Système immunitaire

Greffées d'une tumeur sous la peau puis injectées de cellules immunitaires reprogrammées, 723 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus. Chaque animal peut subir jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie et six à sept prélèvements sanguins, sur des souris dont le système immunitaire a été modifié pour accepter des cellules humaines. Le porteur affirme qu'on ne peut pas encore se passer d'un modèle sur "organisme entier" avant les essais chez l'être humain. Les retombées annoncées, un traitement plus puissant, plus sûr et moins coûteux, restent renvoyées au conditionnel et à un éventuel passage en clinique.

Objectifs

Notre corps possède des défenses naturelles contre les maladies : le système immunitaire. Celui-ci est constitué notamment de cellules tueuses, qui peuvent éliminer des cellules infectées ou anormales. Cependant lors d’un cancer, ces cellules n’ont pas forcément la capacité de reconnaître les cellules cancéreuses. Ainsi le cancer se propage. Des nouvelles approches de thérapie cellulaire, appelées CAR-T ou TCR-T, améliorent cette capacité à cibler les cellules cancéreuses. Les cellules tueuses issues d’un patient atteint d’un cancer sont modifiées génétiquement pour que celles-ci ciblent au mieux les cellules cancéreuses. Cependant, cette approche est 100% personnalisée : longue, coûteuse et incertaine. Pour contourner ces limites, nous développons une alternative : des cellules tueuses reprogrammées « universelles » issues d’un donneur sain et non pas d’un patient. Ces cellules universelles peuvent s’adapter au système immunitaire de chaque patient, sans risque de rejet, rendant le traitement plus rapide et accessible. L’objectif de cette étude est de tester ces cellules universelles dans un modèle de souris afin d’observer leur comportement et leur efficacité contre le cancer. Nous voulons notamment vérifier si une modification spécifique améliore leur action anticancéreuse. Fort de nos résultats obtenus dans un contexte des cancers du sang, nous souhaitons à présent mener les expérimentations pour éliminer les cancers solides. Ce besoin médical est aujourd'hui très présent, les traitements actuels étant peu efficaces. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et accessibles contre le cancer, en simplifiant la production des cellules T modifiées pour une utilisation en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats positifs de ce projet pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un nouveau médicament de thérapie cellulaire pour les patients en impasse thérapeutique. Ce médicament sera à la fois plus puissant et plus sûr que les traitements actuels, produit à des coûts drastiquement diminués (puisqu'il s'agit d'une thérapie cellulaire universelle) et donc disponibles à l'ensemble des patients qui en ont besoin. De plus, cela permettra d’avoir un modèle de souris pertinent pour les études des cellules tueuses reprogrammées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée, avec anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection de cellules thérapeutiques matures ou immatures par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection d’un médicament afin de permettre la prise de greffe des cellules thérapeutiques immatures (1x/souris, durée ~1 minute). Imagerie sous anesthésie générale, jusqu’à 12 fois par souris (durée ~10 minutes par session, 1x/semaine), précédée d’une injection d’un agent de détection des cellules injectées sur souris vigile (jusqu’à 12x/souris, durée ~1 minute). Prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie et analgésique (6-7x/souris, ~1 minute, 1x/2semaines) et (1x/souris, ~5 minutes, pour le dernier prélèvement).

Impact sur les animaux

Stress : l’ensemble des manipulations, contentions et transports peut engendrer un stress chez les souris. Douleurs légères : présentes après une injection intraveineuse (de cellules T modifiées matures, non matures) ou abdominale et prélèvements sanguins sous antidouleur. Altération de l’état général possible, en lien avec le développement de la tumeur (ex : perte de poids).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous prélèverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint au cours de procédure.

Remplacement

Les cellules tueuses du cancer ont été étudiées en laboratoire. Cependant, la réponse du système immunitaire est très complexe, car elle implique différents types de cellules et des interactions spécifiques. Cela rend difficile à étudier la réponse complète seulement en laboratoire. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris pour ces recherches thérapeutiques, car on ne peut pas encore se passer d'un modèle préclinique avant les essais clinique chez l'homme. De plus, on utilise des souris modifiées et disponibles à l'achat pour avoir un système immunitaire humain, ce qui permet de tester des cellules humaines directement applicables ensuite en essai clinique. Avant d'être testées chez la souris, les cellules ont été validées dans notre laboratoire selon nos meilleures connaissances. Nous obtenons ainsi des informations qui ne peuvent être obtenues que chez la souris et nous les utiliserons pour réduire davantage le recours aux expérimentations animales à l'avenir.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. En effet, un outil statistique a été utilisé pour calculer le bon nombre d’animaux à utiliser. Suivre les animaux au fils du temps par des analyses répétées comme la mesure de la taille de la tumeur (grossissement de la tumeur) et le contrôle du sang entraîne une meilleure analyse de l’effet biologique, ce qui permet des données robustes avec un faible nombre de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi quotidien des animaux afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Des points limites clairs et précoces sont définis pour arrêter le projet afin de limiter la souffrance des animaux. Un tapis chauffant sera mis en place afin d’éviter l’hypothermie de l’animal et du gel hydratant oculaire sera appliqué afin d’éviter un dessèchement des yeux lors des séances d’imagerie. Les animaux seront placés sous anesthésie générale et auront des antidouleurs adaptés. De plus, ce projet fait suite à une étude bibliographique afin de raffiner au maximum les expériences, les injections et les prélèvements. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles et femelles à parts égales (50/50) pour cette étude. Ce choix repose sur le fait que les procédures impliquent des souriceaux, pour lesquelles il n’est pas possible de sélectionner le sexe à la naissance. Par souci de cohérence expérimentale, nous appliquerons donc la même répartition (50/50) à l’ensemble des souris utilisées dans cette étude. À part les souriceaux, dans cette étude nous utiliserons des souris de 4–5 semaines et de 6–8 semaines..

