Système immunitaire

Jusqu'à vingt-sept injections dans le ventre et neuf prélèvements de sang par animal après une greffe de cœur cousue au niveau du cou: 1 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Près de la moitié sont utilisées comme donneuses, infectées par un cytomégalovirus, l'autre moitié recevant leur cœur sous traitement anti-rejet. Donneuses et receveuses sont génétiquement différentes pour reproduire l'incompatibilité entre un donneur d'organe et son receveur, et le porteur indique qu'amplifier le virus dans les glandes salivaires de souris vivantes reste "nécessaire", la culture cellulaire l'affaiblissant. Toutes sont tuées pour prélever poumons, foie, cœur, reins, rate et glandes salivaires.

Objectifs

Lorsqu’un patient subit une transplantation d’organe et qu’il reçoit un organe provenant d’un donneur, son système immunitaire peut alors reconnaître cet organe comme étranger et provoque son rejet. Pour l’éviter, les patients doivent prendre des traitements immnosuppresseurs (anti-rejet). Ces médicaments visent à réduire l’activité de l’ensemble du système immunitaire et protègent l’organe transplanté mais ils rendent aussi les patients plus vulnérables aux infections. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est celle causée par le cytomégalovirus. Ce virus est très répandu dans la population générale. Chez une personne en bonne santé qui s’infecte pour la première fois, les symptômes sont souvent légers voire absents, car le système immunitaire contrôle rapidement l’infection. Le virus reste ensuite dormant, en « latence », dans différents organes (les reins, le foie, le cœur, les poumons…). Le problème apparaît lorsqu’un patient receveur, n’ayant jamais été en contact avec ce virus, reçoit un organe provenant d’un donneur porteur du virus. Sous traitements anti-rejet, le receveur ne peut pas développer une réponse immunitaire efficace contre le virus. L’infection peut alors se réactiver et entraîner des complications graves, compromettant la santé du patient et la survie de l’organe transplanté. L’objectif de ce projet est d’étudier la manière dont le système immunitaire réagit contre le cytomégalovirus après transplantation, en particulier sous traitement anti-rejet. Nous analyserons aussi l’impact des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental de transplantation cardiaque chez la souris dans lequel le cœur de souris donneuses infectées de manière latente au cytomégalovirus sera transplanté à des souris receveuses n’ayant jamais été en contact avec le virus et traitées avec différents médicaments anti-rejet. Le choix du modèle de transplantation cardiaque se justifie par la taille plus importante des vaisseaux, rendant la procédure chirurgicale plus simple que pour d’autres organes. Les souris donneuses et receveuses seront génétiquement différentes afin de reproduire ce qui se passe lorsqu’un patient reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la propagation du virus seront analysés dans les différents organes des souris receveuses, ainsi que la réponse immunitaire développée par ces souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organe, ainsi que le rôle des principales cellules immunitaires impliquées dans le contrôle et la résolution de cette infection chez les patients transplantés. Les résultats obtenus permettront de également de préciser l’impact des traitements anti-rejet sur la réactivation et la dissémination du cytomégalovirus et de savoir comment moduler la réponse immunitaire du receveur afin de la rendre efficace contre le cytomégalovirus tout en limitant le risque de rejet, avec pour objectif de réduire la morbi-mortalité liée à ce virus et de prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Toutes les souris donneuses de greffon cardiaque (soit près de la moitié du nombre total des animaux prévue pour ce projet) recevront une injection (du virus) dans le ventre sur animal vigile en début de procédure. 3 prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés sur les souris donneuses (avant infection, une semaine après infection et quelques jours avant la chirurgie pour confirmer l’état de latence du virus). En fin de procédure, les souris donneuses recevront une injection d’anesthésiques (anesthésie générale profonde) dans le ventre et une injection d’analgésique morphinique dans le ventre avant la chirurgie. La peau sera désinfectée et incisée afin de prélever le cœur des souris donneuses. Durée de l’opération chirurgicale : 1h. Toutes les souris receveuses de greffon cardiaque (l’autre moitié des animaux de ce projet) seront anesthésiées profondément via une injection d’anesthésiques dans le ventre et recevront au total 4 injections sous la peau d’analgésique morphinique sur une période de 2 jours. Ainsi, sous anesthésie profonde générale et analgésie, la peau sera désinfectée et incisée afin de greffer le cœur de la souris donneuse au niveau du cou, puis suturée. L’opération chirurgicale durera 2h maximum. De plus, elles seront également soumises à des injections dans le ventre répétées 3 fois par semaine sur animal vigile (soit au maximum 27 injections sur 63 jours maximum), et à des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit jusqu’à 9 prélèvements maximum). Les injections dans le ventre et les prélèvements sanguins dureront 30 secondes (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang répétés sont susceptibles d’entrainer un stress (lors de la contention) et une légère douleur lors de l’acte. La greffe de cœur correspond à une procédure bien documentée, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. L’intervention chirurgicale entrainera une gêne lors du réveil et une douleur malgré les analgésiques et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. L'infection à cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c’est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Pour les souris traitées avec le traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation hépatique non douloureuse), ou une colite (associée à des diarrhées). L’infection durera 4 mois (pour les souris donneuses immunocompétentes) ou 2 mois (pour les souris receveuses sous traitement anti-rejet) au maximum. