Système immunitaire
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Rôle des macrophages dans l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Opérées du cœur pour déclencher un infarctus, 2 920 souris vont toutes être tuées à l'issue, dont 2 400 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 520 sévère. Chacune peut aussi subir jusqu'à dix-huit gavages, autant d'injections et trois échocardiographies sous anesthésie. Le porteur juge le modèle animal "indispensable" au motif que la réparation cardiaque met en jeu plusieurs organes. Les bénéfices, de possibles cibles thérapeutiques, restent au conditionnel face à un infarctus provoqué chez près de 3 000 souris.
Objectifs
L’infarctus du myocarde (communément appelé "attaque cardiaque") est une cause de mortalité et d’invalidité majeure. Les mécanismes gouvernant la réparation du cœur après un infarctus ne sont pas entièrement connus. L’inflammation joue un rôle important dans la réparation du coeur après un infarctus, mais les types cellulaires et voies moléculaires impliqués restent méconnus. Ce projet a pour but de comprendre le rôle de certaines cellules de l’inflammation, les macrophages, dans la réparation du cœur après l'infarctus. Une opération permettra de déclencher de manière contrôlée un trouble cardiaque chez les souris. La fonction cardiaque des souris sera analysée par échocardiographie, et la réparation du coeur après l'infarctus du myocarde sera étudiée. Ce projet permettra d’identifier des nouveaux acteurs inflammatoires de la réparation du coeur après un infarctus et de potentielles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une meilleure compréhension des mécanismes de la réparation du coeur après infarctus, ce qui constitute une étape essentielle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Gavages (jusqu'à 18 fois, quelques secondes) ; Intervention chirurgicale sous anesthésie (1 fois, 30 minutes); Echocardiographie sous anesthésie (3 fois, 15 minutes); Injections (jusqu’à 18 fois, quelques secondes); prélèvement sanguin (1 fois, quelques secondes)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, inconfort lié au gavage, potentielle douleur au point d'injection, stress et hypothermie liés à l'anesthésie, stress lié à l’isolement de courte durée dans la phase post-opératoire et post-échocardiographie ; Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure.
Remplacement
Bien que des études bio-informatique et de culture cellulaire soient menées pour étudier les hypothèses de ce projet, la réparation cardiaque après infarctus du myocarde impliquent l’interaction complexe de différents types cellulaires et une interaction entre différents organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers, rendant le modèle animal indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est déterminé par d’utilisation d'outils statistiques adaptés. Les différences de mortalité liées au sexe existant dans ce modèle (mortalité accrue chez les mâles comparés aux femelles) ont été prises en compte dans le calcul du nombre d'animaux. Des tests statistiques appropriés pour l’analyse des données obtenues ont été prédéfinis. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". L'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal est optimisée.
Raffinement
Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et anti-douleurs adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure chirurgicale et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante à 37°C dès l’induction de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle puis placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie anti-douleur sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 72 heures, avec administration d'anti-douleurs. Tout au long de la procédure, les animaux feront l’objet d’une surveillance continue par les expérimentateurs, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’inflammation et de la réparation cardiaque post-infarctus du myocarde dans un organisme biologique complexe. Le modèle d’infarctus du myocarde utilisé dans ce projet représente un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, permettant une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. L'infarctus du myocarde se manifeste à l'âge adulte: l’infarctus du myocarde sera induit chez des souris âgées entre 8 et 16 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est à maturité.
Etude du rôle et de la régulation de l’IL-33 chez la souris humanisée dans un contexte tumoral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 040 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, dont le développement peut causer douleur et dégradation de l'état général, puis un prélèvement de sang. L'étude porte sur une souris dite humanisée, modifiée pour exprimer une protéine humaine, l'IL-33, à la place de la version murine. Elle vise à préciser le rôle de cette protéine dans la progression des tumeurs, les organes étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
L’IL-33 est une protéine qui alerte notre système immunitaire en cas de danger, notamment lorsque nos cellules sont agressées (infection, traumatismes, cancer). Elle est présente chez l’homme à l’état basal dans les vaisseaux sanguins ainsi que dans d’autres tissus mais elle peut être induite dans certaines situations pathologiques. Chez la souris, l’IL-33 n’est pas retrouvée dans les mêmes cellules que chez l’Homme, par exemple dans les vaisseaux sanguins. C’est pourquoi afin de mieux représenter la physiologie humaine nous utiliserons un nouveau modèle murin « humanisé » dans lequel la protéine IL-33 humaine est exprimée à la place de la protéine murine, avec une expression et une localisation qui miment celles connues chez l’Homme (souris hIL-33). L'objectif principal du projet est de mieux comprendre comment la protéine IL-33 humaine intervient dans la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre d’une part, de préciser le rôle de l’IL-33 dans la réponse tumorale chez des souris humanisées qui miment le profil d’expression observé chez l’homme. D’autre part, de mettre en évidence une différence potentielle avec le rôle de l’IL-33 murine qui est pour l’instant utilisée comme modèle d’étude. Ce projet permettra donc à court terme d’améliorer nos connaissances sur le rôle de l’IL-33 humaine mais aussi à plus long terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques fondées sur la régulation de l’IL-33 humaine afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers.
Procédures
Chaque animal subira une injection de cellules tumorales sous anesthésie de 2 à 3 min, pour un temps d'injection d'environ 30 à 40 secondes. Les souris sous anesthésie générale subiront un prélèvement sanguin. Le prélèvement ne dépasse pas 2 min.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur au réveil au niveau du site d'injection. Le développement tumoral peut causer des douleurs et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…).
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas à ce jour être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet nécessite de mener des expériences chez l’animal, car nous devons travailler dans des conditions intégrées permettant l’interaction de plusieurs systèmes cellulaires complexes dont le système immunitaire et le microenvironnement tumoral. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre. L’espèce animale choisie est la souris car notre étude nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques et les outils nécessaires à notre étude sont disponibles uniquement chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir d'études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximums pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement. Le projet est conçu avec plusieurs étapes afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du projet en fonction des résultats obtenus. De plus une méthode de randomisation sera mise en place afin de diminuer les biais et de ce fait le nombre de souris à utiliser.
Raffinement
Les modèles tumoraux utilisés sont bien maitrisés. Afin de minimiser le stress de la souris, les pesées auront lieu sous anesthésie ou sur un système de pesée dynamique qui limite à quelques secondes le temps de manipulation de la souris. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections ont été optimisées pour réduire au maximum le temps de contention et le stress des animaux. Enfin, les procédures font l’objet d’une réflexion continue sur de potentielles modifications pour réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle le plus couramment utilisé dans la littérature scientifique pour étudier la biologie de l’IL-33 et son implication dans le développement de tumeurs. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature nécessaire à la compréhension du rôle de l’IL-33.
Impact de la pollution sur l’immunité et caractérisation des mécanismes impliqués
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-cinq injections, vingt-cinq gavages et quinze instillations dans le nez par animal: 500 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le protocole comprend aussi des prélèvements de sang et d'urine, l'objectif étant d'étudier l'effet de la pollution respiratoire sur le système immunitaire. Le porteur reconnaît que ces contentions et actes répétés sont source de stress, d'angoisse, voire de douleur. Le choix de la souris repose sur sa proximité physiologique déclarée avec l'humain.
Objectifs
Notre projet vise à améliorer la compréhension d'impact de la pollution sur le système immunitaire et les mécanimes impliqués, dans un modèle de souris exposées à la pollution par voie nasale.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques responsables de l’initiation et de la progression des maladies auto-immunes, c'est à dire les maladies dans lesquelles le système immunitaire s'attaque à notre propre organisme. Ces connaissances fondamentales pourraient ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et personnalisées, visant à limiter l’impact de la pollution atmosphérique sur le système immunitaire.
