Système immunitaire

1 415 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une injection de virus, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique cancérogène, puis passer en moyenne huit échographies hépatiques sous anesthésie avant une chirurgie abdominale terminale. Certaines reçoivent en plus une injection d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois, ce qui peut provoquer des péritonites, ou une toxine déclenchant une hépatite. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la nuisance principale déclarée étant le développement de tumeurs du foie pouvant conduire à une encéphalopathie mortelle. Le porteur annonce des pistes thérapeutiques pour un cancer au pronostic "sombre" et des cultures cellulaires qui réduiraient à terme le nombre de souris, alors que 1 415 animaux sont demandés maintenant.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. MODIFICATION : L’ajout d’un geste technique sur certains animaux pour étudier l'activité traductionnelle implique une modification du projet initial sans ajout d’animaux.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection unique de virus sous anesthésie générale en 30 secondes b) une injection unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes c) une injection unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30 secondes (pendant 2 mois maximum) d) une injection unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes MODIFICATION 3) certains animaux pourront recevoir une injection d'antibiotique modifié permettant de mesurer l'activité de traduction, 4) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections d'anti-oestrogènes, d'anticorps, d'antibiotique ou de toxine peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille. L'injection répétée d'anticorps peut conduire à des péritonites ou infections.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.

Des chocs électriques répétés dans un test de peur contextuelle, six injections sous la peau du crâne en deux semaines, ou huit jours d'injections d'interféron provoquant une sensation de maladie : 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si les macrophages des méninges influencent la mémoire et le comportement, en les éliminant ou en les empêchant de produire une molécule. Le porteur écrit qu'aucune des procédures ne sera "particulièrement douloureuse", après avoir décrit ces chocs électriques et l'inconfort provoqué par l'interféron. Les souris sont tuées dans les heures qui suivent les tests comportementaux, pour prélever leurs méninges et leur cerveau.

Objectifs

Ces dernières années, la recherche a commencé à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans les membranes qui entourent le cerveau, appelées les méninges. On sait maintenant que certaines cellules immunitaires présentes à cet endroit ne servent pas seulement à nous protéger contre les infections, mais peuvent aussi influencer le fonctionnement du cerveau et le comportement. Parmi ces cellules, ce sont surtout les cellules dites « lymphoïdes » qui ont été étudiées jusqu'à présent. Elles produisent des molécules (les cytokines) capables d'agir sur le cerveau, en influençant par exemple la naissance de nouveaux neurones ou l’activité des circuits neuronaux. Cependant, le rôle d’un autre type de cellule immunitaire, les macrophages méningés, reste encore mal compris. Ces macrophages sont pourtant très nombreux aux frontières du cerveau et produisent aussi de nombreuses molécules qui pourraient avoir un impact sur son fonctionnement. Des recherches préliminaires menées dans notre laboratoire suggèrent qu’une molécule appelée Pf4, produite par ces macrophages, pourrait favoriser la formation de nouveaux neurones et stimuler l’activité neuronale dans une région du cerveau appelée l’hippocampe. Cela pourrait indiquer un lien direct entre ces cellules immunitaires et certaines fonctions du cerveau. Par ailleurs, on sait que lors d’une infection, notre comportement change souvent (fatigue, baisse de motivation, repli sur soi, etc.). Ces réactions, appelées « comportement de maladie », pourraient aussi être liées à l’activation des macrophages méningés, qui sont parmi les premières cellules à détecter l’inflammation venant du reste du corps. Le but de ce projet est donc de mieux comprendre comment les macrophages méningés influencent le comportement et les capacités mentales, à la fois dans des situations normales et en cas d’inflammation. En identifiant les mécanismes impliqués, ce travail pourrait aider à mieux lutter contre les problèmes cognitifs causés par l’inflammation, comme ceux observés dans certaines maladies chroniques ou avec le vieillissement.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les macrophages méningés communiquent avec le cerveau et contribuent à réguler l'activité neuronale dans des conditions homéostatiques et inflammatoires. Compte tenu de la complexité de ces processus biologiques, qui sont encore loin d'être modélisés par des systèmes in silico ou in vitro, ce projet s'appuiera principalement sur l'utilisation de modèles in vivo. La caractérisation de cet axe neuro-immunitaire ouvrira potentiellement de nouvelles voies dans notre capacité à sauvegarder l'intégrité fonctionnelle du cerveau pendant les conditions inflammatoires ou à stimuler les performances cognitives dans le cas de conditions progressives telles que les maladies neurodégénératives et le vieillissement . En effet, ce projet vise à obtenir deux avantages principaux : 1) le bénéfice à moyen terme d'une meilleure caractérisation de la fonction des macrophages dans la neurogenèse et dans autres activités neuronales avec des implications dans la mémoire et le comportement et 2) le bénéfice à long terme de l'identification de médiateurs candidats qui favorisent les fonctions cérébrales, conduisant à des approches pharmaceutiques innovantes qui tirent parti des macrophages pour agir sue les maladies neurologiques.