Des injections répétées dans une veine proche de l'œil, deux fois par semaine pendant un à cinq mois, avec un risque reconnu de nécrose et de cécité : 201 souris vont être utilisées, toutes tuées, la plupart dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit d'abord un allergène sur la peau, puis ces injections de cellules sanguines traitées aux ultraviolets, l'épaisseur de l'oreille étant mesurée sous anesthésie gazeuse répétée. Le projet vise à préciser la durée utile d'un traitement déjà employé chez des patients depuis parfois plus de vingt ans. Le porteur situe les points limites au moment où surviennent cécité ou troubles du comportement, complications qu'il juge rares.

Objectifs

Le traitement des cellules du sang par ultraviolets est un traitement de référence de nombreuses maladies immunologiques et permet de traiter des complications sévères de greffes de moëlle osseuse ou de certains rejets sévères de greffes d’organes. Il consiste à collecter des cellules du sang des patients, les mettre en contact avec des ultraviolets (comparables à des rayons du soleil grâce à une machine spécifique) et à les réinjecter par voie intraveineuse, ceci pendant plusieurs mois voire plusieurs années. Il entraine des améliorations de la maladie et limite les complications sévères en agissant sur de multiples cellules ou molécules. Compte tenu de la complexité des maladies chez l’homme et des multiples organes touchés, les études chez l’homme sont difficiles. Il faut souligner que les principales avancées concernant la connaissance des mécanismes d’action de ce traitement ont été permises grâce aux études chez la souris. Récemment l’analyse des réponses du système immunitaires a été améliorée avec la mise en évidence du rôle de cellules mémoires résidant dans les tissus (peau, muqueuse, organes...) appelées cellules résidentes mémoires. Ces cellules protègent d’infections mais peuvent également générer des réactions immunitaires pathologiques et sévères (rejet de greffes, etc…). En plus de ses effets sur le système immunitaire dans le sang ou les ganglions lymphatiques, nous pensons que le traitement des cellules du sang par ultraviolets a un effet bénéfique sur la fonction de ces cellules anormales présentes au niveau de la peau ou d’autres organes et ce traitement pourrait éviter d’entrainer ou d’aggraver la maladie. Plusieurs arguments soutiennent cette hypothèse. Premièrement, l’effet d’un traitement par ultraviolets chez les patients persiste plusieurs mois après son arrêt (suggérant un effet sur des populations cellulaires mémoires des tissus). Deuxièmement, il diminuerait la disponibilité de molécules indispensables à la formation ou la survie des cellules mémoires résidant dans les organes. Il a d’ailleurs été montré que ce traitement par ultraviolets entraine une diminution du nombre de ces cellules mémoires résidant dans le colon, associée à une amélioration de la maladie. Notre projet a donc pour objectif d’étudier la formation de ces cellules résidentes mémoires de la peau ainsi que leurs fonctions et survie dans la peau après un traitement des cellules du sang par ultraviolets. Ceci améliorera le schema de traitement des patients.

Bénéfices attendus

Le traitement des cellules du sang par ultraviolets est un traitement de référence de nombreuses complications immunologiques mais l’insuffisance de connaissance de ses mécanismes d’action limite son utilisation. Ce projet permettra de mieux comprendre son influence sur un plan inexploré des réactions immunitaires anormales, c’est à dire sur les cellules immunitaires persistant au sein des tissus. Sur un plan pratique ceci permettra de préciser les schémas thérapeutiques et la durée d’utilisation de ce traitement chez des patients avec des pathologies sévères et étant souvent hospitalisés, et ceci en se basant sur des arguments scientifiques. A titre d’exemple certains patients sont traités depuis plus de 20 ans par ce traitement et inversement certaines équipes arrêtent ce traitement systématiquement après 6 mois de traitement sans argument scientifique. Sur un plan scientifique, ce projet vise à montrer que le traitement des cellules du sang par ultraviolet exerce un effet bénéfique sur la formation, la fonction, la survie des cellules immunitaires persistant au sein des tissus. Il sera suivi, par des travaux complémentaires aynat pour but d'explorer les voies impliquées dans ce bénéfice induit par ce traitement. Cette étude permettra également de savoir comment utiliser ce traitement pour éviter une récidive au sein des tissus et comment améliorer le planning et l'éfficacité du traitement des patients en ce sens.

