Système immunitaire
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Evaluation de la pharmacocinétique de composés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 500
Lapins : 125
500 souris, 500 rats et 125 lapins vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, tous tués pour récupérer organes et fluides et y doser un composé. Les prélèvements sanguins se font au sinus rétro-orbitaire chez la souris, à la veine caudale chez le rat, à la veine marginale de l'oreille chez le lapin, avec des isolements d'une heure par jour en cage individuelle pour récolter urines et fèces. Le projet suit le devenir de molécules dans le corps pour le compte de clients, l'espèce étant choisie selon la demande de ces derniers. Le porteur retient le lapin parce que sa taille permet des prélèvements de plus grand volume, argument de réduction qui repose sur la quantité de matière tirée de chaque individu.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la pharmacocinétique de composés (médicament ou ingrédient). Lors de l’élaboration d’un nouveau médicament, il est indispensable de s’assurer qu’il atteindra correctement sa cible (cellule, tissu), qu’il pourra être correctement utilisé puis éliminé. C’est précisément l’objectif des études de pharmacocinétique : suivre le devenir d’un composé dans l’organisme. Les résultats de ces études permettent d’identifier les éventuelles étapes au cours desquelles le composé rencontre un obstacle l’empêchant de remplir sa mission (absorption, distribution, métabolisme, élimination). C’est sur la base de ces résultats que la formulation, la dose ou le mode d’administration peuvent être ajustés pour optimiser l’efficacité d’un composé donné. En première intention, des évaluations in silico et/ou in vitro permettent de faire une première étape de caractérisation d’un composé (formulation, structure, concentration, etc.). En deuxième intention, l’évaluation chez l’animal vivant apporte des informations supplémentaires cruciales pour améliorer l’efficacité du composé : biodisponibilité sanguine et tissulaire, concentration des métabolites, clairance, demi-vie, etc. C’est l’objet du présent projet.
Bénéfices attendus
De nombreuses pathologies sont aujourd’hui incurables à cause d’un manque d’efficacité des traitements existants. Nos études de pharmacocinétique contribueront à rendre les traitements du futur plus ciblés et plus efficaces en ayant une meilleure connaissance de leur utilisation par l’organisme.
Procédures
1) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie ou non (selon l’espèce, et le site du prélèvement). Ces prélèvements seront très rapides (1 minute). Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude, mais respectera les limites décrites dans la procédure. 2) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements de fèces ou de mictions. Ces prélèvements s’effectueront sur une durée maximale d’une heure par 24h, en cage isolée. Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude. 3) Les animaux recevront une ou plusieurs injections de composés. Les administrations sont très rapides (2-3 minutes). Le nombre d’administrations sera dépendant de chaque étude mais respectera les limites décrites dans la procédure.
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées dans ce protocole proviennent : - De l’introduction d’une aiguille lors de l’injection d’un composé. - D’un prélèvement sanguin (pouvant être réalisé à la veine mandibulaire ou au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat), veine marginale de l’oreille (lapin) du vivant de l’animal. Dans le cas d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat) ou à la veine marginale de l’oreille (lapins), les animaux seront anesthésiés. - D’un isolement de courte durée (1h maximum par 24h) pour la récolte de mictions et de fèces ou bien lors de l’administration d’un composé par voie aérienne en cage à nébuliser. Toutes les manipulations seront effectuées par un personnel qualifié. Une attention particulière sera portée au stress de l’animal en favorisant une acclimatation des animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans cette procédure seront mis à mort afin de récupérer leurs organes et fluides dans le but de pouvoir doser le composé injecté, ses métabolites et ses précurseurs, ou toute molécule nous permettant de retracer le devenir du composé dans l’organisme.
Remplacement
Chaque fois que cela sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement des tests animaux. L’utilisation unique d’études in vitro n'est pas suffisante pour évaluer la pharmacocinétique d’un composé. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, tissulaires d'un animal entier. De plus, c’est une exigence réglementaire de démontrer des effets bénéfiques chez l’animal (puis chez l’Homme), pour qu’un médicament potentiel puisse prétendre à une autorisation de mise sur le marché.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, chaque fois que cela sera possible, les candidats médicaments seront initialement évalués en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre minimum d’animaux est défini en tenant compte de la variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes d’animaux. Le nombre de rats, de souris et de lapins nécessaires a été défini afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cela nous conduit à former des groupes de 10 animaux chez la souris et le rat, et des groupes de 5 animaux pour les lapins.
Raffinement
Les expérimentateurs sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences des expérimentateurs est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Par ailleurs, les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton) de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Les lapins seront eux hébergés par 2, selon les conditions de la réglementation 2010/63. L'enrichissement sera composé de buchettes et d'un jouet. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante. Pour les gestes qui le nécessite, conformément à la règle des 3R, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Les animaux seront vus quotidiennement par un expérimentateur et/ou un zootechnicien. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Cependant, le lapin est phylogénétiquement plus proche de l'Homme que les rongeurs et compte tenu de sa taille, il permet des prélèvements de fluides ou de tissus importants réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Par conséquent, selon la demande du client l’espèce la plus adaptée sera choisie pour l’étude. Par défaut, les animaux seront utilisés à l'âge adulte car l’essentiel de notre activité se concentre sur des composés visant une population adulte. Nous n’excluons pas la possibilité qu’une étude nécessite de se dérouler chez des animaux plus jeunes (système immunitaire immature). Le cas échéant, l’âge minimum des animaux correspondra à l’âge du sevrage (3 semaines pour les souris et les rats et 7 semaines pour les lapins).
Immunogénicité de stocks de MOPEVACLAS à différents ratios « ARN/particule infectieuse » chez la souris S129 IFNAR
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vérifier que des lots d'un vaccin contre la fièvre de Lassa gardent leur pouvoir immunisant malgré des écarts de fabrication, telle est la finalité de ce projet. 48 souris immunodéficientes de lignée S129 IFNAR vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Marquées par des encoches pratiquées dans les oreilles, réparties en quatre groupes de douze, elles reçoivent une ou deux injections à un mois d'intervalle et un prélèvement de sang. La moitié est tuée au quinzième jour, l'autre au quarante-cinquième, pour prélever les organes servant à mesurer la réponse vaccinale.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de confirmer qu’un vaccin contre la fièvre de Lassa conserve ses propriétés immunogéniques indépendamment de certaines caractéristiques variables du vaccin qui peuvent être mesurées lors de sa production. Ces résultats sont essentiels pour le développement clinique de ce candidat vaccin.
Bénéfices attendus
L’efficacité d’un vaccin contre la fièvre de Lassa a déjà été démontrée chez le primate non humain. Des lots cliniques de ce vaccin sont actuellement en production. Ce projet nous permettra de vérifier que certaines caractéristiques mesurées sur les lots produits n’impactent pas l’immunogénicité du vaccin, permettant ainsi le développement du vaccin vers des essais cliniques.
