Système immunitaire

Pour comprendre comment certains globules blancs entretiennent la parodontite, 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au bout de quatorze jours. Une ligature est posée autour d'une dent sous anesthésie générale profonde, renouvelée quatre fois en deux semaines, et deux radiographies 3D des mâchoires s'y ajoutent, soit cinq anesthésies par animal. Le porteur indique que des douleurs gingivales et des abcès peuvent réduire la mastication et la prise de poids. Les nuisances décrites incluent des accidents de gavage, fausse route ou blessure de l'œsophage, alors qu'aucun gavage n'apparaît dans la description des procédures.

Objectifs

La parodontite est une maladie fortement prévalente qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, des édentements précoces et a des liens avec de nombreuses maladies inflammatoires chroniques. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne. La concentration de certains globules blancs dans la gencive est en corrélation avec la gravité de la parodontite. Inhiber certaines de leurs fonctions permettrait de diminuer l’inflammation. Notre projet vise inhiber certaines fonctions de ces cellules, dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris pour mieux comprendre le développement de cette maladie Le projet concerne 64 souris mâles et femelles, sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet peut permettre de mieux comprendre les mécanismes de la parodontite et ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour éviter la destruction tissulaire caractéristique de cette pathologie.

Procédures

Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) par souris sous anesthésie générale profonde (4 anésthésies + 1 anésthésie avant la mise à mort, par animal), renouvelés tous les 3 jours pendant 14 jours (4 poses de ligature). Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D (2 fois par souris) des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie légère gazeuse (2 fois par souris, durée 5 minutes/souris). Les animaux seront mis à mort après 14 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour tous les animaux pourraient être : - exceptionnellement pour les souris recevant la pose de ligature des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. - une hypothermie au cours de l’anesthésie. - une résistance à l’anesthésie. - un éventuel accident pourrait survenir au cours des gavages, tel qu’une fausse route ou des blessures au niveau de l’oesophage. - Le gavage pourrait induire un stress modéré des animaux

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet. En effet les modèles animaux sont les seuls à reconstituer la complexité des interactions entre le système immunitaire, les pathogènes et le parodonte dans son ensemble. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude de la parodontite dans son ensemble.

Réduction

Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Plusieurs paramètres expérimentaux (résorption de l’os alvéolaire par micro-scanner, analyses de l’infiltrat inflammatoire par histologie) ont déjà été determinés dans nos expériences précédentes. Basé sur nos études précédentes nous avons pu déterminer un nombre d’animaux minimum pour constituer des groupes statistiquement significatifs. Il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 16 animaux (mâles et femelles) est suffisante pour obtenir une différence statistique.

Raffinement

Afin d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur les éléments suivants sont mis en place : (1) Les animaux seront hébergés en groupe sociaux, en milieu enrichi pour minimiser leur stress (2) Avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale, une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, sera effectuée (3) Le gavage sera réalisé par des personnes formées et compétentes pour ce geste (4) Avant chaque pose de ligature les souris seront anesthésiées profondément (5) Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (6) Les animaux seront surveillés quotidiennement par personnel dédié de l'animalerie ou/et les responsables de projet (7) Des points limites ont été établis. (8) La mise à mort anticipée sera effectuée selon les méthodes réglementaires, en cas d’atteinte de points limites. (9) Une analgésie est administrée avant la mise à mort

Choix des espèces

Le modèle de parodontite induite par ligature chez la souris est un modèle d’étude pertinent permettant de reproduire plusieurs caractéristiques de la pathologie humaine (inflammation et resorption osseuse). Ce modèle est validé par la littérature scientifique. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

Les souris reçoivent une irradiation de 3 minutes et 4 secondes, une greffe de cellules de mélanome, de lymphome ou d'adénocarcinome, des injections tous les trois à quatre jours pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée et un prélèvement de sang mandibulaire par semaine. 963 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie la douleur induite par ces manipulations de "faible intensité" et "très transitoire", tout en décrivant des tumeurs sous-cutanées qui se nécrosent et des métastases pulmonaires provoquant un déficit d'oxygénation. Aucun analgésique ni anti-inflammatoire n'est prévu, au motif qu'ils interféreraient avec les processus inflammatoires étudiés.