Procédures

Les animaux recevront une application sur la peau d’un produit allergisant entrainant une réaction immunitaire localisé sur la peau L’application de ce produit sera effectuée sur le ventre rasé des souris au début des procédures. Ce geste n’entraine pas de douleur (rasage + application du produit) sera réalisé sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. Cinq jours après, les animaux recevront des applications du même produit sur les oreilles à raison de 2 fois sur l’ensemble du protocole afin d’induire une réaction immunologique. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale par injection d’un produit anesthésiant (durée d’injection de quelques secondes et durée d’anesthésie d’une heure) afin d’éviter que les souris ne lèchent le produit avant sa pénétration dans la peau. L’anesthésie durera environ 30 minutes. Les animaux auront également une injection veineuse (qui dure 5 secondes) de cellules du sang préalablement traitées par ultraviolets à raison de 2 fois par semaine sur une période de 1 à 5 mois. Cette injection a lieu dans un veine proche de chaque œil, en alternant le coté d’injection à chaque injection. Les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (1 minute) le temps de l’injection et auront une application d’une pommade ophtalmique anesthésiante. Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine pendant 2 semaines, afin de suivre l’inflammation (l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille étant un des signes de l’inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse (durée de l’anesthésie gazeuse : 1 minute) afin d’éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible. Tous ces gestes seront réalisés par des personnes expérimentées qui les ont déjà réalisés de nombreuses fois.

Impact sur les animaux

L’application de la substance allergisante sur la peau n’entraine pas de douleurs et a l’avantage de n’induire que très peu de démangeaisons. Des anesthésiques injectables seront utilisés avant application cutanée de la substance allergisante pour éviter que les souris se grattent et se lèchent au sein de la zone appliquée. Les souris pourraient avoir des douleurs lors de l’injection intraveineuse dans la veine proche des yeux (ceci est prévenu par pommade ophtalmologique anesthésique et par anesthésie gazeuse) et lors de la mesure de l’œdème de l’oreille avec un petit appareil commercialisé et adapté à ces mesures chez la souris (ceci est prévenu par anesthésie gazeuse). Les injections dans les veines proche des yeux répétées pourraient induire des risques de blessure aux yeux (et au pire une nécrose ophtalmique et donc une cécité) et les anesthésies gazeuses répétées pourraient induire des troubles du comportements (souris prostrées, mouvements répétitifs désorganisés, mutisme, isolement et absence de prise alimentaire). La probabilité que ces complications surviennent reste très faible lorsque les expérimentateurs sont formés. De plus la définition de points limites avec la survenue de ces complications et la décision d’euthanasie en cas de leur survenue permet d’éviter des souffrances aux souris. Ces points limites bien définis (correspondant aux complications ophtalmologiques et troubles du comportement décrits ci-dessus), suffisamment précoces et prédictifs ont été mis en place pour prévenir tout stress et toute souffrance de l’animal et en cas de leur survenue la décision sera alors prise d’euthanasier les souris concernées.

Devenir

Une mise à mort sera réalisée à l'issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d'oganes vitaux (oreille et sa peau).

Remplacement

Il n’existe pour l’instant aucun test in vitro satisfaisant permettant d’évaluer la réponse au traitement par ultraviolets des cellules sanguines

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique. Dans toutes les procédures, nous incluons suffisamment d’animaux avec un nombre de 10 animaux par groupe afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous avons associé la mesure de l’épaisseur de l’oreille sur 10 souris de J30 à J35 et la quantification du nombre de cellules immunitaires de la peau à J30 sur les mêmes expérimentations. Le minimum de souris donneuses sera utilisé pour préparer les différents types de cellules traitées par ultraviolets et injectées aux souris. En effet 1 seule souris permettra de réaliser les 3 types de cellules qui sont réinjectées. Il y aura plus de groupes d’intérêt au début de l'expérimentation mais ceci permettra de définir le meilleur type de cellules à traiter par ultraviolet. Nous garderons alors cette condition expérimentale et ce type de cellules à traiter par ultraviolet pour les autres procédures. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la suite de l'expérimentation et dans les projets futurs qui seront réalisés à la suite des avancées scientifiques permises par ce projet. De plus pour toutes les procédures, nous n’utiliserons que 2 souris pour le groupe témoin nommé « témoin irritation » et qui vise à valider les résultats des mesures d’épaisseur de l’oreille.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l’animalerie, une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Des mesures sont prises pour éviter les douleurs et stress avant chaque geste : utilisation de pommade ophtalmologique anesthésiante et anesthésie générale gazeuse avant injection dans les veines proches de l’œil (qui sera alternée sur chaque œil pour éviter d’éventuels dommages aux yeux, par des expérimentateurs ayant une grande expérience de ce geste), anesthésie générale par injection d’anesthésiques avant application de substance allergisante sur l’oreille (pour éviter que les souris se lèchent) et anesthésie gazeuse lors de chaque mesure d’épaisseur de l’oreille. Le volume injecté par voie intraveineuse de cellules traitées par ultraviolet est limité à 0,1 ml afin d’éviter toute surcharge de volume sanguin à la souris. L’application du produit entrainant une réaction immunitaire sur le ventre de souris sera effectuée après rasage, sans anesthésie car ces 2 gestes n’entrainent aucune douleur. Tous ces gestes sont effectués en routine par notre équipe. Un suivi des souris sera réalisé après chaque injection de cellules traitées par ultraviolet et après chaque application cutanée de produit entrainant une réaction immunitaire afin de contrôler l’absence de modification du comportement ou de la prise alimentaire. L’observation des animaux sera effectuée 5 jours/7 et nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs ont été mis en place pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé dans les études immunologiques en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunitaires. Cette espèce est très proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique. Ce modèle reste indispensable dans le développement et la validation de nouvelles stratégies de traitement immunologiques chez ces patients avec complications immunitaires graves. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées une semaine. Le protocole démarre à 7 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une immunisation efficace.

