Système immunitaire

60 souris reçoivent une irradiation qui détruit leur moelle osseuse, puis une greffe de cellules sanguines mutées, avant qu'un produit inflammatoire ne leur soit appliqué six jours de suite sur le dos rasé. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes seront tuées. Le porteur qualifie ce modèle de non invasif et conclut à des nuisances "modérées, réversibles et limitées dans le temps, sans atteinte durable du bien-être animal", tout en indiquant que l'irradiation provoque perte de poids et diarrhées. Les prélèvements de tissus, effectués après la mise à mort, doivent relier l'anomalie sanguine à l'inflammation de la peau.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment certaines anomalies acquises de la production des cellules du sang, appelées hématopoïèse clonale, peuvent influencer ou aggraver les maladies inflammatoires chroniques de la peau, comme la dermatose inflammatoire (DI). À l’aide de modèles expérimentaux reproduisant des réactions cutanées inflammatoires proches de celles observées chez l’humain, nous étudierons comment ces cellules sanguines mutées entretiennent une inflammation persistante. L’objectif est d’identifier les mécanismes responsables et de tester des approches permettant de limiter cette inflammation, afin d’améliorer la prévention et la prise en charge des maladies auto-immunes et inflammatoires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet aideront à mieux comprendre comment certaines anomalies du sang peuvent favoriser ou aggraver les maladies inflammatoires. Ces connaissances pourraient, à terme, permettre de développer des traitements plus précis pour contrôler l’inflammation et améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de maladies chroniques.

Procédures

Les interventions prévues concernent la mise en place et le suivi du modèle d’hématopoïèse clonale (HC) et de DI. Chaque souris sera exposée uniquement aux gestes correspondant à son groupe expérimental. Après une irradiation, étape de conditionnement permettant d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir réaliser ensuite la greffe de cellules d'intérêt dans la veine de la queue sur souris éveillée avec contention douce (durée: 1 min). La prolifération de ces cellules sera suivie grâce à l’analyse réalisée sur des prélèvements sanguins (fait au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillées 2 fois par mois avec un maximum de 4 prélèvements). L’induction de la DI (environ 8 semaines après la greffe) sera effectuée par application sur la peau rasée du dos d’une molécule connue pour induire cette pathologie, une fois par jour pendant 6 jours consécutifs, sans anesthésie (durée: 1 min). Ce modèle est non invasif et entraîne uniquement une inflammation locale transitoire.

Impact sur les animaux

Les souris pourront présenter une inflammation cutanée légère à modérée (rougeur, épaississement local, petites croûtes) due à l’application du produit inflammatoire. Un léger stress lié aux manipulations est possible. Suite à l'étape d'irradiation, les animaux peuvent présenter une perte de poids et des diarrhées suivie d’une phase de récupération complète après la greffe. Ainsi, les nuisances attendues sont modérées, réversibles et limitées dans le temps, sans atteinte durable du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience afin de permettre des analyses approfondies des tissus et cellules. Ces prélèvements sont essentiels pour comprendre le lien entre le développement anormal des cellules du sang et un maladie inflammatoire de la peau.

Remplacement

Aucune alternative in vitro (cellules en culture) ou in silico (par analyse informatique) ne permet actuellement de reproduire la complexité des interactions entre le système sanguin et l'inflammation au niveau de la peau. Seule l'utilisation d'un modèle animal vivant peut permettre de reproduire cette complexité.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés

Raffinement

Les protocoles expérimentaux incluent des mesures spécifiques pour réduire la douleur et le stress des animaux (analgésie, enrichissement du milieu de vie, manipulation douce et rapide, surveillance quotidienne des animaux) ainsi que la mise en place de points limites évalués lors du suivi clinique quotidien à l'aide d'une grille de critères observés. En cas de douleur, celle-ci sera prise en charge (administration d’anti-douleur, surveillance renforcée sur une période de 24 heures avant euthanasie si aucune amélioration n'est observée).