Procédures
Après répartition en 4 groupes de 12 animaux (6 mâles + 6 femelles par groupe, 3 vaccins testés selon différens protocoles vaccinaux), les 48 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - Une ou deux injections de vaccins à un mois d’intervalle sur animaux vigiles - Un prélèvement de sang sur animaux vigiles. - Une mise à mort. Chacun des gestes effectués sur les animaux ne durera pas plus de 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
Ce type de vaccin a déjà été utilisé chez le rongeur et n’a pas causé d’effets secondaires chez les animaux. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever les organes qui seront utilisés pour déterminer les réponses à la vaccination.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro l’induction de réponses immunitaires humorales et cellulaires spécifiques que peut conférer une solution vaccinale. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité des candidats vaccins.
Réduction
Dans ce projet, 4 groupes de 12 animaux seront constitués. Chaque groupe de 12 souris est constitué de 6 animaux mâles et 6 animaux femelles. Dans chaque groupe, les animaux recevront une injection de milieu ou une injection de vaccin. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort à J15 pour des prélèvements qui permettront de déterminer les réponses à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection à J30 et sera mise à mort à J45 pour prélèvements qui permettront de déterminer les réponses après une seconde vaccination. La mise à mort de douze animaux par groupe constitue un minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser des tests statistiques robustes de comparaison de groupes. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des données, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.
Raffinement
Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de désinfectant. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique, l’ajout de gel hydrique peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. Des points limites sont établis et les mesures adaptées mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée est un modèle largement utilisé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Étude de l’impact d’un activateur de la kinase HRI dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une ischémie cérébrale est provoquée par occlusion d'une artère, suivie d'une thrombolyse vingt minutes plus tard, puis d'un traitement à une heure et à vingt-quatre heures. 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par exsanguination au quinzième jour pour prélever leurs tissus. Le projet teste un composé synthétique, le BTdCPU, sur un deuxième modèle d'accident vasculaire cérébral après des résultats obtenus sur un premier. Le porteur classe en sévères les douleurs postopératoires et les déficits fonctionnels ou cognitifs, et écrit par ailleurs que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et ne présentent aucun "syndrome du comportement malade".
Objectifs
L'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique, résultant de l'occlusion d'un vaisseau cérébral, prive les neurones d'oxygène et de nutriments, induisant un stress majeur du réticulum endoplasmique (RE). Face à ce stress, les cellules neuronales activent des mécanismes de survie, notamment en ajustant la façon dont elles fabriquent les protéines. Une molécule essentielle à la fabrication des protéines est modifiée, ce qui ralentit la production générale de protéines. Ce ralentissement permet à la cellule d'économiser son énergie. Cette modification est un mécanisme clé de régulation de la production de protéines en cas de stress. Elle ralentit la fabrication globale de protéines, permettant à la cellule d'économiser de l'énergie pour survivre dans des conditions difficiles. Plusieurs enzymes peuvent provoquer cette modification en réponse à différents types de stress. L'une de ces enzymes, qui est habituellement liée à un manque de fer, montre une implication croissante dans la physiopathologie neuronale et potentiellement dans la réponse au stress ischémique cérébral. Elle représenterait donc un moyen supplémentaire de réguler la fabrication des protéines. Dans ce contexte, le BTdCPU est un composé synthétique, principalement utilisé en recherche pour son action activatrice sur cette enzyme particulière, notamment dans des études précliniques métaboliques et cancérologiques. Des expériences préliminaires sur neurones montrent que de petites quantités de BTdCPU améliorent la survie des cellules après un manque d'oxygène. Chez des souris ayant eu un AVC, l'administration de BTdCPU a réduit la taille des lésions et amélioré leurs fonctions motrices. Ces résultats prometteurs ouvrent la voie à une étude plus approfondie du rôle de cette enzyme dans d'autres modèles d'AVC chez les souris. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact du BTdCPU, seul ou combiné à l'Altéplase, sur les lésions, l'inflammation et la récupération fonctionnelle dans un modèle murin d'AVC ischémique thromboembolique. Tester ce traitement sur un autre modèle animal d'AVC permettrait de confirmer son potentiel thérapeutique après un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en Plaques (SEP) et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de l’efficacité et du mécanisme d’action de notre candidat nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement à 1 heure et 24 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50 minutes). J0+6 heures : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique moléculaire (durée : 30 minutes). J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle (durée : 10 minutes/session). J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5 minutes/session). J+15 : Exsanguination par perfusion intracardiaque (n=80).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de la procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « syndrome du comportement malade ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de Sclérose en Plaques (SEP) et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.
Immunisation des souris par des vaccins à ARNm pour l’évaluation de la protection face à un challenge infectieux et le développement d’anticorps monoclonaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à six injections sur animal vigile et à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, dont des ponctions rétro-orbitaires, 111 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées, en fin de procédure, au moment d'atteindre les points limites, ou pour prélever les organes servant à l'étude des anticorps. Le projet vise à vérifier que certaines protéines protègent contre une bactérie résistante aux antibiotiques et à produire des anticorps utilisables en diagnostic ou en traitement. La nourriture leur est retirée pendant seize heures avant l'infection, qui peut provoquer diarrhée, perte de poids et septicémie sévère jusqu'à la mort, les souris atteignant les points limites étant mises à mort avant ce terme.
Objectifs
Ce projet a deux objectifs : 1) Vérifier si certaines protéines peuvent protéger des souris contre une infection. 2) Créer des anticorps pour voir s’ils peuvent servir à diagnostiquer ou à prévenir l’infection, surtout en cas de bactérie résistante aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Les anticorps et vaccins identifiés peuvent être utilisés comme outils de diagnostic ou comme traitements thérapeutiques potentiels contre l'infection causée par la bactérie d’intérêt.
Procédures
Les animaux subiront un maximum de 6 injections d'une durée inférieure à 1 minute (contention + piqûre), réalisées sur animaux vigiles. Un maximum de 4 prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les prélèvements sanguins (subjugal ou rétro-orbitaires), l'anesthésie sera de courte durée (anesthésie + prélèvement sanguin, temps inférieur à 5 minutes).