1 644 souris vont être utilisées, toutes tuées, la quasi-totalité dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune d'abord soumise douze à vingt semaines à un régime gras et sucré pour rendre son foie malade. On leur injecte ensuite des cellules cancéreuses dans le foie, puis des immunothérapies combinées à une radiothérapie interne, avec deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie. Les traitements peuvent provoquer une toxicité de la rate et de la moelle osseuse et une anémie. Les bénéfices avancés pour les patients, moindre toxicité par voie intratumorale et biomarqueurs prédictifs, restent au conditionnel face à ces atteintes présentes.

Objectifs

Ces dernières années, la prise en charge de patients atteints de cancers du foie métastatiques a été améliorée par l’utilisation de traitements appelés immunothérapies. Bien que très efficaces chez certains patients, les immunothérapies ne permettent pas de traiter tous les patients atteints de cancer du foie et nombreux sont ceux qui y résistent. Par ailleurs ces traitements sont très toxiques et induisent des effets secondaires importants, limitant grandement leur utilisation généralisée. Pour augmenter les chances de réponses aux immunothérapies par les patients résistants, une stratégie consiste à combiner les immunothérapies avec un autre traitement : - soit une autre immunothérapie, - soit une thérapie ciblée (chimiothérapie par exemple), - soit une autre technique comme la radiothérapie interne vectorisée (RIV), une méthode en plein essor qui greffe un radioisotope sur une molécule de « guidage » lui permettant d’atteindre précisément sa cible tumorale pour y délivrer la radioactivité en limitant l’altération des tissus environnants. L’objectif de notre projet est donc de tester en parallèle ces trois types de combinaison pour traiter des modèles de cancer du foie métastatiques. Dans le cas particulier de la combinaison immunothérapie / RIV, deux voies d’administration du radiopharmaceutique utilisé pour la RIV seront testées : - l’administration en intraveineuse qui est la méthode standard mais qui n’est pas sans effets secondaires du fait de l’exposition d’organes sains non ciblés via le passage du radiopharmaceutique dans la circulation générale, - et comme alternative, l’administration par voie intratumorale qui limiterait ces effets secondaires. Un autre objectif du projet est d’investiguer les modifications immunitaires post traitements, pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux interactions entre les traitements contre le cancer et le système immunitaire chez l’Homme.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet est de proposer des approches thérapeutiques et de nouveaux éléments de compréhension des mécanismes immunitaires pouvant être applicables par la suite chez l’Homme. Ce projet devrait permettre de mettre en avant une nouvelle stratégie thérapeutique efficace contre les cancers primitifs du foie, à la fois sur une tumeur traitée mais aussi potentiellement sur des nodules distants du site du cancer primaire. La réduction de la toxicité des traitements par l’utilisation de la voie d’administration intra-tumorale plutôt que intraveineuse pourrait également permettre de revoir leurs indications dans certains cancers. De plus, l’utilisation de biomarqueurs ainsi identifiés permettrait chez l’humain de mieux adapter les traitements. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes immunitaires en jeu dans la réponse aux immunothérapies et à la radiothérapie, ainsi que de démontrer l’effet antitumoral, potentiellement synergique, des thérapies combinées. L’investigation des modulations immunitaires post-traitement pourrait permettre de mettre en avant des groupes de cellules immunitaires dont la présence varie grandement entre des individus répondeurs et des non-répondeurs aux traitements (seuls ou combinés). Il sera alors possible d’identifier des potentiels biomarqueurs immunitaires de réponse ou de résistance au traitement. A l’heure d’une médecine de plus en plus personnalisée dans le cas de la prise en charge de cancers avancés, les biomarqueurs permettraient de prédire les chances de réponse au traitement pour chaque patient, permettant de gagner un temps précieux en les dirigeants directement vers une autre option thérapeutique. Ce projet sera aussi l’occasion de mettre en avant la voie d’injection intra-tumorale, qui devrait permettre de réduire significativement les effets secondaires toxiques associés aux traitements, surtout lorsque ceux-ci sont combinés.