Procédures
15 à 25 injections sur animaux vigiles d’une durée approximative de 30 secondes par injection ; 25 gavages sur animaux vigiles (1 seul groupe), d’une durée approximative de 30 secondes; 15 instillations intranasales (30 secondes) ; 2 prélèvements sanguins sur animaux vigiles, d’une durée approximative de 30 secondes par prélèvement ; 5 prélèvements d’urine, obtenus à partir de mictions spontanées lors d’une contention manuelle, d’une durée d’environ 20 secondes par prélèvement. Lorsque des prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés le même jour, ils seront effectués de manière concomitante afin de limiter la manipulation des animaux. 1 prélèvement sanguin terminal, réalisé après euthanasie, d’une durée approximative de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les manipulations peuvent être source de stress, d'angoisse, voire de douleurs pour les souris, en raison des multiples contentions ( 30 sec à 1 min par contentions) auxquelles s'ajoutent les actions d'injections (30 sec par injection), de prélèvements d'urine et de sang (30 sec par prélèvements de sang et urine) et les instillations intra-nasales (30 sec par acte).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse de tissus et de sang/urine
Remplacement
Le modèle de souirs permet une étude sur l'être vivant et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. La souris est adaptée à notre étude car sa proximité avec l’être humain se traduit par la présence chez cette espèce d’homologies physiologiques très étroites avec notre espèce, notamment en ce qui concerne le système immunitaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et robustes. Le nombre d’animaux a également été fixé qu'à partir des données de la littérature et de notre expérience.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Les animaux feront l’objet d’une surveillance 3 fois par semaine (comportement, apparence générale, signes cliniques) par les personnes en charge de l’expérimentation. Toute apparition de signes de douleur ou de souffrance, tels que la prostration, le dos voûté, l’isolement ou le poil hérissé, entraînera l’ouverture d’une fiche de score comportant des points limites clairement définis, pouvant conduire, le cas échéant, à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée au site d’injection abdominale (recherche de rougeur ou de signes inflammatoires) ainsi qu’au suivi du poids.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Comment le métabolisme et le système immunitaire interagissent dans les maladies inflammatoires : vers de nouvelles pistes de traitement.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
8 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole impose des régimes alimentaires particuliers ou des traitements pendant quatorze semaines, avec injections, gavages et prélèvements de sang répétés, pour étudier le lien entre métabolisme et inflammation. Une partie porte une inflammation chronique qui réduit leur survie à environ six mois, avec troubles cardiaques et respiratoires. Le porteur affirme que les cultures de cellules ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifie selon lui le modèle animal.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre le lien entre les problèmes de métabolisme et l’inflammation dans certaines maladies comme les maladies auto-immunes. Pour cela, nous utiliserons des souris qui ont des troubles similaires à ceux observés chez certaines personnes malades. Nous avons déjà pu observer que ces souris produisent des lipides qui accentuent l’inflammation provoquée par la maladie . Nous voulons maintenant savoir si agir sur l’inflammation et le métabolisme en même temps pourrait aider à mieux traiter ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires de type maladie auto-immunes et à trouver de nouvelles façons de les traiter en agissant à la fois sur les défenses naturelles du corps et sur son métabolisme.
Procédures
Certains animaux recevront des régimes alimentaires spécifiques supplémentés en certains acides gras ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront testés pour voir comment leur corps réagit au sucre (glucose) ou à l’insuline, et comment leur foie régule le taux de sucre dans le sang. Ces tests seront espacés d’au moins 14 jours. Pour cela, il faudra prélever environ 7 petites gouttes de sang sur une période de 2 heures. Ces tests seront réalisés sur des animaux vigiles mais manipulés avec précaution. -Injection 1 fois/2 semaines (x3) ; Prélèvement goutte sang 6 fois/2 semaines (x3) D’autres animaux recevront ces mêmes régimes alimentaires spécifiques ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront prélevés au niveau sanguin toutes les 4 semaines pour suivre des marqueurs sanguins inflammatoires. -Administration traitement 2 fois/semaine (x14) ; Prélèvement sang 1 fois/4 semaines (x4) ; Prise de température environ 1min/2 semaines (x7) Des animaux modèles de maladies inflammatoires chroniques recevront des traitements pharmacologiques pendant 3 semaines via une administration par voie aériennes. Des animaux, dont on aura induit l’inflammation seront traités par voie aérienne ou par injection. -Injection 1 fois ; Administration traitement voie aérienne 40 secondes/jour (x21) Ou 30 secondes/jour (x21)
Impact sur les animaux
Dans ce projet, certains animaux utilisés présentent une inflammation chronique importante, ce qui réduit fortement leur espérance de vie, avec une survie moyenne d’environ 6 mois. Ces animaux peuvent développer des problèmes cardiaques, respirer difficilement ou avoir une peau pâle au niveau des oreilles et des pattes, signes d’un cœur fatigué. D’autres animaux peuvent aussi montrer une faiblesse du système immunitaire, des inflammations des poumons et un poids plus faible que les animaux sains. À noter que certains animaux porteurs d’une seule copie du gène concerné ne développent aucun signe de maladie et vivent normalement.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement des organes d’intérêt (foie, cœur, poumons...)
Remplacement
Ce projet a besoin d'utiliser des modèles animaux, car les méthodes alternatives comme les tests en laboratoire sur des cellules ne permettent pas d’étudier comment les organes communiquent entre eux, ni comment un changement d’alimentation peut influencer tout le corps, notamment le métabolisme et les réactions inflammatoires.
Réduction
Nous adapterons le nombre d’animaux utilisés en fonction des besoins réels de l’étude. Tous les animaux nés seront inclus dans les expériences. Des groupes de référence seront utilisés pour chaque groupe étudié. Par ailleurs, nos expériences précédentes et une analyse préalable nous indiquent qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.
Raffinement
Des signes d’alerte spécifiques ont été définis pour repérer rapidement tout problème lié à leur état de santé. Si un animal montre l’un de ces signes, il sera immédiatement pris en charge et euthanasié si nécessaire. Leurs besoins sociaux et biologiques sont bien connus, ce qui permet de réduire au maximum toute douleur ou souffrance. Les animaux vivront par petits groupes de cinq, dans des cages enrichies avec une maisonnette et du coton pour leur confort. Lors des expériences, un anti-douleur sera appliqué sur leur queue pour limiter toute gêne.
Choix des espèces
Les souris adultes ( à partir de 6 semaines) sont les animaux les plus utilisés pour étudier le fonctionnement du système immunitaire et du métabolisme, notamment pour comprendre comment certains régimes alimentaires influencent ces mécanismes. Grâce à de nombreux modèles génétiquement modifiés disponibles, nous pouvons obtenir des résultats fiables et les comparer facilement avec ceux d'autres études.
Impact d’une exposition directe ou intergénérationnelle à des composés per et poly-fluoroalkylées (PFAS) sur le système hormonal thyroïdien et le système immunitaire de la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4 248 truites arc-en-ciel sont exposées à des polluants PFAS puis, pour une partie, infectées par deux virus, dans des procédures dont 2 400 classées en souffrance sévère. L'exposition couvre deux générations et tous les stades de vie, de l'œuf à l'adulte reproducteur. Le porteur annonce peu d'effets indésirables visibles, tout en décrivant pour les épreuves infectieuses une nage erratique, une perte d'équilibre, une exophtalmie et une mortalité dès cinq à sept jours. Tous les poissons sont mis à mort en fin de projet, au nom de la biosécurité.
Objectifs
Au cours des vingt dernières années, les scientifiques et les pouvoirs publics se sont intéressés de plus en plus aux perturbateurs endocriniens (PE), notamment en raison de leur utilisation de plus en plus importante et des preuves croissantes de leurs effets nocifs sur l'homme et l'environnement. Récemment, la perturbation du système des hormones thyroïdiennes par les PE a suscité plus d'attention en raison de son impact sur de nombreux systèmes physiologiques clés dont le développement du système immunitaire. Parmi les PE, les substances per et poly-fluoroalkylées (PFAS) sont ubiquistes et persistantes dans l’environnement comme dans les organismes entrainant de nombreuses perturbations biologiques. Dans ce projet, une première étape de screening sera réalisée pour évaluer la toxicité et les pouvoirs PE de plusieurs PFAS à différentes concentrations d’exposition sur plusieurs modèles biologiques (xenope, poisson zèbre et truite arc-en ciel (TAC)). Puis, la relation entre le système thyroidien, l'immunité, le développement et la reproduction sera étudiée chez 2 générations de TAC exposées soit directement, soit via leurs parents à une sélection de deux PFAS d’intérêt. L'approche méthodologique utilisera différents stades de vie (embryons, larves, juvéniles et adultes matures), à travers des expositions chroniques intergénérationnelles et des analyses effectuées au niveau moléculaire, cellulaire/tissulaire, morphologique, physiologique, comportemental, résistance aux pathogènes et populationnel
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir des connaissances sur les liens entre le système hormonal thyroïdien et la santé globale des poissons après exposition aux PFAS. Le potentiel de succès de ce projet repose sur les approches ambitieuses et innovantes sélectionnées, qui sont (1) une comparaison entre les différents PFAS, modèles et environnementaux (PFOS, PFOA, PFHxS, PFBA, TFA) pour mettre en évidence l'impact potentiel de ces substances à des concentrations proches de celles auxquelles les poissons sont exposés dans leur environnement ; (2) la réalisation de co-expositions (chimiques et pathogènes), pour créer une approche réaliste des conditions de l'environnement naturel ; (3) l'évaluation des effets directs et indirects des expositions intergénérationnelles, pour mettre en évidence les impacts parentaux ; (4) une intégration des différentes étapes de vie, afin de mieux comprendre les fenêtres de sensibilité ; (5) l'utilisation de multiples biomarqueurs classiques (morphologiques, physiologiques et comportementaux) et omiques pour décrire la relation entre différents niveaux d'organisation biologique.