Procédures

Les souris utilisées dans cette étude recevront différents traitements selon leur groupe. Chez les souris de type sauvage, une injection sera faite sous la peau au niveau du crâne, tous les deux jours pendant deux semaines (soit six fois au total). Ce traitement vise à éliminer spécifiquement les macrophages présents dans les méninges. Les souris génétiquement modifiées recevront un autre type de traitement : • Pour la première lignée, les injections (également tous les deux jours pendant deux semaines) contiendront une substance appelée tamoxifène, qui empêchera les macrophages méningés de produire la molécule Pf4 • Pour la seconde lignée, les souris recevront pendant huit jours consécutifs une injection d’interféron alpha (IFN-α), une molécule qui induira une inflammation généralisée mais pas aigue. Une fois les traitements terminés, toutes les souris passeront une série de tests pour évaluer leurs capacités de mémoire et de comportement.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à anesthésie gazeuse, de sorte qu'elles ne ressentiront pas de douleur pendant la procédure, alors qu'elles pourraient en ressentir au niveau du site d'injection à leur réveil. Même si les souris se familiarisent avec l'opérateur et s'habituent aux paramètres expérimentaux, elles peuvent encore ressentir un stress modéré lors de certains tests comportementaux. En particulier le test de la peur contextuelle va engendrer de la légère douleur à travers des chocs électriques rapides mais répétés. Quant aux souris transgéniques, l'injection intrapéritonéale de IFN peut provoquer une légère sensation de douleur au point d'injection, tandis que l'effet systémique d'une faible dose de IFN provoque une sensation de maladie et d'inconfort chez les souris. Aucune des procédures effectuées dans le cadre de ce projet ne sera particulièrement douloureuse. Néanmoins, nous surveillerons quotidiennement l'état de santé des souris, afin d'évaluer en particulier leur réaction aux traitements. Concernant les deux modèles transgéniques, l’identification (tatouage) et le génotypage (prélèvement de poils) seront réalisé grâce à procédures non-invasives.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans les premières heures suivant les tests comportementaux afin de pouvoir prélever des échantillons biologiques qui nous permettront d’étudier des processus qui se déroulent dans les méninges et le cerveau.

Remplacement

L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les macrophages méningés peuvent moduler les activités neuronales et finalement contribuer à la modulation du comportement et de la cognition. Cependant, l'interaction entre les systèmes immunitaire et nerveux que nous voulons étudier ne peut pas être isolée de l'environnement tissulaire complexe où elle a lieu, qui représente une partie essentielle du système. Ce niveau de complexité n'a été atteint par aucune plateforme technologique disponible à ce jour, c'est pourquoi les modèles in vivo restent essentiels pour étudier de manière fiable l'interaction entre les systèmes immunitaire et nerveux et absolument irremplaçables pour évaluer les caractéristiques comportementales. Une fois que le lien fonctionnel entre les macrophages méningés et l'activité neuronale aura été établi et que des mécanismes moléculaires candidats auront été mis en avant, des expériences complémentaires seront menées à l'aide de systèmes in vitro, tels que des essais de neurogenèse sur des cellules souches.