Impact sur les animaux
L’injection des antigènes pourrait entraîner des effets indésirables tels qu’une inflammation locale au site d’injection lors de l’immunisation. Les animaux seront injectés et cela peut provoquer une douleur légère, et stress (moins d'une minute) pour les animaux. L'anesthésie sera de courte durée, elle peut provoquer un certain stress (moins de 5 minutes) et de l’hypothermie. Le jour -1 avant l'infection, le retrait complet de la nourriture des cages est effectué 16 heures avant l'infection (mais l'eau est conservée). Cela peut causer un certain stress aux animaux. En raison des injections, il est possible que les animaux ressentent une douleur due à l'inflammation causée par les immunisations. En raison de l'infection par la bactérie, les animaux peuvent développer une maladie caractérisée par une perte de poids corporel, des dysfonctionnements intestinaux (diarrhée) et une translocation bactérienne vers la circulation sanguine, pouvant conduire à une septicémie sévère pouvant possiblement entraîner la mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort que ce soit à la fin de la procédure, ou ceux qui auront atteint les points limites lors des expériences de survie, ou ceux utilisés pour le prélèvement d'organes destinés à l’étude des anticorps.
Remplacement
Les protéines ciblées sont sélectionnées en amont par le biais d'outils bioinformatiques adaptés avant toute expérimentation chez l'animal. Cependant le recours à un modèle murin reste indispensable. L’utilisation de souris dans ce projet est essentielle car elles permettent de mieux comprendre comment le corps réagit à un vaccin avant de passer à des études chez l’humain. Les souris possèdent un système immunitaire suffisamment proche de celui de l’homme pour donner des indications fiables sur l’efficacité et la sécurité d’un vaccin. Elles sont également utilisées pour produire des anticorps, des molécules naturelles qui aident le corps à se défendre contre les infections, et qui peuvent ensuite être utilisées pour développer des traitements.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés grâce à des tests statistiques adaptés afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats. Pour cela, des méthodes statistiques rigoureuses ont été utilisées pour calculer le nombre minimal de souris nécessaire à l’obtention de données fiables. Cette approche permet de limiter l’utilisation d’animaux tout en maintenant la qualité scientifique et éthique de l’étude.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera vérifié tout au long de la procédure expérimentale, avec une fréquence définie pour chaque étape de la procédure. Tous les prélèvements sanguins sont réalisés avec l'application d’un anesthésique local. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale et avec un analgésique. Une grille de points limites stricts et spécifiques au projet a été déterminée afin de pallier toute souffrance.
Choix des espèces
Afin de développer des thérapeutiques contre les maladies infectieuses chez l'Homme, les souris permettent d' évaluer la réponse immunitaire et le développement des anticorps. Les souris sont utilisées pour les valider et éventuellement ces anticorps peuvent être transposés à l'homme à des fins thérapeutiques et diagnostiques. Les souris auront au moins 7 semaines (âge adulte) afin que leur système immunitaire soit complètement fonctionnel. Cela assure l'homogénéité des sujets nécessaire a la reproductibilité intra et inter expérimentale des résultats attendus.
Vaccin pour Induire une Immunité Mucosale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une injection unique de vaccin, puis une prise de sang par semaine pendant cinq semaines, puis, entre cinq et douze semaines plus tard, une infection par un virus ou une bactérie : 2 160 souris suivent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une perte de poids et une variation de la température corporelle, et l'animal dont la grille de score atteint sa valeur maximale est tué. Le projet vise des vaccins qui déclenchent une immunité au niveau des muqueuses, que les vaccins actuels induisent peu, et le porteur affirme que ce modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées le jour de l'expérience, pour prélever les poumons et les autres organes où sont analysées les cellules immunitaires.
Objectifs
La vaccination est parfois la seule option clinique pour lutter contre les maladies infectieuses face à une évolution rapide et croissante de la résistance aux médicaments (antibiotiques, antiparasitaires par exemple) ou le faible nombre de médicaments anti-viraux sur le marché. Ainsi, les vaccins ont permis d'éliminer des infections telles que la variole ou la poliomyélite, et atténuer les effets d'autres infections comme la grippe ou le COVID-19. Il est clair que l’objectif de la vaccination est de permettre à un individu de développer une protection active spécifique vis-à-vis d’un microbe, en utilisant les ressources naturelles de l’immunité afin de générer une immunité dite « mémoire ». Toutefois, les vaccins induisent très peu l’immunité dite « mucosale », qui protège les muqueuses des organes tel que les poumons. Ceci peut donc expliquer la recrudescence de certaines pathologies respiratoires comme la coqueluche contre laquelle 86% de la population mondiale est vaccinée (40 millions de cas et 300000 décès d’enfants par an dans le monde). Ainsi, l'amélioration des vaccins et l'optimisation des stratégies de vaccination sont donc aujourd’hui plus que nécessaires, afin de mettre en place une immunité « mucosale » vis-à-vis de n’importe quel microbe pour prévenir une infection quelles qu’en soient la porte d’entrée ou les manifestations cliniques. Ce projet de recherche ambitionne d’aider au développement de stratégies vaccinales innovantes en améliorant les vaccins existant afin de mettre en place une immunité mucosale protectrice à long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’une protection à long terme de cellules immunitaires générées par la vaccination. En effet, la majorité des vaccins disponibles sur le marché ne permettent pas de mettre en place une immunité mucosale favorisant la recrudescence de plusieurs infections.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie -d'une durée de 20 minutes comptant la phase d'endormissement, du geste technique et de reveil-, pesées - d'une durée de 30 secondes-, administration de vaccin - d'une durée de 30 secondes- , injections de virus ou bactérie - d'une durée de 30 secondes- et prise de sang - d'une durée de 30 secondes-). Les animaux recevront une seule injection de vaccin pour mettre en place une immunité protectrice. Nous verifierons si le vaccin a un effet protecteur en analysant les cellules du système immunitaire présentes dans le sang des souris, 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Puis, 5 à 12 semaines plus tard, les animaux seront infectés une seule fois par un virus ou une bactérie afin de vérifier l’effet protecteur des cellules immunitaires mises en place par le vaccin sur le court et long terme. A l’issue de l’exprimentation, les animaux seront mis à mort pour une analyse précise des cellules immunitaires au sein des tissus tel que les poumons.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tels que : l’anesthésie, pesées, administration de vaccin, injections de pathogène, transfert adoptif et prise de sang. De plus, l’infection peut provoquer une perte de poids et une variation de la température corporelle.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle de souris est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expériences. Dans la mesure du possible, les expériences sont regroupées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.
Raffinement
Les souris seront hébergées, en zone d’expérimentation A2L2 (dans un laboratoire de biosécurité car nous utilisons des organismes pathogènes pour lesquels il y a un traitement curatif et/ou préventif), par groupe de 5 au maximum par cage et de même sexe afin d’éviter le stress de l’isolement. L’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de plusieurs éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid, durant leur hébergement. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des procédures . Les souris seront observées quotidiennement et une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale . Si un des points limite est atteint (valeur maximale de la grille de score) cela entrainera la mise à mort de l’animal . Pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation des animaux affaiblis par l’infection, de la nourriture hydratée et du lait en poudre appétant seront aussi fournis directement dans la cage. Suivant les cas, des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA (structure du bien-être animal) et le vétérinaire référent. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’anti-inflammatoire entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésiques qui pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Toutefois, l'utilisation d'anesthesie pourra être utilisée pour certaines procédures comme les injections intra-nasales.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont similaires à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 6 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant en début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.
