéreux dans un modèle de cancer de la vessie. Le porteur annonce un effet "vaccinal" contre les récidives, à partir de résultats antérieurs, et vise des données précliniques pour un futur essai chez l'humain. Il indique que le cathéter peut s'obstruer et que la pousse tumorale peut gêner la locomotion.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur impliqué dans l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce dernier par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales d’une toute nouvelle famille de molécules activant le TLR3 (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, le candidat médicament adapté à une injection dans le système veineux (ici perfusion intraveineuse sur souris vigiles sans contention) va être comparé en doses croissantes sur 63 souris dotées d’un cathéter pour déterminer : (1) l’efficacité antitumorale, (2) la tolérance et (3) les mécanismes d’action (dont l’action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ce candidat médicament puisse être directement comparable aux études précédentes et à venir.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité du candidat médicament par voie d’administration en perfusion intraveineuse et à trouver sa dose efficace pour une action anti-tumorale. L’hypothèse est également que ce candidat médicament permettra d’éviter les récidives avec un effet vaccinal. Il est testé ici sur un modèle de tumeur de la vessie mais il pourrait avoir des actions sur une multitude de cancer.

Procédures

- Anesthésie pour identification, tonte, injection de cellules tumorales dans le flanc …. (5 min) - Douze traitements (injection intraveineuse lente par le cathéter) d’une heure sur souris non anesthésiées. - Une anesthésie pour prélèvement de sang intracardiaque suivi d’une mise à mort (10-15 min).

Impact sur les animaux

Les animaux sont reçus déjà dotées d’un cathéter dans la veine jugulaire avec un injecteur double qui est susceptible de s’obstruer. Les animaux subiront un stress lors des contentions, mesures, entretien des cathéter, anesthésies et greffe tumorale. L’anesthésie terminale en vue du prélèvement sanguin intracardiaque peut entraîner l’arrêt du cœur. La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort avant prélèvements en point final sans réveil (analyses pharmacocinétiques, biodistribution et biomarqueurs).

Remplacement

Pour cette étude, des souris ayant un système immunitaire complet et dotées d’un cathéter sur la veine jugulaire permettant les injections et les prélèvements seront directement reçues du fournisseur. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent pas être REMPLACEES. Seul un modèle in-vivo, possédant un système immunitaire complet, permet l'étude de l'effet vaccinal thérapeutique et anti-récidives contre les tumeurs. Il en va de même pour les facteurs physiologiques pouvant influer sur l’effet de la molécule testée (biodisponibilité, métabolisation, distribution cellulaire, réponse immunitaire...). Aucune donnée bibliographique n’étant disponible sur ces molécules, seules les expérimentations permettront de disposer de ces données et d'étudier l'efficacité du candidat médicament aux différentes étapes de la progression tumorale. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

Une précédente preuve de concept a permis de déterminer que le nombre de souris prévu pour cette expérience était adapté. Ainsi, la REDUCTION du nombre d'animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats sera respectée, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées. Des études statistiques seront effectuées sur les mesures de croissances tumorales et sur le nombre de tumeurs n’atteignant pas une taille critique.

Raffinement

Le RAFFINEMENT sera respecté par la mise en place d’une définition précise des points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 et isolés pendant le temps du traitement dans des cages transparentes et pourront ainsi se voir à travers les parois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’à de l’enrichissement. Un prélèvement de sang aura lieu à la fin de 2 des 12 traitements sans que l’animal s’en rende compte par le cathéter. Les autres prélèvements seront des prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie. Ce modèle se rapproche donc physiologiquement d’une infusion clinique sur l’Homme. Ce dispositif permet aussi de ne pas piquer plusieurs fois dans la même veine, ce qui peut l’abîmer.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les perfusions intraveineuses. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’EU. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ont également été effectuées sur des souris femelles, ce qui permettra de comparer les résultats de cette étude.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un produit cancérigène suivi d'un agent provoquant une inflammation du côlon, puis sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs organes, afin d'étudier le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les cancers. Le porteur indique un risque de prolapsus rectal et une perte de poids, et renvoie ses retombées thérapeutiques éventuelles chez l'humain à un horizon lointain. Il affirme que la complexité du développement tumoral impose l'animal et revendique une expertise de plus de vingt ans pour fixer les effectifs.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