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux. Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Les points limites propres à chaque procédure ont été décrits pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, rate et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe et les interactions cellulaires aboutissant à la réponse dirigée contre le cytomégalovirus font intervenir de multiples acteurs immunitaires présents dans différents tissus ou organes lymphoïdes, ce qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, le phénomène d’ischémie-reperfusion (lésions dues à l’arrêt puis retour du flux sanguin) est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés, nous avons donc besoin de toute la complexité vasculaire et inflammatoire de l’organisme vivant pour reproduire ce phénomène observé en transplantation d’organe. Dans certains cas, la génération du stock de virus peut être réalisée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de dimiuner la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir de glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous devons utiliser la souche non modifiée et peu virulente afin d’étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n’est pas possible avec les autres souches de virus modifiées plus virulentes), et que le virus doit être suffisamment virulent afin d’infecter des hôtes immunocompétents et d’obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe afin d’assurer la robustesse des analyses. Afin d’atteindre un effectif de 5-6 animaux par expérience, sachant que 2 types de protocoles expérimentaux incompatibles seront réalisés (soit 10-12 animaux par groupe), en prenant en compte le taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques, nous prévoyons 14 animaux par groupe. Au total, le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 1226 souris (mus musculus). Néanmoins, ce nombre est suceptible d’être revu à la baisse au cours du projet. L’étape de génération du stock de virus in vivo étant redondante avec un autre projet (déjà validé par le ministère), si la quantité de virus générée dans ce premier projet est également suffisante pour ce nouveau projet, nous ne réaliserons pas cette procédure. De même, le nombre d’animaux prévus pour l’entrainement technique à la greffe cardique correspond à un nombre maximal : ainsi, dès validation de la technique, nous passerons à l’étape suivante. Les différentes étapes de ce projet se feront séquentiellement afin de sélectionner au mieux les groupes les plus pertinents au fur et à mesure de l’avancée du projet, et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le maximum d’échantillons biologiques sera extrait de chaque animal, et plusieurs expériences seront réalisées sur les mêmes échantillons, afin d’éviter d’avoir à reproduire ultérieurement l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque acte ont été définis afin d’assurer une prise en charge adaptée. Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection et les sites de prélèvement. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Bien que la douleur lors des injections ou des prélèvements dans ce protocole sera réduite grâce à l'administration d'analgésiques/anesthésiques, des points limites ont tout de même été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité et de limiter la souffrance de l'animal. Après chaque chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et un suivi rapproché sera effectué. Le protocole chirurgical a été établi de façon à ce que le cœur de la souris receveuse est conservé et fonctionnel, ainsi, la perte du greffon cardiaque (issu de la souris donneuse) ne peut entrainer la mort et la souffrance de l’animal en soi. L'infection au cytomégalovirus des animaux traités sous traitement anti-rejet est susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du côlon. Un suivi quotidien de leur état général sera effectué, et la survenue de diarrhées sera contrôlée. À cela s'ajoute un monitoring spécifique permettant de doser les enzymes du foie grâce aux prélèvement sanguins réalisés de façon hebdomadaire. Ces prélèvements sanguins réguliers sont donc nécessaires afin de suivre l’état de santé des animaux et de réagir plus précocément en cas de résultats insatisfaisants. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Pour les expériences de transplantation, des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin de garantir un système immunitaire pleinement mature capable de répondre à l’infection. Pour la production virale in vivo, des souris immunocompétentes agées de 6 semaines, déjà sevrées, seront utilisées afin d’optimiser le rendement, tout en préservant leur bien-être.