Réaction de sevrage, métabolites microbiens et régulation du système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.
Procédures
- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées
Impact sur les animaux
L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.
Le rôle des granulines dans la régénération des organes du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
936 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cœur, leur nageoire ou d'autres tissus, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 432 subissent l'amputation au scalpel d'une partie de la nageoire caudale, d'autres une cryolésion du cœur de deux minutes sous anesthésie, et 168 sont écartés après génotypage parce qu'ils ne portent pas la modification recherchée. Le porteur décrit ensuite de l'hyperventilation, une prise alimentaire réduite et des comportements qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation, prostration au fond du bac ou nage exclusive en surface, et prévoit de tuer immédiatement les poissons dont la nage devient erratique. Le bénéfice annoncé se limite à l'identification de stratégies immunomodulatrices capables de stimuler la régénération des organes chez les mammifères, perspective lointaine face aux lésions cardiaques et aux amputations infligées maintenant.
Objectifs
Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. En particulier, selon l'Organisation Mondiale de la Santé (World Health Organization), les cardiopathies ischémiques telles que l'infarctus du myocarde représentent la première cause de mortalité dans le monde (13% du nombre total de décès dans le monde) et la deuxième cause de morbidité, juste après le COVID-19, dans la dernière évaluation (2021). Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. Avec l'allongement de la durée de vie des populations modernes, l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé - elle touche une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde (Organisation Mondiale de la Santé). Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire (c'est-à-dire un modèle de régénération osseuse), et retrouver leur fonction. Le moment, l'étendue et le type de réponse immunitaire après une lésion d'organe influencent fortement les résultats de la régénération. En particulier, une vague inflammatoire autolimitée est essentielle pour parvenir à une régénération correcte des organes. Les granulines sont molécules naturellement produites par l'organisme pour aider à contrôler l'inflammation et potentiellement soutenir la réparation des tissus, et jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire. De plus, elles sont régulées à la hausse dans les tissus en régénération chez le poisson zèbre. Nous émettons l'hypothèse que les granulines jouent un rôle clé dans le processus de régénération. Ce projet vise à étudier le rôle des granulines pendant la régénération des organes du poisson zèbre (cœur et nageoire). Cette étude sera essentielle pour stimuler la régénération dans des scénarios non régénératifs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'étudier les aspects immunitaires particuliers qui stimulent la régénération des organes. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.
Procédures
Pour les études cardiaques, 336 animaux seront soumis au génotypage par prélèvement caudal sous anesthésie. Parmi eux, 50 % (168) n'auront pas le bon génotype et ne subiront donc pas d'autres procédures (ils sont donc classés comme modérés). 168 animaux seront génotypés sur la base de la seule fluorescence. Cela est réalisé en analysant rapidement la fluorescence au niveau des yeux sous un stéréomicroscope, sous anesthésie. Parmi ces derniers, 336 seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Pour les études de régénération de la nageoire caudale, certains poissons-zèbres (432) seront soumis à une amputation d'une partie de nageoire, une procédure considérée comme légère. Pour ce faire, les poissons anesthésiés sont placés sur le côté dans une boîte de Pétri et, à l'aide d'un scalpel, une coupe rapide est effectuée sur la nageoire caudale et une petite partie du tissu est enlevée, sans affecter les autres tissus environnants. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours (nous n'étudions ici que les 7 premiers jours, lorsque le processus de régénération est très actif). Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes) du tissu de la nageoire caudale en cours de régénération, et la coloration des os en direct (15 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent : - La cryoblessure (cryoinjury) pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Pour éviter que ces animaux meurent en quelques heures ils sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé. - Amputation de la nageoire caudale. Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes. Aucun fardeau phénotypique n'a été identifié pour les mutants grn1/2, mais on s'attend à ce qu'ils présentent une immunosuppression à un moment donné de leur vie, car ils pourraient être plus sensibles aux infections/maladies. Ce phénomène sera donc surveillé. Les animaux surexprimant le gène grn1 ne devraient avoir des niveaux de grn1 affectés que lors d'un choc thermique, car il s'agit d'une lignée inductible. La surexpression de grn1 peut également conduire à des altérations immunitaires et sera donc également surveillée, en particulier après un choc thermique. Toutes les autres interventions n'entraînent généralement pas de nuisances ou d'effets indésirables en elles-mêmes, à l'exception de l'anesthésie qui leur est associée et qui entraîne généralement une hyperventilation pendant quelques minutes après la récupération.
Devenir
Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils géniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus (principe de remplacement). En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau : nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). NB: L’évaluation du poids sera effectuée toutes les deux semaines. Les poissons ne seront pas anesthésiés pour évaluer leur poids. Ils seront placés vigiles dans un bac d’eau sur une balance préalablement tarée.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est génétiquement modifiable, ce qui permet des études à grande échelle rapides et peu coûteuses. De nombreuses lignées transgéniques et mutantes sont disponibles pour répondre à des questions biomédicales clés. Le poisson-zèbre adulte est capable de régénérer ses organes, offrant des perspectives pour favoriser la régénération dans des contextes non régénératifs. Cette capacité diminue avec l’âge, reflétant la réduction de la capacité réparatrice et le dysfonctionnement des organes observés chez les mammifères. Le système immunitaire du poisson-zèbre est conservé chez les mammifères. Ces caractéristiques font du poisson-zèbre un modèle précieux pour l’étude de la régénération des organes et de la réponse immunitaire. Toutes les expériences seront réalisées sur des poissons adultes, car toute la pathophysiologie que nous étudions se développe à l'âge adulte, et le protocole se concentre sur la réponse immunitaire (et la réponse immunitaire adaptative n'est mature que chez les animaux adultes). En outre, l'objectif proposé se concentre sur l'étude de la régénération chez les individus adultes.
Étude de facteurs de sensibilité aux encéphalites à JEV (Japanese Encephalitis Virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une injection intrapéritonéale de virus de l'encéphalite japonaise, à forte dose : 202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne pendant cinq jours. Deux lignées portent des mutations trouvées chez des enfants atteints d'encéphalite grave, et le projet cherche à savoir si ces mutations aggravent l'infection, le virus se répliquant notamment dans le système nerveux central. Le porteur classe la sévérité globale comme modérée tout en annonçant des symptômes neurologiques sévères possibles, dont une paralysie des membres postérieurs, et se limite pour tout raffinement à des gels hydriques, une réhydratation, du chauffage des cages et de l'enrichissement.