100 chèvres vont être utilisées, réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant sous-cutané et une injection de lipopolysaccharide dans la jugulaire pour déclencher une inflammation qui imite une mammite, avec une fièvre attendue d'environ deux degrés, suivie de onze prises de sang. Le porteur relie ces travaux à la "capacité d'adaptation" dégradée par la sélection sur la production et vise à terme des animaux "plus résilients, productifs et en bonne santé". Il affirme que la réponse inflammatoire du ruminant ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer les capacités d’adaptation des chèvres à une épreuve inflammatoire, en lien avec leur génotype. Dans le cadre du projet nous produisons et utilisons des chèvres laitières de race Alpine, issues d’une sélection divergente sur le caractère de longévité fonctionnelle (chèvres de génotype Longévité élevée (LGV+) et chèvres de génotype Longévité faible (LGV-). L'ensemble des chèvres est génotypé et caractérisé sur des caractères de croissance, de métabolisme énergétique, de production de lait, de santé et de réponse à des épreuves nutritionnelles afin de mieux comprendre les déterminants de la capacité d'adaptation des chèvres à une épreuve transitoire nutritionnelle. Dans cet avenant, nous proposons de réaliser une épreuve inflammatoire transitoire sur un sous ensemble de 2 groupes chèvres LGV+ et LGV- de ce dispositif afin d’élargir le concept d’adaptation à la réponse anti-infectieuse en relation avec le génotype. En effet, la santé des animaux d’élevage fait partie intégrante de leur capacité d’adaptation et de leur bien-être. Les mammites, en particulier, représentent la maladie infectieuse majeure chez les ruminants laitiers. Pour ce faire, nous proposons une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite afin de doser les cytokines circulantes et caractériser la cinétique de réponse suite à cette stimulation.

Bénéfices attendus

La capacité d'adaptation est une caractéristique qui a été dégradée, chez les animaux de rente, par la sélection pour des niveaux de production élevés. Ce qui a eu des conséquences négatives sur la santé, la reproduction, et la longévité de ces animaux et par conséquent a impacté l'efficacité de production. Les causes du déclin de la capacité d'adaptation sont majoritairement inconnues. La capacité d'adaptation d'un animal est due à des mécanismes adaptatifs opérant à différents niveaux d'organisation physiologique. Ils sont en partie sous le contrôle des conditions d’élevage et de nutrition, du statut physiologique de l’animal, mais aussi de son patrimoine génétique. Nous savons, en particulier, que la longévité fonctionnelle, qui traduit des mécanismes d’adaptation des adultes, est partiellement contrôlé par la génétique. Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle de la génétique sur les capacités d'adaptation des chèvres adultes. A court terme (durée du projet), il doit permettre de valider l’utilisation d’un ensemble de cytokines sanguines pour caractériser la résilience de la chèvre, dans le cadre d’une épreuve in vivo par du LPS (mimant une mammite). Si cette étape est concluante, cela permettra de tester une procédure équivalente, in vitro, à partir de simples prélèvements sanguins (sans épreuve LPS). A plus long terme, ce phénotypage pourra être utilisé, le cas échéant, pour sélèctionner des animaux plus résilients, productifs et en bonne santé, afin de garantir la durabilité de l’élevage caprin.