6 435 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie et les autres organes. Selon les lots, elles subissent une chirurgie hépatique, une injection de bactéries à doses croissantes, un régime gras de quatre à douze semaines, ou deux injections abdominales par semaine d'un agent qui provoque une fibrose du foie, presque toutes recevant en plus un prélèvement de 500 microlitres de sang sous anesthésie. Le porteur écrit que la fibrose et la cirrhose provoquées sont indolores et n'affectent pas l'état général, tout en admettant que les fortes doses de bactéries peuvent tuer une partie des souris. Il utilise des souris de 20 à 24 mois pour représenter des patients de plus de 75 ans, et des souris génétiquement modifiées dont le vieillissement est accéléré dès 6 mois.

Objectifs

Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.

Procédures

Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang) (MODIFICATION) - plusieurs lot de souris recevront des doses croissantes de bactéries afin de trouver la dose optimale pour induire une infection non léthal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : * (MODIFICATION) Pour les modèles d'infections bactériennes, les fortes doses peuvent entrainer une mortalité chez une partie des souris. Mais nous avons mis en place un suivi afin de veiller au bien-être animal. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.

Réduction

Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.

Une injection au niveau de l'œil sous anesthésie, une autre dans la veine de la queue sans anesthésie parce que la veine devient inaccessible une fois l'animal endormi, une troisième dans l'abdomen : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle de lymphome T diffus installe des tumeurs dans la rate, la moelle osseuse et le foie, ce qui peut provoquer douleur et inconfort. Toutes seront tuées pour prélever des organes et analyser les cellules immunitaires modifiées. Le porteur écrit que la croissance des tumeurs solides ne provoque aucune gêne locomotrice, en précisant dans la même phrase que les souris sont tuées avant l'apparition de ces gênes.

Objectifs

Les cellules du système immunitaire sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Elles ont besoin d’énergie pour remplir efficacement leur rôle, et plusieurs mécanismes à l’intérieur de la cellule régulent cette utilisation d’énergie. Ce projet cherche à comprendre comment ces mécanismes influencent l’activité de ces cellules, leur activation, leur déplacement et leur capacité à combattre les tumeurs, qu’elles soient localisées (dans la peau) ou diffuses dans l’organisme. Pour des raisons éthiques et de praticité, il est impossible de réaliser ce type d’expérimentation chez l’Homme. C’est pourquoi nous utilisons la souris comme modèle pour étudier le lymphome T, un cancer touchant le système immunitaire, ce qui permet de recréer un environnement biologique complet avec des organes et des interactions cellulaires similaires à celles d’un organisme vivant. Cela offre un cadre pertinent pour étudier l’activité des cellules immunitaires contre les tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’énergie disponible dans les cellules immunitaires influe sur leur capacité à agir contre les cellules cancéreuses. Le rôle des cellules immunitaires étant primordial, les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale.

Procédures

Chaque souris sera soumise à plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux. Chaque animal recevra : • Une injection sous la peau, effectuée sous anesthésie volatile, d’une durée d’environ une minute ou une injection dans la veine de la queue sans anesthésie (inaccessible avec anesthésie), d’une durée d’une minute. • Une injection au niveau de l’œil sous anesthésie volatile (durée : 1 minute) • Une injection dans l’abdomen ne nécessitant pas d’anesthésie et d’une durée d’environ cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les procédures peuvent provoquer une douleur légère et temporaire lors des injections. Le développement des tumeurs, notamment dans le modèle de tumeur diffuse, peut entraîner une douleur ou un inconfort modéré en raison de la présence des tumeurs dans différents organes (rate, moelle osseuse, foie). En revanche, la croissance des tumeurs solides n’affecte pas les mouvements ni ne provoque de gênes locomotrices, car les animaux seront euthanasiés avant l’apparition de ces gênes. Tout animal présentant une réaction anormale ou une souffrance non contrôlable sera immédiatement euthanasié conformément aux critères de fin d’expérience établis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes post mortem pour des analyses fonctionnelles et phénotypiques sur les cellules immunitaires modifiées.