Réduction

Toutes les expériences seront effectuées de manière pertinente et complète afin de limiter au minimum le nombre d’animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, nous allons utiliser les mêmes souris pour plusieurs tests (deux groupes de tests comportementaux). Cette réutilisation pourrait contribuer à augmenter le niveau de stress de l'animal mais devrait nous permettre de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires. 25 animaux seront utilisés pour chaque condition expérimentale pour chaque groupe de tests comportementaux, soit un total de 700 animaux en 5 années de projet. Les résultats seront analysés à l'aide du test statistique le plus adapté. Nous essaierons de réduire encore le nombre d'animaux nécessaires si les données collectées, les analyses statistiques et les données de la littérature nous permettent d'adapter nos estimations au cours du projet. Après les tests comportementaux, le cerveau et les méninges seront prélevés sur chaque souris afin de réaliser plusieurs études à plusieurs niveaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Les souris seront suivies régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance de prendre les mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure chargé du bien-être animal.

Choix des espèces

Comme de nombreux mécanismes biologiques sont similaires chez la souris et chez l’être humain, nous utiliserons différentes souches de souris, dont certaines ont été modifiées génétiquement. Ces lignées transgéniques ont été conçues pour permettre d’observer et de manipuler plus précisément le rôle des macrophages méningés, nôtres cellules immunitaires d’intérêt. Grace à ces modèles, on pourra tester plus rapidement et de manière plus ciblée nôtres hypothèses. L’utilisation de ces souris transgéniques est donc essentielle pour comprendre comment les macrophages méningés participent à la régulation de processus cérébraux complexes. Pour toutes ces raisons, la souris représente le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les tests comportementaux seront réalisés sur des souris âgées d’environ 60 jours, c’est-à-dire à l’âge adulte, lorsque leurs capacités cognitives (mémoire, apprentissage, etc.) sont complètement développées.

Immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines tumorales et immunitaires, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent d'abord une chirurgie sous anesthésie, puis une semaine plus tard l'injection des cellules humaines, puis une injection de Rose Bengale dans la tumeur suivie d'une illumination de dix minutes, une immunothérapie hebdomadaire et un prélèvement sanguin par semaine. La croissance des tumeurs est suivie au pied à coulisse sur animal vigile ou par imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que la maîtrise de la douleur implique pour les animaux de ne pas en subir, et annonce par ailleurs que chez les groupes témoins la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite critique.

Objectifs

Le mélanome est un cancer agressif fortement immunogène dont l’incidence et la mortalité demeurent inquiétantes. Le traitement de 1ère intention repose sur des immunothérapies et des thérapies ciblées. Cependant certains patients échappent au traitement. La thérapie photodynamique (PDT), utilisée de manière courante en dermatologie, consiste en l’illumination de cellules tumorales préalablement photosensibilisées par un agent pharmacologique. En présence d’oxygène, et suite à une exposition à une lumière appropriée, l’agent photosensibilisateur (PS) génère des espèces réactives de l’oxygène responsables de la mort tumorale associée à une réponse immunologique permettant d’accentuer l’effet antitumoral de la PDT. La PDT antitumorale émerge comme une nouvelle modalité de traitement efficace avec un nombre croissant d’essais cliniques de faisabilité sur divers modèles d’études dont le mélanome. Le Rose Bengale (RB) est un PS déjà employé en clinique, mais pour de la PDT, or il est un bon candidat pour des lésions cutanées comme le mélanome. Notre projet vise donc à tester l’efficacité in-vivo de la PDT au Rose Bengale dans le mélanome ; à vérifier l’effet immunogène de ce traitement dans un modèle simple et grâce à un modèle à deux tumeurs pour estimer le potentiel abscopal (à distance de la lésion traitée) du traitement. Le positionnement de la PDT dans la stratégie de traitement sera également estimé en associant la PDT-RB à une immunothérapie spécifique ou sur un modèle de cellules résistantes aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le mélanome humain. Les paramètres de PDT-RB testés auront préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-RB dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Le bénéfice à long terme sera de pouvoir mettre sur le marché de un nouveau traitement, de le positionner dans la stratégie thérapeutique et ainsi d'aider dans la lutte contre le mélanome. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourraient s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). La cicatrice pourrait également être l'objet de démangeaison légère sur les 5 premiers jours. Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines à la fois immunitaires et tumorales, ce qui pourrait engendrer un léger stress de courte durée. Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intratumorale du Rose Bengale (RB) et seront illuminées (extracorporel) 2h après l'injection pendant 10 min. L'injection pourra être la source d'un stress léger de courte durée. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine); là encore un stress legéer de courte durée pourrait etre generé à chaque injection. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Chaque prélèvement pourra être source d'un stress léger de courte durée. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Il s'agira, soit d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire qui exprime une enzyme responsable de la création de lumière et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection du substrat lumineux. Soit, d'utiliser un modèle n’exprimant pas l’enzyme responsable de la création de lumière et la mesure de la croissance tumorale se fera au moyen d’un pied à coulisse sur animal vigile (contention et mesures) ; toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse.La contention et l'injection du produit d'illumination, de même qu eles anesthésie pourraient être la source d'un stress léger de courte durée mais répété. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera mis à mort, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