Procédures
Prélèvements de sang (moins de 10% du volume total disponible, d'une durée de moins de 30 secondes) sur animaux vigiles au cours de l''exposition aux PFAS. Prélèvements de sang et d'organes cibles (rate, rein, foie, branchies, thymus) sur animaux mis à mort à la fin des temps d'exposition chimique ou après l'infection virale.
Impact sur les animaux
1) Induction possible d’un léger stress des animaux du fait des conditions expérimentales. 2) Peu d’effets indésirables visibles attendus sur les animaux qui seront exposés à des concentrations sub-létales de PFAS. 3) Comportements et symptômes caractéristiques de l’infection virale au virus de la nécrose hématopoietique infectieuse (NHI) et au virus de la nécrose pancréatique infectieuse (NPI) lors des épreuves infectieuses (assombrissement de la couleur de la peau, nage erratique, perte d’équilibre, exophtalmie...), avec une mortalité débutant en moyenne à 5-7 jours post-infection.
Devenir
Pour des raisons de biosécurité, tous les poissons ayant intégré la plateforme expérimentale seront mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
L’étude du système hormonal nécessite la mise en place de systèmes biologiques représentatifs de la complexité du fonctionnement d’un organisme. Ceci est encore plus vrai dans le cas de l’étude d’interactions possibles entre différents systèmes biologiques, ici le système hormonal thyroidien et le système immunitaire. Cela ne peut pas être substitué, notamment pour l’étude des effets sur différents systèmes et des interactions entre ceux-ci, par des méthodes alternatives (tests in vitro ou embryo larvaires).
Réduction
Le nombre de poissons et de bassins par condition a été réduit à son minimum en intégrant les temps et nombre de prélèvements prévus, la variabilité inter-bassins fréquemment observée, les mortalités pouvant survenir sur les stades plus précoces et plus sensibles et de façon à assurer une robustesse statistique des résultats. Le nombre maximum de poissons a été estimé à 4248.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront à: - Assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être i.e une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - Evaluer quotidiennement l’état de santé général des poissons et leur comportement natatoire et alimentaire, en suivant une grille de points limites adaptée. - Mettre à mort de façon compassionnelle des animaux dont les points limites sont atteints e.g comportement de nage anormal et/ou aspects physiques déterioré, etc...
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce idéale : (1) elle est d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes, (2) les caractéristiques spécifiques de cette espèce, notamment la présence d'unités fonctionnel de la glande thyroidenne dans le rein, en font un organisme très intéressant pour les études fonctionnelles, 3) c'est une espèce facile à élever en laboratoire, avec un cycle de développement plus long que le poisson-zèbre, ce qui permet des expositions chroniques aux stades embryonnaires, larvaires et juvéniles et (4) son génome, entièrement séquencé, est disponible, facilitant ainsi les analyses génétiques. Les animaux sont utilisés à différents stades de développement, depuis l’œuf, larves, alevins, juvéniles jusqu’à l’adulte reproducteur pour couvrir tout le cycle de vie.
Rôle des lymphocytes T non conventionnels dans le diabète de type 1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 080 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections et neuf gavages, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements de sang, une incision de la queue et, pour certaines, une infection virale destinée à déclencher un diabète de type 1. L'étude cherche à comprendre le rôle de cellules immunitaires et l'effet d'un régime enrichi en fibres et acides gras sur la maladie. Le porteur affirme que ce projet est associé à des travaux visant à réduire le recours à l'expérimentation animale, sans le détailler.
Objectifs
Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle les cellules du pancréas, qui produisent de l’insuline, sont détruites par le système immunitaire. Sans insuline, le corps ne peut plus réguler correctement la glycémie (concentration du sucre dans le sang). L’objectif du projet est d’identifier des facteurs responsables de cette destruction et d’étudier les anomalies observées sur les cellules immunitaires. En effet, des facteurs environnementaux comme une infection virale et le changement de microbiote intestinal influencent le système immunitaire et favorisent la maladie. De plus, certaines études montrent les effets bénéfiques de certains régimes alimentaires. C’est pourquoi, le projet portera aussi sur l’impact d’une modification de l’alimentation, notamment dans la diminution du risque ou la sévérité de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les mécanismes d'action des cellules immunitaires qui participent à l'apparition du diabète de type 1 chez la souris et plus généralement aux complications causées par une infection virale ou par un microbiote modifié. Enfin l’impact d’un régime enrichi en fibres et en acides gras sera évalué sur le développement du diabète. Comprendre l’action de ces cellules immunitaires dans différents contextes permettra d’envisager de nouveaux traitements thérapeutiques contre le diabète de type 1.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir entre 0 et 12 injections (durée 10 secondes par injection). Les animaux peuvent recevoir entre 0 et 9 gavages (durée 1 minute par gavage). Les animaux peuvent être anesthésiés 1 fois pour un prélèvement sanguin (30 secondes). Certains animaux auront une petite incision à la queue pour une micro-goutte de sang (durée 5 secondes)
Impact sur les animaux
Les souris utilisées peuvent développer une hyperglycémie. Le prélèvement d'urine peut induire un stress de courte durée. Les injections et les gavages peuvent générer un stress modéré et de courte durée. La petite incision de l'extrémité de la queue peut induire une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent générer un stress modéré de courte durée. L'infection virale peut induire un état fébrile modéré et transitoire. Les différents traitements peuvent induire une perte de poids légère.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour les analyses des tissus.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas. Néanmoins ce projet est associé à des études visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour valider les données est calculé sur la base d'un plan expérimental élaboré et maîtrisé permettant d'obtenir une puissance statistique nécessaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. La stratégie mise en place vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant différents tests statistiques pour assurer la pertinence des résultats de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. En amont des expériences, des analyses en laboratoire sur cellules seront effectuées afin d’optimiser la sélection des échantillons de microbiote à tester ultérieurement chez l’animal.
Raffinement
Le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement est ajouté dans leurs cages de façon systématique et les animaux sont regroupés en groupes sociaux. Les gestes techniques sont maîtrisés par les porteurs de projet ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux. Toute souris diagnostiquée prédiabétique a une attention plus poussée. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les manipulations expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score de points limites.
Choix des espèces
Le modèle de souris est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : - Il permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour permettre d’isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie. -Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’Homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines d’âge (jeunes adultes), stade duquel sont observées les premières anomalies du système immunitaire chez la souris.
Rôle du système nerveux périphérique sur la physiopathologie de la tuberculose pulmonaire dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Génétiquement modifiées pour visualiser leur système nerveux, 2943 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 1020 classées sévères, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par la tuberculose, une infection sous anesthésie brève, l'autre plus longue, puis reçoivent des traitements pharmacologiques jusqu'à 42 jours. Les effets attendus vont de la perte de poids à la détresse respiratoire, en passant par des troubles moteurs et l'isolement social. Les retombées annoncées contre une maladie qui reste une cause majeure de mortalité mondiale sont formulées comme un espoir, face à des atteintes immédiates et certaines sur plus d'un millier d'animaux en souffrance sévère.