Procédures

Les animaux seront soumis à la pose d’un implant sous cutané après contention pour la mesure de la température interne de l’animal. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Utilisation d’une seringue à usage unique qui contient l’implant à injecter (de la grosseur d’un grain de riz). Ensuite les chèvres se verront injecter des lipopolysaccharide (LPS : Escherichia coli ultrapur) réalisée au niveau du cou dans la veine jugulaire. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Enfin des prélèvements de sang seront effectués à l’aide d’une aiguille montée sur un prolongateur à partir de ponctions à la veine jugulaire. Pour la collecte de 11 tubes (volumes de 4ml) maximum pour chacune des 100 chèvres du projet : 1 prélèvement de 4 ml toutes les deux heures avant l’épreuve (J-1), puis toutes les deux heures entre l’injection de LPS et jusqu’à 12h, et ensuite une fois par jour jusqu’à 72heures. Soit un volume total inférieur à 50mL correspondant à moins de 1% du volume sanguin total de l’animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang et la pose d’un implant sous cutané pour le suivi de la température. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang et la pose de l’implant. Une douleur et une inflammation transitoires peuvent apparaitre lors de la pose des implants sous cutanés. Une eventuelle nuisance serait l'apparition d'hematome suite aux prises de sang. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite, s. Dans une expérience préalable réalisée sur un petit effectif, l’injection par voie générale (0,5 µg/kg poids vif), de LPS a permis de déclencher une réaction inflammatoire des chèvres qui s'est accompagnée d’une élévation de température réctale moyenne de +1,9°C entre +3 et +6 heures après l'épreuve. Le retour à l’état normal (température et fréquence respiratoire) s’observe entre 12 et 48 heures après l’injection. Ainsi il est attendu que les chèvres impliquées dans cette procédure auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Les nuisances eventuellles en lien avec l'injection de LPS pourraient être une fièvre >40°C, un décubitus prolongé, une perte de poids et efin impliquer une prostration, une cachexie ou alopecie.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, la mise à mort sera opérée par le vétérinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimenté et habilité de la structure, à l’aide d’un matador et suivi d’une saignée. Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

La réponse anti inflammatoire du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Le nombre d’individus a été défini afin de pouvoir évaluer la réponse à l’épreuve inflammatoire en interaction avec le génotype de la chèvre. Dans l'esprit des 3R, nous avions proposé initialement d’évaluer 80 chèvres primipares, car les données d’héritabilité (h²) des réponses immunitaires etaient élevées dans la littérature . Ces heritabilités sont en moyenne plus de 3 fois supérieures à celle de la longévité (h²=0.08 en race Alpine). Les analyses préliminaires (n = 96 chèvres des cohortes 1 et 2) du projet ont montré que le Beta Hydroxy Butyrate plasmatique du sang discrimine les génotypes longévité. Toutefois, une étude récente dans l’espèce bovine, utilisant le dosage de cytokines après stimulation par LPS montre des héritabilités plus faibles (0.07 à 0.15 dans de nombreux cas, et aucune h²>0.15). Ainsi, afin d’atteindre la puissance statistique espérée, nous proposons donc d’augmenter l’effectif total de 20 chèvres, soit 100 chèvres évaluées au total.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur litière paillée. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention manuelle minimale, les animaux étant habitués à être manipulés par les opérateurs de la structure. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance accrue pendant toute la durée du protocole, selon une grille permettant d’évaluer la température, le poids, le comportement alimentaire, l’anorexie, la présence d’un décubitus latéral et l’apparition de comportements anormaux. Un score sera donné par animal et si il est superieur à 2 alors il est sorti de l'experimentation. La mise en place des implants sous cutané pour le suivi de la température sera réalisée par des opérateurs expérimentés et habilités (animaliers), qui côtoient ces animaux quotidiennement. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué en massage sur la zone concernée après mise en place de l’implant. Ces implants permettent donc de relever automatiquement la température et de supprimer les prises de température par voie transrectale. Un traitement en cas d'hyperthermie prolongée est administré. En cas de non recouvrement de l'etat , une euthanasie sera realisée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. Le choix est d'étudier des chèvres primipares non gestantes en lactation.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras ou déficients pendant une à seize semaines, des prélèvements répétés, un gavage ou une injection, pour étudier une protéine des macrophages dans l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur indique que les souris privées de la protéine peuvent développer des lésions cutanées et que celles au régime déficient sont surveillées pour ne pas dépasser 20 % de perte de poids. Il conclut que les cultures cellulaires ne donnent pas un modèle physiologique d'obésité et que la souris est "nécessaire", en vue d'une éventuelle approche thérapeutique chez l'humain.