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car elles constituent un modèle bien établi pour l’étude des maladies inflammatoires et hématologiques. Les animaux utilisés auront entre 8 et 12 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est mature, ce qui permet d’obtenir des résultats représentatifs des processus biologiques étudiés.

Dix semaines de régime gras, puis un infarctus provoqué par une chirurgie de trente minutes : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur. S'y ajoutent une échocardiographie et des injections répétées, toutes les quarante-huit heures pendant dix jours ou trois fois par semaine pendant deux semaines. L'objet est de comprendre comment une maladie du foie gras aggrave la réparation du cœur après un infarctus, sur des lignées modifiées pour porter l'atteinte hépatique. Parmi les nuisances attendues, le porteur ne mentionne que l'inconfort de la contention, le stress de l'anesthésie et des douleurs post-opératoires transitoires, sans un mot sur ce que représente l'infarctus lui-même pour l'animal.

Objectifs

La maladie du foie gras, qui touche plus de 127 millions d'Européens, est fortement liée à un risque accru de complications cardiovasculaires, notamment l'infarctus du myocarde. Les décès chez les patients atteints sont d'ailleurs plus souvent d'origine cardio-vasculaire qu'hépatique. Le remodelage cardiaque est un déterminant essentiel du résultat clinique après un infarctus du myocarde impliquant des réponses biologiques complexes, notamment un engagement du système immunitaire. Cependant, le rôle causal précis de l'atteinte hépatique sur la réparation cardiaque reste non établi. Le projet a donc pour but de caractériser les effets de différents types d'atteintes tissulaires qui caractérisent la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque aux niveaux cellulaires et moléculaires, avec un accent particulier sur la réponse inflammatoire. Une approche thérapeutique sera testée pour limiter les dommages cardiaques délétères observés. Les objectifs de ce projet sont : 1. Caractériser les effets de la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde chez la souris. 2. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire, par l’analyse dans le sang, la rate, la moelle osseuse et enfin dans le coeur. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’atteinte cardiaque exacerbée associée à l'atteinte hépatique. 4. Etudier la contribution directe d'un type de cellules inflammatoires délétères: les neutrophiles.

Bénéfices attendus

À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de communication cellulaire qui contrôlent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde, ainsi que le rôle de l’atteinte hépatique dans le contrôle de l’homéostasie du cœur défaillant. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du cœur infarci, prévenir ou freiner les atteintes cardiaques, et ainsi améliorer la survie des patients.

Procédures

Exposition diète riche en matières grasses - durée 10 semaines //chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection - durée 1 minute, soit chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie, soit 3 fois par semaine durant 2 semaines postérieures à la chirurgie.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires.

Devenir

À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.

Remplacement

Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable pour étudier le dialogue pathogénique complexe entre le cœur et le foie, un phénomène qui implique de multiples types cellulaires et ne pourrait pas être entièrement reproduit par de simples modèles cellulaires. Le choix de modèles animaux qui permettent de modifier spécifiquement le foie repose sur des données préalablement observées, garantissant que les modèles reproduisent fidèlement les atteintes hépatiques souhaitées. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'un infarctus du myocarde dans un contexte de maladie du foie gras.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de la relation entre la stéatose hépatique et les maladies cardiovasculaires, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1. génétique et mécanismes : Il permet de générer les lignées génétiquement modifiées nécessaires pour induire spécifiquement l'atteinte hépatique. Ceci est crucial pour décortiquer les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires du dialogue cœur-foie. 2. reproductibilité et rurveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques et vasculaires associées à la maladie du foie dans un délai de temps pertinent. 3. complexité biologique : Contrairement aux modèles in vitro, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions inter-organes (cœur et foie) impliquées dans le remodelage cardiaque post-infarctus. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 10 semaines minimum. Ce choix est fait pour s'assurer que le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. Utiliser des souris plus jeunes risquerait d'introduire un biais, car elles n'auraient pas systématiquement atteint la puberté, et les hormones sexuelles sont connues pour jouer un rôle dans le remodelage cardiaque post-infarctus.