Remplacement

Les cellules du système immunitaire modifiées ont été testées in vitro notamment face à des cellules tumorales. Cependant, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité de la réponse anti-tumorale. De ce fait, la mise en place d’expériences in vivo sur un modèle animal nous paraît pertinent. Pour des raisons éthiques et de praticité, les tests ne peuvent être effectués chez des patients concernés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été défini au strict minimum nécessaire pour permettre une analyse fiable des résultats. Des calculs statistiques simples montrent qu’il faut au moins cinq animaux par groupe pour pouvoir détecter des différences réelles et solides entre les conditions testées, sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. De plus, des expériences préliminaires déjà réalisées nous confortent dans ce choix et confirment que cet effectif est suffisant pour obtenir des données solides. La procédure a été conçue pour obtenir le plus de données possibles à partir d’un seul individu, en réalisant plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Enfin, la co-injection dans un même animal permet une comparaison directe et limite la variabilité inter-expérimentale, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. Cette organisation permet de réduire la répétition d’expériences indépendantes et donc de limiter l’utilisation d’animaux tout en garantissant la qualité scientifique du projet.

Raffinement

L’équipe possède une expertise solide se traduisant par la mise en place de plusieurs mesures visant à garantir au maximum le bien-être des animaux : • Réduire la douleur et le stress lors des manipulations, en utilisant des techniques d’injection parfaitement maîtrisées et en appliquant des anesthésiants locaux • Faciliter l’alimentation grâce à la mise à disposition de croquettes mouillées, réduisant les efforts des animaux • Contrôler précisément le nombre de cellules injectées, afin d’éviter une croissance tumorale trop rapide ou imprévisible • Assurer une surveillance régulière, tous les deux jours, en observant notamment la motricité, le comportement, la posture et la réponse aux stimulations • Définir des points limites stricts (perte de motricité, perte de réponse aux stimulations) et précoces : si l’un de ces seuils est approché, la fréquence de surveillance est immédiatement augmentée pour intervenir au bon moment et éviter toute souffrance inutile. • En cas d’apparition de signes d’irritation ou d’inflammation une pommade vétérinaire anti-inflammatoire sera appliquée afin de prévenir toute complication locale. Les conditions d’hébergement respectent les normes de bien-être animal avec un environnement adapté pour réduire le stress (température, hygrométrie, enrichissement du milieu).

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 7-28 semaines le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Le cœur prélevé chez les unes, greffé au niveau du cou chez les autres en une opération d'environ soixante minutes : 1 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une greffe d'îlots pancréatiques au niveau du rein, puis un contrôle de glycémie par prélèvement sanguin à la queue deux fois par semaine, l'expérience pouvant durer 56 jours. Le porteur écrit que ces procédures sont "bien tolérées" et n'affectent pas l'état général des animaux, après avoir listé la gêne au réveil, la douleur malgré le traitement, les difficultés de mouvement et les démangeaisons pendant la cicatrisation. Toutes sont tuées par dislocation cervicale, pour prélever le sang, les organes lymphoïdes et les greffons.

Objectifs

La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Elle permet de remplacer un organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent.Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. Le projet consiste à étudier l’implication des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe. Les ojectifs du projet sont : 1) tester une nouvelle approche thérapeutique visant à modifier le greffon pour limiter l’activation de cellules innée et donc le rejet de greffe ; 2) analyser les intéractions entres cellules de l’immunité adaptatives et les cellules innée impliquées dans le rejet de greffe. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Le projet est divisé en 2 procédures, une pour chaque objectif. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons donc diffèrents modèles de greffes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 1184 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires dans le rejet de greffes et de leurs échanges avec d’autres cellules du système immunitaire. Ces connaissances permettront d’identifier de nouvelles stratégies pour limiter les réponses immunitaires indésirables après transplantation. L’évaluation de différentes approches aidera à sélectionner les plus prometteuses pour réguler ces interactions. Les résultats obtenus serviront de base à des études mécanistiques complémentaires, ouvrant la voie au développement de stratégies innovantes pour améliorer la survie des greffons et la prise en charge des patients transplantés.