Objectifs
Les encéphalites virales chez les enfants sont un problème majeur de santé publique dans la région Asie-Pacifique. Des altérations de la réponse immunitaire semblent entrainer une sensibilité accrue au développement de symptômes neurologiques sévères. Le but de ce projet est d'étudier deux mutations conduisant à l'inactivation de deux protéines distinctes, retrouvées chez des patients souffrant d’une encéphalite au virus de l'encéphalite japonaise afin de savoir si elles sont potentiellement impliquées dans la sévérité de la maladie. L’étude in vivo des infections invasives au virus de l’encéphalite japonaise nécessite un modèle murin pour évaluer l’impact de ces deux mutations génétiques sur la sévérité de l’infection. En effet, le virus est capable d’induire des symptômes sévères et des séquelles à long terme du fait de son neurotropisme, chez la souris comme chez l'homme. Nous utiliserons deux lignées de souris distinctes, dans lesquelles les mutations dans les deux gènes d'intérêt empêcheront la synthèse des protéines à étudier. Lors de l’infection des souris par voie intrapéritonéale, le virus va se disséminer dans la circulation sanguine et se répliquer dans différents tissus notamment le système nerveux central, permettant un suivi de l'infection dans les souris porteuses des mutations comparées aux souris contrôle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise en évidence de facteurs de sensibilité dans le cadre d’encéphalites causées par le virus de l’encéphalite japonaise.
Procédures
Certains animaux recevront une injection quotidienne intrapéritonéale pendant 5 jours (1 injection dure quelques secondes). Les souris recevront une injection intrapéritonéale de virus le jour de l’infection, (1 fois pendant quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré́ de sévérité global dû à l'infection est considéré́ comme modéré pour les animaux contrôle et génétiquement modifiés. Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des procédures expérimentales présentes dans ce projet : • La piqure de l’aiguille lors des injections intrapéritonéales pourra entrainer une douleur faible et de courte durée (quelques secondes) • Du fait des fortes doses de virus injectées dans les souris contrôles et des mutations induites dans les lignées génétiquement modifiées, les animaux seront potentiellement plus sensibles à l’infection et pourront développer des symptômes neurologiques sévères (paralysie des membres inférieurs…).
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort soit pour pour des analyses ex-vivo ou par ce qu’ils sont infectés par le virus de l’encéphalite japonaise.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence des gènes conduisant à une plus grande sensibilité vis à vis de l'infection. Il est encore impossible de reproduire in vitro la complexité de l’organisme et le rôle du système immunitaire. Si des phénotypes sont obtenus dans le modèle murin (sensibilité ou non à l'infection) alors des études sur des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules cérébrales humaines in-vitro) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « organ on chip ») pourront être effectuées pour caractériser les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Ce modèle permet une alternative aux modèles historiques d’études des infections humaines que sont les primates non-humains. En proposant comme alternative la souris, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Notre expérience sur la procédure mise en œuvre dans ce projet nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle. Les animaux ne pourront pas être réutilisés puisqu’il est nécessaire de les mettre à mort pour prélever différents tissus.
Raffinement
Des signes cliniques spécifiques et précoces sont définis pour éviter toute souffrance inutile. Des aliments appétents (gel hydrique), la réhydratation, le chauffage des cages ou le renforcement de l’enrichissement sont mis en place pour améliorer le bien-être des animaux infectés.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée. Leur système immunitaire est proche du système immunitaire humain, ce qui facilite l’étude physiopathologique du virus. Elles ont déjà été utilisées pour étudier l'infection qui fait l’objet de ce projet. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre de générer des souches ayant les mêmes mutations que celles mises en évidence chez l’humain et donc d’étudier la sensibilité des ces souches au virus. Les animaux seront utilisés à l’âge de 12 semaines, car à l’âge adulte les souris non génétiquement modifiées sont résistantes à l’infection tandis que les souris modifiées génétiquement sont potentiellement sensibles. Pour voir si les gènes étudiés augmentent la sensibilité à l’infection il est essentiel que les animaux du groupe non génétiquement modifié soient plus résistants que les animaux modifiés génétiquement.
Prélèvements de tissus en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
17 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un seul geste, prélever un bout de queue ou d'oreille afin de connaître leur génotype. Sur les souriceaux de cinq à douze jours, la queue est coupée aux ciseaux chirurgicaux sur animal vigile, après séparation de la mère pendant dix minutes au maximum, le tatouage des doigts se faisant dans le même temps. Celles qui portent le génotype recherché partiront vers d'autres projets de l'établissement ou vers des collaborateurs, celles qui ne l'ont pas iront à la formation du personnel ou à des prélèvements post-mortem, ou seront tuées "pour permettre la bonne gestion de nos élevages". Le porteur renvoie la question du remplacement aux projets qui utiliseront ces souris, et affirme qu'il est "indispensable" de connaître leur génotype, donc que ces animaux "ne peuvent donc pas être remplacés ici".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir prélever les tissus (bout de queue ou d’oreille) nécessaires pour caractériser génétiquement les animaux. Les animaux génétiquement altérés produits et génotypés lors de ce projet seront utilisés pour répondre aux objectifs des différents projets autorisés dans notre établissement, portant entre autres sur des études des origines et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires. Les souris génétiquement altérées doivent être identifiées individuellement pour qu'elles puissent se voir attribuer le génotype qui leur est spécifique. Cette identification est réalisée par tatouage à l’encre des doigts des souris et le génotypage se fait directement après le tatouage par biopsie de queue ou d’oreille.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour les projets scientifiques autorisés dans notre établissement (en utilisation continue), mais également de caractériser génétiquement les animaux utilisés pour le maintien et l’optimisation de la gestion des élevages ainsi que ceux utilisés pour des prélèvements de tissus post-mortem.
Procédures
Un prélèvement de tissu (queue) sera effectué sur des souriceaux âgés entre 5 et 12 jours. Le prélèvement se fera sur animal vigile et durera moins d’une minute. Pour les animaux âgés de 12 jours ou plus, le prélèvement de tissu concernera un bout d’oreille (bord externe) et sera réalisé sous anesthésie pour une durée d’environ 1 minute.
Impact sur les animaux
La procédure nécessite une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. De plus, une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrêmité de la queue ou d’un bord d’oreille à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. La procédure dure moins d’une minute par animal. Pour les animaux plus âgés qui seront anesthésiés avant le prélèvement, l’anesthésie en elle-même (d’une durée inférieure à 5 minutes) peut entraîner un léger stress d’une courte durée.
Devenir
Les animaux génotypés présentant un génotype d’intérêt seront utilisés de façon continue dans les projets de recherche autorisés dans notre établissement, pourront être envoyés à des collaborateurs, ou serviront pour le maintien de nos élevages. Certains de ces animaux pourront également servir pour des prélèvements de tissus et/ou d’organes post-mortem. Les animaux qui ne présenteraient pas de génotype d’intérêt pourront être utilisés pour la formation des personnels, pour des prélèvements de tissus et/ou d’organes post-mortem, ou seront sinon mis à mort pour permettre la bonne gestion de nos élevages.