Objectifs

En France, le cancer est la première cause de décès. Pour mieux le soigner, de nouvelles méthodes, comme l’immunothérapie, ont été développées. L’immunothérapie aide le système immunitaire à combattre le cancer, notamment grâce à des cellules appelées lymphocytes T. Ces cellules peuvent être modifiées en laboratoire (on les appelle alors cellules CAR-T) ou stimulées avec des anticorps pour mieux attaquer la tumeur. Cependant, il arrive que ces cellules n’arrivent plus à détruire les cellules cancéreuses et deviennent "épuisées". Comprendre ce phénomène d'épuisement des lymphocytes T est donc très important pour améliorer les traitements d'immunothérapie du cancer. Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre ce phénomène d’épuisement des lymphocytes T, en étudiant le rôle de deux molécules , Id2 et Msc, qui pourraient influencer ce processus. Les objectifs sont : 1. Déterminer si modifier ces molécules dans les cellules CAR-T permet de mieux ralentir la croissance des tumeurs. 2. Comprendre comment Id2 et Msc agissent sur le fonctionnement et l'épuisement des cellules CAR-T. En résumé, ce projet vise à rendre les traitements par immunothérapie plus efficaces contre le cancer, en empêchant les cellules immunitaires de s’épuiser.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet contribueront à l’optimisation de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des immunothérapies contre le cancer et aussi potentiellement pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris subiront un pré-condionnement correspondant à une irradiation non léthale à une dose de 350 rads (3.5Gy) pour une durée de 3 min 4 s dans un irradiateur à rayon X. Elles subiront des injections sur le flanc d’une lignée tumorale (mélanome, Lymphome, adenocarcinome) ou dans le coussinet graisseux mammaire (lignée tumorale mammaire), ainsi que des injections de lymphocytes T et d'anticorps (1 injection tous les 3-4 jours pour un maximum de 4 semaines), des gavages (1 par jour pour un maximum de 4 semaines) et des prélèvements de sang mandibulaire (1 par semaine-maximum de 3 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections d'anticorps et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris subiront un pré-conditionnement correspondant à une irradiation non léthale (3 min 4s d'irradiation). Elles seront aussi soumises à des injections, des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière très transitoire (secondes) . Certaines tumeurs sous-cutanées peuvent se nécroser dans ce cas les animaux sont mis à mort, occasionnellement les animaux peuvent subir une perte de poids. L'immunothérapie peut induire un peu de diahrée et perte de poids transitoire. Dans le cas des tumeurs mammaires des métastases pulmonaires peuvent être observées à un temps tardif pouvant engendrer un deficit d'oxygénation.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine. En effet l’utilisation de modèles expérimentaux intégrés est essentielle à ce projet. En effet, l’environnement tumoral et l’organisation tri-dimensionnel de la tumeur sont des paramètres clés qui réguleront le recrutement, l'activation et les fonctions des lymphocytes T. A ce jour, cette complexité ne peut être entièrement reproduite in vitro. De même les différents types de cellule du système immunitaire patrouillent par voie sanguine dans l’ensemble de l’organisme et leur recrutement dans la tumeur est défini par l’anatomie de la tumeur. Cette régulation de l'adressage tissulaire des cellules immunitaires, n'est à ce jour pas reproduit fidèlement par les systèmes de microfluidique.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux nous utilisons des modèles de tumeurs transplantées robustes dans des conditions expérimentales optimisées pour une prise de tumeur chez plus de 90% des animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec un logiciel de statistique adapté.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage); et tous les deux jours-trois jours par l'expérimentateur qui vérifiera leur poids et apportera une aide à l’alimentation en cas de besoin (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)), et qui évaluera le développement de la tumeur et l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies) . Des points limites ont été mis en place. Ainsi pour évaluer précisément l'etat général des animaux nous utiliserons une fiche de scoring afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites définis sur la fiche de scoring. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection, un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera mis à mort. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.