Procédures

Dans un premier temps, le développement des modèles est nécessaire et passe par plusieurs étapes : - Tous les animaux seront soumis à un régime riche en gras et en sucre pendant 12 à 20 semaines avant le début des expérimentations pour induire une maladie du foie gras, présente chez la très grande majorité des patients atteints de cancer primitif du foie. - Les cancers du foie seront ensuite induits chez les animaux sous anesthésie générale pendant 30 à 60 minutes, par injection de cellules cancéreuses dans un lobe hépatique. La tumeur mimant une métastase sera induite par injection d’une suspension des mêmes cellules de cancer du foie, toujours sous anesthésie générale. Par la suite, les animaux seront traités sous anesthésie générale par injection avec : - les immunothérapies seules - Les immunothérapies combinées avec de la radiothérapie interne (1 minute par injection, pouvant être répétées tous les 4 jours dans la limite de 3 fois maximum). Dans la mesure du possible, les implantations tumorales intrahépatiques et les traitements intra tumoraux seront fait par voie percutanée. Néanmoins, si les tests de mise au point ne sont pas concluants, une seule chirurgie abdominale sera faite (pour limiter les incisions chez les animaux) soit pour l’implantation, soit pour l’injection intra tumorale. L’autre technique se fera par voie percutanée. Des imageries multiples pré et post traitements sous anesthésie générale (2 par semaine et par animal, d’une durée de 120 minutes maximum, durant toute la durée des études, soit 8 semaines maximum après implantation des tumeurs) seront effectuées pour suivre l’efficacité des traitements, et évaluer les potentiels biomarqueurs prédictifs de réponse. Pour les besoins des traitements et des imageries, des administrations (de traitements ou de produits d’imagerie) pourront être réalisées (3 par semaine maximum, sur 3 semaines maximum). Pour le besoin des imageries, des molécules pourront être injectées sous anesthésie générale (1 minute par injection). Des prélèvements de sang (un seul avant traitement, puis 1 fois par semaine pour un total de 5 prélèvements, pendant 1 minute), sous anesthésie générale ou en vigile, seront effectués pour suivre l’évolution de différents marqueurs sanguins.

Impact sur les animaux

Le régime enrichi en gras et en sucre entraine une accumulation de gras dans le foie (asymptomatique) et une prise de poids de l’animal. Les chirurgies peuvent induire une douleur au site d’incision pendant les 24 à 48h suivant l’opération. Une analgésie sur ces délais sera administrée pour pallier cette douleur, et une attention particulière sera portée après ces procédures. Les anesthésies de longue durée (pendant des sessions d’imagerie) peuvent induire une hypothermie chez l’animal, une désorientation et un stress au réveil. Les prélèvements et injections peuvent entrainer une douleur au niveau du site de prélèvement ou d’injection. Les traitements (immunothérapie et radiothérapie interne) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau d’organes sains, notamment la rate et la moelle osseuse, avec dans ce cas des conséquences possibles sur l’état général (anémie par exemple). La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines.

Devenir

A l’issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever es ’organes pour étudier notamment les populations cellulaires dans les tumeurs et investiguer de potentiels effets secondaires des traitements.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer l‘efficacité thérapeutique de combinaisons de traitements anticancéreux, qui jouent notamment sur le système immunitaire. Il n’est actuellement pas possible de représenter entièrement les interactions complètes mises en jeu au cours d’une réponse immunitaire antitumorale, c’est pourquoi il est nécessaire de travailler sur des organismes vivants. De la même façon, la distribution des traitements injectés par voie intra-tumorale ou intraveineuse diffère, et nécessite de travailler sur des organismes complets pour comprendre à la fois les effets bénéfiques mais aussi les effets secondaires potentiels pouvant intervenir.

Réduction

L’utilisation de différentes modalités d’imageries permettra d’obtenir plusieurs types d’informations chez un même animal, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. De même, la répétition d’imageries et de prélèvements sur un même animal permettra de réduire le nombre de souris utilisées. En effet, grâce à l’imagerie répétée à différents temps, il est possible de faire un suivi dans le temps (cinétique) de plusieurs paramètres, là où auparavant, pour connaitre l’évolution d’un phénomène dans le temps, plusieurs sujets étaient nécessaires. Cette possibilité de suivi dans le temps chez un même animal, par l’imagerie notamment, permettra aussi de répondre à plusieurs questions scientifiques à la fois (évolution de la réponse antitumorale dans le temps, évaluation de la prédictivité de deux biomarqueurs sur un même individu). Le nombre d’individus nécessaires au cours de chaque étude a été déterminé par une approche statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux au minimum suffisant pour garantir la validité et l’interprétabilité des résultats.

Raffinement

Les souris, âgées de 4 à 5 semaines, seront hébergées par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, des bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue au début de leur séjour et avant de débuter le régime alimentaire spécifique. Les animaux nourris avec le régime et porteurs de tumeurs feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi à minima hebdomadaire du poids au cours du traitement. Toutes les interventions invasives (injections, chirurgies), ainsi que les imageries, seront réalisées sous anesthésie générale afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage de réveil. Les traitements pouvant induire des effets secondaires, seules des doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature seront utilisées pour limiter la toxicité. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Les animaux seront observés quotidiennement et un ensemble d’indicateurs prédictifs de douleurs ou stress éventuels a été mis place. Le moindre signe de mal-être (prostration, dépilation, refus de s’alimenter…) entrainera une évaluation précise de l’état général de l’animal, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Des mesures adaptées seront mises en place pour éviter ou limiter la douleur, notamment par l’administration d’antalgiques lorsque cela est nécessaire. Enfin, des critères d’arrêt d’expérience clairs seront définis : si un animal présente des signes de souffrance ou un état de santé dégradé, il sera retiré de l’expérimentation et pris en charge de manière appropriée.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux axes thérapeutiques qui peuvent être directement transférables à l’humain. La souris est une espèce de choix pour la mise en place de modèle tumoraux. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine (ici le foie), environnement rendu pathologique par un régime, permettant ainsi de mimer les cancers du foie majoritairement développés sur une maladie hépatique, sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Par ailleurs, les traitements associés dans ce projet ont déjà démontré, utilisés en monothérapie, leur efficacité sur la souris et chez l’Homme, ce qui rend cette espèce pertinente pour des études d’efficacité et d’étude de mécanismes immunitaires communs aux deux espèces. Par ailleurs, le travail sur le modèle de la souris permettra de positionner ces recherches dans le cadre des précédentes études en interne et décrites dans la littérature, pour ainsi renforcer les hypothèses étudiées et les résultats obtenus, permettant de mieux pouvoir les compléter et les comparer. Les souris utilisées dans ce projet seront de jeunes adultes (5 semaines) ou adultes (8 semaines). Cette tranche d’âge est représentative de l’âge de la majorité des patients atteins de cancers hépatiques.