La maîtrise de la douleur et le respect des règles éthiques implique pour les animaux de ne pas subir de douleur. Néanmoins, la procédure expérimentale engendrera inévitablement un stress , là encore, il sera réduit au strict minimum par divers leviers (visite et manipulations régulières, anesthésies gazeuses préalables). L'emplacement des tumeurs est étudié pour ne gêner en rien la locomotion ou l'alimentation des animaux.

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d'une masse tumorale suivie ou non d'un traitement expérimental. Selon l'efficacité des traitements, la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester de l’efficacité anti tumorale de notre thérapie (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de notre thérapie et/ou des immunothérapies in-vitro; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in-vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles, non traités, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre experience nous bénéficions de protocoles déjà approuvés ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à un outil d'évaluation en ligne). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans mise à mort. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnées pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro.

Raffinement

Nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi habitués en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutané (au flanc arrière) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaires, nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faible quantité. Nous utilisons des souris immunodéficientes pour permettre la xenogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires).

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à faire exprimer un auto-antigène dans le foie, une vaccination dans les deux pattes arrière qui gonfle le muscle pendant douze à vingt-quatre heures, cinq injections en deux semaines sur animal éveillé et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle actuel ne produit qu'une hépatite minime qui se résorbe vite, loin de la maladie humaine, et l'équipe veut donc invalider dans les cellules du foie les gènes de molécules immunitaires inhibitrices pour obtenir une auto-immunité qui dure. Foie, rate et sang sont prélevés après la mise à mort, le porteur affirmant qu'aucun système de remplacement pertinent n'existe et que les biopsies humaines sont rares et de petite taille.

Objectifs

L’hépatite auto-immune est une pathologie dont les causes restent méconnues. L’ L’hépatite auto-immune est caractérisée par une attaque immunitaire du foie conduisant à des niveaux élevés des enzymes hépatiques et des anticorps notamment des auto-antigènes. Les patients répondent pour la plupart bien aux traitements immunosuppresseurs non spécifiques; Toutefois, ces traitements à long terme ne sont pas sans effets délétères. Les cellules immunitaires sont classiquement considérées comme responsables des lésions hépatiques, mais les mécanismes cellulaires, notamment les antigène-spécifiques impliqués restent largement incompris. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’hépatite auto-immune qui permettent d’étudier le rôle des cellules immunitaires spécifiques d’un antigène exprimé dans le foie. De nombreux outils sont disponibles pour l’expression et l’étude de cet antigène, permettant ainsi de suivre les réponses immunitaires spécifiques associée à l’antigène après expression de celui-ci dans le foie. Avec ce système, notre équipe a pu montrer que l’expression de l’antigène dans le foie des souris est tolérée et n’induit pas de réponse spécifique contre celui-ci, de plus que l’accumulation de cellules immunitaires dans le foie des souris dépend d’une immunisation préalable contre l’antigène et l’expression de celui-ci au niveau du foie. Nous avons également montré que les cellules immunitaires spécifiques de l’antigène ressemblaient aux cellules immunitaires auto-réactives chez les patients et que le blocage transitoire des molécules immunitaires inhibitrices perturbe le contrôle de cette réponse . Cependant, l’hépatite induite est peu détectable/minime et se résorbe rapidement ce qui diffère de la maladie chez l’homme. Notre hypothèse est que l’évolution chronique d’une auto-immunité dans le foie dépend d’une dérégulation de ces voies immunitaires inhibitrices sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons invalider, spécifiquement dans les hépatocytes, les gènes codant pour ces molécules inhibitrices et évaluer leur impact à court et long terme, ce qui permettrait une compréhension des mécanismes impliquées dans la maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un auto-antigène hépatique, en identifiant des voies de signalisations essentielles au contrôle de ces réponses sur le long terme. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs actes en fonction du protocole appliqué. Acte 1 : Les animaux recevront, des injections (durée de l’acte : 1 minute, animal anesthésié et analgésié localement). Cette injection sera réalisée dans tous les groupes une fois et un seul groupe recevra 3 injections supplémentaires une semaine après (1 jour d’intervalle/injection). Acte 2 : Les animaux recevront 5 injections (durée : 30 secondes, animal vigile), à 2 ou 3 jours d’intervalle. Acte 3 : Prélèvement sanguin (durée : 2 minutes, animal anesthésié et analgésié localement) une première fois durant le protocole et une dernière fois en fin de protocole.Acte 4 : Les animaux recevront, 1 injection / patte soit deux injections par souris (1 minute, animal anesthésié).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Une procédure d’injection répétée cinq fois en deux semaines pourra entrainer un inconfort local et transitoire au moment de l’injection dû au passage de l’aiguille dans la peau qui s’estompera 5 min après la procédure. . La vaccination des souris sera réalisée au niveau des deux pattes arrière qui entrainera un étirement local du muscle. Cette gêne temporaire associée à un gonflement du muscle durera entre 12h et 24h. La gêne disparait généralement 24h post injection. Lors des prélèvements sanguins un inconfort durant ces gestes est estimé à 1min correspondant au temps nécessaire à la réalisation du prélèvement. L’animal pourra également ressentir pendant 30 secondes une gêne lors de la réalisation du geste de compression pour arrêter le saignement éventuel post prélèvement. Les prélèvements et injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse pouvant entrainer une phase de stress pour l’animal pendant environ 30 secondes avant la phase d’endormissement . De plus la phase de réveil avec le reprise de conscience sera également un facteur de stress qui durera environ 1min pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.