Choix des espèces

La possibilité de générer des modèles soit sur-exprimant soit déficient pour une molécule d’intérêt font des souris un modèle de choix pour mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les tumeurs naissantes. Par ailleurs, les modèles murins pré-cliniques ont montré leur pertinence dans la découverte et le développement de nouvelles immunothérapies. La disponibilité d'anticorps spécifiques d'un nombre conséquent de molécules permet d'analyser finement les différentes composantes du sytème immunitaire et de leur environnement par cytométrie en flux ou par imagerie. De plus, nombre de ces anticorps sont des agonistes ou antagonistes des voies de signalisations induites par ces récepteurs, ils peuvent donc être utilisés afin de moduler le système immunitaire ou de préciser les mécanimes impliqués dans le processus biologique étudié. Des souris adultes, agées de 2 mois seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation.

Les cellules transférées proviennent de lignées de souris génétiquement modifiées mises au point par l'équipe, et sont injectées à des souris immunodéficientes plus exposées aux infections. 210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation de moins de quatre minutes, deux injections et deux prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, avant prélèvement de leurs organes lymphoïdes. Sur le remplacement, le porteur écrit en deux lignes qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les étapes de développement des lymphocytes B, sans citer une seule méthode essayée.

Objectifs

Nous avons mis en évidence l’accumulation de cellules exprimant un gène de l’immunité innée à partir des deux chromosomes X dans une population de cellule immunitaire associée à la pathogénie du lupus systémique. Nous avons généré des souris génétiquement modifiées pour comprendre les mécanismes mise en jeux dans l’émergence de ces cellules. L’objectif de ce projet est de montrer que les phénotypes que nous observons sont limités aux cellules lymphoïdes. Pour cela les cellules provenant de nos différents modèles génétiques seront transférées dans des souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Les maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique sont plus fréquentes chez les femmes comparées aux hommes (sexe ratio 9:1). L’hypothèse d’un rôle du dosage des gènes du chromosome X a été évoquée. Ce projet vise à démonter s’il existe un lien direct de causalité entre l'échappement à l’inactivation d’un gène de l’X, conduisant à une plus forte expression de ce gène dans les cellules immunitaires et une réponse fonctionnelle exacerbée responsable du déclenchement du lupus in vivo chez la souris. Les bénéfices de ce projet sont considérables car il permettrait d’établir que la plus grande prédisposition des femmes à la maladie lupique serait d’origine génétique et lié à ce mécanisme. Cela pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques ou à l’utilisation de modulateurs capables de promouvoir ou de renforcer l’inactivation du chromosome X.

Procédures

Les animaux pourront subir : une irradiation légère de moins de 4 minutes ; des injections (durée moins de 1 minute) 2 fois sous anesthésie gazeuse; des prélèvements de sang (1 min) sous anesthésie gazeuse, 2 fois pendant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes que nous utilisons sont davantage susceptibles de développer des infections. L'irradiation peut entrainer un stress et des troubles cutanés. Les injections peuvent entrainer une douleur modérée et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever les organes lymphoïdes pour analyses cytométriques et/ou transciptomiques et/ou histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pour reproduire les différentes étapes de développement des lymphocytes B dans la moelle et les organes lymphoides, de même toutes le populations de lymphocytes B. Ces différentes étapes ne peuvent être reproduites qu'in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience afin d'obtenir des résultats statistiquement interprétables et de faire des analyses à des temps différents. De manière générale, nous avons estimé que 2 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante et que d’après nos données expérimentales un effectif de 5 souris/ groupe serait suffisant. Le calcul d’effectif a été réalisé en utilisant une analyse statistique et en se basant sur des travaux antérieurs.