Une partie des souris utilisées porte une modification génétique qui leur fait développer un lupus, les autres reçoivent une huile minérale qui déclenche la même maladie huit semaines plus tard. 2140 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont tondues puis exposées à des UVB sous anesthésie, ce qui provoque des rougeurs, une inflammation et, à force de répétition, des lésions de la peau. Le projet cherche à relier la sensibilité au soleil des patients lupiques à une molécule produite par certaines cellules immunitaires.

Objectifs

Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune (où le système immunitaire attaque le corps lui-même) qui touche principalement les femmes jeunes. Les traitements actuels ont de lourds effets secondaires et ne sont pas forcément efficaces pour tous les patients. Chez 30 à 50% des patients lupiques, les reins peuvent être touchés, ce qui peut mener à la nécessité d’une dialyse ou d’une greffe de rein. La moitié des patients sont aussi très sensibles au soleil (photosensibilité): les rayons UVB peuvent aggraver la maladie notamment au niveau des reins. Le lupus est une maladie complexe et implique des cellules qui font partie des défenses naturelles du corps. Par exemple, les basophiles, généralement connus pour leur rôle dans les allergies, participent à l’aggravation du lupus. Une substance appelée prostaglandine D2 (PGD2) joue un rôle important en activant ces cellules lors des poussées de la maladie. Un autre type de cellule, les mastocytes de la peau, sont aussi connus pour être impliqués dans les réactions allergiques et pour produire beaucoup de PGD2 après une exposition au soleil, mais leur rôle dans le lupus n’est pas connu. Le but de notre projet est de comprendre si la sensibilité au soleil chez les patients lupiques est liée à la PGD2 produite par les mastocytes de la peau lorsqu’ils sont exposés aux UVB. Cette PGD2 des mastocytes pourrait ensuite activer les basophiles et déclencher une poussée de la maladie. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris lupiques avec ou sans mastocytes, ou dont les mastocytes ne peuvent pas produire de PGD2, puis nous les exposerons aux UVB. L’objectif final est de mieux comprendre la photosensibilité dans le lupus, afin de mieux diagnostiquer la maladie et de développer de nouvelles façons de la traiter.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre exposition au soleil et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des marqueurs quantifiables associés à cette photosensibilité dans le lupus permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir ou limiter les atteintes rénales graves du lupus..

Procédures

Un génotype (gène absent dans une des lignées de souris) dit dommageable est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie autoimmune (lupus) légère (pas de maladie grave) mais cependant quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Différentes lignées de souris modifiées génétiquement seront utilisées. Toutes les souris seront euthanasiées et analysées avant de développer une forme grave de la maladie. Des animaux seront injectés en intrapéritonéal avec une huile minérale pro-inflammatoire, ce qui entraînera 8 semaines plus tard une pathologie lupique également légère (pas de maladie grave) mais quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 4 types d’interventions : des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) (souris vigiles), des injections dans la peau (« intradermiques ») et/ou dans le ventre (« intrapéritonéales ») (moins de 30 secondes par injection) (souris vigiles), des prélèvements d’un petit volume de sang (moins de 30 secondes) sous anesthésie générale (2 à 3 minutes), et des expositions à des doses contrôlées d’UVB avec un appareil de photothérapie (moins d’une minute), également sous anesthésie générale. Des animaux pourront recevoir jusqu’à 8 piqûres intradermiques et 8 piqûres intrapéritonéales. Pour certains animaux, l’exposition aux UVB sera répétée jusqu’à 3 fois tous les 3 jours pendant une semaine. Certains animaux seront prélevés deux fois d’un petit volume de sang avec une semaine entre les deux prélèvements.

Impact sur les animaux

Une des lignées de souris utilisées développe une pathologie autoimmune (lupus) légère (pas de maladie grave) mais cependant quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). D’autres animaux seront injectés en intrapéritonéal avec une huile minérale pro-inflammatoire, ce qui entraînera 8 semaines plus tard une pathologie lupique également légère (pas de maladie grave) mais quantifiable (détection de marqueurs inflammatoires spécifiques). Dans certains cas peu fréquents, l’huile minérale pro-inflammatoire peut induire une détresse respiratoire. Des animaux seront tondus sur le dos 48 heures avant la première exposition aux UVB avec une tondeuse adaptée, ce qui pourra entraîner un stress sur 2-3 minutes. L’exposition aux UVB n’entraînera pas de brûlure mais une rougeur et une inflammation légère de la peau des souris tondues. La répétition des expositions peut induire des lésions cutanées non sévères. Les injections intrapéritonéales induiront un stress et une douleur brève de piqûre. Les contentions des animaux induiront un stress bref.