Objectifs
La tuberculose pulmonaire est une maladie provoquée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis. La personne infectée développe une inflammation chronique qui change, parfois de façon irréversible, l’architecture de ses poumons. Des travaux récents ont révélé que cette infection entraîne aussi des modifications importantes dans l’organisation du système nerveux périphérique. Cependant, on ignore encore la nature exacte de ces changements. Permettent-ils une meilleure interaction avec le système immunitaire local ? Contribuent-ils à la résolution de la pathologie ? Ou à son aggravation ? L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment le système nerveux périphérique s’adapte à l’infection par Mycobacterium tuberculosis au niveau des poumons. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser et de manipuler différents compartiments du système nerveux. Ces modèles permettront d’identifier les cellules nerveuses impliquées, de suivre leur évolution pendant l’infection, et d’évaluer leur rôle fonctionnel dans la progression de la maladie. Plus précisément, nous étudierons : ● Le remodelage des fibres nerveuses autour des bronches, ● Le rôle des cellules qui les accompagnent et les soutiennent dans ce processus, ● Les interactions entre cellules nerveuses et cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire infecté. Ces analyses utilisent des approches d’imagerie (microscopie), de biologie cellulaire (tri et culture de cellules), et des techniques avancées de séquençage pour étudier finement les réponses des cellules nerveuses et immunitaires au cours du temps. À terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de communication entre système nerveux et système immunitaire dans un contexte infectieux. Ces connaissances pourraient ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour mieux contrôler l’inflammation et les dégâts pulmonaires associés à la tuberculose.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter des bénéfices scientifiques et médicaux importants dans la lutte contre la tuberculose, une maladie qui reste aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité infectieuse dans le monde. Les résultats attendus permettront d’améliorer notre compréhension d’un aspect encore très peu étudié de la maladie : l’implication du système nerveux dans les infections pulmonaires chroniques. En effet, il est de plus en plus évident que les nerfs présents dans les poumons ne sont pas de simples structures passives, mais qu’ils peuvent influencer l’inflammation, la réparation des tissus, et même la réponse immunitaire face aux bactéries. En étudiant précisément le rôle de différents types de nerfs et de cellules nerveuses pendant l’infection tuberculeuse, ce projet pourra : ● Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter les dégâts causés aux poumons pendant la maladie, ● Mieux comprendre pourquoi certains patients développent des formes sévères de tuberculose avec des atteintes pulmonaires importantes, ● Éclairer le rôle du système nerveux dans d’autres maladies inflammatoires chroniques du poumon. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer au développement de stratégies dites « à visée neuro-immunologique », c’est-à-dire ciblant les interactions entre les nerfs et le système immunitaire pour mieux contrôler l’inflammation. Ce type d’approche est déjà en cours d’exploration dans d’autres pathologies (maladies auto-immunes, cancer), mais n’a jamais été appliqué à la tuberculose. Sur le plan fondamental, ce projet aidera également à mieux comprendre comment les cellules de soutien des nerfs (appelées cellules de Schwann) peuvent changer de fonction en réponse à une infection et participer aux mécanismes de défense ou de réparation. Ces connaissances pourront donc aussi bénéficier à d’autres domaines de recherche, comme la régénération nerveuse ou les maladies neuro-inflammatoires.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à plusieurs types d’interventions : ● Deux types d’infections différentes : l’une sous anesthésie générale d'une durée de 30 seconde , l’autre d’une durée de 40-45min au total. ● Des injections engendrant une contention de 1min. ● Des traitements pharmacologiques ciblés d’une durée de maximale de 42 jours. ● Des manipulations génétiques conditionnelles par administration d’une substance d’une durée maximale de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables répertoriés précédent pourraient être en fonction des procédures : une perte de poids, une baisse d'activité, des troubles moteurs, une perte d'appétit, une altération du comportement, une détresse respiratoire modérée, une altération temporaire de l'état général, une diminution des interactions sociales.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet feront l’objet d’analyses approfondies. Ils seront donc mis à mort de manière programmée et encadrée à la fin des procédures expérimentales pour répondre au mieux aux problématiques scientifiques.
Remplacement
L’étude proposée cherche à comprendre comment les nerfs pulmonaires et les cellules du système immunitaire interagissent lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis. Aujourd’hui, aucun modèle de culture cellulaire ou système artificiel ne permet de reproduire fidèlement la complexité du tissu pulmonaire, notamment l’organisation des nerfs et des cellules gliales dans un environnement en 3 dimensions, avec toutes les interactions mécaniques, nerveuses, vasculaires et immunitaires qui se produisent dans un animal vivant. La bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis) se développe très lentement et son comportement dépend fortement du fonctionnement global du corps. Les alternatives existantes ne permettent pas de suivre l’évolution réelle de l’infection, ni les modifications des nerfs ou des cellules. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de la souris reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques du projet : identifier les types de nerfs impliqués, comprendre leur rôle pendant l’infection, et explorer la manière dont les cellules s’adaptent à la présence de la bactérie. Aucun autre modèle ne permet actuellement d’atteindre ces objectifs de manière fiable.
Réduction
Les effectifs proposés ont été définis à partir de données préliminaires, d’expériences antérieures réussies et d’outils d’analyse statistique reconnus. Les résultats seront traités avec des méthodes statistiques appropriées, permettant d’évaluer les différences entre groupes de manière rigoureuse sans multiplier inutilement les animaux. Nous avons également mis en place des approches permettant d’extraire plusieurs types d’informations à partir d’un seul animal. Par exemple, à partir d’un même poumon, nous réalisons l’analyse des bactéries présentes, l’étude de l’expression des gènes, et le dosage des molécules inflammatoires. Enfin, le projet suit une logique progressive : si une étape expérimentale ne donne pas de résultats exploitables, elle sera arrêtée immédiatement.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin de minimiser les nuisances pour les animaux. Les temps de contention lors des phases d’infection et d’injection seront réduits au strict minimum nécessaire. Une surveillance renforcée sera établie après chaque intervention. Une grille de scoring ainsi que des points limites précoces et adaptés à chaque procédure seront mis en place pour suivre au mieux l’évolution de l’état général des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce avec une réponse immunitaire bien caractérisée et comparable à celle de l’humain. Ce modèle permet aussi d’examiner finement les interactions entre nerfs périphériques, cellules gliales, et cellules immunitaires dans le contexte pulmonaire. De nombreuses lignées transgéniques nécessaires à ce projet sont disponibles chez la souris et permettent d’isoler, tracer ou manipuler spécifiquement les populations cellulaires ciblées. Seules des souris adultes (6 à 10 semaines) seront utilisées. Ce stade garantit une immunité pulmonaire mature, indispensable pour étudier les conséquences de la tuberculose.
Évaluation de l’impact de mutations génétiques dans la mise en place de l’insuffisance cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Irradiées en corps entier puis greffées de moelle osseuse, 2592 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi l'implantation chirurgicale de mini-pompes et des échocardiographies sous anesthésie, pour étudier l'inflammation menant à une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée. Le porteur indique avoir d'abord testé ses hypothèses sur des cultures de macrophages, mais affirme que la réponse inflammatoire ne s'appréhende que dans un "organisme entier". Toutes sont tuées par exsanguination en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée est une forme d'insuffisance cardiaque qui se définit par des symptômes cliniques d’insuffisance cardiaque, associés, entre autres, à une fraction d’éjection du ventricule gauche supérieure ou égale à 50 %. Il a été estimé que la proportion de patients souffrant d’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée augmente de 1% par an et est en passe de devenir la forme d’insuffisance cardiaque majoritaire. Les études récentes indiquent une claire implication du système inflammatoire menant à une fibrose du coeur (rigidification du muscle du coeur) excessive dans cette pathologie, en revanche, les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent l’implication du système inflammatoire dans le développement de l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée restent mal compris. Également, des études ont mis en évidence un lien causal entre une pathologie des cellules de la moelle osseuse, qui affecte préférentiellement les individus âgés, et le développement d’une inflammation excessive et d’une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée. Cette pathologie est caractérisée par l'acquisition, par des cellules de la moelle osseuse, de mutations touchant des gènes impliqués dans les cancers du sang. Au stade de cette pathologie auquel nous nous interessons, une ou des mutation(s) sont observées dans au moins 2% des cellules sanguines circulantes en absence de cancer du sang. Notre projet vise à explorer précisément les liens mécanistiques entre cette pathologie de la moelle osseuse et notamment sa principale mutation décrite sur le développement de l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires inflammatoires mis en jeu lors de l'hématopoïèse clonale à potentiel indeterminé et impliqués dans l’insuffisance cardiaque. Ce projet permettra également de mettre en évidence de nouvelles options thérapeutiques prometteuses qui cibleront la réponse inflammatoire.
Procédures
- Irradiation en corps entier. Durée : 30min. - Transplantation de moelle osseuse dans des souris irradiées anesthésiées par injection. Durée: 5 secondes. - Echocardiographie sur souris anesthésiées (une à quatres fois). Durée : 10min. - Implantation de mini-pompes sur souris anesthésiées. Durée : 5min - L'administration de traitements. Durée: 5 secondes. - Mise à mort par exsanguination pour récupération des organes et prélèvement de sang sous anesthésie. Durée : 5min.
Impact sur les animaux
- Transplantation de moelle osseuse dans des souris irradiées anesthésiées par injection. Durée 5: secondes. Nuisance : légère douleur transitoire au point d'injection. - Implantation de mini-pompes osmotiques sur souris anesthésiées. Douleur péri-opératoire modérée. - L'administration d'inhibiteurs peut induire du stress et une légère douleur transitoire au moment de l'administration au traitement. Durée: 5 secondes.