Remplacement

Dans ce projet, nous interrogeons les voies de régulations de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares et de petites tailles. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1536 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisée par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet, une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. A l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissues seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toute manipulation, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris (Mus musculus) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. A nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, le modèle murin utilisé au cours de ce projet, et développé au sein du laboratoire, a déjà démontré sa pertinence pour étudier une réponse spécifique d’un antigène hépatique. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.

Jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale, chacune précédée d'une injection sur animal vigile, et six à sept prélèvements de sang sans anesthésie : 101 souris femelles dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques humaines leur sont injectées, puis des cellules CAR-T dites universelles, cette version modifiée du projet doublant les injections du médicament qui facilite la prise de greffe. Le porteur annonce de probables maux de tête et nausées, et un déficit moteur des membres inférieurs si la tumeur atteint la moelle osseuse. Toutes sont mises à mort pour prélèvement de tissus, ou plus tôt si un point limite est atteint.

Objectifs

Notre corps possède des défenses naturelles contre les maladies : le système immunitaire. Celui-ci est constitué notamment de cellules tueuses, qui peuvent éliminer des cellules infectées ou anormales. Cependant lors d’un cancer, ces cellules n’ont pas forcément la capacité de reconnaître les cellules cancéreuses. Ainsi le cancer se propage. Une nouvelle approche de thérapie cellulaire, appelée CAR-T, améliore cette capacité à cibler les cellules cancéreuses. Les cellules tueuses issues d’un patient atteint d’un cancer sont modifiées génétiquement pour que celles-ci ciblent au mieux les cellules cancéreuses. Cependant, cette approche est 100% personnalisée : longue, coûteuse et incertaine. Pour contourner ces limites, nous développons une alternative : des cellules tueuses reprogrammées « universelles » issues d’un donneur sain et non pas d’un patient. Ces cellules universelles peuvent s’adapter au système immunitaire de chaque patient sans risque de rejet, rendant le traitement plus rapide et accessible. L’objectif de cette étude est de tester ces cellules universelles dans un modèle de souris afin d’observer leur comportement et leur efficacité contre le cancer. Nous voulons notamment vérifier si une modification spécifique améliore leur action anticancéreuse en bloquant un certain mécanisme biologique. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et accessibles contre le cancer, en simplifiant la production des cellules CAR-T pour une utilisation en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats positifs de ce projet pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un nouveau médicament de thérapie cellulaire pour les patients en impasse thérapeutique. Ce médicament sera à la fois plus puissant et plus sûr que les traitements actuels, produit à des coûts drastiquement diminués (puisqu'il s'agit d'une thérapie cellulaire universelle) et donc disponibles à l'ensemble des patients qui en ont besoin. De plus, cela permettra d’avoir un modèle de souris pertinent pour les études des cellules tueuses reprogrammées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection de cellules tumorales par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection de cellules thérapeutiques matures ou immatures par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection d’un médicament afin de permettre la prise de greffe des cellules thérapeutiques immatures (1x/souris MODIFICATION : 2X/SOURIS, durée ~1 minutes). Imagerie sous anesthésie générale, jusqu’à 12 fois par souris (durée ~10 minutes par session, 1x/semaine), précédée de l’injection d’un agent de détection de la tumeur sur souris vigile (jusqu’à 12x/souris, durée ~1 minute). Prélèvements sanguins, réalisés sans anesthésie (6-7x/souris, ~1 minute, 1x/2semaines) soit sous anesthésie générale (1x/souris, ~5 minutes, pour le dernier prélèvement).