Une perte de poids trop importante ou une immobilité totale suffit à arrêter l'expérience, un score clinique supérieur à 8 pouvant y mettre fin. 4 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est provoquée par injection, puis des composés sont administrés jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire ou intradermique, avec des prélèvements sanguins allant jusqu'à 12 % du volume sanguin total. Le porteur décrit œdèmes, difficultés locomotrices, posture prostrée et douleur, et précise que la fréquence des prélèvements relève de "l'appréciation du client".

Objectifs

Plus de 200 maladies rhumatismales sont recensées et se manifestent sous différentes formes avec des atteintes au niveau des os et des articulations, des ligaments, des cartilages, des muscles et des tendons des membres inférieurs et supérieurs. On distingue quatre principaux types de rhumatismes : les rhumatismes inflammatoires (arthrite rhumatoïde, spondylarthropathies...), les rhumatismes dégénératifs (arthrose...), les affections des parties molles (fibromyalgie...) et les affections osseuses (ostéoporose...). Parmi les rhumatismes inflammatoires, l’arthrite rhumatoïde (AR) fait partie des maladies articulaires inflammatoires chroniques de l'adulte les plus fréquentes. En effet, elle concerne plus de 300 000 personnes en France et peut réduire l’espérance de vie des personnes atteintes. Bien que l’AR puisse se manifester à tout âge, elle apparaît généralement à l’âge adulte entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans et une incidence deux à trois fois plus élevée chez les femmes. Les répercutions psychologiques, fonctionnelles, professionnelles et sociales, de la pathologie sont importantes et en font un enjeu économique de santé majeur. En effet, la douleur est souvent le symptôme le plus contraignant pour les patients car elle peut persister malgré la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. Ainsi, bien que certains traitements soient proposés aux patients, ils n’en restent pas moins uniquement symptomatiques et parfois peu efficaces sur l’évolution de la pathologie et la gestion de la douleur. A ce jour, il est donc impératif de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Depuis ces dernières années, le développement de traitements pour les maladies articulaires a permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Même si certaines de ces stratégies s’avèrent efficaces dans l’amélioration des symptômes et permettent parfois une rémission complète et prolongée, le pronostic d’évolution de la pathologie reste mauvais pour de nombreux patients. En effet, les déformations articulaires ainsi que la destruction des tendons contraignent parfois les médecins à avoir recours à la chirurgie orthopédique. Par ailleurs, de part leurs comorbidités, certains traitements ne peuvent être proposés à certains patients. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un suivi plus personnalisé et d’aboutir à une rémission complète de tous les patients. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement…) de différents candidats médicaments dans les maladies articulaires.

Procédures

1) Induction de la pathologie : les animaux pourront être soumis à une ou plusieurs injections afin de mettre en place le modèle (1 minute maximum). Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale (5min) ou non selon le mode d’injection décrit dans la procédure. 2) Administrations répétées de composés client (2 fois par jour au maximum): les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client (maximum 2 fois par semaine pour des petits prélèvements inférieurs à 8% du volume sanguin total, 1 fois pour ceux supérieurs à 8%), un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées à la pathologie pourront être observées sur les animaux telles que : - Perte de poids - Posture prostrée - Absence d’hygiène corporelle : poil hérissé - Difficultés locomotrices - Douleur - Œdèmes et atteintes des articulations - Stress lié à l’isolation des animaux en cages individuelles pendant 24 à 60h (activmètre) - Stress et douleur liés à l'utilisatuon d'un test de douleur. De plus, l’injection de certains inducteur de la maladie peut provoquer une inflammation au niveau de la queue. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.