Devenir
Les organes de tous les animaux seront prélevés à la fin des différentes procédures, nécéssitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses avec des cultures de macrophages avant de l’étudier dans un modèle pré-clinique chez la souris. Ces expériences nous ont notamment permis de déterminer les concentrations optimales et d’évaluer la puissance des inhibiteurs dans des tests d’activation cellulaire. Cependant, la réponse inflammatoire et le remodelage cardiaque résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes (moelle osseuse, sang, rate) et diverses populations cellulaires. Cette dynamique ne peut être appréhendée de manière intégrée qu’au sein d’un organisme entier, dans lequel la physiologie systémique et les communications intercellulaires et inter-organes sont préservées. C’est pourquoi notre projet nécessite l’utilisation d’un modèle chez la souris préservant la complexité physiopathologique globale des systèmes cardiovasculaire et inflammatoire.
Réduction
Les effectifs sont déterminées et les résultats sont analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales, notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. - Transplantation de moelle osseuse : injection de cellules de moelle par voie intraveineuse, anesthésie gazeuse. - Implantation de mini-pompes osmotiques en sous-cutané (chirurgie) : injection sous-cutanée d’analgésique. L’intervention se fait sous anesthésie gazeuse. La stratégie d’antalgie préventive au site d’incision par injection sous-cutanée d’analgésique, qui sera répétée dans les jours suivants la chirurgie selon les besoins des animaux. - Mise à mort des animaux par exsanguination (veine cave inférieure) : injection sous-cutanée d’analgésique. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse profonde durant toute l’intervention. Les souris seront élevées en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris : - température contrôlée à 22°C - cycle de jour/nuit de 12 heures - nourriture et eau ad-libitum - hébergement dans des cages de 2 à 5 souris maximum - enrichissement des cages avec maisonnettes, batônnets en bois et coton. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire, avec administration sous-cutanée d’antalgique le lendemain de la chirurgie et les jours suivants si nécéssaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les responsables du projet pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être jusqu’à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle expérimental de référence pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’inflammation et le remodelage cardiaque. Ces phénomènes mettent en jeu différents systèmes biologiques extrêmement dynamiques (inflammation, fonction et remodelage cardiaques), ce qui nous oblige d’avoir recours au modèle d’insuffisance cardiaque par surcharge de pression. Ce modèle est largement validé dans la littérature, ce qui permet une comparaison directe et une intégration cohérente des résultats avec les données existantes dans la littérature. Les procédures seront initiées sur des souris jeunes adultes (souris de 6 semaines). Le protocol expérimental s'étend sur 7 semaines, cela nous permet d'obtenir des prélèvements de souris adultes âgées de 13 semaines.
Etude par imagerie moléculaire du rôle de l’inflammation intestinale dans l’accident vasculaire cérébral chez la souris Mus musculus – Etude pilote
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
À J1, une colite est déclenchée chez la moitié des 120 souris par un produit dans l'eau de boisson, à J5 vient une IRM sous anesthésie, à J6 un AVC provoqué par injection de thrombine lors d'une chirurgie d'une à deux heures, puis deux IRM à J7 et J13. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec diarrhées, saignements rectaux et faiblesse d'une patte. L'étude déclare n'être qu'un pilote, destiné à calibrer une expérience plus large sur les liens entre inflammation intestinale et AVC. Toutes sont tuées à J13 par exsanguination pour prélever cerveau et intestin.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un enjeu majeur de santé publique. Le traitement de l’AVC ischémique repose actuellement sur la thrombolyse et/ou la thrombectomie. Cependant, ces interventions ne sont pas toujours réalisables et ne garantissent pas une récupération fonctionnelle complète. Cela justifie le développement de nouveaux outils pronostiques et thérapeutiques. Le rôle de l’inflammation intestinale dans la pathophysiologie de l’AVC suscite un intérêt croissant. Plusieurs travaux récents mettent en évidence des interactions étroites entre inflammation intestinale et neuroinflammation post-AVC. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet pilote est de réaliser des expérimentations préliminaires visant à évaluer l’impact d’un état inflammatoire intestinal élevé sur la sévérité de l’AVC dans un modèle murin. Les données obtenues permettront d’optimiser les protocoles ultérieurs, en fournissant notamment les éléments statistiques nécessaires à une estimation rigoureuse du nombre d’animaux requis, dans une logique de réduction et de raffinement conformément aux principes des 3R. Ces expérimentations préliminaires aideront également à identifier d’éventuelles contraintes techniques ou biologiques, afin d’ajuster au mieux les procédures et d’améliorer le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude pilote constitueront une base expérimentale pour une étude de plus grande envergure, destinée à approfondir l’analyse des interactions entre l’inflammation intestinale et la neuroinflammation post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une séquence expérimentale unique comprenant l’induction d’une inflammation intestinale, des examens IRM, l’induction d’un AVC thromboembolique et la mise à mort pour analyses histologiques. 1. Induction de l’inflammation intestinale (J1–J5) Chez la moitié des animaux (n = 60), une inflammation intestinale modérée sera induite par administration de DSS 2 % dans l’eau de boisson pendant 5 jours. Cette étape ne nécessite pas d’anesthésie. Un suivi clinique quotidien sera assuré. 2. IRM moléculaire (J5) Tous les animaux (n = 120) seront anesthésiés à l’isoflurane (2 % dans O₂/N₂O 30/70) pour un examen IRM de 30 à 45 minutes. Un cathéter sera inséré dans la veine caudale pour l’injection de MPIO, puis retiré en fin de séance. Une analgésie locale (lidocaïne/xylocaïne) sera appliquée au point d’insertion. 3. Induction du modèle d’AVC (J6) Sous anesthésie générale (isoflurane 2 % dans O₂/N₂O 30/70) et analgésie systémique (buprénorphine 0,1 mg/kg s.c. en prémédication), une chirurgie stéréotaxique sera réalisée pour induire une ischémie focale par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. La procédure dure 60 à 90 minutes. Les animaux recevront ensuite soit du tPA (10 mg/kg i.v.), soit une solution saline. 4. IRM post-AVC (J7 et J13) Deux nouveaux examens IRM seront réalisés sous les mêmes modalités anesthésiques (isoflurane 2 %, durée 30–45 min) afin d’évaluer le volume lésionnel, la neuroinflammation et l’inflammation intestinale. 5. Mise à mort et prélèvements (J13) À l’issue du dernier examen, les animaux encore sous anesthésie générale seront mis à mort par exsanguination induite par perfusion intracardiaque de sérum physiologique (isoflurane 5 % en O₂/N₂O 30/70 ; fentanyl 0,3 mg/kg i.p. en prémédication). Les organes d’intérêt (cerveau, intestin) seront prélevés immédiatement pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Le modèle d’induction d’une inflammation intestinale par traitement au DSS peut entraîner une perte de poids, des diarrhées et des saignements rectaux. Ces symptômes seront suivis avec attention grâce à l’utilisation quotidienne d’échelles de scores cliniques déjà établies, permettant un ajustement rapide des soins si nécessaire. Nos travaux antérieurs ont de plus montré que la dose de 2 % utilisée dans cette étude n’entraîne que des signes modérés de colite tout en induisant une inflammation intestinale suffisante pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Concernant le modèle d’AVC, certains animaux peuvent présenter des signes transitoires de douleur dans les heures suivant la chirurgie, ainsi qu’un affaiblissement temporaire de la patte avant gauche, correspondant à la zone cérébrale lésée, qui disparaît généralement au cours de la première semaine. Afin de limiter au maximum toute forme d’inconfort ou de souffrance, des analgésiques locaux seront appliqués au niveau du site chirurgical avant l’intervention, et des analgésiques systémiques seront administrés avant et après l’intervention. La surveillance quotidienne des animaux, associée à ces conditions environnementales contrôlées et à la prise en charge analgésique, permettra de réduire autant que possible les nuisances et la douleur liées aux procédures expérimentales.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (n = 120) seront mis à mort afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques indispensables à la compréhension des mécanismes étudiés. Ces prélèvements visent notamment à confirmer et compléter les observations issues des analyses d’imagerie in vivo (IRM), en permettant une évaluation fine des lésions cérébrales, de la neuroinflammation et de l’inflammation intestinale. Les échantillons obtenus fourniront également les données quantitatives nécessaires à l’optimisation et à la standardisation des protocoles ultérieurs. La mise à mort interviendra à la fin de la procédure. La mise à mort de tous les animaux se justifie par la nécessité scientifique de disposer de tissus parfaitement préservés pour les analyses post-mortem et par le souci constant de limiter toute utilisation et toute souffrance inutile, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Remplacement
Les modèles animaux constituent à ce jour les outils expérimentaux les plus pertinents pour répondre à la question scientifique posée. En effet, aucun modèle de substitution disponible actuellement ne permet de reproduire la dimension multi-organe de la pathophysiologie de l’AVC étudiée ici et, donc d’apporter une réponse adéquate à la problématique susmentionnée.