Impact sur les animaux

Stress : l’ensemble des manipulations, contentions et transports peut engendrer un stress chez les souris. Douleurs légères : potentiellement présentes après injection intraveineuse (de cellules CAR-T matures, non matures) ou abdominale et prélèvements sanguins sous antidouleur. Probables maux de tête et nausée par suite du traitement avec un médicament. Altération de l’état général : possible en lien avec le développement tumoral exemple : perte de poids. Déficit moteur des membres inférieurs : possible si la tumeur atteint la moelle osseuse des membres.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous prélèverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint en cours de procédure.

Remplacement

Les cellules tueuses du cancer ont été étudiées en laboratoire. Cependant, la réponse du système immunitaire est très complexe, car elle implique différents types de cellules et des interactions spécifiques. Cela rend difficile d’étudier la réponse complète seulement en laboratoire. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris pour ces recherches thérapeutiques, car on ne peut pas encore se passer d'un modèle préclinique avant les essais clinique chez l'Homme. De plus, on utilise des souris modifiées et disponibles à l'achat pour avoir un système immunitaire humain, ce qui permet de tester des cellules humaines directement applicables ensuite en essai clinique. Avant d'être testées chez la souris, les cellules ont été validées dans notre laboratoire selon nos meilleures connaissances. Nous obtenons ainsi des informations qui ne peuvent être obtenues que chez la souris et nous les utiliserons pour réduire encore davantage le recours aux expérimentations animales à l'avenir.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. En effet, un outil statistique a été utilisé pour calculer le bon nombre d’animaux à utiliser. Suivre les animaux au fils du temps par des analyses répétées comme l’imagerie (grossissement de la tumeur) et le contrôle du sang entraîne une meilleure analyse de l’effet biologique, ce qui permet des expériences à haute puissance avec un faible nombre de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi quotidien des animaux afin de d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Des points limites clairs sont définis pour arrêter le projet afin de limiter la souffrance des animaux. Un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie de l’animal sera mis en place et du gel hydratant oculaire sera appliqué afin d’éviter un dessèchement lors des séances d’imagerie. Les animaux seront placés sous anesthésie générale et auront des antidouleurs adaptés. De plus, ce projet fait suite à une étude bibliographique afin de raffiner au maximum les expériences, les injections et les prélèvements. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Nous utiliserons exclusivement des souris femelles génétiquement modifiées dépourvues de système immunitaire. Ces modèles permettent la greffe de cellules humaines, le développement d’un système immunitaire humanisé, ainsi que la croissance de tumeurs humaines. En plus de leur grande sensibilité aux agents pathogènes, nécessitant des conditions d’élevage en milieu stérile, ces souris présentent une apparence et un comportement comparables à ceux de leurs congénères non modifiées. Le choix d’utiliser uniquement des femelles est motivé par nos observations expérimentales précédentes: chez les femelles, les tumeurs se développent de manière plus régulière, homogène et prévisible, ce qui améliore la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Des souris âgées de 4-8 semaines sont utilisées, afin d’observer si le développement des cellules humaines s’effectue de manière plus optimale en l’absence d’interaction avec les cellules immunitaires de souris.