Remplacement
Les animaux issus de ce projet seront utilisés (lorsque leur génotype le permet) dans les projets autorisés dans notre établissement. C’est dans ces projets qu’est à chaque fois justifié la nécessité d’utiliser les animaux produits et génotypés dans le présent projet et l’impossibilité de les remplacer. Ainsi, il est indispensable de connaître le génotype des animaux concernés afin de pouvoir les utiliser dans les projets autorisés et c’est pourquoi ces animaux ne peuvent donc pas être remplacés ici.
Réduction
Le nombre d’animaux génétiquement altérés pour lesquels un prélèvement de tissu sera fait est calculé en fonction des besoins expérimentaux. Les élevages sont optimisés pour produire un maximum d’animaux ayant le génotype d’intérêt pour les projets autorisés. Les animaux surnuméraires ou ne possédant pas le génotype d’intérêt peuvent être utilisés pour la formation des personnels ou pour des prélèvements de tissus post-mortem après mise à mort selon les méthodes réglementaires. Le nombre de ces animaux est d’ailleurs régulièrement suivi par la SBEA afin d’optimiser au mieux les schémas d’accouplement des lignées concernées. Les lignées qui ne seraient plus utilisées sont arrêtées dès que possible, ou sont cryoconservées si nécessaire. En parallèle de ces prélèvements, des méthodes de génotypage sous le seuil réglementaire seront testées pour être mises en place au sein de l’animalerie et ainsi réduire au fur et à mesure le nombre d’animaux génotypés par méthode « invasive ».
Raffinement
Pour réduire le nombre de manipulations, l’identification par tatouage et la biopsie de queue sont réalisés en même temps. Les souriceaux de la portée sont placés dans une boîte propre, elle-même placée sur plaque chauffante afin d’éviter une trop grande déperdition de chaleur aux souriceaux. La biopsie de queue est réalisée à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale désinfectée entre chaque animal. L’identification et la biopsie, réalisées par un personnel expérimenté, n’excèdent pas 1 minute par animal et ne provoquent pas ou très peu de saignement. La portée est rendue à la mère dès la fin des prélèvements (durée n’excédant pas 10 minutes au total), et la boîte est désinfectée avant d’y remettre une nouvelle portée. La présence de l’ensemble des souriceaux dans le nid après la biopsie est vérifiée dès le lendemain, lors du suivi journalier. Concernant les animaux âgés de plus de 2 semaines au moment de l’identification, l’identification ainsi que la biopsie auront lieu sous anesthésie, et la biopsie réalisée concernera non pas un bout de queue, mais un bout du bord externe de l’oreille. À partir de cet âge là, le prélèvement à l’oreille est moins impactant que le prélèvement à la queue.
Choix des espèces
Les modifications génétiques des lignées de souris élevées dans notre animalerie permettent de réaliser les différents projets autorisés dans notre établissement, et de répondre aux questions scientifiques soulevées dans des thématiques telles que l'étude des origines et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires. En effet, la souris est un des modèles les mieux connus du point de vue génétique, permettant ainsi d’y apporter différentes modifications génétiques, et ses mécanismes physiologiques sont semblables à ceux de l’Homme, ce qui en fait donc un très bon modèle d’étude pour les travaux réalisés dans les différents projets autorisés de notre établissement. Les animaux seront identifiés et prélevés à un âge compris entre 5 et 12 jours. Les animaux qui seraient plus âgés au moment du génotypage seront prélevés sous anesthésie. La procédure de génotypage doit être faite le plus tôt possible pour que les animaux puissent être utilisés jeunes dans les projets autorisés ou pour des prélèvements de tissus post-mortem sur des animaux juvéniles lorsque c’est nécessaire. Cela permet aussi de connaître le génotype des animaux suffisament tôt pour pouvoir effectuer la sélection des animaux à garder ou non pour le maintien des élevages.
Rôle immunosuppressif et origine des ostéoclastes dans l’ostéosarcome chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Une mesure au pied à coulisse deux fois par semaine, sur animal vigile, suit la croissance des tumeurs : 471 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées, dont 258 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de cellules d'ostéosarcome au contact du tibia sous anesthésie gazeuse, et le porteur indique que la tumeur se développe alors chez 100 % des animaux, en envahissant l'os. Il décrit une douleur croissante avec le développement tumoral, traduite par une perte de poids, des mouvements limités et de la prostration. Trois seuils déclenchent la mise à mort immédiate par dislocation cervicale : un score de souffrance de 6, une perte de poids supérieure à 15 %, ou un centimètre d'écart entre la patte injectée et l'autre.
Objectifs
L'ostéosarcome est un cancer osseux agressif touchant surtout les enfants et adolescents. Le taux de survie à cinq ans n'est que de 60%, il diminue à 20% en cas de métastases et les traitements ne sont donc pas satisfaisants. Dans l'os, les cellules tumorales établissent un environnement favorable au développement tumoral de 2 façons. Elles augmentent la formation d'ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de l'os qui libèrent des molécules favorisant la tumeur. De plus, elles inhibent la réponse immunitaire anti-tumorale. Il a été récemment démontré qu’il existe plusieurs populations d'ostéoclastes, d'origine différente, qui ne sont pas impliqués seulement dans la dégration osseuse mais aussi dans les réponses immunitaires. En particulier, certains ostéoclastes peuvent inhiber ces réponses. Mais la fonction immunitaire des ostéoclastes dans la réponse anti-tumorale reste inconnue. Notre objectif est de caractériser la contribution des ostéoclastes au blocage de la réponse anti-tumorale et de définir l'origine des ostéoclastes associés à l'ostéosarcome afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblées sur les ostéoclastes néfastes pour la réponse anti-tumorale. Nous utiliserons un modèle d'ostéosarcome induit chez la souris normale par injection de cellules d'ostéosarcome en site péri-osseux (tibia). Dans ce modèle, la tumeur se développe chez 100% des animaux injectés et envahie l’os en augmentant la formation d'ostéoclastes. Ces ostéoclastes seront étudiés pour comprendre leur fonction immunitaire. Pour identifier leur origine, nous utiliserons 1 lignée de souris génétiquement modifiées chez lesquelles les cellules à l’origine des ostéoclastes sont identifiables grâce à l’expression de marqueurs fluorescents et dans lesquelles nous induiront un ostéosarcome comme décrit ci-dessus. Nos résultats permettront de comprendre le rôle des ostéoclastes dans la réponse anti-tumorale et d'identifier les facteurs impliqués qui pourront être ciblés spécifiquement pour bloquer les ostéoclastes protumoraux ou les cellules dont ils sont isses afin de prévenir ou limiter le développement tumoral. Ils auront des retombées pour d'autres types de tumeurs et de métastases se développant dans l’os dans lesquelles les ostéoclastes jouent également un rôle important.