Réduction
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques ne pouvant être ici exclue, nous veillerons à en limiter le recours au strict nécessaire. La présente demande d’autorisation de projet couvre une étude pilote, dont les résultats permettront de mieux anticiper et d’optimiser l’utilisation d’animaux lors des études ultérieures. Nonobstant le caractère préliminaire de cette étude, nous nous attachons à réduire le nombre d’animaux employés, tout en conservant un effectif suffisant pour assurer la robustesse et la validité des analyses. Par ailleurs, l’utilisation de méthodologies d’imagerie in vivo autorise le suivi longitudinal des mêmes individus et contribue, de fait, à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires tient également compte des aspects méthodologiques de la procédure expérimentale, notamment l’habileté et l’expérience de l’expérimentateur, ainsi que des risques de perte inhérents à la conduite de la procédure.
Raffinement
Au cours de la procédure expérimentale, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux. La procédure inclut des modèles et des modalités d’imagerie susceptibles d’entraîner certaines nuisances et/ou un stress. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi quotidien assuré par du personnel qualifié. Les symptômes intestinaux induits par le traitement au DSS seront évalués quotidiennement à l’aide d’une échelle de score spécifique, permettant d’anticiper la persistance ou l’aggravation des nuisances. Des protocoles validés d’anesthésie et d’analgésie seront également mis en œuvre, notamment lors de l’induction du modèle d’AVC et des examens IRM, afin de limiter au maximum toute forme de douleur, de détresse ou d’angoisse liées aux interventions. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel expérimenté et formé aux procédures chirurgicales et aux soins post-opératoires. Les animaux seront hébergés en petits groupes sociaux (n=5) dans des cages standard, dans des conditions conformes aux normes européennes en vigueur (température stabilisée à 21 °C, hygrométrie de 55 %, intensité lumineuse de 100 lux, et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h), avec du matériel d’enrichissement et un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme espèce expérimentale pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et de sa faisabilité technique. La physiologie murine, notamment en ce qui concerne le système immunitaire intestinal et la réponse neuroinflammatoire post-AVC, présente des similitudes établies avec celle de l’humain, permettant ainsi d’étudier de manière appropriée les interactions entre inflammation intestinale et sévérité de l’AVC. De plus, des modèles murins bien caractérisés existent à la fois pour l’induction d’une colite expérimentale et pour l’ischémie cérébrale thromboembolique focale, avec des protocoles reproductibles et validés à l’échelle internationale. Enfin, aucune alternative in vitro ou modèle in silico ne permet aujourd’hui de reproduire de manière intégrée les interactions multi-organes dans le contexte post-AVC, rendant l’utilisation de la souris indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. L’AVC est une pathologie qui touche principalement l’adulte, le plus souvent au-delà de 65 ans, mais son incidence augmente également chez l’adulte jeune. Pour reproduire au mieux la pathophysiologie humaine, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), stade où la maturation physiologique et la réponse neurovasculaire sont comparables à celles de l’adulte humain.
Rôle des récepteurs hormonaux et des oestrogènes dans les réponses immunitaires antitumorales dans les cancers du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 575 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur mammaire, une partie subissant en plus une ablation des ovaires, puis elles reçoivent des injections d'hormonothérapie ou de cellules immunitaires avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. L'objectif déclaré est de comprendre l'effet des œstrogènes sur les réponses immunitaires face au cancer du sein. Le porteur indique avoir envisagé des insectes ou des organismes non-vertébrés, écartés faute d'un système immunitaire comparable, et conclut que la souris est "indispensable".
Objectifs
Le système immunitaire est capable dans la plupart des cas de contrôler l’apparition et le développement des cancers. Dans certains cas les cancers peuvent échapper à ce contrôle immunitaire grâce à de nombreux mécanismes, incluant l'induction de cellules dites "immuno-suppressives". Ces cellules sont capables de bloquer la capacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales. Plusieurs sous-types de cancers du sein ont été définis, basés sur la présence (l’expression) par les cellules tumorales des récepteurs hormonaux ER (récepteurs aux œstrogènes), ou PR (récepteurs à la progestérone). Les cancers hormono-dépendant dépendent ainsi de ces récepteurs. Cliniquement, il est possible de bloquer ces récepteurs en utilisant des molécules spécifiques. Cependant, outre les cellules cancéreuses, certaines cellules immunitaires pourraient également exprimer ces mêmes récepteurs hormonaux. L’effet des œstrogènes sur ces cellules immunitaires reste à ce jour peu connu. Ce projet a ainsi pour objectif de caractériser l’influence des hormones femelles sur les cellules immunitaires tueuses anti-tumorales et sur les cellules immunitaires pro-tumorales impliquées dans l’échappement des cancers au système immunitaire. Un modèle de cancer du sein de souris représentatif des cancers du sein humain et maîtrisé depuis 20 ans par le laboratoire sera utilisé.
Bénéfices attendus
Les données générées au cours du projet proposé devraient permettre : 1) de clairement déterminer l’effet des oestrogènes, le rôle des récepteurs hormonaux ER et des hormonothérapies sur différentes populations de cellules immunitaires pro- et anti-tumorales. 2) De déterminer si, en modifiant le contexte immunitaire chez des souris porteuses de tumeur, les hormonothérapies permettent d’améliorer l’efficacité des immunothérapies. Notre objectif à long terme est d'améliorer les réponses cliniques chez les patientes atteintes de cancer du sein.
Procédures
Modèle de cancer du sein de souris : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Ablation des ovaires, environ 15 min. Les procédures se feront sous anesthésie générale. Pour les thérapies: injections intraveineuses (dans la circulation sanguine), intrapéritonéales (dans la cavité péritonéale) ou intratumorales d'hormonothérapie (3 injections tous les 2-3 jours), ou de lymphocytes T (cellules immunitaires anti-tumorales) (1 injection) (temps de la procédure ~10 secondes). Les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, y compris les animaux mis à mort aux points limites. Des prélèvements des différents organes seront effectués uniquement après la mort de l'animal : - Rates - Tumeurs - Foies - Poumons - Sang.
Impact sur les animaux
Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la manipulation et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une fatigue générale. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puisque les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux. Les stratégies permettant une réduction de la souffrance et du stress sont détaillées dans les sections « remplacement, réduction, raffinement » et spécifiquement décrites pour chaque procédure.
Devenir
A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires
Remplacement
L'utilisation de modèles de cancers de souris est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives : en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permettrait pas de reconstituer toute la complexcité cellulaire d'une tumeur et de son environnement immunitaire. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules pro-tumorales in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs les réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, les expériences nécessitent d'être répétées au moins 3 fois.
Raffinement
La procédure majeure consiste à injecter des cellules cancéreuses dans la glande mamaire des souris. Cette procédure ne demande pas de chirurgie, et permet un suivi à long terme; la manipulation des animaux n'engendre pas de douleur et n'est associée qu'à un stress limité. L'évolution tumorale est très documentée, permettant un suivi reproductible et fiable des animaux, ainsi que d'anticiper les signes de détresse potentiels. Concernant l'objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l'angoisse infligées aux animaux, les souris sont hébergées dans des conditions très contrôlées, adaptées à leur fragilité (cages, nourriture et litière stériles). Elles sont observées chaque jour pour repérer tout signe de malaise. Si un animal montre trop de souffrance, il est euthanasié rapidement pour éviter toute douleur inutile. Des limites précises ont été fixées : Perte de poids de plus de 20% d’une semaine à l’autre; Changement de comportement (isolement, posture anormale, poils hérissés); Tumeur dépassant 2 cm. Les souris étant des animaux sociaux, 5 animaux seront placé par cage en présence d'un enrichissement de leur environnement (matériaux pour la fabrication de nids).
Choix des espèces
Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle. Il est impossible, pour des raisons techniques et éthiques, d’observer directement chez l’être humain comment une tumeur agit sur le système immunitaire au fil du temps. C’est pourquoi la souris est utilisée, dont l’immunité ressemble beaucoup à celle des humains. L’étude sur la souris permet de suivre précisément comment les cellules du système immunitaire réagissent et évoluent face à une tumeur. Les expériences sur des cellules isolées ou sur des organismes plus simples (comme les insectes) ne permettent pas d’obtenir ces informations, car ils ne possèdent pas un système immunitaire comparable. La souris est donc le modèle le plus fiable et le plus couramment utilisé pour comprendre les mécanismes immunitaires liés au cancer.
Rôle des contacts microglie-synapses dans les mécanismes de consolidation de la mémoire chez la souris (EU 1/3)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Crâne aminci et implant collé sous anesthésie de quatre heures, contention de la tête, restriction d'eau et jets d'air aversifs en cas de mauvaise réponse: 3480 souris subissent ce protocole d'apprentissage. Le RNT en classe 2895 en souffrance légère et 585 en modérée, toutes tuées à l'issue. L'étude porte sur le rôle des cellules immunitaires du cerveau dans les troubles de mémoire après une anesthésie prolongée. Le porteur qualifie le stress lié à la contention et aux jets d'air de "difficile à évaluer" faute de signes physiques, sans le mesurer autrement.