Raffinement

Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé à l’expérimentation animale. Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. Les injections i.v. ainsi que les prélèvements sanguins sous-madibulaires seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Afin de limiter les risques d’infection des animaux immunodéficients ils seront placés dans des cages sur portoirs ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environement de toutes les cages sera enrichi (igloo, sizzelnest, rouleau en carton). Les animaux seront manipulés sous hotte. La définition des points limites adaptés à la procédure et les critères d’arrêts sont définis suivant un arbre décisionnel validé par notre comité d'étique.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental pour étudier les mécanismes d’échappement à l’inactivation du chromosome X et les conséquences fonctionnelles car il s’agit d’un modèle approprié proche de ce qui se passe dans l’espèce humaine. Nous avons déjà développé des modèles génétiques uniques et originaux chez la souris pour suivre les cellules immunitaires d’intérêt. Ces modèles ont tous été validés et serviront de source de cellules pour un transfert dans des souris immunodéficientes. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes entre 7-10 semaines comme décrit dans la littérature.

3 060 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux administrations orales espacées de 48 heures, subit un conditionnement par la peur de sept minutes puis une réexposition de cinq minutes, donne deux à trois prélèvements de sang à l'état vigile et finit par une chirurgie sans réveil pour prélèvement du cerveau. Les retombées annoncées pour le stress post-traumatique et la maladie d'Alzheimer sont renvoyées au long terme, l'objet immédiat restant de décrire le rôle des cellules gliales dans la mémorisation. Les souris qui atteignent un point limite sont tuées et servent alors, selon le porteur, à des mises au point expérimentales.

Objectifs

La mémorisation et l’apprentissage reposent sur la "plasticité" des circuits neuronaux, c’est-à-dire la capacité à remodeler, réorganiser, les connexions entre les neurones. Cette plasticité est importante au quotidien, voire pour la survie. En effet, reconnaître des contextes dans lesquels on s’est senti précédemment menacé permet d’avoir un comportement adapté si on y est réexposé. Un défaut de cette mémoire entraîne un risque de s’exposer à des situations dangereuses, mais un excès peut conduire à une anxiété disproportionnée dans un contexte ne ressemblant qu’approximativement à celui où l’on a été en danger (c’est le stress post-traumatique). Inversement, la capacité à mémoriser est altérée dans certaines maladies comme celle d’Alzheimer. Il est donc important de connaître les facteurs régulant la plasticité des circuits neuronaux, afin de comprendre pourquoi elle est perturbée dans des situations pathologiques, et d’imaginer comment le prévenir ou y remédier. L’objectif de ce projet est d’étudier, chez la souris, de nouveaux mécanismes permettant la plasticité et donc la mémorisation. Le rôle des neurones dans la mémoire est bien établi, mais d’autres cellules du cerveau, les cellules gliales, pourraient favoriser la plasticité neuronale, c’est-à-dire les remaniements des connexions qui permettent de mémoriser un événement, une situation. L’hypothèse au cœur de ce projet est que lors de l’apprentissage, les propriétés des cellules gliales changent, ce qui a un impact sur leur interaction avec les neurones et favorise la mémoire. Pour tester cette hypothèse, nous avons besoin d’étudier les modifications des cellules gliales lors de la formation de la mémoire, chez des animaux normaux, et chez des animaux dans lesquels ces cellules gliales sont altérées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier les mécanismes de la mémoire. Voici les retombées possibles : 1) Nous étudierons comment on mémorise une situation de danger, parfois excessivement. C’est un modèle pour étudier le trouble de stress post-traumatique (TSPT), qui est reconnu comme un problème de santé mentale par les psychiatres. Le TSPT peut toucher des personnes ayant connu des traumatismes dans l’enfance, des catastrophes naturelles, ou des situations violentes et/ou très anxiogènes (la moitié des personnes témoins ou endeuillées par les attentats de 2015 ont présenté un TSPT dans les mois qui ont suivi). Certaines professions (pompiers, soignants, militaires) sont particulièrement à risque à cause d’expositions fréquentes à des situations dramatiques. Les manifestations sont diverses : peur intense, pensées intrusives, hypervigilance... Non pris charge, cela perturbe fortement la qualité de vie des personnes, perturbe leur travail, diminue leur insertion sociale, et peut conduire à des idées suicidaires dans les cas extrêmes. Ce modèle permet aussi d’étudier les processus de mémorisation en général. Les résultats que nous obtiendrons pourront donc aussi servir à long terme pour la recherche sur les troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer, qui atteint 1 personne de plus de 75 ans sur 6 en France. 2) Nos expériences vont apporter de nouvelles connaissances sur le rôle des certaines cellules et molécules, qui sont ciblées par des médicaments (anti-dépresseurs, neuroleptiques, psychostimulants…). Nos résultats pourraient donc aussi permettre, à long terme, de mieux comprendre les effets positifs ou indésirables de ces médicaments sur la mémoire, et donc d’améliorer, pour les êtres humains, leur prescription et leur utilisation.