Procédures

Chez les souris donneuses, une anesthésie et une analgésie sont administrées par injection abdominale (5 secondes), puis le cœur est prélevé (durée : 15 minutes). Chez les souris receveuses de greffon cardiaque, une anesthésie et une analgésie sont réalisées par injection abdominale (5 secondes). La greffe est effectuée au niveau du cou et dure environ 60 minutes. La douleur est prise en charge par trois injections abdominales d’analgésique (15 secondes chacune), complétées par un traitement supplémentaire (injection derrière l’œil, 5 secondes). L’expérience peut durer jusqu’à 56 jours. Chez les souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques, un traitement préparatoire est administré par injection abdominale (5 secondes). Une anesthésie et une analgésie sont ensuite pratiquées par injection abdominale (5 secondes). La greffe est réalisée au niveau du rein, sous anesthésie, et dure une dizaine de minutes. Un traitement complémentaire est administré par injection abdominale (5 secondes). Une seconde intervention est réalisée au niveau de l’abdomen pour la greffe (15 minutes), avec un suivi de la douleur assuré par trois injections abdominales d’analgésique (15 secondes chacune). Le suivi de la glycémie est effectué deux fois par semaine à l’aide d’un glucomètre (prélèvement sanguin à la queue, durée maximale : 5 secondes par prélèvement). L’expérience peut durer jusqu’à 56 jours.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang peuvent provoquer du stress et une légère douleur. Les greffes de cœur et de cellules pancréatiques sont des interventions connues, et les problèmes éventuels sont surtout liés à l’anesthésie ou aux sutures pendant la chirurgie. Chaque opération peut causer une gêne au réveil, de la douleur malgré le traitement, ainsi que des difficultés de mouvement ou des démangeaisons pendant la cicatrisation. De manière générale, ces procédures sont bien tolérées et n’affectent pas l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure par dislocation cervicale, avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

Un nombre suffisant de souris sera utilisé par groupe (prévu initialement 12 animaux pour obtenir 8 souris analysables par groupe), afin de permettre une analyse statistique fiable des données. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1280 souris (mus musculus).

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement. Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général et points limites associés à chaque chirurgie). Différents traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés au cours de la chirurgie pour prévenir tout douleur. Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées dans un environnement stérile pour éviter toute infection. Les animaux sont placés en armoire chauffante durant la phase de réveil. Les animaux sont suivis dans les 4-6 h post chirrugie, le lendemain, puis 2 à 3 fois par semaine. La fréquence sera augmentée selon l’apparition des signes cliniques.

Choix des espèces

La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées, afin d’étudier le rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 6 mois en fin de procédure.

Toutes seront tuées à l'issue des projets dans lesquels elles seront versées, et aucune ne sera élevée en surnombre. 2 000 souris immunodéprimées vont être élevées et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun geste expérimental n'est décrit au-delà de l'hébergement en armoires ventilées et de la manipulation sous hottes filtrantes, la contrainte tenant au déficit immunitaire lui-même, qui expose ces souris à une infection mortelle en quelques jours si les barrières sanitaires cèdent. L'élevage interne est justifié par la disponibilité de souris hôtes d'âge et de sexe voulus, à synchroniser avec les cultures de cellules tumorales humaines à greffer, condition que le porteur qualifie d'"indispensable".

Objectifs

L’objectif est d’entretenir et de gérer des lignées de souris immunodéprimées utilisées pour les travaux sur un plateau technique dédié cancérologie. Ces souris, fragiles en raison de leur déficit immunitaire, servent surtout à greffer des cellules tumorales, ici des tumeurs solides. Leur élevage nécessite des soins particuliers et un hébergement adapté pour éviter que leur fragilité ne s’exprime. La mise en place d’un élevage interne est justifiée par des contraintes expérimentales. Elle permet d’assurer la disponibilité de souris hôtes en nombre, d’âge et de sexe précisément définis, condition indispensable à la synchronisation avec les manipulations cellulaires réalisées en amont et les analyses prévues en aval. Par ailleurs, l’élevage interne garantit la maîtrise des conditions d’élevage et d’hébergement et permet d’assurer une traçabilité individuelle complète des animaux utilisés, tant sur le plan sanitaire qu’expérimental.