Objectifs
L’anesthésie générale est utilisée tous les jours à l’hôpital, notamment lors d’opérations chirurgicales ou pour maintenir un patient endormi en soins intensifs. Dans certains cas, notamment lorsqu’elle dure longtemps, elle peut être suivie de troubles de la mémoire ou de la concentration. Ce phénomène a été observé chez plusieurs patients après leur séjours en réanimation, notamment pendant la pandémie de COVID-19, mais les causes exactes de ces effets restent encore mal connues. Le sommeil et l’anesthésie peuvent sembler similaires (on ne bouge plus, on ne sent plus les choses, l’activité du cerveau ralentit), mais ils ne reposent pas sur les mêmes mécanismes. De plus, le sommeil est réparateur pour le cerveau, alors que l’anesthésie prolongée pourrait avoir des effets plus néfastes sur son fonctionnement. Chez la souris, il a été montré que rester longtemps sous anesthésie modifie certaines connexions dans le cerveau. Jusqu’à présent, les chercheurs ont surtout étudié les neurones, les cellules qui permettent la communication dans le cerveau. Mais les cellules immunitaires du cerveau, les microglies, pourraient aussi jouer un rôle important. Ces cellules aident normalement à entretenir et à remodeler les connexions dans le cerveau, surtout pendant l’apprentissage ou lorsqu’on forme des souvenirs. Ce projet multi-établissement (3 établissements utilisateurs), vise à mieux comprendre comment l’anesthésie prolongée pourrait perturber les interactions entre neurones et microglies chez la souris, à différents moments de la mémoire : quand on apprend, quand on consolide l’information, et quand on se souvient. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre pourquoi certaines personnes ont des troubles de la mémoire après une anesthésie, et à trouver des solutions pour mieux les prévenir.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’approfondir notre compréhension des effets à long terme de l’anesthésie générale prolongée sur le cerveau, notamment sur la mémoire et les capacités cognitives. En explorant pour la première fois le rôle potentiel des microglies dans ces effets, il pourrait: 1) Améliorer la compréhension des troubles cognitifs post-anesthésie, en identifiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, au-delà des seuls neurones. 2) Contribuer à la recherche médicale humaine, en proposant des pistes pour prévenir ou limiter les séquelles cognitives chez les patients ayant subi une anesthésie prolongée (par exemple après chirurgie lourde ou séjour en réanimation). 3) Orienter de futures stratégies thérapeutiques ciblant la plasticité cérébrale et les cellules gliales pour favoriser une meilleure récupération cognitive. 4) Fournir un nouveau modèle préclinique expérimental pour étudier les effets de l’anesthésie sur la mémoire, intégrant non seulement l’activité neuronale mais aussi les interactions cellules gliales-neurones. 5) Réduire les impacts socio-économiques des déficits cognitifs post-opératoires, en apportant des solutions de prévention ou d’accompagnement adaptées à ces patients.
Procédures
Une chirurgie sous anesthésie pour placer implant et des électrodes d'enregistement sur le crane (4h00) au sein de l'EU1/3. Habituation à la contention longue de la tête au sein de l'EU2/3 (10 jours par session quotidienne allant progressivement de 5 minutes à 3h00). Comportement (tâche de discrimination tactile par les vibrisses) et imagerie, 2 sessions de 3h maximum/jour pendant 3 jours avec des pauses de 3 heures minimum au sein de l'EU2/3. Restriction hydrique pendant 12 heures répétées 6 fois maximum. Mise à mort sous anesthésie générale (animaux inconscients) au sein de l'EU3/3.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une chirurgie afin de coller un implant sur le crâne de la souris, implantons des électrodes sur le crane et dans les muscles de la nuque pour évaluer leur activité et déterminer si la souris est endormie ou éveillée, et amincissons le crâne sans corrompre l'intégrité du système nerveux central sous anesthésie. Cette chirurgie peu invasive réalisée sous analgésie et anesthésie entraine des douleurs post opératoire pendant 48h00. Les complications au stade de la chirurgie sont extrêmement rares. Nous réalisons ensuite une habituation progressive des souris par renforcement positif pour qu'elles restent en condition tête restreinte pendant les sessions d'apprentissage et de rappel et pendant la phase de sommeil (séances allant de 5 minutes à 3 heures progressivement sur 7 jours). Il arrive rarement que certaines souris présentes des difficultés à s'habituer. Cette contention entraine certainement un stress léger, difficile à évaluer car nous n'observons pas de manifestations physiques (grattage, vocalisations, mictions/défécations, posture ou comportements compulsifs), le stress potentiel, est atténué par le renforcement positif (récompense avec des friandises). Afin de motiver les souris à s'engager dans la tâche d'apprentissage une restriction hydrique est réalisée pendant 12 h max sur 24h, cette restriction d'accès à l'eau peut être reproduite pendant 3 jours, elle entraine un inconfort transitoire de la souris (sensation de soif). Un stimulus aversif, puff d'air (durée 1s) en cas de mauvaises réponses est utilisé dans la phase initiale de l'apprentissage pour aider les souris à comprendre la tâche à réaliser, le puff d'air est utilisé uniquement si elle ne répondent pas aux pénalités de temps. Ces puffs d'air utilisé en dernier recours et potentiellement répétés peuvent engendrer un stress, difficile à quantifier en absence de signes cliniques. 2 séances de comportement et d'imagerie en tête restreinte de 3 heures maximum chacune ont lieu chaque jour et sont répétées au maximum pendant trois jours, ses séances peuvent occasionner un stress identique voir plus faible que lors de l'habituation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Les organes d'intérêt pour l'étude sont alors prélevés et d'autres organes sont collectés pour constituer un banque de tissus à disposition d'autres équipes et laboratoires (muscles ou rétine).
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’à présent inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées par informatique. Nous utilisons généralement des cultures cellulaires ou des explants de cerveaux mais modifier l’environnement des microglies entraine un changement morphologique et fonctionnel. Afin de comprendre le rôle des microglies dasn le cerveau sain, il faut donc les étudier in vivo. Les données obtenues seront partagées avec des mathématiciens afin de modéliser la morphodynamique microgliale.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés sur la base de notre connaissance de la littérature. Les comparaisons seront faites en utilisant des statistiques non paramétriques ne nécessitant pas de distribution normale et compatible avec nos effectifs réduits pour la partie in vivo. D'autre part, dans certaines expériences ex vivo et in vivo, chaque souris est son propre contrôle ce qui permet de réduire drastiquement le nombre d'expériences et d'animaux requis.
Raffinement
Notre expérience du modèle nous permet d’affirmer que la morbidité due à l’implantation de la fenêtre est quasi nulle. Après plus de 10 ans d'expérimentation avec ce modèle, nous n'avons observé qu'une désimplantation et aucun signe de souffrance ou de stress. Nous veillerons à limiter le mal être des animaux en réalisant des habituations progressives de nos souris à la manipulation. La gestion de la douleur et de l'inflammation sera réalisée de la façon suivante : injection d'anesthésique local avant la chirurgie, injection d'anti inflammatoire non stéroidiens en s.c en début de chirurgie, puis 24 et 48h après. En complément le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Ils seront observés dans leur cage pendant plusieurs minutes puis pesés. L’évaluation se fera selon un scorage établi tenant compte de différents paramètres classiquement utilisés (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (nid et roue d'activité), tout au cours de l'expérience. Une partie des expérimentations seront réalisées ex vivo. Les expérimentations ex vivo sur tissus post-mortem ont été pensé pour compléter l'approche in vivo sur animal vigile tout en réduisant la nécessité de prélèvements impliquant des gestes invasifs ou la durée d'inconfort des animaux. Le transport des souris d'une UE à l'autre (5 minutes de transport) se fait dans des cages opaques et en triple emballage pour limiter le stress lié au transport.
Choix des espèces
Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Enfin l'architecture corticale est proche de celle de l'homme et il s'agit donc d'un des meilleurs modèles non primate pour étudier la plasticité synaptique. Les souris seront des souris jeunes adultes utilisées entre 6 et 10 semaines car la taille du crâne n'évolue plus dans le temps.
Impact de la modification de la structure tissulaire sur la surveillance immunitaire – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
4443 souris vont être utilisées pour une zone de peau fibrosée de moins d'un centimètre carré dans le bas du dos, chacune recevant des injections répétées d'un agent inflammatoire cinq jours par semaine pendant deux semaines. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées pour analyses. Le projet observe comment la rigidité du tissu modifie la migration des cellules immunitaires dans la peau. L'effectif de plus de quatre mille animaux n'est rattaché qu'à un objectif de connaissance fondamentale, sans justification détaillée du nombre.