Procédures

Dans ce projet, les animaux doivent recevoir un composé pharmacologique, par voie orale, en 2 prises espacées de 48h. Chaque administration sur animal vigile dure moins de 30 secondes. Au minimum 4 semaines plus tard, les animaux vont être soumis à un test de mémoire. Cela nécessite une phase d’apprentissage qui dure 7 minutes, suivie quelques heures ou jours plus tard (selon les lots), d’une phase de test pendant 5 minutes. Par ailleurs, pour vérifier le niveau de stress chez les animaux, nous devons doser dans le sang des marqueurs comme la corticostérone. Pour ce faire, nous devons prélever quelques gouttes de sang sur les animaux vigiles. Le geste dure moins d’une minute. Les animaux seront prélevés 2 ou 3 fois selon les lots, et les prélèvements sont espacés d’une semaine au minimum. A la fin de l’expérience, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie est réalisée. Ce geste dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par voie orale, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure de l’animal au niveau de l’œsophage lors des gavages, et un risque mineur de « fausse route ». Pour le test de mémoire, on réalise un conditionnement par la peur, qui génère donc un stress modéré. Ensuite, on réexpose l’animal au même environnement, ce qui induit une anxiété qui se manifeste par une immobilité, et que l’on quantifie pour déterminer le niveau de mémorisation. Lors des prélèvements de sang, il y a un risque d’hématome ou d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation. Lors de l’anesthésie/analgésie, il y a un risque de détresse respiratoire, comme effet secondaire possible des produits employés comme la kétamine.

Devenir

Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de mémorisation.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules gliales lors d’un apprentissage. En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, ce qu’on ne peut pas modéliser fidèlement ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment les processus de mémorisation. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées génétiquement modifiées qui permettent d’invalider ou d’exprimer des gènes pour étudier leur rôle.

Réduction

Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique a été effectuée et a permis d’estimer qu’il faut prévoir une douzaine d’animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par groupe expérimental. Si l’on réduit trop le nombre d’animaux, on perd en « puissance statistique », c’est-à-dire qu’on risque de ne pas pouvoir détecter des différences, et de conclure par erreur à une absence d’effets. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent au mieux et que les résultats soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 3060 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les conditions sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernés (température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien, hébergement en groupes sociaux de 5 individus maximum et présence dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification). Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et/ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation. Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la perfusion intracardiaque, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien, de sorte à administrer un traitement adapté si besoin, et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle de choix pour les études sur le cerveau et la mémoire car en tant que mammifère son système nerveux a des similarités importantes avec l’homme. De plus, elles peuvent apprendre des tâches complexes, et on peut analyser leur comportement finement. Cette espèce est bien connue comme modèle pour étudier la mémoire. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider, muter, des gènes particuliers dans des cellules précises, et à des stades de développement particuliers. Dans notre étude, pour étudier la mémoire, nous étudierons des animaux dont le développement aura été normal, mais dans lesquels on aura induit des modifications à l’âge adulte (4 semaines après la naissance au moins). Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience.