Bénéfices attendus

L’utilisation de souris immunodéficientes en cancérologie permet le développement de modèles expérimentaux pertinents pour l’étude de la tumorigenèse humaine. L’absence ou l’altération de la réponse immunitaire chez ces animaux autorise l’implantation et la croissance de cellules tumorales humaines, permettant ainsi l’analyse des mécanismes biologiques impliqués dans l’initiation, la progression et la dissémination tumorales. Ces modèles constituent un outil essentiel pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment l’étude de l’efficacité et de la toxicité de traitements anticancéreux, dans un contexte in vivo contrôlé. Ils contribuent également à l’identification de biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de réponse aux traitements. Enfin, le recours à ces modèles permet de limiter le nombre d’animaux utilisés grâce à une meilleure reproductibilité des protocoles expérimentaux et à une réduction de la variabilité biologique.

Procédures

La manisfestation du phénotype dommageable d'immunodéficience soumet les souris à un risque d'infection par des agents pathogènes extérieurs. En conséquence, elles sont hébergées dans des cages ventilées et manipulées sous hottes filtrantes pour garantir les barrières sanitaires afin de les protéger de ce risque.

Impact sur les animaux

L’immunodéficience de ces souris les rend plus sensibles aux infections que les souris classique dites "immunocompétentes", c'est à dire capable de se défendre contre un agent pathogène par le biais du système immunitaire. Un risque rare, mais possible, de développer des infections peu apparaitre. Ce risque est présent en cas de mise en défaut des mesures barrières sanitaires lors de l’hébergement de ces lignées (Dysfonction du système de filtration des armoires ventilées, de la hotte de change, rupture de la stérilité de l'aliment ou de l'eau de boisson etc.). Dans ce cas, les animaux seraient exposés à des agents pathogènes et développeraient un syndrome infectieux qui conduiraient à leur mort en quelques jours.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort en fin de procédure dans les DAP dans lesquelles ils seront inclus. Tous les animaux générés seront utilisés.

Remplacement

Malgré le développement de technique in vitro sur cellules permettant de limiter l’utilisation des animaux, il est impossible à ce jour de remplacer totalement le modèle animal car celui-ci nous permet de comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement dans toute sa complexité.

Réduction

La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévu dans les projets autorisés. Cette production est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistiques pour chaque projet. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques, …) sont prises en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements dans le but de ne produire aucun animal superflu et se limiter au nombre d'animaux requis pour chaque étude.

Raffinement

Afin d’éviter toute contamination, les animaux sont hébergés en armoires ventilées dans un secteur spécifique pour les animaux à risque d'infection. Des contrôles sanitaires réguliers (tests bactériologiques sur gélose une fois par an) sont réalisés, l’eau est autoclavée, la nourriture est irradiée, l’air des enceintes d’hébergement est filtré, nous réalisons un change de tenue et protections individuelles réguliers concernant le personnel en contact avec les aniaux. Les animaux sont surveillés tous les jours pour vérifier l’absence d’atteintes des points limites. Les points observés sont les suivants : -Hyperactivité ou hypoactivité -Isolement et indifférence au milieu extérieur -Modifications des périodes de sommeil (Hyperactivité en période diurne) -Tout comportement inhabituel (activité stéréotypée, déplacement erratique, passivité à l'environnement, interaction sociale modifiée...). -Dos vouté, yeux enfoncés, poils hérissés -Perte de poids (supérieur à 10% pendant plus de 24h). Lors des reproductions, le nid est également enrichi par des frisottis et du coton pour accompagner les femelles durant leur gestation. Pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Dans le but de limiter le risque d’infection par des agents opportunistes, la fréquence des changes est augmentée et l’ensemble du matériel d’hébergement est autoclavés (cages, biberons, grilles, enrichissements...). Les animaux seront hébergés à raison de 2 à 5 par cages.