Objectifs

Le diabète ainsi que l’accumulation de graisse dans un organisme peuvent provoquer une cascade de réactions immunitaires. Ces dernières sont connues comme étant déterminantes dans la survenue d’un diabète de type 2 et les nombreuses complications associées à cette maladie. Les mécanismes impliqués commencent à être connus. Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un modulateur du système immunitaire susceptible d’être impliqué.

Bénéfices attendus

Nous devrions démontrer l'importance de ce modulateur dans la maladie du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences que pourrait provoquer l'absence de cette protéine, uniquement dans les macrophages, et donc de comprendre son rôle dans l’inflammation et la régulation du glucose chez des souris. A terme, influencer l'activité de cette protéine pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique chez l'Homme pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2 et de stéatose hépatique.

Procédures

Selon les groupes, les animaux seront soumis à différents types d'alimentation sur des durées comprises entre 1 et 16 semaines et à des prélèvements répétés (entre 2 et 9 prélèvements par souris) espacés de 2 semaines et qui durent chacun 30 secondes. En fin d’expérience, les animaux subiront une mise à jeun de 16h ou 6h et un gavage ou une injection (10 secondes chacun) suivi de 6 prélèvements de sang. Un groupe d’animaux recevra l’injection d’une molécule pour pouvoir accumuler et récupérer les cellules d’intérêts pour le projet. Cette injection aura lieu une seule fois et durera 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant pas la protéine étudiée (uniquement dans les macrophages) peuvent être amenés à développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Pour cette raison aucun animal ne sera étudié au delà de l'âge de 6 mois, de cette façon nous évitons l'apparition éventuelle de ces plaies. Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins actifs. Les souris placées sous régime décifient vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur procédure afin de prélever différents organes pour les analyser. Nous pourrons ainsi étudier les altérations du foie, des tissus graisseux, et du pancréas par différentes techniques permettant des observations précises au niveau cellulaire, génomique ou protéique et ce afin de bien décrire le processus de la maladie et notamment le rôle de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce sont des études in vitro, elles même appuyées sur des données issues de cohortes de patients, qui ont déterminé le choix de cette protéine à étudier. Cependant, les études in vitro seules, comme les cultures cellulaires, ne permettent pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité, d'homéostasie glucidique et de stéatose hépatique. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour évaluer in vivo l’effet de l'absence de notre protéine d'intérêt au niveau des macrophages, mais également pour définir la réponse globale d’un animal face à la maladie (obésité, diabète, athérosclérose, stéatose hépathique modérée ou majeure).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est de 1430. Afin de limiter le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé́ des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l'évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline successivement. De plus afin de réduire le nombre d'animaux, le groupe contrôle (régime non enrichi ou déficient) servira de comparaison aux cinq types d'alimentation. Pour chaque condition (type d'alimentation et durée), des groupes de 80 souris seront générés (40 qui possèdent la protéine étudiée et 40 qui n'en possèdent pas dans les macrophages), il s'agit du nombre minimal d'individus nécessaire pour analyser correctement les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sur des portoirs ventilés et ont un accès libre et illimité à l'eau et la nourriture. Les conditions de température et d'humidité sont contrôlées et monitorées tous les jours pour qu'elles soient optimales pour les souris. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h), les souris étant des animaux nocturnes une période importante d'obscurité est indispensable à leur bien-être. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum, en effet la souris est un animal grégaire, la vie en groupe est un facteur important pour son bien-être. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du confort des souris, elles bénéficieront de coton et de «maisons» afin de les occuper et qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l'équipe professionnelle de zootechnie. En ce qui concerne les procédures expérimentales nous avons mis en place des fiches de suivi permettant la prise en compte de différents facteurs visibles chez l'animal révélant son bien-être (évolution du poids, comportement, aspect physique). Nous avons également veillé à ce que le matériel soit adapté pour les prélèvement ou l'administration. Nous avons également mis en place des mesures en vue de réduire au maximum les douleurs pouvant être dues aux prélèvements (mise sous anesthésie ou application d'une solution antiseptique).