Bénéfices attendus
Le dialogue établi entre les cellules cancéreuses et les ostéoclastes est considéré comme un point majeur dans la progression tumorale, mais le rôle immunitaire des ostéoclastes n'a jamais été étudié dans ce contexte. Ce projet permettra de caractériser et de comprendre comment les différents types d'ostéoclastes évoluent et contribuent à la réponse immunitaire dans l'ostéosarcome. Ces aspects sont très peu étudiés dans la littérature. Le projet est donc original et apportera de nouvelles connaissances sur la biologie des ostéoclastes et l'environnement immunitaire des ostéosarcomes. Les mécanismes et processus identifiés pourront à terme permettre d’améliorer les traitements en ciblant les ostéoclastes néfastes sans affecter ceux nécessaires au remodelage osseux physiologique. Ils pourront avoir des conséquences plus larges pour d'autres contextes pathologiques qui présentent des caractéristiques similaires de formation augmentée d'ostéoclastes, par exemple les métastases osseuses de tumeurs répandues (cancer du sein, de la prostate, du poumon...) ou le myélome multiple.
Procédures
Tous les animaux recevront: - 1 injection de cellules cancéreuses ou de PBS (pendant quelques secondes), 1 seule fois pour induire la tumeur. Cela concerne tous les animaux. - 1 injection d'antalgique au moment de l'induction tumorale (quelques secondes). Cela concerne tous les animaux. - 1 prélèvement sanguin à la veine mandibulaire (2 minutes) au moment de la mise à mort. Cela concerne 416 animaux. - 1 anesthésie par inhalation d’isoflurane. Cela concerne tous les animaux. - Les volumes tumoraux seront suivis manuellement à l’aide d’un pied à coulisse deux fois par semaine sur animal vigile (durée de la manipulation : 2 minutes/animal). Cela concerne tous les animaux.
Impact sur les animaux
Toutes les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotype dommageable (viabilité, poids, comportement et reproduction normaux). Elles sont entretenues à l’état homozygote donc sans nécessité de génotypage. L’injection de cellules en intra-musculaire peut générer une douleur très transitoire. Le développement tumoral peut entrainer avec le temps de la douleur qui se traduit par une perte de poids, des mouvements limités, une prostration
Devenir
Tous les animaux dans chacune des procédures seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes pour l'analyse du phénotype et de la fonction des ostéoclastes et de leurs progéniteurs, ainsi que pour la mise en culture de cellules primaires.
Remplacement
L’existence de plusieurs populations d’ostéoclastes n’a été mise en évidence que très récemment et les rares lignées de cellules disponibles pour étudier les ostéoclastes ne reproduisent pas leur diversité et ne permettent pas d'analyser leur interaction avec leur environnement. Elles ne reproduisent pas non plus le phénotype des ostéoclastes pathologiques. De plus, étant donné la complexité des mécanismes impliqués et du microenvironnement tumoral, aborder ce problème seulement par des analyses in vitro n'est pas suffisant et le recours à des modèles animaux est lui aussi indispensable. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Cependant, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer ces modèles in vitro en les modifiant génétiquement grâce aux marqueurs et autres caractéristiques que nous identifierons pour qu'ils reproduisent les différentes populations d'ostéoclastes en cancer. Si cela est possible, cela permettrait à terme de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de ces cellules en condition normale et pathologique.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste en fonction du nombre de cellules nécessaire aux différentes analyses et d'une évaluation statistique, en tenant compte de pertes éventuelles afin de ne pas avoir à répéter inutilement les procédures et avec le nombre de souris minimum par groupe. Pour l'évaluation statistique, nous avons utilisé le test G*power qui permet d'estimer le nombre d'animaux nécessaires en fonction des différences attendues sur la base de nos expériences antérieures et des résultats de la littérature. La procédure 1 nous permettra de définir les conditions expérimentales optimales (nombre de cellules injectées et cinétique) pour nos analyses. Cela nous permettra de réduire le nombre d'animaux dans les procédures suivantes en ne conservant que les groupes les plus appropriés. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
Raffinement
Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Une attention particulière sera portée au suivi des signes de souffrance des animaux. L’injection intramusculaire de cellules tumorale sera faite sous anesthésie gazeuse courte (quelques minutes). Pour réduire la souffrance des animaux pendant le développement tumoral, une grille de score (en annexe) a été établie pour le suivi des animaux avec des critères bien définis pour détecter tout signe de souffrance et des points limites bien définis. Un antalgique sera administré si les animaux présentent des signes de souffrance. Si ces signes ne disparaissent pas, comme indiqué dans la grille de score, ils seront mis à mort par dislocation cervicale. Si le score atteint la limite de 6 (point limite) les animaux seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale. Les animaux seront pesés toutes les semaines après l’injection des cellules tumorales. Si une diminution du poids est observée (>15%) ils seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite). Le volume des tumeurs induites sera contrôlé à l’aide d’un pied à coulisse sur animaux vigiles. Le diamètre le plus grand de la patte injectée sera comparé à celui de la même région de la patte non injectée. Dès que la différence entre les 2 pattes atteint 1cm (correspondant à un volume tumoral d’1cm3), les souris seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite).
Choix des espèces
Les données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons et nos résultats précédents ont été obtenus chez la souris. Nous allons travailler par analogie avec ces résultats dans la continuité de nos travaux antérieurs sur les ostéoclastes. De plus, les cellules tumorales que nous utilisons sont des cellules de souris. Enfin, les modèles déjà existants pour tracer l’origine des ostéoclastes sont tous uniquement des modèles murins. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des souris au stade jeunes adultes (6-8 semaines) afin de mimer au mieux les tumeurs chez les patients (adolescent et jeune adulte).
Test d’efficacité d’un anti-inflammatoire au cours d’un stress metabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Caractériser la toxicité et l'effet anti-inflammatoire d'une molécule développée par une start-up : 880 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont incubées douze heures avec un marqueur fluorescent des lipides, la veille de leur mise à mort. Le porteur reconnaît qu'une létalité est possible aux doses les plus élevées, et prévoit cent larves par dose pour établir des courbes de survie. Le RNT détaille l'incubation au marqueur, mais ne décrit ni le stress métabolique auquel les larves sont soumises ni les doses testées, alors que ce stress est l'objet même du protocole.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de caracteriser la toxicité, les effets anti-inflammatoires sur la cellule d'un composé synthétique, au cours d'un stress métabolique chez la larve de poisson zèbre. Cette molécule qui est développée par une start-up est connue pour inhiber la réaction inflammatoire via le bloquage d'acteurs intracellualires favorisant la réaction inflammatoire.