Choix des espèces

Les souches de souris élevées sont choisies en fonction des besoins des projets de recherche autorisés. Grâce à la bonne connaissance de ces souches d'un point de vue biologique, leur utilisation en cancérologie est très standardisée. Ce sont des modèles étudiés depuis longtemps, avec beaucoup de données scientifiques disponibles, ce qui permet de préparer les expériences avec précision et de prévoir leurs réactions grâce aux données accumulées dans la littérature. Les souris seront mises en accouplement entre 6 et 24 semaines (période de capacité de reproduction optimale) pour une durée correspondant aux recommandations spécifiques de chaque souche, en fonction des objectifs de production pour nos projets. Le phénotype dommeageable d'immunosensibilité n'a pas d'impact sur la reproduction puisque les animaux sont maintenus en condition stérile qui empêche sa manisfestation.

Modifiées génétiquement pour rendre leurs vaisseaux lymphatiques visibles et pour permettre d'éteindre certains gènes au moment voulu, 1 846 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent d'une à quinze injections en étant vigiles, des instillations dans le nez, et une à deux injections après incision de la peau sous anesthésie. Le projet vise à décrire comment se met en place, après la naissance, le réseau lymphatique qui draine le cerveau. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur précisant que l'irritation liée aux incisions dure les deux heures qui séparent le réveil de la mise à mort.

Objectifs

Les vaisseaux lymphatiques ont pour fonction le nettoyage des tissus en drainant les fluides et les déchets dans les différents organes. Ils participent aussi à la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons aux vaisseaux lymphatiques autour du système nerveux central. Ils sont capables de drainer les débris, les antigènes cérébraux et le liquide céphalorachidien. Leur implication a été démontrée dans de nombreux modèles de pathologies neurologiques. Ce réseau se développe après la naissance chez la souris et est à l’heure actuelle peu étudiée. Nos objectifs sont d'étudier le développement postnatal des vaisseaux lymphatiques drainant le cerveau et d'identifier les mécanismes qui contrôlent leur fonction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la mise en place des vaisseaux lymphatiques et leur fonction. Les mécanismes biologiques seront caractérisés dans le but développer des outils moléculaires capable de moduler les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques méningés et de la réponse immunitaire. À long terme, les informations recueillies grâce à ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies pour les troubles neurologiques.

Procédures

Injections de molécules sur souris vigiles : entre 1-15 injections, durée geste: entre 1 et 10 min. Incisions cutanées et injections sous anesthésie : 1-2 injections, durée geste: entre 10 et 15 min

Impact sur les animaux

L'anesthésie, les instillations intranasales et les injections de modulateurs et de traceurs peuvent provoquer une légère douleur et un certain stress au moment de leur administration. Les incisions cutanées peuvent entraîner une irritation modérée pendant les deux heures séparant le réveil de l'anesthésie de la mise à mort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études des vaisseaux lymphatiques méningés et du cerveau des animaux.

Remplacement

Les médiateurs de croissance des vaisseaux lymphatiques que nous caractériserons dans ce projet ont été sélectionnés parmi un ensemble de médiateurs candidats en fonction de leur capacité à moduler de manière reproductible la migration des cellules endothéliales lymphatiques in vitro. Afin d'étudier leur rôle spécifique dans le drainage lymphatique cérébral et leur potentiel thérapeutique, le recours à des modèles animaux est indispensable. Cependant, à chaque fois que ce sera possible, l’étude des mécanismes moléculaires identifiés in vivo sera approfondie sur des cellules lymphatiques in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichie. Ils sont anesthésiées pour toute intervention. Nous avons défini une grille de score avec des points limites adaptés. En cas d'une altération modérée ne répondant aux critères de mise-à-mort, les soins à apporter seront définis avec la personne responsable du bien-être animal. Pour les incisions cutanées, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant thermostatée. Du gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter l’assèchement. Les souriceaux seront placés dans une chambre de réveil chauffée et hydratée afin de faciliter leur rétablissement post-opératoire.

Choix des espèces

Notre objectif est d'identifier les mécanismes moléculaires du remodelage et de fonction lymphatiques. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. L’existence de modèles génétiques permettant de visualiser les vaisseaux lymphatiques et d’inactiver de manière temporelle et spatiale des gènes d'intérêt fait de la souris le modèle de choix pour décrypter les mécanismes contrôlant les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques. Les souris seront analysées à différents jours après la naissance et chez l’adulte pour étudier les effets de nos gènes d’intérêt et/ou des agents activant ou bloquant les voies de signalisation impliquées dans la mise en place et le maintien du réseau vaisseaux lymphatiques.