Remplacement

Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être évitée. En effet, comme vu précédemment, les maladies articulaires telles que l’arthrite rhumatoïde présentent des origines diverses (facteurs immunologiques, environnementaux, hormonaux, génétiques). Les modifications physiopathologiques liées à ces pathologies sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Il s’agit de maladies évolutives qui, une fois déclenchées, s’aggravent progressivement et s’étendent à d’autres articulations. La douleur est un problème majeur chez les patients car elle persiste bien après la prise en charge thérapeutique par des anti-inflammatoires par exemple. Il est donc inévitable d’utiliser les modèles animaux dans l’étude de l’efficacité de nouvelles thérapies qui doivent impérativement prendre en compte le paramètre de la douleur. Par ailleurs, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux minimum seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63 en unités individuelles ventilées avec enrichissement de l’environnement (igloo et carrés de ouate). L'état de santé des animaux sera évalué selon des critères en accord avec le comité́ de suivi du bien - être animal de notre établissement. L’expérimentateur sera alors prévenu et une dégradation trop importante de l'état de santé (au-delà d'un score de 8 selon les critères détaillés dans les procédures, score 1) pourra entrainer l'arrêt immédiat de l'expérimentation. Par ailleurs, dès lors que la pathologie sera induite, les expérimentateurs procéderont à un suivi quotidien des animaux (le suivi du week-end sera effectué par le personnel de la zone d'expérimentation) afin d’identifier les atteintes spécifiques à la pathologie (grilles de score spécifiques permettant de définir les points limites). Certains critères suffiront à eux seuls pour acter l'arrêt de l'expérience, tels qu'une perte de poids trop importante ou une immobilité totale. Par ailleurs, dès lors qu’une inflammation d’une articulation et/ou une difficulté de mobilité seront observées, de la nourriture humidifiée et de l’eau gélifiée seront ajoutés dans la cage.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement d’arthrite rhumatoïde compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la réponse inflammatoire. L’ensemble des modèles décrits dans ce projet nécessite l’utilisation de souris adultes car l’arthrite rhumatoïde apparaît généralement entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans. Le modèle de développement de l’arthrite rhumatoïde nécessite l’utilisation d’animaux âgés de 6 semaines, c’est-à-dire un âge auquel la sensibilité au développement de la pathologie est optimale. Le modèle d’induction de l’arthrite rhumatoïde par transfert de sérum nécessite d’une part, des souris présentant les premiers signes de développement de la pathologie à partir de 8 semaines et permettant de fournir le sérum nécessaire à l’injection et, d’autre part, des souris âgées de 6 à 10 semaines qui recevront le sérum. Les autres modes d’induction nécessiteront l’utilisation d’animaux âgés de 6 à 10 semaines.

Irradiées puis greffées, à trois jours de vie, avec des cellules souches prélevées sur des patients atteints de mastocytose, ces souris développent un système immunitaire humain et des tumeurs de mastocytes. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une anémie possible, des ulcérations sur les tumeurs sous-cutanées, un rejet des nouveau-nés par leur mère après manipulation et des chocs anaphylactiques faisant chuter la température corporelle de plus de huit degrés. Il écrit que "100 %" des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs organes.