Les expérimentateurs excluent de l'étude et mettent à mort tout animal dont l'état ne s'améliore pas, selon une grille de score prévue pour chaque procédure. 2 000 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines et pendant une quarantaine de semaines, elles reçoivent un régime hypercalorique et des boissons au fructose qui les rendent obèses, diabétiques et porteuses d'une stéatose hépatique, avec une à deux administrations de composés par jour, des jeûnes de six heures, une épilation sous anesthésie pour l'échocardiographie et jusqu'à trente semaines d'hébergement seule en cage. La finalité déclarée est de disposer de modèles reproductibles, utilisables ensuite pour tester des candidats thérapeutiques contre l'obésité et la stéatose.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possible. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (1 fois, durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement (max 3 fois). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes (1 fois). Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique (3 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère (quelques minutes) . Pour pouvoir relever la consommation alimentaire et hydrique, nous pourrons être amené à héberger les souris de façon individuelle pendant une partie ou toute la durée du projet (jusqu'à 30 semaines). Les souris seront stressées par cet hébergement, même si elles voient et entendent leur congénères. Pour palier le stress engendré, du sur-enrichissement (petits tunnels suspendus, boule de bois notamment) sera ajouté dans les cages et le personnel est formé à l'approche délicate des animaux, aux gratouilles lors des préhensions. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h. Lors des mesures de composition corporelle, l'animal peut ressentir un stress léger modéré , cela dure environ 2 minutes.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Pour les animaux immunodéficients, nous mettrons en place une zone dédiée et un process clair pour garantir leur statut sanitaire. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique pour chaque procédure est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et le mettront à mort. Les prélèvements de sang seront fait sous couverture analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques et des comorbidités associées. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Modifiées pour n'exprimer qu'un récepteur humain à la place du récepteur murin, 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales de côlon ou de pancréas sous anesthésie générale, puis des chimiothérapies une fois par semaine pendant trois semaines et jusqu'à cinq injections de la molécule testée. Les tumeurs peuvent gêner leurs mouvements et se nécroser, et les souris sont tuées quand la tumeur atteint une taille limite ou en cas de perte de poids. La molécule a déjà été administrée à des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques, où elle a été bien tolérée, mais le porteur indique qu'elle active le récepteur chez la souris alors qu'elle l'inhibe chez l'humain, ce qui le conduit à construire un modèle murin porteur du récepteur humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester l’efficacité de la combinaison thérapeutique de chimiothérapies et d’une molécule bloquant un récepteur humain et rechercher le mécanisme mis en jeu. Ce projet a comme origine un essai clinique de phase I réalisé avec cette molécule sur des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques. Cette molécule s’est révélée être bien tolérée par les patients, ne pas présenter de toxicité et il y a eu stabilisation de la maladie pour certains des patients inclus. L’étude de l’effet anti-tumoral de cette molécule avait été réalisée dans des modèles de rongeurs, or il s’est avéré que cette molécule qui active le récepteur chez la souris, au contraire inhibe ce même récepteur chez l’Homme. Ce projet a donc comme but d’élucider le mécanisme anti-tumoral de cette molécule dans un modèle de souris exprimant le récepteur humain et non murin. Nous chercherons également à montrer l’intérêt d’associer cette molécule à des chimiothérapies pour augmenter l’efficacité anti-tumorale de cette thérapie. En effet, un nouvel essai clinique est en projet et inclura des patients porteurs de tumeurs coliques ou pancréatiques traitées par des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Afin de pouvoir finaliser la mise en place d’un nouvel essai clinique chez les patients porteurs de cancers pancréatiques et coliques, il est nécessaire de déterminer l’efficacité thérapeutique de ces combinaisons dans ce modèle de souris exprimant uniquement un récepteur humain, ainsi que de comprendre le mécanisme mis en place. A l’issu de ce projet, l’essai pourra débuter et à terme nous comptons bien pouvoir proposer un nouveau type de traitement pour les patients atteints de ce type de tumeurs.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection des chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines - injection de la molécule, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales, ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées des traitements pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - La molécule est également utilisée à des doses déjà bien établies dans les modèles murins et induit un léger épisode fébrile qui ne devrait pas être présent dans ces souris humanisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur pourra être prélevée.