Devenir

Les expérimentations du projet sur les lots de souris dureront au minimum 72 heures et au maximum 16 semaines. Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des expérimentations et en cas d’atteinte de points limites, et leurs organes prélevés et analysés.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études en milieu artificiel ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence UVB/autoimmunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Expérimentalement, le modèle d‘exposition aux UVB dans le contexte lupique a déjà été réalisé précédemment au sein de notre laboratoire et permet donc de réduire ici au strict minimum le nombre de souris nécessaires. Les nombres de souris par groupe ont été calculés pour tenir compte de la variabilité entre les souris dans la réponse aux UVB et au développement des paramètres lupiques. Cela nous donnera une puissance statistique suffisante pour pouvoir conclure scientifiquement sur les paramètres analysés. Des prélèvements post-mortem seront conservés pour répondre à d’éventuelles questions ultérieures afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet. Enfin, dans le but de démontrer la reproductibilité de nos résultats, chaque procédure ne sera répétée qu’une fois uniquement si lors de la première série d’expérience une tendance nette mais avec des statistiques ne permettant pas de conclure scientifiquement sont obtenues. Cette éventuelle répétition nous permettra de confirmer ou d’invalider scientifiquement les premiers résultats.

Raffinement

Avant et pendant les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, jamais isolés, toujours avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher) et sont observés quotidiennement. Les procédures sont réalisées dans le but de limiter au maximum les nuisances induites aux animaux. La surveillance des animaux injectés avec une huile pro-inflammatoire sera renforcée entre la deuxième et la troisième semaine après injection, ce qui correspond au moment où les souris sont fragilisées et sensibles au stress. Une grille de score a été établie afin de suivre l’état général de ces animaux et d’identifier ceux nécessitant une intervention rapide d’interruption des procédures. Les animaux n’ayant pas un score nul (mais inférieur au point limite) se verront apportés une attention particulière. Passée la période où les animaux injectés avec une huile pro-inflammatoire sont plus fragiles (fin semaine 1 à fin semaine 2), ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Si le point limite était malgré tout atteint, les souris seraient euthanasiées sans attendre la fin de la procédure. L’évaluation des points limites au cours d’une des procédures sera réalisée à l’aide d’une grille d’évaluation déjà validée et prenant en compte : l’évolution du poids de la souris, son comportement, son apparence et ses difficultés éventuelles à respirer. L’expérience acquise avec les expositions aux UVB nous a montré que dans les conditions utilisées dans le présent projet, aucune brûlure ou lésion cutanée n’est induite. Cependant, une grille de score de dermatite a été établie pour pouvoir vérifier cela pour tous les animaux avant chaque exposition aux UVB. En plus de la surveillance quotidienne des animaux, les évaluations « cliniques » seront réalisées une à trois fois par semaine.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes pathologiques d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce utilisée (souris domestique) est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.

3 380 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. On dépose une bactérie sur la peau du dos et des oreilles, on décolle les couches superficielles de l'épiderme au ruban adhésif et on provoque une inflammation chimique, ce qui peut entraîner ulcération et nécrose douloureuses. L'objectif est de bâtir un modèle de la maladie de Verneuil, pour laquelle il n'existe pas de modèle animal. Le porteur reconnaît disposer déjà d'organoïdes et d'explants de peau humaine, qu'il juge insuffisants pour reproduire la vascularisation et la réponse immunitaire.

Objectifs

La maladie de Verneuil, ou hidradénite suppurée (HS), est une dermatose inflammatoire chronique caractérisée par des lésions douloureuses dans les zones de plis. Sa physiopathologie, largement méconnue, implique une interaction complexe entre dérégulation des réponses immunes et déséquilibre du microbiote cutané, marqué par l’expansion de certaines bactéries. Aucun traitement curatif n’existe actuellement ; les prises en charge associent antibiothérapie prolongée, traitements immunomodulateurs et chirurgie, sans prévenir les rechutes. Nos travaux récents ont identifié une forte association entre les formes sévères de la maladie et la présence de la bactérie Porphyromonas uenonis (P. uenonis). Absente du microbiote cutané sain, cette bactérie est détectée dans les couches profondes de la peau lésionnelle et péri-lésionnelle des patients. Sa présence corrèle avec une accumulation épidermique marquée de cellules productrices d’anticorps, un phénomène inhabituel susceptible de contribuer à l’inflammation chronique. Des modèles ex vivo, combinant organoïdes et explants de peau humaine ont montré que P. uenonis est intrinsèquement invasive et capable de pénétrer et se multiplier dans des cellules cutanées humaines saines. Une étude pilote chez la souris a confirmé que le simple dépôt de la bactérie sur une peau intacte suffit à reproduire l’accumulation épidermique de plasmocytes, en l’absence de lésion, reproduisant ainsi un marqueur clé de la maladie humaine. Ces données suggèrent que P. uenonis est normalement contrôlée en conditions saines, mais possède des propriétés invasives et immunomodulatrices uniques favorisant le recrutement anormal de cellules sécrétrices d’anticorps dans la peau. P. uenonis apparaît comme un pathobionte cutané opportuniste susceptible d’initier et d’entretenir l’inflammation chronique de HS. Son isolement dans d’autres infections profondes renforce l’hypothèse d’un potentiel pathogène multi-tissulaire encore méconnu. Ce projet vise à exploiter un modèle murin afin de caractériser les mécanismes de pathogénicité cutanée de P. uenonis, la réponse immunitaire induite et l’impact de l’accumulation de plasmocytes sur la barrière cutanée. À terme, ce modèle permettra de mieux comprendre la contribution de cette bactérie à la pathogénèse de la maladie de Verneuil et de fournir à la communauté scientifique un outil préclinique pour tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce modèle murin d’association bactérienne permettra de mieux comprendre le rôle pathogénique des bactéries associées à la maladie de Verneuil ainsi que le rôle pathogénique des réponses immunitaires mise en place. A moyen terme nous espérons que ce projet aboutira à l’établissement d’un modèle murin pour étudier la maladie de Verneuil pour laquelle il n’existe actuellement pas de modèle A long terme nous espérons que ce modèle permettra l’ouverture à de nouvelles pistes de traitement.