Objectifs

La mastocytose est une maladie rare due le plus souvent à des mutations activantes d’un récepteur entraînant une différentiation et une prolifération aberrante de cellules immunitaires appelées mastocytes. La mastocytose est classée en trois types principaux selon le degré de sévérité et les organes atteints: la mastocytose cutanée (MC), qui affecte uniquement la peau ; la mastocytose systémique (MS), allant des formes indolentes aux formes sévères ou agressives, dans lesquelles au moins un organe extra-cutané est atteint ; et le sarcome mastocytaire, caractérisé par la présence d'une tumeur solide composée de mastocytes malins présentant une capacité d’infiltration destructrice et un potentiel métastatique. Selon la localisation tissulaire et la sévérité de la maladie, les symptômes peuvent inclure une irritation cutanée, des symptômes allergiques tels que l’anaphylaxie, ainsi que des déficits cellulaires, organomégalies (augmentation du volume des organes), et de l’ostéoporose. La forme la plus grave de mastocytose est la mastocytose agressive, dans laquelle il y a formation de tumeurs de mastocytes dans de nombreux tissus et dans la moelle osseuse et, dans la majorité des cas la survie des patients atteints de mastocytose agressive n’excède pas 3 à 5 ans après le diagnostic. Au-delà des traitements mis en place permettant de réduire les symptômes associés tel que les réactions allergiques, l’ostéoporose ou les atteintes cutanées, les thérapies visant à la destruction des mastocytes tumoraux induisent de nombreux effets secondaires et présentent un manque de spécificité, ce qui limite leur utilisation aux formes les plus graves de la mastocytose. Il n’existe pas à l’heure actuelle de solution thérapeutique satisfaisante dans cette pathologie. Ce programme de recherche a pour but de développer de nouvelles approches d’immunothérapie dans la mastocytose. Les résultats attendus des expériences que nous projetons de réaliser contribueront à mieux comprendre le développement de cette pathologie grave et à identifier de nouvelles approches d’immunothérapie pour soigner cette maladie.

Bénéfices attendus

La preuve de l’efficacité des anticorps déplétant les mastocytes in vivo dans les modèles murins décrits ci-dessous représente une étape essentielle pour la validation thérapeutique dans le traitement de la mastocytose et la justification du démarrage d’essais précliniques.

Procédures

L’irradiation n’aura lieu qu’une fois par animal (25 sec). Chaque injection des traitements (de 2 à 4 ; une fois par semaine) se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que d'autres ainsi que le rasage de la zone d’injection se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; injection : 30 sec). L’imagerie non-invasive se fera sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; prise de l'image : 5 min). Les prélèvements de sang seront réalisés également sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées : L’irradiation peut entrainer une perte de poids transitoire, une léthargie et/ou alopécie. Le développement d’un système immunitaire humain chez la souris peut entrainer une anémie. Les données existantes suggèrent que ces effets apparaissent plus de 20 semaines après ce développementet se manifestent par des symptômes d’anémie, incluant pâleur des extrémités, baisse importante de l’activité et perte de poids rapide. Outre les effets indésirables décrits ci-dessus qui s’appliquent également dans le cas de souris humanisées à partir de nouveaux nés, la manipulation de ces animaux avant sevrage peut entrainer un rejet de la part de la mère. De plus, il est impossible d’évaluer le développement des cellules souches hématopoïétiques dérivées de patients mastocytose in vivo et on ne peut exclure la survenue de symptômes liés à une prolifération anormale des mastocytes et des atteintes comparables aux symptômes observés chez l’Homme. Les traitements ciblant les mastocytes peuvent induire des réactions allergiques de type choc anaphylactique se traduisant par une perte de température corporelle rapide et transitoire, supérieure à 8°C. Le développement de tumeurs solides sous cutanées dans les souris humanisées peut mener à l’apparition d’ulcérations cutanées et une potentielle perte de poids. Une perte de température corporelle rapide, transitoire et supérieure à 8°C peut survenir lors d’in modèle d’anaphylaxie systémique passive

Devenir

100% des animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes post mortem.

Remplacement

Devant la complexité de cette pathologie, due notamment à l’implication de différents organes, le recours aux modèles animaux est indispensable. Toutes les études préliminaires visant à sélectionner les anticorps déplétant les mastocytes ont été réalisés in vitro dans des modèles de cultures de mastocytes humains. De ce fait, seuls les anticorps présentant le meilleur potentiel thérapeutique seront testés dans ce projet dans des modèles murins. De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo pour tester les effets thérapeutiques d’anticorps déplétant les mastocytes nous permettra d’évaluer leur efficacité dans les différents tissues (bio-distribution), et leur capacite à induire la déplétion des mastocytes médiée par les cellules du système immunitaire inné.