Remplacement

L’effet de la molécule combinée ou non à des chimiothérapies a déjà fait l’objet de nombreuses expériences in vitro en utilisant des cellules cancéreuses et immunitaires humaines, porteuses du récepteur humain. Cependant pour démontrer l’efficacité anti-tumorale de ces combinaisons, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant l’ensemble des cellules présentes dans les tumeurs : cellules immunitaires, fibroblastes, vaisseaux sanguins… De plus, cette démonstration nécessite aussi que ces organismes présentent un récepteur humain d’où ce modèle de souris humanisées pour ce récepteur.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage. En cas de nécroses sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, un produit cicatrisant sera utilisé. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection de la molécule, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Le fait que la molécule, ciblant le système immunitaire, a un mode d’action différent sur le récepteur humain de ce qui est retrouvé sur le récepteur murin nous oblige à utiliser un modèle de souris modifiées pour n’exprimer que le récepteur humain. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Des prélèvements dans l'os du tibia toutes les trois semaines, des prises de sang tous les vingt et un jours et des injections d'anticorps deux fois par semaine attendent 9 724 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le myélome leur est inoculé par injection de cellules tumorales murines ou humaines, et le RNT décrit ensuite des douleurs chroniques, des ulcérations, une anémie, une immunosuppression persistante et une mobilité qui se dégrade. L'objectif déclaré est d'évaluer des anticorps monoclonaux et bispécifiques avant des essais chez l'humain. Le porteur écrit néanmoins que ce protocole "vise à réduire l'utilisation d'animaux" et que les interventions "visent à minimiser la souffrance animale", alors que les 9 724 souris seront toutes tuées pour prélèvements post mortem.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le myélome multiple, en particulier à travers l'immunothérapie, afin d'augmenter l'efficacité des traitements actuels et, à terme, induire la guérison des patients à long terme. Cela inclut l'évaluation de l'activation des lymphocytes tueurs par l'administration d'anticorps monoclonaux, en testant ces approches sur des modèles murins de myélome. L'objectif est également de suivre le comportement des cellules immunitaires in vivo pour mieux comprendre leur rôle dans la lutte contre la tumeur et d'identifier des solutions thérapeutiques innovantes qui pourraient être validées avant des essais cliniques sur l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet offre des bénéfices multiples pour la recherche fondamentale et les traitements cliniques du myélome multiple, en répondant aux questions clés des immunothérapies et en optimisant leur efficacité. L’étude de l’action des anticorps monoclonaux ou bispécifiques et leur association avec des chimiothérapies classiques vise à surmonter les résistances observées chez certains patients et à augmenter les taux de réponse à long terme. Ces travaux permettront aussi d’identifier de nouvelles cibles immunologiques et d’approfondir notre compréhension des rôles de molécules spécifiques et des mécanismes d’action des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules NK dans le contexte tumoral, avec des implications directes pour les thérapies humaines. Les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) sont des cellules du système immunitaire capables de reconnaître et de détruire les cellules tumorales ou infectées, en libérant des substances cytotoxiques. De leur côté, les cellules NK (Natural Killer)sont des acteurs clés de l'immunité innée qui éliminent les cellules anormales sans nécessiter d’activation préalable par un antigène, jouant ainsi un rôle crucial dans la surveillance immunitaire contre le cancer. Grâce aux études croisées entre modèles humanisés et murins, ce projet permettra de relier directement les résultats aux thérapies appliquées en clinique, avec l’ambition d’élaborer des traitements plus ciblés, limitant les effets secondaires et adaptés au profil de chaque patient. En parallèle, ce protocole vise à réduire l'utilisation d’animaux en maximisant la collecte de données longitudinales, conformément aux exigences éthiques modernes. Enfin, en testant l'efficacité des combinaisons d’immunothérapie et de chimiothérapie, ce projet constituera une base solide de données précliniques pour accélérer la transition vers des essais cliniques, soutenant ainsi l'intégration de nouvelles approches dans le traitement du myélome multiple.