Procédures

-Application d’ une suspension bactérienne sur la peau du dos et de l’oreille sur souris vigiles : 1 fois par jour pendant 4 à 7 jours. -Desquamation des couches superficielles de l’épiderme sur la peau du dos ou de l’oreille sur animaux rasé, anesthésiés et analgésiés : 1 fois au cours de la procédure, avec 1 répétition possible après 14 jours. -Inflammation cutanée locale sur la peau du dos ou de l’oreille par application d’un produit 1 fois par jour pendant 3 à 7 jours sur animaux rasés et anesthésiés. -Pose d’un cathéter dans la veine caudale sur animaux anesthésiés, 1 fois au cours de la procédure.

Impact sur les animaux

Ce projet sera attentif aux cinq libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines des procédures pourraient avoir un effet indésirable sur l’animal. o Une inflammation cutanée chimique ou générée par desquamation mécanique sur une partie de la peau du dos et/ou sur la peau des oreilles entrainera un inconfort ou une douleur modérée pendant quelques jours. o Une infection locale liée à l’expansion de la bactérie pourra éventuellement induire une ulcération/ nécrose localement générant une douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous aurons besoin de collecter les organes pour étudier la réponse immunitaire et l’invasion bactérienne dans les tissus.

Remplacement

La bactérie étant associée à une pathologie cutanée humaine, la majorité de nos travaux repose sur des modèles de peau humaine, incluant des organoïdes d’épiderme établis au laboratoire, des explants de peau saine et des prélèvements issus de patients. Il reste toutefois impossible de reconstituer in vitro la complexité du système cutané avec sa vascularisation et ses interactions avec le système immunitaire. Notre modèle murin d’association constitue donc, à ce jour, le seul système capable de reproduire un tel niveau d’intégration, en faisant un modèle de choix pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos collaborateurs sur la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (4) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs (ANOVA). On choisit le cas d’une comparaison de 2 moyennes avec les conditions d’association avec une bactérie pathogène versus une bactérie commensale contrôle, en l’absence d’effet sexe. On décide d’utiliser 32 individus par groupe, répartis en 4x2 cages par groupe (4 individus par cage, 1 cage par sexe, 4 répétitions). En supposant un effet cage de 50.00%, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d’effets forts à très forts. Un calcul de puissance a été réalisé pour chaque procédure de la même façon. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Nous proposons aussi de réduire le nombre d’animaux utilisé si les différences à différent temps ou entre les sexes n’est pas importante. D’autre part, les techniques expérimentales nous permettent d’analyser plusieurs paramètres sur un même individu, pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Notamment l’imagerie intravitale nous permettra de collecter un grand nombre d’information sur une fenêtre de temps de quelques heures, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Optimisation du protocole d’association avec la bactérie : Le protocole d’association avec la bactérie est sans douleur, cependant nous utiliserons des conditions expérimentales pour optimiser l’invasion de la bactérie. Parmi ces conditions, l’induction d’une inflammation sur la peau des animaux par application d’une crème sur la peau, la desquamation des couches superficielles de la peau par application d’un scotch ou un régime alimentaire spécifique. Les animaux recevront un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de la dequamation. Les animaux seront surveillés quotidiennement dès l’apparition des premiers signes d’inflammation (rougeurs, squames) et pour l’apparition de lésions cutanées. En cas de signes de mal-être (prostration, poil ébouriffé), la surveillance sera intensifiée et un enrichissement de la cage avec du gel nutritif sera réalisé. La litière sera remplacée par une litière douce en cellulose dès l’apparition de lésions cutanées et la douleur pourra être prise en charge par administration d’analgésique. Imagerie intravitale : Lors des expériences d’exploration par microscopie, les animaux seront maintenus au chaud et hydratés par une injection tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Cette étude utilise des souris car le système cutané, vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système cutané, vasculaire et immunitaire humain. De plus, la souris est un animal pour lequel nous avons une très bonne expertise pour détecter et réduire au mieux les conditions de stress, d’inconfort et de douleur. En conséquence la souris représente l’espèce de choix pour cette étude où les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. Plusieurs types de souris seront utilisées dans cette étude. Des souris de type sauvage (C57Bl/6Jrj) et des souris génétiquement modifiées ‘modifications permettant d’explorer plusieurs composants du système immunitaire). Les associations avec les bactéries sont réalisées chez des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines, afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine. Les expérimentations sont ensuite réalisées 1 à 12 semaines après l’association, période nécessaire au développement et au maintien de la réponse immunitaire.