Bénéfices attendus
Déterminer l'effet d'une molécule anti-inflammatoire, la fenêtre de dose efficace et non toxique sur des larves de poisson zèbre.
Procédures
Les animaux seront soumis pour chacune des phases, à un traitement avec une molécule fluorescente, appelée BODIPY (Minchin JEN et al 2011) qui a une affinité toute particulière pour les lipides. Nous incuberons les larves, une seule fois, la veille de l'euthanasie, avec du BODIPY- comme déjà decrit dans la litterature (Minchin JEN et al 2011) - pour une durée de 12 heures.
Impact sur les animaux
A haute dose, il est possible que nous observions de la letalité meme si à ce jour, et aux doses testées aucune toxicité n'a été repertoriée in vitro sur les cellules et in vivo chez la souris au cours d'etudes préliminaires chez la souris.
Devenir
Toutes les larves seront euthanasiées pour les 3 procédures.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler 3 lignées génétiquement modifiées de larves de poisson zèbre. Ces lignées combinées à la puissance exploratoire du modèle poisson zèbre font de ce poisson un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de l'anti-inflammatoire dans le développement de l'inflammation associée à la progression de l'obésité (principe de remplacement).
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 20 larves par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les tests de toxicité, nous utiliserons 100 larves par dose, pour avoir des courbes de survie robustes et fiables et être sur de nos conclusions (principe de réduction).
Raffinement
Les larves inclues dans les procédures sont hébergées dans un bac d'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés, comme la température ou le pH. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotioncou leur fonction respiratoire (battements cardiaques et mouvements des branchies) (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre ou Brachydanio rerio est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée que celles réalisées chez la souris, tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteûses. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un très grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle trés pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller trés en profondeur pour l'exploration mécanistique. Les animaux seront utilisés au stade larvaire. L'idée est d'abord d'établir une preuve de principe de l'efficacité d'action de l'anti-inflammatoire, chez la larve avant de passer en cas de résultats encourageants à une étude chez le poisson adulte.
Etude de l’effet d’une mort inflammatoire des cellules tumorales comme traitement vaccinal contre le cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une tonte, une injection de cellules tumorales tuées dans le flanc gauche sous anesthésie, puis huit jours plus tard une injection de cellules cancéreuses vivantes dans le flanc droit sur animal vigile, 70 souris subissent cette séquence, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tumeurs. Les cellules viennent d'un adénocarcinome du pancréas de souris, modifié pour qu'on puisse en déclencher la mort à volonté. L'hypothèse testée est qu'une mort cellulaire inflammatoire vaccine l'organisme contre la tumeur qui suit. La croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse pendant 28 jours, et le porteur annonce des points limites établis sans indiquer à quelle taille de tumeur ils se déclenchent.
Objectifs
Afin de tester l’effet vaccinal d'une mort inflammatoire des cellules issues d'adénocarcinomes du pancréas (PDAC) murines, sur l’induction d’une immunitée anti-tumorale, nous avons introduit dans une lignée de PDAC ( isolées de tumeurs d’animaux mutants portant les mutations sur l'oncogène K-ras et le gène suppresseur de tumeur TP53) une construction permettant d'actionner la mort des cellules sur commande. Sept jours après leur acclimatation, les souris sauvages seront injectées en sous-cutanée avec ces cellules qui auront été préalablement stimulées à mourir puis 8 jours plus tard les cellules PDAC vivantes seront injectées dans le flanc droit des souris. La croissance tumorale sera suivie sur 28 jours avec un pied à coulisse en mesurant la longueur et la largeur de la masse tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la mort inflammatoire des cellules de PDAC active une réponse immunitaire contre la tumeur en fournissant à la fois les signaux inflammatoires et l’antigène tumoral. Si cette hypothèse est validée par ce test, elle ouvrira la voie d’une étude plus complète sur la séquence de recrutement et d’activation des cellules immunitaires dans ce contexte précis, mais également au développement d’approche thérapeutique basée sur l'outil que nous avons déveoloppé et qui permettra de tuer les cellules cancéreuses de patients de façon ciblée.
Procédures
Les animaux recevront une ou deux injections en sous-cutanée précédées d'une tonte à une semaine d’intervalle l'injection flanc gauche aura lieu sous anesthésiant l'injection flanc droit aura lieu sur animal vigile.Le geste dure moins d’une minute
Impact sur les animaux
Différentes nuisances peuvent être attendues : Stress liés à la contention des animaux et l’injection, et une douleur est éventuellement possible liée à l’injection des cellules mortes et à la pousse tumorale
Devenir
Les animaux entrés dans la procédure développeront des tumeurs. Ils ne pourront pas être ré-utilisés, ils seront mis à mort, et les tumeurs seront collectés pour une analyse anatomopathologique.
Remplacement
Nous avons généré des données solides in vitro en démontrant l’activation des cellules immunitaires humaines qui nécessitent une validation in vivo. A ce jour, pas de méthode alternative possible que le modèle animal car nous avons besoin de tous les acteurs de la réponse immunitaire pour évaluer la réponse anti-tumorale. Néanmoins nous travaillons en parallèle à mettre au point des modèles cellulaires 3D humains dans le but de remplacement futur.
Réduction
L'effet minimal souhaité de l’approche vaccinale serait une réduction de 50% de la pousse tumorale. Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience a été calculé sur la base d’un test statisitqie non paramétrique, non pairé avec un risque de 5% ainsi qu'une puissance de 80%. La simulation projette 20 animaux par groupe. Pour la procédure n°1 qui prépare la procédure N°2, le nombre d’animaux est réduit de moitié car il s’agit d’estimer le comportement de différentes conditions de culture cellulaire afin de déterminer la condition la plus appropriée pour la procédure N°2. Il s’agira de 3 groupes avec 10 animaux par groupes.
Raffinement
Les tumeurs PDAC injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases. Les animaux sont hébergés en groupe, dans un milieu enrichi pour limiter le stress. En cas d’agressivité, surtout des mâles, des bâtonnets de bois seront mis dans les cages. Si l’agressivité persistait le mâle agresseur sera hébergé individuellement de façon temporaire. Des points limites ont été établis entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si necessaire Les souris seront suivies quotidiennement, en cas de douleur de la buprenorphine sera administrée par injection sous-cutanéee. Si une alteration de l’état general de l’animal est observée des aliments gélifiés ou de l’eau gélifié sera utilisé.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis chez la souris. De nombreuses lignées cancéreuses syngéniques sont disponibles comme celles du PDAC. Des animaux adultesmâles et femelles âgés de 8-10 semaines seront utilisés. Pour ces expériences de vaccination des animaux adultes avec un système immunitaire mature sont requis