Procédures

Dans le cadre de ce protocole, les animaux subiront plusieurs interventions afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le myélome multiple. Voici les principales interventions : 1. Prélèvements sanguins : Réalisés tous les 21 jours. 2. Injections de traitements : Administration d’anticorps monoclonaux et anticorps bispécifiques Fréquence : deux fois par semaine, pendant 2 semaines max. 3. Injections de cellules tumorales: Pour induire le myélome, des lignées murines ou humaines sont injectées. 4. Prélèvements intra-osseux : Prélèvements intratibiaux toutes les 3 semaines pour évaluer la croissance tumorale. 5. Suivi de la croissance tumorale : Mesures fréquentes de la taille des tumeurs. 6. Analgésie et soins : Administration d'analgésique (20 min avant le prélèvement) pour soulager la douleur. Les animaux présentant des signes de souffrance seront euthanasiés. Ces interventions visent à minimiser la souffrance animale tout en assurant le suivi des traitements expérimentaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce protocole expérimental visant à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le myélome multiple, les animaux sont susceptibles de présenter diverses nuisances, dont certaines peuvent s’inscrire dans la durée. Les prélèvements sanguins répétés, peuvent induire une anémie modérée et un stress physiologique cumulatif sur une période de plusieurs jours à plusieurs semaines. Les injections de cellules tumorales et les administrations de traitements sont susceptibles d'entraîner des effets secondaires systémiques prolongés, tels qu’une perte de poids progressive ou une immunosuppression persistante, pouvant affecter le bien-être sur le moyen terme. Les prélèvements intra-osseux, réalisés ponctuellement sous anesthésie, comportent un risque limité mais réel de douleur post-procédure ou de boitement temporaire, généralement de courte durée (24 à 72 heures), nécessitant une surveillance clinique ciblée. Le développement tumoral peut, quant à lui, s’accompagner de douleurs chroniques, d’ulcérations et d’une altération progressive de la mobilité, avec une intensification des signes cliniques au fil des jours, imposant des critères d’arrêt clairs et anticipés (CF grille de scoring) Enfin, la manipulation fréquente des animaux, associée aux contraintes environnementales liées aux procédures expérimentales, représente un facteur de stress chronique non négligeable, dont les effets peuvent s’accumuler tout au long de l’étude. Une surveillance rapprochée, associée à des mesures de raffinement (anesthésie, analgésie, période de récupération, limitation des interventions non essentielles), est mise en place afin de limiter au maximum la durée et l’intensité de ces nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélèvement post mortem.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans ce protocole n’intervient qu’après une phase approfondie d’études in vitro sur des modèles cellulaires. Ces recherches préliminaires ont permis de démontrer l’importance des facteurs étudiés dans la régulation des mécanismes biologiques liés au myélome multiple. Ces approches in vitro, incluant notamment des co-cultures cellulaires et des tests fonctionnels sur les récepteurs et les cytokines, permettent de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires en validant en amont les hypothèses expérimentales. Ainsi, les modèles murins ne sont utilisés que pour des validations finales indispensables, lorsque les systèmes cellulaires ne permettent plus de répondre aux questions scientifiques posées. Cette démarche s’inscrit pleinement dans le principe de remplacement des 3R.

Réduction

Le principe de Réduction, dans le cadre des 3R, vise à minimiser le nombre de souris utilisées tout en assurant la solidité scientifique des résultats. Dans ce protocole, une planification rigoureuse des expériences, appuyée par des analyses statistiques, permet de déterminer avec précision le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives, évitant ainsi toute expérimentation superflue. L’emploi de suivis longitudinaux, tels que des prélèvements sanguins ou intratibiaux répétés, permet d’optimiser la collecte d’informations sans accroître le nombre de sujets utilisés. Par ailleurs, le partage des données entre équipes de recherche et le recours à des modèles complémentaires, comme les systèmes in vitro ou les simulations informatiques, renforcent l’efficacité des études tout en limitant le recours aux animaux.

Raffinement

Le principe de raffinement est appliqué dans ce protocole pour assurer les meilleures conditions de bien-être animal tout au long de l’étude. Une procédure rigoureuse de suivi quotidien des souris est mise en place, permettant d’observer tout signe de stress ou de souffrance. En cas de douleur, des mesures adaptées, comme l’administration d’analgésiques, sont immédiatement appliquées pour limiter les effets indésirables des interventions. De plus, des techniques minimisant l’inconfort, comme l’utilisation de méthodes non invasives et des conditions de logement enrichies, contribuent à réduire le stress. Cette approche vise à respecter les exigences éthiques tout en maintenant la qualité scientifique des données obtenues.

Choix des espèces

Les modèles souris sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. Ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisées en clinique