Réduction

Les expériences décrites dans ce projet de recherche (incluant le nombre d’animaux par groupe) ont été élaborées sur les bases de travaux antérieurs et sur la base de notre expérience et de nos données préliminaires dans le domaine des mastocytes et des souris humanisées. Ceci dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de données statistiques robustes permettant de répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons une moyenne de 5 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet sont maintenus dans un département de zootechnie dédié (environnement stérile), et soumis à une surveillance journalière. Les soins sont prodigués par des personnels spécialisés, avec une connaissance des procédures animales et des projets scientifiques que nous menons, dont la priorité est le bien être animale et le respect des lois bioéthiques en vigueur. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour, permettant une détection précoce de toute altération de l’état de santé et une adaptation rapide des mesures nécessaires, contribuant ainsi à la réduction de la souffrance animale. Pour chaque procédure, des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera mis à mort s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif, nécessite peu de place, et il existe de nombreux modèles bien établis grâce aux progrès scientifiques réalisés ces dernières années. Les lignées transgéniques nécessaires pour ce projet sont d’ailleurs principalement disponibles chez la souris, avec un contrôle précis de leur fond génétique. De plus, la physiologie de la souris, en particulier dans les modèles « humanisés » que nous utiliserons, présente de fortes similarités avec celle de l’être humain. Cela permet de reproduire de manière fiable des maladies proches de celles observées chez les patients. Les animaux seront utilisés entre 0 (injection des cellules souches hématopoïétiques dérivés de patients mastocytose) et 20 semaines (immunisation vaccin à ARNm, regreffe de lignées de cellules tumorale, traitement avec des anticorps déplétant) après la naissance. Pour maximiser le succès de la regreffe des souris avec des cellules souches humaines, des souris nouveaux-nés (jour 3 après la naissance) seront regreffées, avant que le système immunitaire murin ne soit trop développé. Les souris sont dites « humanisées » lorsque leur système immunitaire humain est composé de plus de 25% de cellules immunitaires humaines (dans la circulation) entre 12 et 16 semaines après l’injection des cellules souches hématopoïétiques ; c’est pourquoi, les animaux seront utilisés entre 0 et 20 semaines.

Flanc rasé sous anesthésie, injection de cellules de mélanome sous la peau, puis deux à trois injections de traitement dans l'abdomen et des mesures de la tumeur trois fois par semaine: 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la croissance de la tumeur sur le flanc peut provoquer une douleur modérée et que les tumeurs peuvent, rarement, nécroser. Le projet cible deux protéines soupçonnées de soutenir la progression du mélanome et la résistance aux immunothérapies, près de la moitié des patients développant de telles résistances. Toutes les souris sont tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques.

Objectifs

Le mélanome, cancer de la peau le plus agressif, a causé la mort de plus de 60.000 patients dans le monde en 2022. Malgré les progrès récents dans le domaine des immunothérapies du cancer, près de la moitié des patients développent des résistances, dont les mécanismes sont encore mal compris. Nous avons identifié deux protéines susceptibles de soutenir la progression du mélanome et de la résistance aux immunothérapies. Les objectifs de ce projet sont de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires médiés par ces deux protéines, d’évaluer l’impact de leur inhibition sur la pousse tumorale, et de valider nos observations dans un second modèle de mélanome cutané.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouveaux mécanismes permettant la progression du mélanome, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Injections intrapéritonéales de médicaments (2 ou 3x 5 secondes/souris) – Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)

Impact sur les animaux

L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle des deux protéines d’intérêt dans la croissance tumorale et l’échappement immunitaire, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées seront faites sous anesthésie gazeuse. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide, de l’eau gélifiée et une solution de réhydratation, pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, sauf dans une procédure où seules des femelles seront utilisées.

Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.