Objectifs
La peau est le plus grand organe du corps humain, indispensable à notre survie. Elle agit comme une barrière protectrice et joue un rôle crucial dans notre système immunitaire. La peau est composée de trois couches. 1)L’épiderme, la couche la plus superficielle 2)Le derme, la couche intermédiaire, contient des fibres de collagène et d’élastine qui lui donnent élasticité et fermeté. Il abrite également des vaisseaux sanguins, des nerfs, ainsi que des follicules pileux. 3) l’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et est essentiellement composée de tissus adipeux et conjonctif. Elle fournit une isolation thermique. Dans le derme et l’épiderme, les cellules immunitaires patrouillent à la recherche de pathogènes ou de signaux de danger pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace, qu’elle soit spontanée suite à une infection ou à l’apparition d’une tumeur, ou induite par un vaccin par exemple. Ce processus est aussi essentiel pour le maintien de la tolérance immunitaire, et ainsi éviter les maladies auto-immunes. Certaines cellules immunitaires (les cellules dendritiques) se déplacent dans les tissus en prélevant des échantillons de leur environnement. Elles migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques drainant leur tissu d’origine. Ces 2 étapes (échantillonnage en périphérie et migration vers les ganglions) sont clefs dans la mise en place de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance. Dans les tissus, la migration des cellules dendritiques est guidée par des signaux chimiques et physiques, qui sont profondément modifiés en cas d’inflammation. Notre projet vise à comprendre comment la modification des propriétés mécaniques de la peau modifie la migration et l’efficacité des cellules immunitaires dans la peau et dans les ganglions. La compréhension de ces mécanismes mis en jeu pourra s’appliquer à d’autres pathologies dans lesquelles la modification de la structure du tissu est majeure. La modification de la structure tissulaire et de ses propriétés physiques est maintenant connue dans de nombreuses pathologies notamment au sein de divers cancers, où le la modification du collagène semble favoriser la survenue de métastases en inhibant la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Comprendre comment l’installation d’une fibrose modifie les propriétés mécaniques des tissus et la migration des cellules immunitaires permettra d’obtenir des connaissances fondamentales sur la migration des cellules dans les tissus. Nous focalisons nos recherches sur les cellules dendritiques, cellules sentinelles du système immunitaire indispensable pour le déclenchement d’une réponse immunitaire spécifique. Nos premiers résultats mettent en évidence une accumulation de cellules dendritiques en cas de fibrose, qui sont incapables de migrer au ganglion lymphatique. Nous souhaitons adapter cette DAP afin de préciser les mécanismes moléculaires mis en cause dans ce défaut de migration. Ces mécanismes pourront être utilisés dans de nombreuses autres pathologies où la modification de la structure du collagène joue un rôle majeur dans la progression de la maladie et la réponse immunitaire, notamment en cas de cancer, où la migration des cellules dendritiques est également défectueuse. La modification proposée permettra d’identifier des mécanismes précis qui régulent la migration des cellules dendritiques, et pourra s’appliquer à d’autres pathologies (cancer).
Procédures
Dans un premier lot, les animaux anesthésiés recevront des traitements par injection à raison de maximum 1 injection par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines (durée de chaque anesthésie de 5 minutes maximale). Certains de ces animaux recevront également un second traitement soit par injection à raison d’1 injection par jour pendant 5 jours consécutifs au maximum (durée du geste inf à 10sec) soit par application cutanée (application unique – durée du geste de 3 minutes). Dans un second lot, les animaux vigiles recevront une application cutanée unique de produit (durée du geste inférieure à 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de produits seront celles liées à la piqûre (douleur de courte durée). L’injection d’un agent inflammatoire induira une inflammation chez les animaux. L’inflammation se caractérise par la douleur, le gonflement, la rougeur et la chaleur qui peuvent entraîner une gêne chez l’animal. Néanmoins, il s’agit ici d’une inflammation locale et non générale, et modérée. La gêne est caractérisée par l’apparition d’une desquamation principalement entre les 12e et 16e jours après injection, et la présence d’un érythème dont l’intensité est maximale du 9e au 14e jour. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines afin d’étudier la résolution de l’inflammation, mais nous ne nous attendons pas à des effets rémanents après la fin des injections. La surface attendue de la zone fibrotique de la peau du bas du dos de la souris est inférieure à 1cm. Nous porterons notre attention spécifique sur cette zone. Nous ne nous attendons pas à des conséquences sur la mobilité des souris, la zone fibrotique étant à distance des articulations des membres supérieurs et inférieurs. Un éventuel effet sur la mobilité n’a d’ailleurs pas été décrit dans la littérature.L’application cutanée d’un marqueur fluorescent sans addition de molécule pro-inflammatoire induira une réaction locale éventuelle (mais non décrite dans la littérature). L’application cutanée d’un marqueur fluorescent associé à une molécule proinflammatoire pourra induire un aspect inflammatoire local (rougeur, chaleur).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’influence du microenvironnement tissulaire sur la migration des cellules immunitaires a été démontré par de nombreuses équipes au cours de la dernière décennie. Ces cellules répondent à des signaux de dangers, largement étudiés in vitro , comme par exemple la présence de composants bactériens. Néanmoins, il s’agit d’un effet direct d’un agent inflammatoire sur les cellules, qui ne prend pas en compte le contexte complexe et la réponse du tissu, qui répond également à la présence de signaux de dangers. Il n’est donc pas possible d’extrapoler ces données sans avoir une description précise et quantitative des propriétés du microenvironnement in vivo. L’utilisation de différents modèles in vitro (matrice en fibres 3D) ou ex vivo (explants de peau humaine) ne permettent pas de reconstituer la complexité du tissu cutané : - Sa structure en 3 couches (épiderme, derme, hypoderme) et la structure des fibres de collagène formant le tissu de soutien aux cellules. - Nombreux types cellulaires présents : kératinocytes dans l’épiderme, fibroblastes dans le derme, adipocytes (manquant dans les modèles in vitro), extrémités neuronales (non présents dans les modèles in vitro) et l’infiltrat immunitaire comportant de multiples types cellulaires différents. L’objectif de ce projet est de fournir cette description, afin ensuite de pouvoir établir des modèles in vitro conformes aux propriétés des tissus observées in vivo. Cela permettra alors d’isoler les propriétés du tissu une par une et de tester leur effet individuel sur les cellules immunitaires, afin d’identifier les paramètres les plus importants. Par ailleurs, Le modèle in vivo est indispensable pour déchiffrer le dialogue entre différentes cellules immunitaires et la migration d’un organe à l’autre, dans un organisme vivant intégré dont le système immunitaire est proche de celui de l’homme, comme la souris. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet, afin d’avoir un tissu et un système immunitaire complets et fonctionnels.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les expériences de mise au point seront réalisées sur des échantillons prélevés sur des animaux utilisés pour d’autres expériences (mise à mort pour prélèvement d’autres organes que la peau). Une première expérience sera réalisée afin de déterminer les meilleurs temps expérimentaux à utiliser. Les échantillons issus de cette expérience seront également utilisés pour les analyses des procédures suivantes. Le maximum d’échantillons d’intérêt a été et sera prélevé lors de la mise à mort des souris (peau, ganglions, sérum) et conservés pour des analyses ultérieures. Cela permettra de concentrer ensuite la caractérisation sur ces conditions expérimentales et donc de limiter le nombre total d’animaux utilisés. Grâce à nos résultats préliminaires, nous avons pu supprimer une procedure initialement prevue qui n’a plus de rationnel scientifique. A partir de données publiées et accessibles, nous avons ici déterminé le nombre d’animaux nécessaire comme étant le plus petit nombre d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative dans notre modèle expérimental (induction de fibrose cutanée).
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales, les animaux sont suivis attentivement afin d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Pour cela : -Les souris sont habituées à l’animalerie (accoutumance après transfert) et habituées à être manipulées par le même expérimentateur avant le début de la procédure, afin de limiter le stress après le début de la procédure. -Un suivi clinique renforcé sera réalisé pendant les 30 min suivant l’injection sous-cutanée, puis 6h après, puis une fois par jour pendant 10 jours, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. -Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point limite, les animaux seront sortis de la procédure (traitement antalgique, mise à mort). -Le suivi des animaux pour les procédures suivantes sera adapté en fonction de ce qui a été observé dans les procédures antérieures (au fur et à mesure de l’avancée du projet). Nous n’avons pas observé d’effet secondaire inattendu lors des premières expériences réalisées. Pour éviter l’inconfort et la douleur lors des procédures, des anesthésiques et analgésiques adaptés seront utilisés.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.