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant et que nous sommes en capacité d'héberger dans des conditions (surface, température, luminosité) nécessaires à son bien-être. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes n'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Nous avons choisi de commencer les études sur des souris qui ont entre 8 et 10 semaines. Cela correspond à la maturité sexuelle (stabilisation hormonale) et équivaut à l'entrée dans l'âge adulte chez l'Homme.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de tumeurs murines ou humaines, sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine MIF dans la réponse à l'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur indique que la croissance tumorale sera limitée à 300 mm2 pour les tumeurs solides et que les animaux seront tués lorsque les points limites seront atteints, celles qui n'y parviennent pas étant considérées comme "protégées" et tuées elles aussi. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire fidèlement l'environnement tumoral et par l'accès aux modèles transgéniques et humanisés.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur l’inhibition des points de contrôle immunitaires qui permet d’activer le système immunitaire et sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Ce projet est dans la continuité de nos études précédentes au cours desquelles nous avons montré que l’une protéine du système immunitaire, appelée MIF, peut contrôler les réponses anticancéreuses de type immunitaire du patient. Ce projet comporte deux parties : 1) Évaluation de la qualité du système immunitaire dans un contexte d’immunothérapie bloquant les immuno-checkpoints chez des souris avec une expression plus ou moins forte de MIF. 2) Étude de l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient donner des informations pour améliorer les immunothérapies en cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a par objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant l’effet bénéfique de MIF dans l’activité des cellules T . Nos résultats ont démontré que la cytokine pro-inflammatoire MIF est essentielle pour la réponse à l’immunothérapie anti-PD-1 et l’immunothérapie par transfert adoptif en cancer. Nous avons aussi montré que cette réponse est potentiellement dépendante de l’expression élevée de MIF et que la basse expression de MIF pourrait avoir un effet délétère. Nous avons des agents thérapeutiques qui peuvent reverser l’effet d’une basse expression de MIF et potentiellement reverser l’effet délétère. Les résultats qui découleront de ce projet et permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Toutes les procédures seront réalisées lorsque les points limites seront atteints comme décris dans les procédures.

Impact sur les animaux

Les souris seront soit injectées avec des tumeurs murines (MC38,B16) dans les cas des souris 5CATT et 7CATT ou avec des tumeurs humaines (NALM6, Raji ou A549 ) pour les souris NSG. L’injection des tumeurs se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 300 mm2 pour les tumeurs solides et plus de 25% des cellules tumorales dans le sang (~3 semaines) dans le cas des tumeurs sanguines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, lorsque les points limites seront atteints, tous les animaux seront mis à mort. Lorsque l’effet thérapeutique est étudié, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront considérés protégés et seront mis à mort également par anesthésie à l’isoflurane et dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’importance de MIF dans notre modèle et le potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats nous devons passer dans un modèle de souris pour étudier notre hypothèse dans l’environnement tumorale

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon univarié en raison de la taille des groupes. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permettant d’avoir une réelle puissance statistique. Les expériences ne seront réalisées que deux fois et les rates, et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les jours pour limiter leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolation du groupe, absence de toilettage). De plus les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également des points limites spécifiques seront appliqués. Ces mesures assureront le raffinement de l’étude

Choix des espèces

Il est impossible de nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique pour améliorer la maladie, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature